CN104120147A - 一种制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制作基因敲除动物模型的领域，具体讲，涉及一种制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的方法及应用。其制备方法为：从基因组DNA中分离iGb3S基因，经长链PCR方法扩增获得同源臂，与抗生素耐药基因复合构建打靶载体；将打靶载体转入到胚胎细胞，将重组胚胎细胞注入代孕动物胚胎中，移植到假孕动物体内，与正常动物交配；对得到的嵌合体动物进行基因型验证，筛选基因成功敲除的阳性基因敲除的嵌合体动物；进一步与野生型动物交配，获得F1代杂合子；F1代杂合子之间交配后获得两条染色体均被剔出的纯合子动物，建系获得基因敲除动物种群。

Description

一种制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的方法及应用

技术领域

本发明涉及制作基因敲除动物模型的领域，具体讲，涉及一种制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的方法及应用。

背景技术

由哺乳动物细胞外基质构成的生物源性材料因其具有良好的生物相容性被广泛用于外科的创伤修复、组织重建和组织工程的支架材料等。异种器官也早已成为解决器官移植中供器官严重缺乏的潜在途径之一。然而，动物源性生物材料或异种器官组织应用于人体所带来的免疫学问题直接影响着这类材料使用的安全性和有效性。异种器官移植的最大障碍是供器官异种抗原与受者体内天然抗体结合后激活补体系统，攻击供器官而产生的超急性免疫排斥反应(Hyperacute rejection，HAR)，其发生时间在异种移植后的几分钟至数小时，供器官在短时间内发生功能衰竭使移植失败。动物源性生物材料虽经各种去除抗原的处理，却难以彻底去除所有的异种抗原，残留抗原仍然是造成慢性免疫排斥反应和免疫毒性而影响创伤愈合的重要因素。

已有研究显示异种抗原α-半乳糖基抗原(α-1,3-galactosyle，α-Gal)是动物源性生物材料或异种器官移植超急性免疫排斥反应中的主要靶抗原。α-Gal是含有聚乳糖胺核心末端残基的细胞表面分泌型糖蛋白或糖脂，广泛存在于猪和其它低等动物体内。α-Gal主要受α-1,3半乳糖基转移酶(α1,3-galactosyltransferase，α-1,3GT)及异红细胞糖苷酯合成酶(isoglobotriosylceramide synthase或isogloboside 3 synthase，iGb3S)调控。由于人体及类人猿、旧世纪猴的半乳糖苷转移酶基因有2个碱基错位变异而不表达Gal抗原，但人血清中存在高滴度的抗α-Gal抗体(占总血清球蛋白的1％)，因此当人体接受含有Gal抗原的生物材料或异种器官移植时会导致超急性免疫排斥反应及慢性的免疫毒性反应。有研究证实人血清中的抗α-Gal抗体既与α-1,3GT催化的Gal抗原(糖蛋白)反应，也与iGb3S催化的Gal抗原(糖脂肪)反应。动物源性生物材料或异种器官移植中Gal抗原的去除成为降低免疫排斥和慢性免疫毒性反应的关键。目前，如何评价Gal抗原的去除和残留Gal抗原诱导的免疫毒性尚存在着瓶颈。由于野生型低等动物都表达α-Gal抗原，因此无法利用野生型低等动物去评价α-Gal抗原相关的免疫毒性反应，只能用狒狒作为受体来考察α-Gal抗原阳性或者异体器官的免疫毒性反应，而这种动物稀少很难普及使用。因此，如何评价动物源性生物材料或异种器官组织的免疫毒性存在着瓶颈。检测与监管机构因没有方法和标准可依据而无法进行有效的安全性和质量监控，同时也限制了该类产品的研发和产业化发展。

国际上早在90年代就有通过构建α-1,3GT基因敲除小鼠，来研究α-Gal相关的免疫学反应，探讨不含Gal抗原的克隆动物的构建方法和可行性。早在1996年，RG Tearle等报告了α-1,3GT基因敲除小鼠模型的成功制作方法，为α-1,3GT基因敲除克隆猪的构建开辟了先锋。之后开始有报告使用α-1,3GT基因敲除小鼠模型研究其与人所诱导抗体的相似性及其免疫学特征。Chiang TR等报告，α-1,3GT基因敲出小鼠免疫后诱导的抗-Gal抗体与α-Gal结合的亲和性和人的抗Gal抗体相似，是能够诱导Gal抗原阳性异种心脏补片的超急性免疫排斥反应。Chong A等报告，α-1,3GT基因敲除小鼠能够诱导自然的抗α-Gal IgM和IgG，并呈现周龄依存性增强；在同种异体或异种补片移植后可以观察到T-cell依存性的抗α-Gal抗体反应。这些研究提示α-1,3GT基因敲除小鼠模型对Gal抗原残留诱导的免疫毒性具有敏感的反应性。

α-Gal抗原引起的超急性免疫排斥反应和慢性免疫毒性的克服方法得到了深入研究。许多实验室采用了不同的方法对供器官或细胞进行处理，其中以酶处理法、物理化学分离法及交联法和基因改造等方法的研究最广泛。在2000年初研究者们开始了α-1,3GT基因敲除猪的研究，甚至α-1,3GT基因敲除牛的研究，期望能够直接从α-1,3GT基因敲除猪或牛获得没有Gal抗原的组织或器官，以避免动物源性生物材料及异种脏器移植的免疫排斥反应。Dai Y及Lai L等报道，他们运用核转移技术成功培育出了α-1,3GT基因敲除猪(GT/KO pig)。实验研究显示α-1,3GT基因敲除猪来源的生物材料能够显著减轻Gal抗原诱导的超急性排斥反应。

