CN116144831B - 用于鉴定金耳单核体交配型的引物组合及鉴定方法 - Google Patents

用于鉴定金耳单核体交配型的引物组合及鉴定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116144831B
CN116144831B CN202310410540.6A CN202310410540A CN116144831B CN 116144831 B CN116144831 B CN 116144831B CN 202310410540 A CN202310410540 A CN 202310410540A CN 116144831 B CN116144831 B CN 116144831B
Authority
CN
China
Prior art keywords
primers
pair
mating type
primer
mating
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202310410540.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116144831A (zh
Inventor
沈真辉
李荣春
曹瑶
杨林雷
李梦杰
罗祥英
郭晶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yunnan Mushroom World Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Yunnan Mushroom World Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yunnan Mushroom World Biotechnology Co ltd filed Critical Yunnan Mushroom World Biotechnology Co ltd
Priority to CN202310410540.6A priority Critical patent/CN116144831B/zh
Publication of CN116144831A publication Critical patent/CN116144831A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116144831B publication Critical patent/CN116144831B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

用于鉴定金耳单核体交配型的引物组合及鉴定方法，所述引物组合包括如下四对引物；其中，第一对引物序列为：上游引物：5’‑CGTATCGTTTGACCACCTTG‑3’；下游引物：5’‑TCGCCCGCTTCTACTCTAT‑3’；第二对引物序列为：上游引物：5’‑CGATGTTGCCGCTTTATG‑3’；下游引物：5’‑TCGCCCGCTTCTACTCTAT‑3’；第三对引物序列为：上游引物：5’‑AACGACAATGAGGGCGAT‑3’；下游引物：5’‑TCGTCAAGCCAACCTTTC‑3’；第四对引物序列为：上游引物：5’‑AACGACAATGAGGGCGAT‑3’；下游引物：5’‑CGGTGAGGACAATCAAAGC‑3’。本发明的引物组合及鉴定方法相对于传统鉴定方法具有耗时短，准确性高，重复性好，操作简单的优点，大大减少了工作强度，有利于提高育种效率。

Description

用于鉴定金耳单核体交配型的引物组合及鉴定方法
技术领域
本发明属于金耳分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种用于鉴定金耳单核体交配型的引物组合及其应用。
背景技术
