CN117965622A

CN117965622A - 艾滋病疾病模型猫的建立方法

Info

Publication number: CN117965622A
Application number: CN202311666492.3A
Authority: CN
Inventors: 米继东; 赵建平; 郑敏
Original assignee: Beijing Sinogene Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Sinogene Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-12-06
Filing date: 2023-12-06
Publication date: 2024-05-03

Abstract

本发明涉及艾滋病疾病模型猫的建立方法。本发明的方法包括利用基因编辑技术制备hCD4、hCCR5和hCXCR4基因敲入的猫体细胞，然后通过体细胞克隆相结合的手段获得HIV‑1易感的hCD4、hCCR5和hCXCR4基因敲入的艾滋病疾病模型猫。

Description

艾滋病疾病模型猫的建立方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及艾滋病疾病模型猫的建立方法。

背景技术

艾滋病是一种由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的严重的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。HIV进入机体后，通过识别人体的CD4+T淋巴细胞及巨噬细胞，与细胞表面CD4及其辅助受体CCR5/CXCR4识别结合，实现在感染细胞内的复制，破坏人的免疫系统，最终导致免疫系统崩溃，各种机会性感染及恶性肿瘤的发生，最终死亡。

为了找到更好的针对HIV引起的AIDS相关疾病的原因及治疗方法，同时也为了兼顾相关研究中的涉及的安全性问题，越来越多的动物模型被应用到HIV相关的科学研究中。早在20世纪80年代，研究者们通过利用血液以及阴道感染的手段，将HIV-1病毒引入黑猩猩体内，成功得到了HIV感染的黑猩猩模型。多项研究表明，黑猩猩由于与人有着高达97％的基因组同源性，因而被认为是最理想的研究人类疾病的动物模型。然而，抛开其与人高度的基因组同源性特点，黑猩猩在免疫应答反应等多方面与人仍有着明显差异，从而导致其在感染HIV-1后的表现出的临床症状与人的模拟度有限。其中，最为突出的一点即是黑猩猩在成功感染HIV-1后，并没有出现在临床HIV患者体内发现的高水平CD8+T淋巴细胞现象，也未检测到β2微球蛋白、TNF-α的表达升高等。另一方面，鉴于其物种的濒危性，研究者们也在通过多种技术手段，如异种细胞/器官移植、体细胞克隆、CRISPR/Cas9基因编辑技术等，寻求其他替代黑猩猩的HIV动物模型，用以更好的应用于HIV相关的病理及转化应用研究中。

目前，HIV研究中比较常用的动物模型包括非人灵长类(黑猩猩、恒河猴、豚尾猕猴、食蟹猴等)、家猫、转基因大鼠/小鼠、HIV人源化小鼠等。非人灵长类由于与人具有基因组进化上的高度相似性，虽然极大程度上可以满足于HIV相关疫苗以及治疗手段的开发，但其在免疫应答与人的明显差异、伦理审查困难及高额饲养成本上的劣势阻碍了HIV研究的大规模开展。另一方面，大/小鼠HIV动物模型成本相对低廉，饲养方法相对简单，尤其是利用基因编辑产生的人源化HIV模型，可以在一定程度上模拟人的临床效果，但其真正的投用于临床转化以及应用的时效性仍有待检验。

因此，HIV领域亟需可以满足其致病机制相关研究的同时，也可以在一定程度上投入成果转化应用、疫苗开发以及治疗手段验证的更为理想的动物模型。

发明内容

为了解决现有技术中存在的不足，本发明提供了一种利用基因编辑获得HIV基因敲入的艾滋病疾病模型猫的方法，主要通过基因编辑技术以及体细胞克隆相结合的手段，获得HIV-1易感的人源化CXCR4、CD4和CCR5(hCCR5、hCD4和hCXCR4)基因敲入的模型猫，使HIV-1研究直接在猫上开展变得可行。