国内关于α-1,3GT基因敲除动物模型的研究也已起步，但进展缓慢，大部分研究都还停留在打靶载体构建或胚胎细胞重组的阶段。关于iGb3S基因敲除动物的研究未见报道。第三军医大学的张伟在博士论文中曾记述了C57BL/6J小鼠胚胎干细胞的α-1,3GT基因敲除的工作，成功获得了α-1,3GT基因敲除的小鼠胚胎干细胞。作者周建在林爱星导师的指导下曾进行了“猪体细胞α-1,3-半乳糖基转移酶基因的敲除并敲入HLA-G1基因的研究”，获得敲除α-1,3GT并敲入HLA-G1基因的体细胞。在2011年，南方医科大学的郑道山硕士研究生开展了“利用启动子缺陷型打靶载体敲除五指山小型猪GGTA1(α-1,3GT)基因”的研究。军事医学科学院野战输血研究所的作者常宏宇报道了利用正负筛选打靶载体在猪肾细胞系PK-15细胞中敲除GGTA1基因，获得了杂合子GGTA1(+/-)PK-15细胞。戴一凡教授早在2002年在美国留学期间就在国际上率先发表了α-1,3GT基因敲除猪的研究成果。据报道戴一凡教授于2011年回到南京医科大学代谢疾病研究中心，率领团队开始了α-1,3GT基因敲除猪的深入研究和育种繁殖，并很快成功迎来了首批转基因克隆猪的诞生。

有研究发现，α-1,3GT基因敲除的小鼠或者猪仍然表达α-Gal抗原，仍然能够观察到轻度的免疫排斥反应。另外有研究已经证实人的组织器官中不表达活性的iGb3，提示由iGb3S转移酶基因转写的iGb3含半乳糖基脂蛋白可能是动物源性材料移植于人体时造成异种免疫排斥反应的另一种外源性抗原。Milland等的研究显示在α-1,3GT基因敲除动物体内仍然表达低水平但有显著意义的Gal抗原。α-1,3GT基因敲除小鼠表达iGb3S mRNA，更重要的是α-1,3GT基因敲除小鼠来源的抗体与iGb3S合成的脂肪骨架的Galα(1,3)Gal抗原反应。这一研究结果提示iGb3S合成的Galα(1,3)Gal糖脂肪抗原可能是造成异体移植慢性免疫排斥反应的主要原因。因此，Milland等认为α-1,3GT基因敲除动物虽然避免了急性免疫排斥反应，脂肪连接的Gal抗原是异体移植后期慢性免疫排斥反应的根源。有学者开始研究iGb3介导的免疫反应以及iGb3S缺损模型动物的免疫学变化。

然而，上述的一些研究也只限于个人的实验室研究范围，国内还没有具有自主知识产权的iGb3S基因敲除小鼠。而由于国际间技术壁垒的存在，在国内无法得到相关的模型动物。针对现有技术的不足和缺陷，特提出本发明。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提出了一种制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的方法。

本发明的第二发明目的在于提出该iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的应用。

为了实现本发明的目的，采用的技术方案为：

一种制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的方法，包括以下步骤：

(1)构建打靶载体：从基因组DNA中分离iGb3S基因，经长链PCR方法扩增获得同源臂，与抗生素耐药基因复合构建打靶载体；

(2)将打靶载体转入到胚胎细胞，将重组胚胎细胞注入代孕动物胚胎中，移植到假孕动物体内，与正常动物交配；

(3)对得到的嵌合体动物进行基因型验证，筛选基因成功敲除的阳性基因敲除的嵌合体动物；进一步与野生型动物交配，获得F1代杂合子；F1代杂合子之间交配后获得两条染色体均被剔出的纯合子动物，建系获得基因敲除动物种群。其制备方法的流程图如附图18所示。

本发明的第一优选技术方案为：所述的非人哺乳动物为小鼠，进一步优选C57BL小鼠。

本发明的第二优选技术方案为：所述的iGb3S基因敲除为敲除iGb3S基因的功能性催化区第五外显子，其核苷酸序列如SEQ NO ID:1所示，全长687kb。

本发明的第三优选技术方案为：所述打靶载体含有5`同源臂、耐药抗生素基因NeoR-PA和3`同源臂，用NeoR-PA取代第5外显子。

本发明的第四优选技术方案为：耐药抗生素基因NeoR-PA5`端和3`端的同源臂序列取自小鼠第四条染色体上iGb3S基因第五外显子的5`端和3`端，分别为8.3kb和9.1kb。

本发明的第五优选技术方案为：构建打靶载体的步骤为：

(1)从正常C57BL/6J小鼠分离基因组DNA，扩增第5外显子5’端C1(586bp)、A(547bp)和3’端B(486bp)、C2(585bp)片段，分别连接到pBlunt载体；

(2)将酶切鉴定、测序正确的A和B片段依次连接到pL452载体得到pL452-iGb3S-A-B，同时，通过Overlap PCR将测序正确的C1、C2片段融合后连接到pDTA-Down载体上；

(3)将连接正确的pL452-iGb3S-A-B用EcoRV酶切，pL452-AB切出2880bp、2885bp两条带，回收目的片段A-NeoR-B，电转含pBCTG的BAC菌进行重组；菌落PCR检测A-NeoR-B片段重组BAC，鉴定扩增条带正确；