金耳子实体是由金耳(Naematelia aurantialba(Bandoni&M.Zang)Millanes&Wedin)与毛韧革菌(Sterem hirsutum(Willd.)Fr.)共同形成的金黄色脑状子实体。金耳子实体属于异质复合体，其隶属于耳包革科(Naemateliaceae)、耳包革属(NaemateliaFr.)(见参考文献1、2)。金耳属于四级性异宗结合担子菌，在减数分裂过程中，能够产生四种不同交配型的有性孢子，即单核体；在A位点和B位点中交配型基因的共同作用下，可亲和的金耳单核体芽孢配对后形成双核体，再与毛韧革菌相结合发育形成金耳子实体。所以单核体的交配型鉴定是金耳遗传育种研究的基础性工作之一。目前，采用分子标记鉴定单核体交配型的研究主要集中在蛹虫草(Cordyceps millitaris)(见参考文献3)，花脸香蘑(Lepistasordida)(见参考文献4)，香菇(Lentinus edodes)(见参考文献5、6、7)及灰树花(Grifolafrondosa)(见参考文献8)等常见食用菌中，而关于金耳单核体交配型鉴定的研究未见报道。
金耳为二型态真菌，在环境的影响下其存在酵母型及菌丝型两种型态，金耳在常规食用菌培养基中(如：PDA、CYM及马铃薯综合培养基等)只能培养出酵母状芽孢菌落，而只有在特殊培养基(见参考文献9)中培养特定的时间才能形成细弱的金耳菌丝体，这导致了金耳单核菌株很难采用传统的交配型鉴定方法，造成在金耳杂交育种、新品种选育等方面带来很大的困难。因此，需要一种高效、快速、特异性强、准确性高、成本低、操作简单的检测金耳交配型的方法，以提高金耳的育种效率。
传统的交配型鉴定通常采用单核体两两交配后镜检观察锁状联合的方式进行,工作量大,耗时长且易产生人为误检。而以基因组DNA为基础的分子标记技术来鉴定单核体交配型，具有不受外界环境影响、检测快速简单、检测结果准确稳定和特异性强等优点。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种高效、快速、特异性强、准确性高、成本低、操作简单的用于鉴定金耳单核体交配型的引物组合，本发明还提供这种引物组合的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
用于鉴定金耳单核体交配型的引物组合，包括如下四对引物；其中，第一对引物序列为：上游引物序列，系列号1：5’-CGTATCGTTTGACCACCTTG-3’；下游引物序列，序列号2：5’-TCGCCCGCTTCTACTCTAT-3’；第二对引物序列为：上游引物序列，序列号3：5’-CGATGTTGCCGCTTTATG-3’；下游引物序列，序列号4：5’-TCGCCCGCTTCTACTCTAT-3’；第三对引物序列为：上游引物序列，序列号5：5’-AACGACAATGAGGGCGAT-3’；下游引物序列，序列号6：5’-TCGTCAAGCCAACCTTTC-3’；第四对引物序列为：上游引物序列，序列号7：5’-AACGACAATGAGGGCGAT-3’；下游引物序列，序列号8：5’-CGGTGAGGACAATCAAAGC-3’。
进一步地，所述四对引物是基于金耳转录组和基因组测序信息，筛选到金耳交配因子A和金耳交配因子B区域的基因序列，再根据SNP位点的差异而开发的交配型标记引物。
进一步地，所述第一对引物和第二对引物分别能够扩增金耳交配型基因A1和A2的核苷酸片段；所述第三对引物和第四对引物分别能够扩增金耳交配型基因B1和B2的核苷酸片段。
采用本发所述引物组合鉴定金耳单核体交配型的方法，是以样品基因组DNA为模板，分别使用第一对至第四对引物分别对样品基因组DNA进行PCR扩增以及凝胶电泳检测；第一对引物和第二对引物用于检测A交配型因子，第三对引物和第四对引物用于检测B交配型因子；若仅有第一对引物和第三对引物能够扩增出条带，则判断交配型为A1B1；若仅有第一对引物和第四对引物能够扩增出条带，则判断交配型为A1B2；若仅有第二对引物和第三对引物能够扩增出条带，则判断交配型为A2B1；若仅有第二对引物和第四对引物能够扩增出条带，则判断交配型为A2B2；若第一对引物至第四对引物均能扩增出条带，则判断交配型为A1A2B1B2的双核体。