在第一方面，本发明提供了一种艾滋病疾病模型猫的建立方法，所述方法包括利用基因编辑技术制备hCD4、hCCR5和hCXCR4基因敲入的猫体细胞的步骤。

在一些实施方式中，所述基因编辑技术选自BE3单碱基编辑技术、CRISPR、TALEN和ZFN，优选为CRISPR/Cas9。

在一些实施方式中，利用基因编辑技术制备hCD4、hCCR5和hCXCR4基因敲入的猫体细胞包括以下步骤：

(1)根据猫CD4基因的7号外显子序列确定打靶位点；

(2)根据确定的打靶位点合成sgRNA序列，将合成的sgRNA序列与骨架载体连接构建sgRNA打靶载体；

(3)将所述打靶载体电转染至猫体细胞中，通过同源重组，将hCD4、hCCR5和hCXCR4基因敲入猫体细胞的CD4基因的7号外显子区域。

本发明通过同源重的方式将hCD4、hCCR5和hCXCR4基因敲入猫体细胞的CD4基因的7号外显子区域，相比于插入其他位点，整体功能会有差别。

在一些实施方式中，所述打靶位点的序列为：

tgactcagtctgggaacaatctgacctgtgaggtgctgggacccacctcccctgagctgacgctgagcttgaaactcaaaggacaggctgccaa

ggtctcaaagcagcagaagatggtaagggtggaggacgccgaggcgggaacatggcaatgtctactgagtcacaaggacaaagtcttgctgg catccaaggccgagg(SEQ ID NO:1)。

在一些实施方式中，所述sgRNA序列为：gcaatgtctactgagtc(SEQ ID NO:2)。

在一些实施方式中，所述sgRNA序列的互补序列：gactcagtagacattgc(SEQ ID NO:3)。

在一些实施方式中，所述方法还包括将制备的hCD4、hCCR5和hCXCR4基因敲入的猫体细胞移植到受体母猫体内，从而获得艾滋病疾病模型猫的步骤。

在一些实施方式中，将制备的hCD4、hCCR5和hCXCR4基因敲入的猫体细胞移植到受体母猫体内包括以下步骤：

(1)制备去核卵母细胞；

(2)将获得的hCD4、hCCR5和hCXCR4基因敲入的猫体细胞的细胞核导入去核卵母细胞的细胞质中；

(3)激活克隆胚胎；

(4)将获得的克隆胚胎移植到受体母猫。

在一些实施方式中，所述去核卵母细胞获自受体母猫异体。

在一些实施方式中，所述去核卵母细胞获自自体只单侧冲卵的受体母猫冲卵那侧的输卵管，将克隆胚胎移植到受体母猫未冲卵那侧的输卵管中。

在一些实施方式中，所述去核卵母细胞获自绝育猫的卵巢。

在一些实施方案中，步骤(1)中，用PMSG和HCG处理受体母猫后确定受体母猫的发情和排卵，然后进行单侧或双侧冲卵获得成熟的卵母细胞，再进行成熟卵母细胞的去核处理，

优选地，所述PMSG的用量为100-600单位(IU)，所述HCG的用量为100-300单位(IU)。

在一些实施方案中，在步骤(2)中，采用仙台病毒和/或电融合的方式进行融合，

优选地，所述电融合的电压为1.0-3KV/cm，优选为1.0-1.6KV/cm。

在一些实施方式中，所述猫体细胞来自如下的组织或器官：胎儿组织、皮肤、肌肉、耳、乳腺、输卵管、卵巢、血液、尿液、脂肪、骨髓、血管和管腔内皮。

在一些实施方式中，所述猫体细胞选自胎儿成纤维细胞、皮肤细胞、上皮细胞、耳细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌肉细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、卵巢细胞、卵丘细胞、神经细胞和成骨细胞。

本发明首先利用基因编辑技术例如CRISPR/Cas9获得hCCR5、hCD4和hCXCR4人源化基因敲入猫胎儿纤维细胞，然后利用体细胞克隆技术及hCCR5、hCD4和hCXCR4人源化基因编辑阳性细胞获得HIV人源化基因编辑猫，首次获得了人源化基因编辑活体猫，有望将此技术手段推广于其他适合以猫为模型的疾病模型的开发。

在第二方面，本发明提供了一种hCD4、hCCR5和hCXCR4基因敲入猫体细胞的打靶载体，所述打靶载体由针对猫CD4基因的打靶位点序列设计的sgRNA序列以及骨架载体构成。

