CN104342378A - 一种验证酿酒酵母Mbp1基因影响细胞形态的方法 - Google Patents

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Abstract

一种验证酿酒酵母Mbp1基因影响细胞形态的方法，包括如下步骤：首先通过PCR反应构建Mbp1基因敲除组件，然后将该敲除组件分别转化酿酒酵母两种配型的单倍体细胞，并通过单倍体复倍得到敲除Mbp1基因的酿酒酵母突变菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株LC5，最后根据突变菌株细胞形态的变化来验证Mbp1基因功能，若突变菌株细胞形态发生变化，则确定所述Mbp1基因与细胞形态相关。在分析细胞形态时，本发明采用流式细胞仪对细胞体积变化进行分析，具有快速简单、耗时短和可大批量操作的优点，对于快速鉴定和挖掘工业酿酒酵母菌株表型相关基因资源有重要意义。

Description

一种验证酿酒酵母Mbp1基因影响细胞形态的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体是一种验证酿酒酵母Mbp1基因影响细胞形态的方法。 
背景技术
根据用途及来源的不同，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)分为模式菌株和工业菌株，模式菌株的基因信息、遗传背景较为清楚，有多种遗传标记可以选择，一般只是作为实验室研究的对象或工具；工业菌株一般是从自然界中筛选获得的、对人们生活或生产有价值的菌株，其遗传信息不明了，没有遗传标记，对其进行改造或研究的难度较大。为了更好地应用工业酿酒酵母菌株，亟需鉴定和挖掘工业酿酒酵母菌株的基因的功能。 
酿酒酵母Mbp1基因编码Mbp1p蛋白，该蛋白与Swi6p组成转录复合物MBF。MBF是转录抑制因子[de Bruin R A M,Kalashnikova T I,Chahwan C,et al.Constraining G1-specific transcription to late G1phase:the MBF-associated corepressor Nrm1acts via negative feedback[J].Molecular cell,2006,23(4):483-496]。研究发现，白色念珠菌(Candida albicans)在敲除Swi4基因和Swi6基因后会形成假菌丝，但单独敲除Mbp1不会出现假菌丝 [Hussein B,Huang H,Glory A,et al.G1/S transcription factor orthologues Swi4p and Swi6p are important but not essential for cell proliferation and influence hyphal development in the fungal pathogen Candida albicans]。敲除酿酒酵母Mbp1基因对酿酒酵母细胞形态，如假菌丝形成是否有影响尚无报道。 
基因敲除是指一种遗传工程基因修饰技术，针对某个感兴趣的遗传基因，通过一定的基因改造过程，令特定的基因功能丧失，并研究可能进一步对相关生命现象造成的影响，进而推测该基因的生物学功能。目前构建基因敲除组件常用的方法是融合PCR。融合PCR需要分别扩增出目标基因特定位点的上下游同源臂以及选择性标记基因，然后再通过一步或两步PCR反应才获得基因敲除组件。融合PCR方法不仅费时费力，且融合效率低。 
酿酒酵母的细胞有两种生活形态，单倍体和二倍体。单倍体的生活史较简单，通过有丝分裂繁殖。在环境压力较大时通常会死亡。二倍体是酵母的优势形态，可以通过简单的有丝分裂繁殖，但在外界条件不佳时能进入减数分裂，生成一系列单倍体的孢子。单倍体的交配 类型有两种，即a型和α型，这两种单倍体可以交配，重新形成二倍体。单倍体酵母是a型还是α型，由单个基因座MAT所决定。MAT有一对等位基因MATa和MATα，它们的片段大小不一样，根据片段大小即可验证单倍体酵母是属于a型还是α型。直接对二倍体菌株进行基因改造，得到的只是显性突变，隐性突变会被漏掉。所以最好是先制备单倍体，对单倍体进行改造，再将单倍体突变子通过有性交配恢复为二倍体，从而获得二倍体突变株。 
现有技术中，通常采用光学显微镜分析细胞体积，该方法繁琐、需要用肉眼观察、容易产生误差，不利于批量分析。 