进一步地，所述使用第一对至第四对引物分别对样品基因组DNA进行PCR扩增以及凝胶电泳检测，包括培养酵母状芽孢和对培养的样品基因组进行DNA提取，将金耳单核菌株转接到PDA培养基内，置于21℃～25℃恒温恒湿培养箱中避光培养4～6天；待金耳酵母状芽孢培养好后，利用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取金耳单核菌株DNA；PCR反应体系为：30μL体系，PCR Mix 17μL，10μmol/L的上游引物和下游引物各1μL，提取的金耳单核菌株DNA1μL，ddH2O10μL；PCR扩增的条件为：在94℃预变性5min，94℃变性30s，第一对引物和第二对引物的退火温度均为54℃，第三对引物和第四对引物的退火温度均为56℃，退火时间为60s，72℃延伸60s，35个循环，最后在72℃保温10min；将扩增后产物进行电泳检测，通过观察条带的有无来判定金耳单核体交配型。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明利用实验室测序的金耳转录组和基因组序列信息，应用生物信息学方法检测到A交配型位点基因和B交配型位点基因，并根据该位点上SNP位点差异的基因序列开发引物，最终得到了4对扩增条带清晰、稳定性高、特异性强的交配型标记引物组。
2、本发明的引物组合能扩增交配型基因A和交配型基因B的核苷酸片段，可快速鉴定出金耳的四种不同交配型，再根据检测出的交配型快速筛选具有亲和性的单核菌株进行两两杂交，可迅速、高效获得双核菌株，提高准确性，大量节省筛选时间，大大加快新品种选育过程。
3、本发明相对于传统鉴定方法具有耗时短，准确性高，重复性好，操作简单的优点，大大减少了工作强度，有利于提高育种效率。
4、本发明的引物组合既能够快速、高效鉴定金耳四种不同交配型的单核菌株，又能鉴定双核菌株及混杂的单核菌株，解决了二型态真菌金耳单核菌株(常以酵母状芽孢态存在)不能用传统显微镜观察方法检测其交配型的难题，避免了在金耳单核体芽孢组合配对时的盲目性和大量筛选可亲和菌株的工作，在金耳育种方面有很好的应用前景。
附图说明
图1为JSJ-X9菌株子实体形态；
图2为JSJ-X9菌株单核体芽孢于PDA生长情况；
图3为JSJ-X9菌株的孢子单核体交配型A因子扩增图谱(A1表示使用第一对引物的扩增结果；A2表示使用第二对引物扩增的结果)；
图4为JSJ-X9菌株编号2-23的孢子单核体交配型B因子扩增图谱(B1表示使用第一对引物的扩增结果；B2表示使用第二对引物扩增的结果)；
图5为JSJ-X9菌株双核体孢子4对引物扩增的结果图；
(A1表示使用第一对引物的扩增结果；A2表示使用第二对引物的扩增结果；B1表示使用第三对引物的扩增结果；B2表示使用第四对引物的扩增结果)；
图6为JSJ-X9菌株双核体在特殊培养基的菌丝生长情况；
图7为JSJ-X9菌株双核体特有的锁状联合结构显微镜检图(箭头所指为锁状联合)；
图8为JSJJ208菌株子实体形态；
图9为JSJJ208菌株编号2-22的孢子单核体交配型A因子扩增图谱(上：A1表示使用第一对引物的扩增结果；下：A2表示使用第二对引物扩增的结果)；
图10为JSJJ208菌株编号2-22的孢子单核体交配型B因子扩增图谱(上：B1表示使用第一对引物的扩增结果；下：B2表示使用第二对引物扩增的结果)；
注：图3-图5，图9和图10中M表示DNA分子量标记的条带大小从下到上分别为：100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp；编号1表示以H2O作为对照组。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
用于鉴定金耳单核体交配型的引物组合，包括如下四对引物；其中，第一对引物序列为：上游引物序列，系列号1：5’-CGTATCGTTTGACCACCTTG-3’；下游引物序列，序列号2：5’-TCGCCCGCTTCTACTCTAT-3’；第二对引物序列为：上游引物序列，序列号3：5’-CGATGTTGCCGCTTTATG-3’；下游引物序列，序列号4：5’-TCGCCCGCTTCTACTCTAT-3’；第三对引物序列为：上游引物序列，序列号5：5’-AACGACAATGAGGGCGAT-3’；下游引物序列，序列号6：5’-TCGTCAAGCCAACCTTTC-3’；第四对引物序列为：上游引物序列，序列号7：5’-AACGACAATGAGGGCGAT-3’；下游引物序列，序列号8：5’-CGGTGAGGACAATCAAAGC-3’。
本发明所述四对引物是基于金耳转录组和基因组测序信息，筛选到金耳交配因子A和金耳交配因子B区域的基因序列，再根据SNP位点的差异而开发的交配型标记引物。
所述第一对引物和第二对引物分别能够扩增金耳交配型基因A1和A2的核苷酸片段；所述第三对引物和第四对引物分别能够扩增金耳交配型基因B1和B2的核苷酸片段。