(4)pDTA-down-iGb3S-C的线性化处理，即EcoRV酶切处理pDTA-Down-iGb3S-C，回收目的条带，电转已经重组了NeoR的iGb3S的BAC菌；pDTA-iGb3S-C拯救iGb3S-NeoRBAC(AmpR+KanR)；对C拯救后的菌落进行PCR检测鉴定，将重组正确克隆进行扩增，经Stbl3纯化后酶切验证。

本发明的第六优选技术方案为：步骤(2)包括以下步骤：制备不育雄鼠和假孕母鼠；超排卵；收获受精卵；目的DNA的制备；将目的DNA导入受精卵；受精卵的移植；首建鼠中目的DNA整合情况的检测；通过杂交繁育基因剔出小鼠种系。

本发明还涉及来自基因敲除动物的精子、卵细胞、受精卵、胚胎、子代、组织或细胞。

本发明还涉及基因敲除的非人哺乳动物或来自基因敲出动物的精子、卵细胞、受精卵、胚胎、子代、组织或细胞在生物源性材料中的应用；所述生物源性材料包括动物源性或取自人体的，所述的动物源性生物材料不包括灵长类动物；所述的动物源性生物材料的种类包括取自动物体内的各种组织、脏器及其衍生物，或者由组织或脏器制备的各种材料；所述的灵长类动物特指古世纪猴、狒狒。所述的应用包括在免疫学研究、免疫毒理学、免疫排斥反应及其机理的研究、安全性评价中的应用，所述的安全性评价包括生物源性材料在临床试验前的安全性评价。

所述的iGb3S基因敲除为敲除iGb3S基因的功能性催化区第五外显子，其核苷酸序列如SEQ NO ID:1所示。全长688kb，其核苷酸序列为：

7728   gta cctggagaag

7741 tacctggaac acttcctggt atcggcagag cagcacttca tggtcggcca gaacgtggtg

7801 tactatgtgt ttacggatcg cccggaagca gtgccctatg tggctctagg ccagggtcgc

7861 ctgctgcggg caaaacccgt gcagcgagag aggcgctggc aggacgtgtc catggcacgc

7921 atgcccacgc tacacgaggc tctgggaggg cagctgggcc aagaagctga ctttgtgttc

7981 tgcctggacg tggaccagta cttcaccggt aacttcgggc ctgaggtgct ggcagatttg

8041 gtggcacagc tgcacgcctg gcactaccgc tggccgcggt ggctgctgcc ctacgagagg

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8221 cagctggacc ataagcgcgg cattgaggca ctctggcacg acgaaagcca ccttaacaag

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8341 attatctgga ggagagagat ccatcaccca cgcctgctct gggcacccaa ggaatatacg

8401 ctggtgcgaa actag

下面对本发明的技术方案做进一步的解释和说明。

本发明涉及一种制作基因敲除动物模型的方法，以及该动物模型在多种生物源性材料(动物源性、取自人体的)、组织或器官的免疫学研究、免疫排斥反应及其机理的研究、临床前安全性评价(如免疫学评价、植入实验等)中的用途；以及由该模型动物衍生出来的细胞、组织、器官及胚胎在上述领域中的用途。

本发明的动物模型被人为地剔出了iGb3S基因的功能性催化区第5外显子。利用了细菌人工染色体同源重组技术，以抗生素耐药基因和附加在5`端(上游)与3`端(下游)的同源臂构成打靶载体，替换iGb3S基因的功能性催化区第5外显子。实施该发明的途径主要包括打靶载体构建、重组胚胎细胞克隆和囊胚显微注射。首先从C57BL小鼠的基因组DNA中分离iGb3S基因，经长链PCR方法扩增获得同源臂，再与抗生素耐药基因复合构建打靶载体；从C57BL小鼠的胚胎中分离胚胎细胞，短期扩增培养后用于打靶载体的电转，筛选、获得阳性胚胎细胞克隆；经显微注射方法将重组胚胎细胞注入鼠胚胎中，然后移植到假孕鼠体内；获得黑斑状嵌合体小鼠；进一步与野生型C57BL小鼠交配，获得F1代杂合子；利用分子生物学方法对得到的F1代杂合子小鼠进行基因型验证，筛选基因成功敲除的阳性基因敲除的杂合子小鼠；F1代杂合子之间交配后获得两条染色体均被剔出的纯合子小鼠；Southern Blot方法进行基因型鉴定后，建系获得基因敲除动物种群。在此基础上，可以进一步获得该动物模型的细胞、器官及胚胎。

具体的，本发明提出了一种从小鼠基因组中剔除了iGb3S基因的功能性催化区第5外显子的啮齿类基因敲除动物的制作方法。本发明所用的iGb3S基因全长约10kb，基因序列选自C57BL/6J小鼠第4染色体基因组DNA。iGb3S基因含有5个外显子，其功能性催化区位于第5外显子。本发明所构建的打靶载体长度为25.2kb，如图1所示，含有5`(上游)同源臂(8.3kb)、NeoR-PA(7.343bp)和3`(下游)同源臂(9.1kb)。用NeoR-PA取代第5外显子。

与文献报道的不同：文献Normal development and function of invariant natural killer T cells in micewith isoglobotrihexosylceramide(iGb3)deficiency(PNAS,2007,104(14)5977-5982)利用Cre-介导的loxP-NeoR选择盒(PGK-gb2-neomycin selection cassette(neo)symbolize loxP sequences)剔除第5外显子，重组完成之后脱掉NeoR序列，其示意图如图2所示。最上端为野生型基因位点(WT locus)，含有1～5个外显子(Exon1-5)；插入的抗生素耐药基因(neo,PGK-gb2-neomycinselection cassette)取代了外显子5和部分3’端序列；打靶载体包括上游同源臂(含2～4外显子)，抗生素耐药基因序列和下游同源臂；重组完成后脱掉neo序列(recombined locus)。