在一些实施方式中，所述打靶位点序列根据猫CD4基因的7号外显子序列确定。

在一些实施方式中，所述打靶位点的序列为：

在第三方面中，本发明提供了由第一方面的方法获得的艾滋病疾病模型猫的体细胞、组织或器官。

在一些实施方式中，所述体细胞、组织或器官包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的序列。

在一些实施方式中，敲入猫体细胞的hCD4基因的序列如SEQ ID NO:4所示。

在一些实施方式中，敲入猫体细胞的hCCR5基因的序列如SEQ ID NO:5所示。

在一些实施方式中，敲入猫体细胞的hCXCR4基因的序列如SEQ ID NO:6所示。

在一些实施方式中，所述体细胞的分类命名为hCCR5\hCD4\hCXCR4基因敲入阳性细胞株，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.45184，保藏日期为2022年6月9日。

在第四方面，本发明提供了一种引物对组合物，所述引物对组合物包括第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对，其中，

所述第一引物对的序列如下：

正向引物：ggtctctaacacggtctatgcgaaa(SEQ ID NO:7)，

反向引物：aagaagattccagagaagaagccta(SEQ ID NO:8)；

所述第二引物对的序列如下：

正向引物：cttcgcctgttggctgccttactac(SEQ ID NO:9)，

反向引物：agccagagcacgagtgtgtcgcata(SEQ ID NO:10)；

所述第三引物对的序列如下：

正向引物：ctggttctggaaacctgaccc(SEQ ID NO:11)，

反向引物：ctgcgatttgcttcacattgat(SEQ ID NO:12)；

所述第四引物对的序列如下：

正向引物：tgaaccccatcctctatgcttt(SEQ ID NO:13)，

反向引物：cagttacgcttgggtctcatc(SEQ ID NO:14)。

在第五方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对，其中，

所述第一引物对的序列如下：

正向引物：ggtctctaacacggtctatgcgaaa(SEQ ID NO:7)，

反向引物：aagaagattccagagaagaagccta(SEQ ID NO:8)；

所述第二引物对的序列如下：

正向引物：cttcgcctgttggctgccttactac(SEQ ID NO:9)，

反向引物：agccagagcacgagtgtgtcgcata(SEQ ID NO:10)；

所述第三引物对的序列如下：

正向引物：ctggttctggaaacctgaccc(SEQ ID NO:11)，

反向引物：ctgcgatttgcttcacattgat(SEQ ID NO:12)；

所述第四引物对的序列如下：

正向引物：tgaaccccatcctctatgcttt(SEQ ID NO:13)，

反向引物：cagttacgcttgggtctcatc(SEQ ID NO:14)。

在第六方面，本发明提供了根据第一方面所述的引物对组合物或根据第二方面所述的试剂盒在检测包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的序列片段的基因组序列的艾滋病疾病模型猫中的应用。

本发明提供了利用基因编辑技术例如CRISPR/Cas9技术获得hCCR5、hCD4和hCXCR4人源化基因敲入猫胎儿纤维细胞的方法；并且首次实现了利用基因编辑获得的体细胞进行克隆方法，完成了hCCR5、hCD4和hCXCR4人源化基因敲入HIV阳性猫(艾滋病疾病模型猫)的制备。

与现有的HIV动物模型相比，本发明存在以下有益效果：第一，通过利用CRISPR/Cas9技术，成功实现了hCCR5、hCD4和hCXCR4人源化HIV基因在猫上的敲入，获得了稳定的hCCR5、hCD4和hCXCR4基因敲入猫胎儿纤维细胞株系，为人源化HIV动物模型填补了猫科动物的空白，丰富了猫HIV疾病模型的基因编辑细胞库；第二，通过利用基因编辑及体细胞克隆手段，实现了hCCR5、hCD4和hCXCR4基因在猫全身组织细胞的DNA水平上的插入改变，满足其个体多组织器官细胞在基因上的统一，从而促使实验结果更加明确和突出，避免需要大量的动物来进行实验，也免去了许多动物的痛苦；第三，人源化基因编辑HIV猫相对于人源化小鼠/大鼠HIV模型更适合应用于HIV中早期疾病发展的追踪，模拟临床病人的疾病发展轨迹，更适用于HIV相关治疗手段的开发及药物的临床前实验；第四，相对于非人灵长类，HIV人源化基因编辑猫的饲养及繁育成本相对低廉，动物伦理相对容易满足，便于基础科研以及临床转化研究的开展。