实施例1
本实施例提供鉴定图1所示的金耳JSJ-X9菌株(由云南菌视界生物科技有限公司提供，菌株保藏号：CGMCC No.20271)的单核体交配型的方法，步骤如下：
(1)芽孢培养：将获得金耳JSJ-X9菌株的22个孢子单核菌株转接至马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA的平板中，平板直径90cm，置于恒温恒湿培养箱，于21℃下避光静置培养。
(2)基因组DNA的制备：待芽孢培养6天后，JSJ-X9菌株单核体芽孢于PDA生长情况如图2所示。利用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取样品基因组DNA。真菌基因组DNA快速抽提试剂盒为生工生物工程(上海)股份有限公司生产。
(3)检测菌株的交配因子类型：将步骤(2)提取的DNA进行PCR扩增。PCR扩增体系为：30μL体系，PCR Mix 17μL，10μmol/L的上游引物和下游引物各1μL，提取的金耳单核菌株DNA 1μL，ddH2O 10μL。PCR反应条件：在94℃预变性5min，94℃变性30s，第一对引物和第二对引物的退火温度均为54℃，第三对引物和第四对引物的退火温度均为56℃，退火时间为60s，72℃延伸60s，35个循环，最后在72℃保温10min。PCR引物组的具体信息参照表1所示。表1中matAF1和matAF2分别表示第一对引物和第二对引物的正向引物，matAR表示第一对引物和第二对引物的反向引物，检测A1和A2因子的反向引物相同。matBF表示第三对引物和第四对引物的正向引物，matBR1和matBR2表示第三对引物和第四对引物的反向引物，检测B1和B2因子的正向引物相同。
表1.交配型引物详细信息列表
(4)电泳检测：将步骤(3)PCR扩增得到的产物经1.2％的琼脂糖凝胶电泳，电压120V，电泳40min，用凝胶成像系统观察是否有无条带，进而判定每个单核体的交配型。
若仅有第一对引物和第三对引物能够扩增出条带，则判断交配型为A1B1；若仅有第一对引物和第四对引物能够扩增出条带，则判断交配型为A1B2；若仅有第二对引物和第三对引物能够扩增出条带，则判断交配型为A2B1；若仅有第二对引物和第四对引物能够扩增出条带，则判断交配型为A2B2；若第一至第四引物均能扩增出条带，则判断交配型为A1A2B1B2的双核体。电泳图参照图3和图4所示，图3为JSJ-X9菌株的孢子单核体交配型A因子扩增图谱，其中A1表示使用第一对引物的扩增结果，A2表示使用第二对引物扩增的结果。图4为JSJ-X9菌株的孢子单核体交配型B因子扩增图谱，其中B1表示使用第一对引物的扩增结果，B2表示使用第二对引物扩增的结果。电泳结果得出：交配型为A1B1的菌株有2、11、12、17、21，交配型为A2B2的菌株3、4、9、10、16，交配型为A1B2的菌株有5、6、15、19、20，交配型为A2B1的菌株有7、8、13、14、18。而在编号22和23两个菌株使用四对引物均有扩增产物，具体分别使用四对引物扩增检测这两个菌株的A1，A2，B1和B2基因型，扩增产物部分电泳图参照图5。图5所示为JSJ-X9菌株双核体孢子4对引物扩增的结果电泳图，两个菌株的扩增结果电泳图相同。图5中，A1表示使用第一对引物的扩增结果，A2表示使用第二对引物的扩增结果，B1表示使用第三对引物的扩增结果，B2表示使用第四对引物的扩增结果。由图5可得这两个菌株均含有A1和A2、B1和B2基因型。进一步将双核体芽孢在特殊培养基中培养出图6所示地点双核体菌丝体。所述特殊培养基为中国专利CN114634880A公开的培养基，培养基的原料及质量为：金耳出菇包菌渣100g-200g、琼脂25g、磷酸二氢钾1.24g、硫酸镁0.71g、水1L。图6为双核体芽孢在特殊培养基培养10-12天后开始向周围长出细弱的白色菌丝情况，而单核体芽孢培养不能长出菌丝。随后进行双核体菌丝显微镜检确认，镜检结果见图7所示。图7中，箭头所示为双核体特有的锁状联合现象，而单核体没有这个结构。因此，判断这两个菌株均为双核体菌株。
为了进一步验证本发明方法交配型鉴定结果的准确性，从每种交配型的单核体群体中随机选取4个菌株配成可亲和的组合一对一进行杂交，在特殊培养基培养出菌丝体后，显微镜镜检结果为，8对杂交组合均有锁状联合，说明配对的两个单核体的交配型可亲和，进而表明本发明方法交配型鉴定结果完全准确。