通过显微注射(Microinjection)生产基因敲除动物的过程包括以下步骤：制备不育雄鼠和假孕母鼠；超排卵；收获受精卵；重组胚胎细胞的制备；将重组阳性的胚胎细胞导入受精卵；受精卵的移植；嵌合体小鼠的获得，进一步与野生型小鼠交配，获得杂合子小鼠(首建鼠)；首建鼠(Founder)中重组DNA整合情况的检测；通过杂交繁育基因剔出小鼠种系。

本发明获得的首建鼠具有新的表型。一般生命指征正常，生长发育正常。由于iGb3S基因剔除动物模型的报道极少，其表型特征有待进一步观察。

采用如下方案交配建系：对于雌性嵌合体小鼠(图7)则与正常雄鼠交配，选择周龄在10周，具有交配经历、身体健壮的C57BL小鼠与之交配。同居1周后开始检查受孕情况，如果发现怀孕即将雌鼠单独饲养，直至生产。如果为雄性嵌合体小鼠，则选择8周以上，健壮的雌鼠与之交配。每一只纯合子小鼠的后代单独标记，作为一个系对待。检测发现基因剔出能在后代中稳定遗传，每窝产仔数量与正常小鼠无异，一般能成功喂养，少有吃仔等母性不良现象。这些有利特性为下一步大规模繁殖建系打下了基础。

iGb3S的基因水平表型鉴定采用iGb3S mRNA的RT-PCR鉴定法。iGb3S的蛋白质水平表型鉴定采用alpha-Gal ELISA抑制法，利用其特异性抗体进行alpha-Gal抗原表达的检测。alpha-Gal抗原的表达由alpha-GT(GGTA1)和iGb3S调控。由于iGb3S是催化合成alpha-Gal抗原的基因之一，iGb3S基因表达的缺失将会导致alpha-Gal抗原表达的减少。alpha-Gal ELISA抑制法采用alpha-Gal抗原的特异性抗体M86，先用M86与组织中的alpha-Gal抗原反应，再进行离心分离未反应的剩余抗体；将剩余抗体通过alpha-Gal/BSA固相抗原包被96孔板进行测定，以此计算与组织反应的alpha-Gal抗原的表达量。iGb3S基因剔除动物的生命周期与野生型动物无显著差异，未见生命周期不同的报道。本发明中，首建鼠的生命周期未见缩短现象，且一般状态正常。

本发明涉及制作基因敲除动物模型的方法，以及该动物模型在多种生物源性材料(动物源性、取自人体的)、组织或器官的免疫学研究、免疫排斥反应及其机理的研究、临床前安全性评价(如免疫学评价、植入实验等)中的用途；以及由该模型动物衍生出来的细胞、组织、器官及胚胎及其在上述领域中的用途。

本动物模型被人为地剔出了iGb3S基因的功能性催化区第5外显子。目前，没有人研究用来作为动物源性生物材料安全性评价和质量控制的一种工具和方法；国内还没有具有自主知识产权的iGb3S基因敲除小鼠，国内无法得到相关的模型动物；除此之外，还有许多研究利用α-Gal能够诱导人体超急性免疫反应的特性将其用于肿瘤的免疫治疗，自体肿瘤疫苗：将自体肿瘤细胞，如血液肿瘤细胞、固体肿瘤细胞膜，与神经氨酸酐酶、尿嘧啶核苷二磷酸半乳糖和重组α-1.3GT共培养。本发明利用同源重组技术以及胚胎干细胞技术构建稳定遗传的iGb3S基因敲除小鼠，用于动物组织Gal抗原相关的免疫学研究和免疫排斥机理的研究；动物源性生物材料的免疫毒理学研究、再生修复医学研究；同时还可用于癌症治疗的免疫学研究。

说明书附图：

图1为iGb3S基因打靶位点示意图，标出了与全基因拼接相关的酶切位点和重组验证用探针的位点；

图2为背景技术中文献报道打靶位点示意图；

图3为打靶载体pDTA-iGb3S-A-B-C酶切验证的电泳图；

图4为打靶载体pDTA-iGb3S-A-B-C1号质粒大提后酶切验证的电泳图；

图5为重组ES细胞经探针1的Southern Blot确认阳性克隆电泳图；

图6为重组ES细胞经探针2的Southern Blot确认阳性克隆电泳图；

图7为嵌合体小鼠照片；

图8为iGb3S(+/-)杂合子小鼠(首建鼠)照片；

图9为杂合子小鼠基因型鉴定高保真PCR引物设计图；

图10为iGb3S-WT-F/WT-R高保真PCR电泳图；

图11为Gb3S-Neo-F/WT-R高保真PCR电泳图；2、3、7号为阳性克隆；

图12为iGb3S(-/-)纯合子小鼠照片；

图13为纯合子小鼠基因型鉴定高保真PCR扩增基因片段的电泳图；

图14为Southern blot筛选策略的示意图；

图15为基因组DNA经5’Probe的Southern Blot图；

图16为基因组DNA经3’Probe的Southern Blot图；

图17为iGB3S mRNA的RT-PCR检测结果图；

图18为本发明制作基因敲除动物模型的流程示意图。

本发明的具体实施方式仅限于进一步解释和说明本发明，并不对本发明的内容构成限制。

具体实施方式

实施例1

1、打靶载体的构建

1.1从正常C57BL/6J小鼠分离基因组DNA，然后采用PCR方法分别扩增第5外显子5’端C1(586bp)、A(547bp)和3’端B(486bp)、C2(585bp)片段，A和B片段分别位于外显子5催化功能区的5`端和3`端，C1和C2片段分别位于A片段的5`端和B片段的3`端。