发明内容
为了快速挖掘工业酿酒酵母菌株的基因资源，本发明提供一种验证酿酒酵母Mbp1基因影响细胞形态的方法。本方法敲除单倍体的Mbp1基因后进行单倍体复性，得到敲除Mbp1基因的二倍体突变菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株LC5，通过酿酒酵母细胞形态的变化来判断Mbp1基因是否与细胞形态相关。在分析细胞形态时，为了解决采用光学显微镜分析细胞体积存在的繁琐、容易产生误差的问题，本发明采用流式细胞仪对细胞体积变化进行分析，当细胞流通过流式细胞仪时，流式细胞仪发出的激光照射细胞而发生散射，前向角散射(FSC)光与细胞的体积大小有关，并且FSC的强度与细胞大小成正比。该方法具有快速简单、耗时短和可大批量操作的优点。本发明验证了Mbp1基因影响酿酒酵母细胞形态。证实了只敲除Mbp1基因的酿酒酵母会形成假菌丝，而现有技术中发现只敲除Mbp1基因的白色念珠菌不会形成假菌丝。 
本发明构建敲除组件时，在引物中引入与Mbp1基因上下游同源以及与选择性标记基因互补的序列，即正向引物：与Mbp1基因上游同源的序列-选择性标记基因正向引物；反向引物：与Mbp1基因下游同源的序列-选择性标记基因反向引物。通过一次PCR即可获得Mbp1基因敲除组件，即Mbp1基因上游同源臂-选择性标记基因-Mbp1基因下游同源臂。因为引物太长，本发明中敲除组件构建成功的关键是缩短退火时间，提高退火温度。由于退火温度过高会使PCR效率过低，所以采用降落PCR这一简易的方法进行优化。降落PCR设计多循环反应的程序，以使相连循环的退火温度越来越低。由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平，用于确保第一个引物-模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。 
本发明的技术方案如下：一种验证酿酒酵母Mbp1基因影响细胞形态的方法，包括如下步骤：首先通过PCR反应构建Mbp1基因敲除组件，然后将该敲除组件分别转化酿酒酵母两种配型的单倍体细胞，并通过单倍体复倍得到敲除Mbp1基因的酿酒酵母突变菌株酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)菌株LC5，最后根据突变菌株细胞形态的变化来验证Mbp1基因功能，若突变菌株细胞形态发生变化，则确定所述Mbp1基因与细胞形态相关。 
所述酿酒酵母为野生型二倍体工业酿酒酵母。 
所述突变菌株细胞形态的变化是指是否形成假菌丝。 
所述突变菌株细胞形态的变化是指细胞体积是否发生变化，所述细胞体积是否发生变化是通过流式细胞仪进行分析。 
所述突变菌株细胞形态的变化是指单菌落形态是否发生变化。 
所述突变菌株细胞形态的变化是指SDS和刚果红是否抑制菌株生长。 
所述敲除Mbp1基因的酿酒酵母是指首先敲除单倍体的Mbp1基因，然后通过单倍体复倍获得敲除Mbp1基因的二倍体酿酒酵母。 
本发明的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株LC5，该菌株已经于2014年9月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，保藏号为：CCTCC M 2014409。地址：中国武汉武汉大学，邮政编码：430072。 
本发明的有益效果在于： 
1、证实了Mbp1基因影响工业酿酒酵母细胞形态。 
2、证实了只敲除Mbp1基因的酿酒酵母会形成假菌丝，而现有技术中发现只敲除Mbp1基因的白色念珠菌不会形成假菌丝。 
3、采用流式细胞仪对细胞体积变化进行分析，具有快速简单、耗时短和可大批量操作的优点。 
4、本发明对于快速鉴定和挖掘工业酿酒酵母菌株表型相关基因资源有重要意义。 
附图说明
图1为本发明实施例中以PUG为模板扩增敲除组件，其中，F：正向引物，A：Mbp1基因上游同源臂，C：KanMX基因5′端互补序列，R：反向引物，B：Mbp1基因下游同源臂，D：KanMX基因3′端互补序列。 
图2为本发明实施例中敲除组件的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：DNA分子量marker,1：敲除组件。 
图3为野生型菌株和突变菌株的单菌落形态。 
图4为野生型菌株和突变菌株的单细胞形态。 
图5为野生型菌株和突变菌株在刚果红平板上的菌落形态。 
图6为野生型菌株和突变菌株在SDS平板上的菌落形态。 