为了进一步验证本发明方法交配型鉴定结果的准确性，将A1B1的1个单核体和5个A2B2交配型的单核体进行交配，将2个A1B2和3个A2B1交配型的单核体配成完全双列杂交，在特殊培养基培养出菌丝体后，显微镜观察结果显示，11对杂交组合均有锁状联合现象，即配对的两个单核体的交配型可亲和，表明本发明方法交配型鉴定结果完全准确。
实施例2
本实施例提供了鉴定图8所示的金耳JSJJ208菌株的单核体交配型的方法。金耳JSJJ208菌株由云南菌视界生物科技有限公司提供，已实现工厂化栽培并上市销售(见参考文献10)。鉴定方法如下：
(1)芽孢培养：将获得金耳JSJJ208菌株的20个孢子单核菌株转接至马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA的平板中，平板直径90cm，置于恒温恒湿保温箱中，于22℃下避光静置培养。
(2)基因组DNA的制备：待芽孢培养5天后，利用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司生产)提取基因组DNA。
(3)检测菌株的交配因子类型：将步骤(2)提取的DNA进行PCR扩增。PCR扩增体系为：30μL体系，PCR Mix 17μL，10μmol/L的上游引物和下游引物各1μL，提取的金耳单核菌株DNA 1μL，ddH2O 10μL。
PCR反应条件：在94℃预变性5min，94℃变性30s，第一对引物和第二对引物的退火温度均为54℃，第三对引物和第四对引物的退火温度均为56℃，退火时间为60s，72℃延伸60s，35个循环，最后在72℃保温10min。PCR引物组的具体信息如上述表1所示。
(4)电泳检测：将步骤(3)PCR扩增得到的产物经1.2％的琼脂糖凝胶电泳，电压120V，电泳40min，用凝胶成像系统观察是否有无条带，进而判定每个单核体的交配型。
若仅有第一对引物和第三对引物能够扩增出条带，则判断交配型为A1B1；若仅有第一对引物和第四对引物能够扩增出条带，则判断交配型为A1B2；若仅有第二对引物和第三对引物能够扩增出条带，则判断交配型为A2B1；若仅有第二对引物和第四对引物能够扩增出条带，则判断交配型为A2B2；若第一至第四引物均能扩增出条带，则判断交配型为A1A2B1B2的双核体。
图9所示为JSJJ208菌株编号2-22的孢子单核体交配型A因子扩增图谱(电泳图)。图9中，A1表示使用第一对引物的扩增结果，A2表示使用第二对引物扩增的结果。图10所示为JSJJ208菌株编号2-22的孢子单核体交配型B因子扩增图谱(电泳图)。图10中，B1表示使用第一对引物的扩增结果，B2表示使用第二对引物扩增的结果。
由电泳结果得出：交配型为A1B1的菌株有2、3、4、5、6，交配型为A2B2的菌株18、19、20、21、22，交配型为A1B2的菌株有12、13、14、15、16，交配型为A2B1的菌株有7、8、9、10、11。
为了进一步验证本发明方法交配型鉴定结果的准确性，从每种交配型的单核体群体中随机选取4个菌株配成可亲和的组合一对一进行杂交，在特殊培养基培养出菌丝体后，显微镜镜检结果为，8对杂交组合均有锁状联合，说明配对的两个单核体的交配型可亲和，进而表明本发明方法交配型鉴定结果完全准确。
为了进一步验证本发明方法交配型鉴定结果的准确性，将A1B1的1个单核体和5个A2B2交配型的单核体进行交配，将2个A1B2和3个A2B1交配型的单核体配成完全双列杂交，在特殊培养基培养出菌丝体后，显微镜观察结果显示，11对杂交组合均有锁状联合现象，即配对的两个单核体的交配型可亲和，表明本发明方法交配型鉴定结果完全准确。
实施例3
本实施例提供了鉴定图8所示的金耳JSJJ208菌株(由云南菌视界生物科技有限公司提供)(见参考文献10)的单核体交配型的方法，方法如下：
(1)芽孢培养：将获得金耳JSJJ208菌株的100个孢子单核菌株转接至马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA的平板中，平板直径90cm，置于恒温恒湿保温箱中，于25℃下避光静置培养。
(2)基因组DNA的制备：待芽孢培养4天后，利用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司生产)提取基因组DNA。