打靶位点示意图如图1所示：基因序列选自C57BL/6J小鼠第4染色体基因组DNA(GRCm38.p1 C57BL/6J，NCBI Reference Sequence:NC_000070.6)。剔除基因部分位于外显子5，其长度为第5外显子催化区全长687bp加上5`(上游)端的255bp，全部长度为942bp。本发明所用打靶载体长度为25.2kb(图1-A)，含有5`(上游)同源臂(8.3kb)、NeoR-PA(7.343bp)、3`(下游)同源臂(9.1kb)。

克隆A片段的引物序列如SEQ NO ID:2和SEQ NO ID:3所示；

SEQ NO ID:2的核苷酸序列为：CGATGGTACCGATATCACAGAATCTTTCTCTGTTTTC；

SEQ NO ID:3的核苷酸序列为：CGATGAATTCCATATGCAGGGTTTCTCTGTGTAGCC；

扩增体系和条件如表1所示：

表1：

克隆B片段的引物序列如SEQ NO ID:4和SEQ NO ID:5所示；

SEQ NO ID:4的核苷酸序列为：CGATGGATCCCATATGCAGCCCTTCCCTGGCCAAGC

SEQ NO ID:5的核苷酸序列为：CGATGCGGCCGCGATATCCTGGTCACAGGAATGGCTTCA

扩增体系和条件如表2所示：

表2：

其中克隆片段A和片段B的引物如表3所示：

表3：

克隆C1片段的引物序列如SEQ NO ID:6和SEQ NO ID:7所示；

SEQ NO ID:6的核苷酸序列为：CGATCTCGAGGTGGATGTCTCAGTGTGCGAA

SEQ NO ID:7的核苷酸序列为：TACCGCAGACGGTGGATATCATTGACAGTCACTGAGCAA

扩增体系和条件如表4所示：

表4：

克隆C2片段的引物序列如SEQ NO ID:8和SEQ NO ID:9所示；

SEQ NO ID:8的核苷酸序列为：TTGCTCAGTGACTGTCAATGATATCCACCGTCTGCGGTA

SEQ NO ID:9的核苷酸序列为：CGATGCGGCCGCCTATCGAGTGGTTATTCTCAGGG

扩增体系和条件如图5所示：

表5：

其中克隆片段C1和C2的引物如表6所示：

表6：

1.2连接到pBlunt载体：

1.2.1将酶切鉴定、测序正确的A和B片段依次连接到pL452载体，得到pL452-iGb3S-A-B：

通过酶切连接方法将A片段连接到pL452载体得到pL452-iGb3S-A，然后再通过酶切连接的方法将B片段连接到pL452-iGb3S-A上得到pL452-iGb3S-A-B。

1.2.2通过Overlap PCR将测序正确的C1、C2片段融合(1134bp)连接到pDTA-Down载体上：

C1和C2片段通过Overlap PCR得到C片段(1134bp)，C片段连接到pBlunt载体测序正确后，通过酶切连接的方法连接到pDTA-down载体上得到pDTA-Down-iGb3S-C。

1.2.3将连接正确的pL452-iGb3S-A-B用EcoRV酶切，pL452-AB切出2880bp、2885bp两条带，回收目的片段A-NeoR-B。

在A片段的正向引物和B片段的反向引物上添加有EcoRV酶切位点，所以pL452-AB可以用EcoRV将A-Neo-B片段切下来。

1.3将目的片段A-NeoR-B电转入含pBCTG的BAC菌进行重组：

将切下来的A-Neo-B片段回收纯化，然后通过电转化的方法转入到含pBCTG的BAC菌里面。

1.4菌落PCR检测A-NeoR-B片段重组BAC，鉴定扩增条带正确：

在A和B片段两端设计合适的检测引物，检测引物的序列如表7所示；通过AB两端的PCR来验证重组是否正确。

表7：

1.5pDTA-down-iGb3S-C的线性化处理：

EcoRV酶切处理pDTA-Down-iGb3S-C，使pDTA-down-iGb3S-C线性化，回收目的条带，然后再通过电转化的方法将线性化条带转入到重组了NeoR的iGb3S的BAC菌里。

1.6pDTA-iGb3S-C拯救iGb3S-NeoR BAC(AmpR+KanR)：

线性化的pDTA-down-iGb3S-C电转到重组了NeoR的iGb3S的BAC菌里面后，通过同源重组的方式将A-Neo-B片段拯救到pDTA-down-C上。

1.7对C拯救后的菌落进行PCR检测鉴定，将重组正确克隆进行扩增，在C1和C2两端设计合适的检测引物，通过PCR来验证重组是否正确，将重组正确的菌落摇菌过夜培养。

检测引物的序列如表8所示：

表8：

经转化Stbl3感受态细胞后，酶切验证如图3所示。

酶切检测pDTA-iGb3S-A-B-C：

BgllI：740bp+2354bp+4252bp+5015bp+12389bp；

NheI：90bp+930bp+9890bp+13840bp；

SpeI：2850bp+3880bp+7110bp+10910bp。

1.8酶切正确克隆1号和2号经测序鉴定，1号质粒经测序确认序列正确。

1号样本大提后酶切检测pDTA-iGb3S-A-B-C结果见图4。

打靶载体pDTA-iGb3S-A-B-C1号质粒大提后酶切检测：

BgllI：740bp+2354bp+4252bp+5015bp+12389bp；

NheI：90bp+930bp+9890bp+13840bp；

SpeI：2850bp+3880bp+7110bp+10910bp。

将酶切正确的克隆用于酶切线性化电转胚胎干细胞(AscI)。

2、胚胎细胞的重组

将线性化重组DNA通过电转方式同源重组进胚胎干细胞，再通过G418筛选，筛除掉未重组的胚胎干细胞，挑取剩下的克隆，进行PCR和Southern筛选，最后选取正确的克隆进行注射。