下面提供实施例和附图以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。

附图说明

图1示例性示出了在猫的CD4基因处敲入hCD4、hCCR5和hCXCR4基因的示意图。

图2示出了本申请实施例2中克隆猫的分子鉴定结果。

具体实施方式

定义

除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。

除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。

克隆：采用相应的技术手段，生产与供核细胞具有相同DNA序列的动物个体。

体细胞核移植：将猫成体细胞移植入去核的猫卵母细胞中构建克隆胚胎的方法。

供核细胞：包含有完整的遗传物质的细胞，将其移植入受体卵母细胞内用于制备体细胞克隆动物。

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。

以下实施例中使用的试剂主要有：PMSG(Pregnant Mare Serum Gonadotropin)、hCG(人绒毛膜促性腺激素)、(FBS：胎牛血清)、DPBS(Dulbecco's Phosphate BufferedSaline)、SOF(Synthetic Oviduct Fluid)、BSA(牛血清白蛋白)、EGF(表皮生长因子)、PBS(磷酸盐缓冲液)、DMEM(dulbecco's modified eagle medium)、CHX(环己酰亚胺)。

实施例中未注明具体方法者，按照本领域能够实现所述目的的常规方法进行。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：hCD4、hCCR5和hCXCR4基因敲入的猫胎儿纤维细胞株的构建

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在猫的CD4基因处设计打靶载体，通过同源重组的方式将hCD4、hCCR5和hCXCR4敲入该基因的7号外显子区域(参见图1)，然后通过质粒电转猫胎儿纤维细胞，筛选得到阳性克隆细胞株。具体如下：

1.通过CRISPR/Cas9基因编辑制备hCD4、hCCR5和hCXCR4基因敲入的猫体细胞，具体步骤包括：

(1)根据猫CD4基因的7号外显子序列确定打靶位点；打靶位点的序列为SEQ IDNO:1所示的序列：

ggtctcaaagcagcagaagatggtaagggtggaggacgccgaggcgggaacatggcaatgtctactgagtcacaaggacaaagtcttgctgg catccaaggccgagg(SEQ ID NO:1)；

(2)根据确定的打靶位点合成sgRNA序列，将合成的sgRNA序列与骨架载体连接构建sgRNA打靶载体；sgRNA序列为gcaatgtctactgagtc(SEQ ID NO:2)，sgRNA序列的互补序列为gactcagtagacattgc(SEQ ID NO:3)；

(3)将所述打靶载体电转染至猫胎儿成纤维细胞中，通过同源重组，将hCD4(SEQID NO:4)、hCCR5(SEQ ID NO:5)和hCXCR4(SEQ ID NO:6)基因敲入猫体细胞的CD4基因的7号外显子区域。其中，同源重组用载体的构建方法为针对猫CD4基因外显子7两端分别设计扩增与猫CD4基因完全相关的两段同源臂序列(同源左臂、同源右臂)，在同源左臂的3‘端引入E2A短肽序列，分别扩增hCD4、hCCR5、hCXCR4的CDS序列，在hCCR5序列的5‘端引入E2A短肽序列，3’端引入P2A短肽序列，hCD4序列的5‘端引入P2A短肽序列，3’端引入T2A短肽序列，hCXCR4序列的5‘端引入T2A短肽序列，3‘端引入与猫CD4基因同源右臂相同的约18-25bp的完全相同的序列，通过天根的EasyGeno快速重组克隆试剂盒(VI201-01/VI201-02)，将5个片段重组构成完整的同源重组质粒。

2.细胞筛选：将经电转染后的猫胎儿成纤维细胞中，经过两轮嘌呤霉素(puro)药筛后，挑取细胞单克隆，细胞裂解后进行PCR扩增鉴定基因组，共筛选了91株细胞克隆。结合PCR琼脂糖凝胶电泳和基因测序的结果，共获得7株阳性细胞克隆，分别为：#19、#35、#38、#46、#57、#66和#86。

经测序结果证明上述得到的细胞克隆插入了正确序列的hCD4(SEQ ID NO:4)、hCCR5(SEQ ID NO:5)和hCXCR4(SEQ ID NO:6)基因。