(3)检测菌株的交配因子类型：将步骤(2)提取的DNA进行PCR扩增。PCR扩增体系为：30μL体系，PCR Mix 17μL，10μmol/L的上游引物和下游引物各1μL，提取的金耳单核菌株DNA 1μL，ddH2O 10μL。
PCR反应条件：在94℃预变性5min，94℃变性30s，第一对引物和第二对引物的退火温度均为54℃，第三对引物和第四对引物的退火温度均为56℃，退火时间为60s，72℃延伸60s，35个循环，最后在72℃保温10min。PCR引物组的具体信息如上述表1所示。
(4)电泳检测：将步骤(3)PCR扩增得到的产物经1.2％的琼脂糖凝胶电泳，电压120V，电泳40min，用凝胶成像系统观察是否有无条带，进而判定每个单核体的交配型。
若仅有第一对引物和第三对引物能够扩增出条带，则判断交配型为A1B1；若仅有第一对引物和第四对引物能够扩增出条带，则判断交配型为A1B2；若仅有第二对引物和第三对引物能够扩增出条带，则判断交配型为A2B1；若仅有第二对引物和第四对引物能够扩增出条带，则判断交配型为A2B2；若第一至第四引物均能扩增出条带，则判断交配型为A1A2B1B2的双核体。根据电泳统计结果得出：100个金耳孢子单核体菌株中四种交配型A1B1、A2B2、A1B2、A2B1的比例为26：30：21：23。
为了进一步验证本发明方法交配型鉴定结果的准确性，从每种交配型的单核体群体中随机选取10个菌株配成可亲和的组合一对一进行杂交，在特殊培养基培养出菌丝体后，显微镜镜检结果为，20对杂交组合均有锁状联合，说明配对的两个单核体的交配型可亲和，进而表明本发明方法交配型鉴定结果完全准确。
为了进一步验证本发明方法交配型鉴定结果的准确性，将A1B1的1个单核体和5个A2B2交配型的单核体进行交配，将3个A1B2和5个A2B1交配型的单核体配成完全双列杂交，在特殊培养基培养出菌丝体后，显微镜观察结果显示，20对杂交组合均有锁状联合现象，即配对的两个单核体的交配型可亲和，表明本发明方法交配型鉴定结果完全准确。
参考文献1：杨林雷,李荣春,曹瑶,等.金耳的学名及分类地位考证[J].食药用菌,2020,28(4):5；
参考文献2：田云霞,童江云,汪威,等.银耳属伴生现象研究进展[J].食用菌,2019,41(4):1-3；
参考文献3：一种快速区分蛹虫草交配型的分子检测方法，CN101649350B；
参考文献4：鉴别花脸香蘑原生质体单核体交配型的方法及其专用引物对SR-6×6，CN103233081A；
参考文献5：鉴定香菇申香215菌种及其实质性派生品种的单核体交配型的引物组,鉴定方法和应用，CN110029191B；
参考文献6：一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型A的InDel分子标记及方法，CN113151577B；
参考文献7：一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B的InDel分子标记及方法，CN113215302B；
参考文献8：一种用于鉴定灰树花菌种单核体交配型的InDel引物组合及鉴定方法，CN113981129B；
参考文献9：一种诱导金耳菌芽孢萌发菌丝的培养基及制备、培养方法,CN114634880A；
参考文献10：曹瑶,李荣春,杨林雷,李梦杰,罗祥英,沈真辉,闻绍锋.工厂化栽培金耳的氨基酸组成及蛋白质营养评价[J].食药用菌,2021,29(02):152-156。

Claims (3)

1.用于鉴定金耳单核体交配型的引物组合，其特征在于，包括如下四对引物；其中，第一对引物序列为：上游引物序列，SEQ ID NO:1：5’-CGTATCGTTTGACCACCTTG-3’；下游引物序列，SEQ ID NO:2：5’-TCGCCCGCTTCTACTCTAT-3’；第二对引物序列为：上游引物序列，SEQ IDNO:3：5’-CGATGTTGCCGCTTTATG-3’；下游引物序列，SEQ ID NO:4：5’-TCGCCCGCTTCTACTCTAT-3’；第三对引物序列为：上游引物序列，SEQ ID NO:5：5’-AACGACAATGAGGGCGAT-3’；下游引物序列，SEQ ID NO:6：5’-TCGTCAAGCCAACCTTTC-3’；第四对引物序列为：上游引物序列，SEQ ID NO:7：5’-AACGACAATGAGGGCGAT-3’；下游引物序列，SEQ ID NO:8：5’-CGGTGAGGACAATCAAAGC-3’。