详细步骤为：将1号样本大提质粒pDTA-iGb3S-A-B-C线性化后转染C57BL/6ES细胞，通过G418筛选，挑选200个克隆用探针1进行筛选，探针的设计见图1，序列见表9。

探针1(Probe1)位于5`端同源臂的外侧，在A片段3’端引入了NdeI的酶切位点，因此，野生型和突变型酶切后探针标记的大小是不同的，分别是25.2kb和11.3kb，以此来确定是否重组成功，并确认重组是特异的，而非随机插入。

用探针1进行重组ES细胞的阳性克隆筛选。探针1(Probe1)位于5`端同源臂的外侧，在A片段3’端引入了NdeI的酶切位点，因此，野生型和突变型酶切后探针标记的大小分别是25.2kb和11.3kb，以此来确定是否重组成功，并确认重组是特异的，而非随机插入。如图5所示，共获得了12个阳性克隆。

将挑选的阳性克隆再用探针2进行复筛。探针2(Probe2)位于3`端同源臂的内侧，野生型和突变型酶切后探针2标记的大小分别是25.2kb和12.3kb。结果见图6，获得了11个阳性克隆，这些阳性克隆将用于鼠胚的囊胚注射。

探针1和探针2的核苷酸序列如表9所示：

表9：

3、重组胚胎细胞的囊胚注射

通过囊胚的显微注射(Microinjection)生产基因敲除动物，其主要过程包括以下步骤：

3.1制备不育雄鼠和假孕雌鼠

3.1.1麻醉准备：选择7周龄雄鼠称重并经腹腔注射0.7％戊巴比妥钠溶液。

3.1.2准备手术器械：眼科镊3把，眼科剪1把，剪毛剪1把，酒精灯，酒精喷壶一个，三棱针，缝合线，消毒滤纸片(直径15cm左右)。

3.1.3雄鼠结扎：将已麻醉雄鼠腹部距生殖器2cm处剪毛，70％酒精棉擦拭消毒后，分别开口皮肤层和肌肉层，用眼科镊夹住睾丸脂肪团拉出睾丸、附睾、输精管，选取输精管中间部分，用缝合线将输精管及毛细血管扎紧，间隔1cm处再次扎紧，用简单将缝合线扎紧的中间部分剪掉，一侧的结扎手术完成，用同样方式再结扎另外一侧，两侧完成用镊子夹住脂肪团将其送回腹腔，缝合肌肉层和皮肤层，复苏后单笼饲养。

3.1.4术后复苏：结扎完成饲养两周后，用6周龄发情雌鼠合笼交配，翌日检栓后单独饲养，15日后确认妊娠与否，检查结扎成功与否。

假孕雌鼠准备：

3.1.5发情雌鼠挑选：挑选发情前期和发情期雌鼠，组织表征为阴道裂缝，组织为淡红色到粉色，较湿润，在阴道背唇和腹唇上都出现许多纵横的皱纹。

3.1.6与结扎雄鼠交配：将已选发情雌鼠1:1结扎雄鼠交配，次日检栓，单笼饲养备用，见栓当天为0.5天，输卵管移植用见栓0.5天假孕鼠，子宫移植用见栓2.5天假孕鼠。

3.2超排卵

3.2.1激素准备：用0.9％生理盐水稀释孕马血清(PMSG)和人绒毛膜促性激素(hCG)，国产激素稀释为10IU/0.1ml，进口激素稀释为5IU/0.1ml。

3.2.2激素注射：准备4-6周龄雌鼠，间隔48小时，每只分别腹腔注射PMSG和hCG10IU。hCG注射后与同品系性成熟雄鼠合笼交配，次日检栓，单笼饲养备用，见栓当日为0.5天，3.5天后处死雌鼠采集囊胚。

3.3采集囊胚

3.3.1培养液准备：M2培养液放到37℃水浴锅温育，KSOM培养液和1mg/ml透明质酸酶在超净工作台内做成培养液滴，放到37℃二氧化碳培养箱温育备用。

3.3.2解剖动物：颈椎脱臼处死见栓3.5天雌鼠，70％酒精棉消毒擦拭腹部后，打开腹腔，取其子宫，放到已温育有1ml M2培养液的35mm培养皿中。

3.3.3采集胚胎：取原核胚是将输卵管放到300μl透明质酸酶液滴中，在实体显微镜下，找到输卵管膨大部，用1ml注射器针头将其刺破，释放卵母细胞团，3～4分钟后在显微镜下观察，卵母细胞周围的颗粒细胞已消化，就可以收集卵母细胞，洗涤干净后放到KSOM培养液滴，放到二氧化碳培养箱中备用。取囊胚是将子宫放到60mm培养皿中，用1ml注射器吸取M2培养液，在实体显微镜下，将注射器针头插入子宫一端，冲洗子宫，并在镜下收集囊胚，洗涤干净后放到KSOM培养液滴，放到二氧化碳培养箱中培养备用。