实施例2：hCD4、hCCR5和hCXCR4基因敲入猫胎儿纤维细胞克隆猫的获得

本实施例中，使用实施例1中获得的hCD4、hCCR5和hCXCR4阳性猫胎儿成纤维细胞获得克隆猫。简单来讲，包括以下步骤：a.hCD4、hCCR5和hCXCR4阳性克隆细胞株培养；b.从受体母猫制备去核卵母细胞；c.将hCD4、hCCR5和hCXCR4阳性细胞导入去核卵母细胞的细胞质中；d.激活克隆胚胎；e.将步骤d获得的克隆胚胎移植到受体母猫。具体如下：

(1)成熟卵母细胞的获得

用于克隆的猫成熟卵母细胞由两种途径获得。一种是经超数排卵的母猫，每组实验选5只猫同步肌肉注射孕马血清促性腺激素(PMSG)200～500单位，96h后注射100-300IU人绒毛膜促性腺激素(HCG)后人工刺激排卵，注射药物后40-48h进行手术冲卵。沿腹中线切开皮肤，暴露卵巢及子宫的宫管结合部，将带有圆形前端的金属注射针从卵巢囊的裂口处插入输卵管伞部，然后将针管缝合固定；在宫管结合部输卵管处将插入注射针，用含有10％的FBS的TCM199培养基冲洗输卵管，将长度为3cm的塑料管穿刺入子宫内部，结扎固定后使用冲卵液从宫管结合部冲洗卵母细胞。冲卵方向也可逆向进行，但接取冲卵液一端的针管直径要大于冲卵液进入的针管直径。冲卵手术结束后，猫立即进行苏醒处理，并注意保温，胚胎移植时再进行麻醉。供体猫则进行双侧输卵管冲卵，获得的卵母细胞用于体细胞核移植，供体猫不进行冲卵或单侧冲卵。将冲卵液置于显微镜下，捡出卵母细胞，放入含有0.1％透明质酸酶的DPBS溶液中，操作在37℃热台上进行，利用口径COCs相近的胚胎吸管反复吸吐，将卵丘细胞移除。在显微镜下挑选排出极体的卵母细胞用作体细胞核移植。

另一种途径是从动物医院收集健康绝育母猫的卵巢，置于含37℃添加青链霉素的生理盐水的保温杯中，在4h内尽快运回实验室。用无菌生理盐水清洗3次，然后用眼科剪和镊子小心分离卵巢周围的脂肪组织，剥离卵巢，并对卵巢状态进行评价，挑选肉眼可见明显卵泡的卵巢纳入试验。将卵巢放入含10％FBS的M199中，用无菌刀片进行切割，尽量释放卵母细胞。在显微镜下收集包裹2层以上，胞质均一的卵丘卵母细胞复合体(COCs)进行体外成熟培养。培养基为SOF+3mg/ml BSA+1-5IU/mlHCG+0.5-1IU/ml PMSG+20ng/mlEGF，每次使用前需在培养箱中预热2h。培养采取微滴培养的方式，每100μL做一个微滴，每滴不超过20个COCs。培养24h后放入含有0.1％透明质酸酶的DPBS溶液中，在37℃热台上，利用口径COCs相近的胚胎吸管移液枪反复吸吐，将卵丘细胞移除。在显微镜下挑选排出极体的卵母细胞用作体细胞核移植。

卵母细胞超数排卵结果及体外成熟结果如表1和表2所示。

表1卵母细胞超数排卵结果

表2卵母细胞体外成熟结果

序号	培养的卵的数量	成熟的卵的数量	成熟率
				1	100	37	37.00％
2	60	36	60.00％
				3	32	27	84.00％
4	120	88	73.00％
				5	41	26	63.00％
合计	353	214	60.62％

(2)卵母细胞去核

挑选成熟的卵母细胞在HCR犬操作液+细胞松弛素B(CB，5μg/mL)中处理5min，HCR+CB+H33342中染色5min,HCR+CB中去核，去核后将针中取得的物质在紫外灯下照射以确定去核率。去核后的卵在SOF中恢复半小时。