2.采用权利要求1所述引物组合鉴定金耳单核体交配型的方法，其特征在于，以样品基因组DNA为模板，分别使用第一对至第四对引物分别对样品基因组DNA进行PCR扩增以及凝胶电泳检测；第一对引物和第二对引物用于检测A交配型因子，第三对引物和第四对引物用于检测B交配型因子；第一对引物和第二对引物分别能够扩增金耳交配型基因A1和A2的核苷酸片段；第三对引物和第四对引物分别能够扩增金耳交配型基因B1和B2的核苷酸片段；若仅有第一对引物和第三对引物能够扩增出条带，则判断交配型为A1B1；若仅有第一对引物和第四对引物能够扩增出条带，则判断交配型为A1B2；若仅有第二对引物和第三对引物能够扩增出条带，则判断交配型为A2B1；若仅有第二对引物和第四对引物能够扩增出条带，则判断交配型为A2B2；若第一对引物至第四对引物均能扩增出条带，则判断交配型为A1A2B1B2的双核体。
3.根据权利要求2所述鉴定金耳单核体交配型的方法，其特征在于，所述使用第一对至第四对引物分别对样品基因组DNA进行PCR扩增以及凝胶电泳检测，包括培养酵母状芽孢和对培养的样品基因组进行DNA提取，将金耳单核菌株转接到PDA培养基内，置于21℃～25℃恒温恒湿培养箱中避光培养4～6天；待金耳酵母状芽孢培养好后，利用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取金耳单核菌株DNA；PCR反应体系为：30μL体系，PCR Mix 17μL，10μmol/L的上游引物和下游引物各1μL，提取的金耳单核菌株DNA 1μL，ddH2O 10μL；PCR扩增的条件为：在94℃预变性5min，94℃变性30s，第一对引物和第二对引物的退火温度均为54℃，第三对引物和第四对引物的退火温度均为56℃，退火时间为60s，72℃延伸60s，35个循环，最后在72℃保温10min；将扩增后产物进行电泳检测，通过观察条带的有无来判定金耳单核体交配型。
CN202310410540.6A 2023-04-18 2023-04-18 用于鉴定金耳单核体交配型的引物组合及鉴定方法 Active CN116144831B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310410540.6A CN116144831B (zh) 2023-04-18 2023-04-18 用于鉴定金耳单核体交配型的引物组合及鉴定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310410540.6A CN116144831B (zh) 2023-04-18 2023-04-18 用于鉴定金耳单核体交配型的引物组合及鉴定方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116144831A CN116144831A (zh) 2023-05-23
CN116144831B true CN116144831B (zh) 2023-07-21

Family

ID=86360356

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310410540.6A Active CN116144831B (zh) 2023-04-18 2023-04-18 用于鉴定金耳单核体交配型的引物组合及鉴定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116144831B (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101314795B (zh) * 2008-07-16 2011-08-24 江苏同源堂生物工程有限公司 金耳与寄主真菌粗毛韧革菌的dna分子鉴定方法
CN101348833B (zh) * 2008-07-16 2010-12-01 江苏同源堂生物工程有限公司 金耳与粗毛韧革菌的its区序列组及用其鉴定金耳的方法
CN110029191B (zh) * 2019-05-31 2022-09-06 上海市农业科学院 鉴定香菇申香215菌种及其实质性派生品种的单核体交配型的引物组，鉴定方法和应用