3.4将重组的胚胎细胞导入囊胚

囊胚显微注射：用M2培养液在60mm培养皿上做椭圆形注射滴，覆盖石蜡油，将培养皿放到显微操作仪镜下，取30个囊胚放到注射滴中，再吸取干细胞加入注射滴中，调整显微镜物镜，在合适倍数下，调整注射针，吸入50～100个干细胞，在镜下找到囊胚，操作持卵针，固定囊胚，操作注射针将10～15个干细胞注射到1个囊胚腔中，完成注射。一批囊胚注射完成后放回KSOM培养液滴中，于二氧化碳培养箱培养，恢复30分钟后挑选好的囊胚进行子宫移植。

3.5受精卵的移植

囊胚移植：假孕鼠背部距尾部3～4cm的背中线处被毛，用70％酒精棉擦拭消毒后剪开皮肤层，再找到卵巢部位，剪开肌肉层，将卵巢、输卵管和子宫取出，用止血钳固定，在实体显微镜下吸取8个囊胚，同时将已经固定好卵巢、输卵管的假孕鼠放到显微镜下，找到子宫和输卵管连接处血管少的部位，用1ml注射器针头刺一小口，将有囊胚的吸卵管沿口插入，把胚胎吹入，用同样方式移植另一侧。术后缝合皮肤层，动物苏醒后单笼饲养，等待注入重组胚胎细胞的受精卵着床，母鼠的受孕。

4、交配、繁育与建系

将上述获得的ES细胞(C57BL/6ES细胞iGb3S^-/-)阳性克隆经显微注射技术注入C57BL/6小鼠(黑色)的受精卵，再移植入代孕母鼠(Balb/C，白色)的子宫内，获得嵌合体小鼠(黑色花斑)。嵌合鼠确认：在移植17日后产子，记录产子数量，在10～15天据毛色确认是否有嵌合鼠。胚胎细胞来源于C57BL/6，黑色；假孕鼠Balb/C是白色的，所以得到黑色斑点的花斑嵌合体小鼠，照片如图7所示；通过杂交繁育基因剔出小鼠种系。

采用如下方案交配建系：对于雌性嵌合体小鼠则与野生型雄鼠交配，选择周龄在10周，具有交配经历、身体健壮的C57BL/6小鼠与之交配。同居1周后开始检查妊娠情况，如果发现怀孕即将雌鼠单独饲养，直至生产。如果为雄性嵌合体小鼠，则选择8周以上，健壮的野生型C57BL/6雌鼠与之交配，获得F1代杂合子小鼠(首建鼠)，照片如图8所示。F1代杂合子小鼠再与野生型C57BL/6交配，筛选纯合子小鼠。每一只纯合子小鼠的后代单独标记，作为一个系对待。

5、基因型鉴定

5.1首建鼠(Founder)及纯合子小鼠中目的重组DNA整合情况的检测：

从基因剔除动物首建鼠(杂合子小鼠，图8)的尾尖组织提取DNA，通过高保真PCR扩增基因的部分片段进行基因型的鉴定。用于基因型鉴定的引物设计见图9，引物序列见表10，其PCR条件见表11。

表10.引物序列

表11.PCR条件：

PCR扩增基因片段的电泳图如图10所示，图10为iGb3S-WT-F/WT-R高保真PCR电泳图；其中由iGb3S-WT-F/WT-R配对引物扩增的片段为173bp；

图11为Gb3S-Neo-F/WT-R高保真PCR电泳图；由iGb3S-Neo-F/WT-R配对引物扩增的片段为276bp，图11中显示获得3个杂合子克隆，2、3、7号为阳性克隆。

经多次繁殖，合计获得21只杂合子小鼠，其中20只用于纯合子小鼠的育种繁育。iGb3S(-/-)纯合子小鼠照片如图12所示，将F1杂合子小鼠和F1杂合子小鼠交配，获得F2纯合子小鼠。纯合子小鼠出生后未见明显的生理状况异常，生长、发育以及摄食、活动等均正常。

纯合子的基因型鉴定采用高保真PCR扩增法(其引物和PCR条件同表10和表11)，其PCR扩增基因片段的电泳图如图13所示。

纯合子基因型鉴定后，用探针1和探针2进行Southern Blot鉴定，确认敲除基因的正确性和稳定性。Southern blot筛选策略的示意图如图14，其中用短线表示了出5’Probe和3’Probe的位点。所示探针1和探针2的引物设计同表9；在5’端和3’端loxP位点外侧分别引入两端的southern酶切位点，分别用NdeI消化酶切，通过5’Probe和3’Probe的southern blot检测iGb3S基因敲除纯合子小鼠(Mut/Mut)只会产生突变型条带，杂合子小鼠(Mut/WT)会产生野生型和突变型条带，而iGb3S基因未敲除的野生型小鼠(WT/WT)只会产生野生型条带。各条带的大小见表12。

表12.Southern blot检测基因片段的大小

	探针	WT/WT	Mut/WT	Mut/Mut
					Ndel	5’	25.2kb	25.2kb/11.3kb	11.3kb
Ndel	3’	25.2kb	25.2kb/12.3kb	12.3kb

Southern Blot合计检测6只小鼠(纯合子、杂合子和野生型各2只)，提取iGb3S基因敲除纯合子小鼠(Mut/Mut)、杂合子小鼠(Mut/WT)以及野生型小鼠(WT/WT)鼠尾基因组DNA。其Southern Blot鉴定结果分别如见图15(5’Probe)和图16(3’Probe)所示，证实了纯合子小鼠已经获得了稳定的遗传。