(3)供体细胞准备

供体细胞的准备：利用实施例1获得的hCD4、hCCR5和hCXCR4阳性基因编辑猫胎儿纤维细胞，细胞在核移植前经过2天的接触抑制或者血清饥饿处理，使用时先把准备好的细胞在高倍显微镜下观察细胞的生长状态和密度，选好要的一孔进行消化。用1ml无钙镁的PBS把细胞洗一遍，去除孔内残留的血清，然后加入新配的0.25％的胰酶200μl左右，放入培养箱中定时2分钟，然后马上用1ml含血清的DMEM终止消化，用枪头吹打细胞，收集全部的细胞到15ml无菌的离心管中，1200rpm 5分钟。弃上清，加100-200μl的培养液(HCR)备用。

(4)注核、融合及激活

使用灭活仙台病毒融合。将选取的供体细胞放入仙台病毒微滴中处理几秒后，立即注射到卵母细胞透明带和细胞质之间，用注射针轻轻点压透明带，使体细胞与卵母细胞膜紧密结合构建重构胚。放入SOF微滴中培养30分钟以后，在体式显微镜下观察卵母细胞细胞质和供体细胞的融合，统计融合效率。融合(0.5mm融合槽融合)：将重构胚用1根不沾油的捡卵针洗净油，并在融合液中平衡若干时间使复合体沉底，吸100μl融合液，放入电极槽并吹洗，再把液吸干(用此方法洗3遍)，然后放入逐个将复合体放入融合槽的平行电极之间。不同的卵用不同的电压，融合的重构胚约1.0KV/CM，2个脉冲，间隔60μs，进行电刺激。未融合的胚胎使每一个体细胞处在12点或6点的位置用电融合设备(BTX)进行电刺激，1.6KV/CM，2个脉冲，间隔60μs把卵从融合槽中用捡卵针放入HCR液中，待所有卵电击完后，从HCR液中转移到SOF溶液中清洗至少三遍后，放入SOF微滴中培养30分钟以后，再在体式显微镜下将能观察卵母细胞细胞质和供核细胞的融合，统计融合效率。判定为融合的重构胚用含10μg/ml CHX和5μg/ml CB胚胎培养液激活4h，完成激活后进行胚胎移植。

(5)胚胎移植

受体猫麻醉后，选择未冲卵一侧腹壁侧切，暴露未冲卵的卵巢组织，将子宫及卵巢牵出。将克隆胚胎吸入胚胎移植管中，从输卵管伞部插入胚胎移植管，将胚胎植入受体体内。

胚胎移植结果如表3所示。

表3克隆胚胎移植结果

(6)克隆猫分子的鉴定

对获得的4只幼猫分别编号为：202201001、202202001、202202002、202202003。

为确定出生克隆幼猫是否为hCCR5、hCD4和hCXCR4人源化基因敲入HIV阳性猫。采用如下的方法进行鉴定：

第一轮PCR扩增鉴定的引物信息如下：

h5-HLFN：ggtctctaacacggtctatgcgaaa(位于猫内源性CD4基因组)(SEQ ID NO:7)h5-HLRN：aagaagattccagagaagaagccta(位于插入片段hCCR5基因序列)(SEQ ID NO:8)退火温度：59℃，PCR产物理论大小为1629bp；

h5-HRFN：cttcgcctgttggctgccttactac(位于插入片段hCXCR4基因序列)(SEQ IDNO:9)h5-HRRN：agccagagcacgagtgtgtcgcata(位于猫内源性CD4基因组)(SEQ ID NO:10)退火温度：62℃，PCR产物理论大小为1151bp；

鉴定体系和PCR程序如下表4所示。

表4

以第一轮产物为模板，进行第二轮PCR扩增鉴定：

第二轮(嵌套于第一轮PCR产物中)PCR扩增鉴定的引物信息如下：

h5-HL-Fi：ctggttctggaaacctgaccc(SEQ ID NO:11)

h5-HL-Ri：ctgcgatttgcttcacattgat(SEQ ID NO:12)

退火温度：59℃，PCR产物理论大小为1113bp；

h5-HR-F2：tgaaccccatcctctatgcttt(SEQ ID NO:13)

h5-HR-R2：cagttacgcttgggtctcatc(SEQ ID NO:14)