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。 
以下实施例所涉及实验材料如下： 
菌株和质粒：工业酿酒酵母菌株由广西科学院生物科学与技术研究中心筛选获得；质粒PSH65和PUG6分别购自宝赛生物科技有限公司。 
试剂盒和试剂：TIANprep Mini Plasmid Kit购自天根生化科技(北京)有限公司,rTaq酶等PCR相关试剂购自TaKaRa公司，其它试剂为进口分析纯或国产产品。 
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。 
以下实施例所涉及引物如表1所示。 
表1引物序列表 
实施例1 
酿酒酵母单倍体的制备 
过夜活化酿酒酵母并涂布于产孢培养基，30℃培养3～5天，收集子囊孢子，用0.85％NaCl清洗，用破胞液(0.01M/L Tris-HCl、10％β-巯基乙醇、10％蜗牛酶)处理过夜，再涂布于YPD培养基，30℃培养2～3天，挑取菌落，分别利用引物MATF、MATa和MATF、MATα进行菌落PCR，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，条带为544bp的为a型，404bp的为α型。 
实施例1所述菌落PCR反应体系如表2所示： 
表225μl菌落PCR反应体系 
成分 体积
无菌水 10.5μl
Taq master mix 12.5μl
Primer MATF 1μl
Primer MATa(或MATα) 1μl
单菌落 1个
菌落PCR扩增程序如下：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，运行30个循环后，于72℃再延伸10min。 
实施例2 
酿酒酵母Mbp1基因敲除组件的扩增 
提取PUG6质粒，具体操作参考TIANprep Mini Plasmid Kit说明书。如图1所示，首先以该质粒为模板，用引物F和R进行PCR扩增Mbp1基因敲除组件。 
所述PCR反应体系如表3所示： 
表350μl PCR反应体系 
成分 体积
无菌水 35.75μl
10×Buffer(Mg2+plus) 5μl
dNTP Mix(Each 2.5mM) 4μl
Primer F 2μl
Primer R 2μl
PUG6 1μl
rTaq 0.25μl
PCR扩增程序如下：94℃预变性3min，94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸2min，每运行一个循环后退火温度便降低1℃，运行15个循环后，于53℃退火温度下再运行15个循环，最后于72℃再延伸10min。反应完毕，扩增到约1.6kb的Mbp1基因敲除组件，如图2所示。 
实施例3 
酿酒酵母Mbp1基因的敲除 
将Mbp1基因敲除组件分别转化到酿酒酵母a型和α型单倍体细胞，通过含G418的YPD培养基筛选阳性转化子。以阳性转化子为模板，分别利用Ka-Kb，Kc-Kd引物对进行PCR，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增产物的大小分别为1.4kb和1.7kb，表明敲除组件已成功重组到酵母基因组中；分别利用引物对056wa-056wb,056wc-056wd进行PCR,琼脂糖凝胶电泳结果显示均无扩增条带，进一步确认Mbp1基因敲除成功。 
实施例3的PCR体系如表4所示： 
表425μl PCR反应体系 
无菌水 17.65μl
10×Buffer(Mg2+plus) 2.5μl
dNTP(Each 2.5mM) 2μl
Primer Ka(Kc,056wa,056wc) 1μl
Primer Kb(Kd,056wb，056wd) 1μl
DNA 0.5μl
rTaq 0.25μl
所述PCR的扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，每个循环退火温度降低1℃，共10个循环；之后94℃30s，45℃30s，72℃2min，再进行20个循环，最后72℃延伸10min。 
实施例4 
单倍体复性及抗性基因消除 
将敲除了Mbp1基因的两种单倍体杂交复倍，然后根据单倍体和二倍体不同的细胞形态挑选二倍体，进行产孢验证，并以引物MATF、MATa和MATF、MATα进行PCR验证，PCR扩增产物为544bp和404bp的两条带，表明复倍成功。 