6、表型鉴定

本发明获得的iGB3S基因敲除小鼠具有新的表型。一般生命指征正常，生长发育正常。由于iGb3S基因剔除动物模型的报道极少，其表型特征有待进一步观察。

iGb3S的基因表达水平表型鉴定采用iGb3S mRNA的RT-PCR鉴定法。取纯合子小鼠的多种脏器组织，包括肝、肺、肾、脾、心脏，进行mRNA的表达测定。RT-PCR所用引物见表13；其检测结果见图17，iGb3S基因剔出的纯合子小鼠完全失去了iGb3S mRNA的表达。

iGb3S的蛋白质表达水平表型鉴定采用alpha-Gal ELISA抑制法进行alpha-Gal抗原表达的检测。alpha-Gal抗原的表达由alpha-GT(GGTA1)和iGb3S调控，由于iGb3S是催化合成alpha-Gal抗原的基因之一，iGb3S基因表达的缺失将会导致alpha-Gal抗原表达的减少。alpha-Gal ELISA抑制法采用alpha-Gal抗原的特异性抗体M86，先用M86与组织中的alpha-Gal抗原进行反应，再进行离心分离未反应的剩余抗体；将剩余抗体通过alpha-Gal/BSA固相抗原包被96孔板进行测定，以此计算与组织反应的alpha-Gal抗原的表达量。其检测结果表14，iGb3S基因剔出纯合子小鼠的alpha-Gal抗原的表达量较野生型小鼠(WT)相比都有不同程度的减少。

表13：RT-PCR引物序列

表14：alpha-Gal抗原的表达量检测结果

7、基因剔出动物的生命周期

iGb3S基因剔除动物的生命周期与野生型动物无显著差异，未见生命周期不同的报道。本发明中iGb3S基因剔除小鼠的生命周期未见缩短现象，且一般状态正常。

Claims (10)

1.一种制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建打靶载体：从基因组DNA中分离iGb3S基因，经长链PCR方法扩增获得同源臂，与抗生素耐药基因复合构建打靶载体；

(2)将打靶载体转入到胚胎细胞，将重组胚胎细胞注入代孕动物胚胎中，移植到假孕动物体内，与正常动物交配；

(3)对得到的嵌合体动物进行基因型验证，筛选基因成功敲除的阳性基因敲除的嵌合体动物；进一步与野生型动物交配，获得F1代杂合子；F1代杂合子之间交配后获得两条染色体均被剔出的纯合子动物，建系获得基因敲除动物种群。

2.根据权利要求1所述的制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的方法，其特征在于，所述的非人哺乳动物为小鼠，进一步优选C57BL小鼠。

3.根据权利要求1所述的制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的方法，其特征在于，所述的iGb3S基因敲除为敲除iGb3S基因的功能性催化区第五外显子，其核苷酸序列如SEQ NO ID:1所示。

4.根据权利要求1所述的制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的方法，其特征在于，所述打靶载体含有5`同源臂、耐药抗生素基因NeoR-PA和3`同源臂，用NeoR-PA取代第5外显子。

5.根据权利要求1所述的制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物、子代、胚胎或细胞的方法，其特征在于，耐药抗生素基因NeoR-PA5`端和3`端的同源臂序列取自小鼠第四条染色体上iGb3S基因第五外显子的5`端和3`端，分别为8.3kb和9.1kb。

6.根据权利要求2所述的制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的方法，其特征在于，构建打靶载体的步骤为：

(1)从正常C57BL/6J小鼠分离基因组DNA，扩增第5外显子5’端C1片段、A片段和3’端B片段、C2片段，分别连接到pBlunt载体；

(2)将酶切鉴定、测序正确的A和B片段依次连接到pL452载体得到pL452-iGb3S-A-B，同时，通过Overlap PCR将测序正确的C1、C2片段融合后连接到pDTA-Down载体上；

(3)将连接正确的pL452-iGb3S-A-B用EcoRV酶切，pL452-AB切出2880bp、2885bp两条带，回收目的片段A-NeoR-B，电转含pBCTG的BAC菌进行重组；菌落PCR检测A-NeoR-B片段重组BAC，鉴定扩增条带正确；

(4)pDTA-down-iGb3S-C的线性化处理，即EcoRV酶切处理pDTA-Down-iGb3S-C，回收目的条带，电转已经重组了NeoR的iGb3S的BAC菌；pDTA-iGb3S-C拯救iGb3S-NeoRBAC(AmpR+KanR)；对C拯救后的菌落进行PCR检测鉴定，将重组正确克隆进行扩增，经Stbl3纯化后酶切验证。

7.根据权利要求1所述的制备iGb3S基因敲除的非哺乳动物、子代、胚胎或细胞的方法，其特征在于，步骤(2)包括以下步骤：制备不育雄鼠和假孕母鼠；超排卵；收获受精卵；目的DNA的制备；将目的DNA导入受精卵；受精卵的移植；首建鼠中目的DNA整合情况的检测；通过杂交繁育基因剔出小鼠种系。

8.一种来自权利要求1所述的基因敲除动物的精子、卵细胞、受精卵、胚胎、子代、组织或细胞。

9.一种如权利要求1所述的基因敲除的非人哺乳动物或如权利要求8所述的精子、卵细胞、受精卵、胚胎、子代、组织或细胞在生物源性材料中的应用；所述生物源性材料包括动物源性或取自人体的，所述的动物源性生物材料不包括灵长类动物；所述的动物源性生物材料的种类包括取自动物体内的各种组织、脏器及其衍生物，或者由组织或脏器制备的各种材料；所述的灵长类动物优选古世纪猴、狒狒。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的应用包括在免疫学研究、免疫毒理学、免疫排斥反应及其机理的研究、安全性评价中的应用，所述的安全性评价包括生物源性材料在临床试验前的安全性评价。