退火温度：59℃，PCR产物理论大小为684bp；

鉴定体系和PCR程序如下表5所示。

表5

PCR鉴定结果如图2所示，各泳道依次代表DNA2000(marker)、202201001、202202001、202202002、202202003、WT、NC的第一轮PCR产物以及202201001、202202001、202202002、202202003、WT、NC的第二轮PCR产物。根据图2的PCR胶图结果可以看出，202201001、202202001、202202002、202202003一共4只个体均检测到目标条带，成功获得202201001、202202001、202202002、202202003共4只hCCR5、hCD4和hCXCR4人源化基因敲入HIV阳性猫。对上述4只HIV阳性猫进行基因组测序，结果进一步证实上述四只阳性猫均在CD4基因成功敲入了hCCR5、hCD4和hCXCR4人源化基因。

编号为202201001的HIV阳性猫的体细胞保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，分类命名为hCCR5\hCD4\hCXCR4基因敲入阳性细胞株，保藏号为CGMCC No.45184，保藏日期为2022年6月9日。

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims

1.艾滋病疾病模型猫的建立方法，所述方法包括利用基因编辑技术制备hCD4、hCCR5和hCXCR4基因敲入的猫体细胞的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑技术选自BE3单碱基编辑技术、CRISPR、TALEN和ZFN，优选为CRISPR/Cas9。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用基因编辑技术制备hCD4、hCCR5和hCXCR4基因敲入的猫体细胞包括以下步骤：

(1)根据猫CD4基因的7号外显子序列确定打靶位点；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述sgRNA序列及其互补序列包括：gcaatgtctactgagtc(SEQ ID NO:2)，互补序列为gactcagtagacattgc(SEQ ID NO:3)。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将制备的hCD4、hCCR5和hCXCR4基因敲入的猫体细胞移植到受体母猫体内，从而获得艾滋病疾病模型猫的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将制备的hCD4、hCCR5和hCXCR4基因敲入的猫体细胞移植到受体母猫体内包括以下步骤：

(1)制备去核卵母细胞；

(3)激活克隆胚胎；

(4)将获得的克隆胚胎移植到受体母猫。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述猫体细胞来自如下的组织或器官：胎儿组织、皮肤、肌肉、耳、乳腺、输卵管、卵巢、血液、尿液、脂肪、骨髓、血管和管腔内皮。

8.hCD4、hCCR5和hCXCR4基因敲入猫体细胞的打靶载体，所述打靶载体由针对猫CD4基因的打靶位点序列设计的sgRNA序列以及骨架载体构成。

9.根据权利要求8所述的打靶载体，其特征在于，所述打靶位点序列根据猫CD4基因的7号外显子序列确定，

优选地，所述sgRNA序列为gcaatgtctactgagtc(SEQ ID NO:2)，gactcagtagacattgc(SEQ ID NO:3)。

10.由权利要求1至7中任一项的方法获得的艾滋病疾病模型猫的体细胞、组织或器官。

11.根据权利要求10所述的体细胞、组织和器官，其特征在于，所述体细胞、组织或器官包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的序列。

12.根据权利要求10所述的犬体细胞、组织或器官，其特征在于，所述体细胞的分类命名为hCCR5\hCD4\hCXCR4基因敲入阳性细胞株，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.45184，保藏日期为2022年6月9日。

13.一种引物对组合物在检测包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的序列片段的基因组序列的艾滋病疾病模型猫中的应用，所述引物对组合物包括第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对，其中，

所述第一引物对的序列如下：

正向引物：ggtctctaacacggtctatgcgaaa(SEQ ID NO:7)，

反向引物：aagaagattccagagaagaagccta(SEQ ID NO:8)；

所述第二引物对的序列如下：

正向引物：cttcgcctgttggctgccttactac(SEQ ID NO:9)，

反向引物：agccagagcacgagtgtgtcgcata(SEQ ID NO:10)；

所述第三引物对的序列如下：

正向引物：ctggttctggaaacctgaccc(SEQ ID NO:11)，

反向引物：ctgcgatttgcttcacattgat(SEQ ID NO:12)；

所述第四引物对的序列如下：

正向引物：tgaaccccatcctctatgcttt(SEQ ID NO:13)，

反向引物：cagttacgcttgggtctcatc(SEQ ID NO:14)。