将含有Cre重组酶基因的工程质粒PSH65转化复倍成功的菌株，用含博来霉素的半乳糖培养基诱导使其丢失抗性标记，传代10次使该菌株丢失PSH65质粒。以该菌的基因组DNA为模板，以引物对Ka-Kb和Kc-Kd进行PCR,均无扩增产物；以引物对Ka-kd进行行PCR，扩增到584bp的片段表明突变菌株的抗性标记已去除。 
实施例5 
酿酒酵母假菌丝检测 
将过夜活化的野生型菌株和突变菌株稀释后涂布于YPD平板上，于30℃培养箱中连续倒置培养3～4天后观察野生型菌株和突变菌株的菌落形态是否有差异，同时挑取菌落周边菌体进行镜检，观察是否形成假菌丝。图3显示：敲除Mbp1基因的突变菌株单菌落出现褶皱形态，而原始菌株菌落形态光亮圆滑；图4显示：大部分突变子细胞出现了假菌丝，而出发菌株没有假菌丝形成。说明Mbp1基因与菌落形态及假菌丝形成相关。已有研究发现只敲除Mbp1基因的白色念珠菌不会形成假菌丝，但本实验证实只敲除Mbp1基因的酿酒酵母会形成假菌丝。 
实施例6 
酿酒酵母细胞壁生理检测 
细胞壁生理检测时，用含SDS的YPD平板来检测细胞壁缺陷的菌株，可以用含刚果红的YPD平板抑制细胞壁中微纤丝的组装。具体方法是，取过夜活化的野生型菌株和突变菌株的菌液，离心收集菌体，依次稀释10-1、10-2、10-3、10-4，各取2μl菌液，分别转接于含0.05％SDS的YPD平板和0.5％刚果红的YPD平板上，置于30℃培养箱中培养2～3天，观察菌落生长是否受抑制。从图5和图6可以看出，突变菌株对SDS和刚果红的敏感性明显大于野生型菌株，表明Mbp1对于细胞壁的完整性是必要的。 
实施例7 
酿酒酵母细胞体积的分析 
分别将野生型菌株和突变菌株离心去上清，用pH值为7.4的PBS缓冲液清洗3次，然后用10％的醋酸作用15～20min，5000r/min低速离心3min后，再用PBS缓冲液洗涤并将细胞稀释至约106个/ml，取200μl样品上流式细胞仪,其中采集细胞数控制在10,000个，中速运行程序，其它参数默认，以平均FSC信号强度表示细胞体积，结果表明突变菌株的细胞体积比野生型菌株大19.2％。 
综上所述，本发明成功验证了酿酒酵母Mbp1基因与细胞形态相关，用流式细胞仪可以快分析细胞体积的变化。本方法同样适用于酿酒酵母Mbp1基因以外的其它细胞形态相关基因的验证。对于鉴定和挖掘工业酿酒酵母菌株表型相关基因资源有重要意义。 
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (8)

1.一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株LC5，其特征在于，该菌株已经于2014年9月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，保藏号为：CCTCC M2014409。
2.一种验证酿酒酵母Mbp1基因影响细胞形态的方法，其特征在于，包括如下步骤：首先通过PCR反应构建Mbp1基因敲除组件，然后将该敲除组件分别转化酿酒酵母两种配型的单倍体细胞，并通过单倍体复倍得到敲除Mbp1基因的酿酒酵母突变菌株，最后根据突变菌株细胞形态的变化来验证Mbp1基因功能，若突变菌株细胞形态发生变化，则确定所述Mbp1基因与细胞形态相关。
3.根据权利要求1所述的验证酿酒酵母Mbp1基因影响细胞形态的方法，其特征在于：所述酿酒酵母为野生型二倍体工业酿酒酵母。
4.根据权利要求1所述的验证酿酒酵母Mbp1基因影响细胞形态的方法，其特征在于：所述突变菌株细胞形态的变化是指是否形成假菌丝。
5.根据权利要求1所述的验证酿酒酵母Mbp1基因影响细胞形态的方法，其特征在于：所述突变菌株细胞形态的变化是指细胞体积是否发生变化，所述细胞体积是否发生变化是通过流式细胞仪进行分析。
6.根据权利要求1所述的验证酿酒酵母Mbp1基因影响细胞形态的方法，其特征在于：所述突变菌株细胞形态的变化是指单菌落形态是否发生变化。
7.根据权利要求1所述的验证酿酒酵母Mbp1基因影响细胞形态的方法，其特征在于：所述突变菌株细胞形态的变化是指SDS和刚果红是否抑制菌株生长。
8.根据权利要求1所述的验证酿酒酵母Mbp1基因影响细胞形态的方法，其特征在于：所述敲除Mbp1基因的酿酒酵母是指首先敲除单倍体的Mbp1基因，然后通过单倍体复倍获得敲除Mbp1基因的二倍体酿酒酵母。
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