CN112626249A (zh) * 2020-12-11 2021-04-09 云南菌视界生物科技有限公司 一种用于鉴定金耳菌x9菌株或包含x9菌株的金耳菌株的scar标记

Also Published As

Publication number Publication date
CN116144831A (zh) 2023-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Baker Brachmann et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR‐mediated gene disruption and other applications
CN110241249B (zh) 一种快速检测覆土中双孢蘑菇疣孢霉病病原菌的引物及方法
CN107151698B (zh) 鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型方法
CN107746815A (zh) 生产13r‑泪柏醚的重组酿酒酵母菌及其构建方法
Lu et al. PCR-based sensitive detection of medicinal fungi Hericium species from ribosomal internal transcribed spacer (ITS) sequences
Dalzoto et al. RAPD analyses of recombination processes in the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana
CN116144831B (zh) 用于鉴定金耳单核体交配型的引物组合及鉴定方法
Miyazaki et al. Specific PCR assays for the detection of Trichoderma harzianum causing green mold disease during mushroom cultivation
CN113215302B (zh) 一种用于鉴定香菇同一菌株不同单核体交配型B的InDel分子标记及方法
CN112063535B (zh) 一种真姬菇菌株
CN112126701B (zh) 用于鉴定硬毛粗盖孔菌原生质体单核体交配型的引物对、试剂盒及其应用
CN111394491B (zh) 蘑菇交配型分子标记及其在鉴定蘑菇交配型中的应用
CN112593003B (zh) 一种香菇申香16号菌株的InDel标记指纹图谱及其构建方法
CN111996128B (zh) 一种适合工厂化栽培的金针菇及其分子鉴定方法
Naumova et al. Molecular polymorphism of α-galactosidase MEL genes of Saccharomyces yeasts
Imoulan et al. New record of Beauveria pseudobassiana from Morocco
CN109628626B (zh) 鉴定梯棱羊肚菌的特异性引物、试剂盒、方法及其应用
CN113136447A (zh) 一种快速区分稻瘟病菌交配型的pcr-hrm检测方法
CN112646920A (zh) 一种秀珍菇同核体菌丝鉴定的InDel标记方法
CN116814830A (zh) 一种鉴定野生金针菇及其单孢菌株交配型的引物组、其应用和鉴定方法
CN104342378A (zh) 一种验证酿酒酵母Mbp1基因影响细胞形态的方法
Lu et al. Rapid and effective identification of A mating-type loci in Volvariella volvacea by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism
CN112593004B (zh) 一种香菇香杂26菌株的InDel标记指纹图谱及其构建方法
CN115725606A (zh) 一种花脸香蘑单核体交配型基因及其引物组合组和应用
CN112899388B (zh) 一种香菇香如菌株的InDel标记指纹图谱及其构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant