CN109355245A - 一种基于流式细胞术超高通量分离酿酒酵母单倍体的方法 - Google Patents

一种基于流式细胞术超高通量分离酿酒酵母单倍体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于流式细胞术超高通量分离酿酒酵母单倍体的方法，属于高通量筛选技术领域。本发明通过优化子囊孢子处理条件，得到了酿酒酵母孢子悬液的最佳制备条件。利用PI和FDA染料分别对孢子悬液中活性孢子和失活细胞进行染色，通过基于流式细胞仪分析染色样品，实现了对酿酒酵母孢子的活性区分及孢子的绝对计数。本发明确立了最优的孢子悬液制备条件，建立了基于流式细胞仪的超高通量酿酒酵母单倍体分离技术。

Description

一种基于流式细胞术超高通量分离酿酒酵母单倍体的方法
技术领域
本发明涉及一种基于流式细胞术超高通量分离酿酒酵母单倍体的方法，属于高通量筛选技术领域。
背景技术
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在发酵工业中有广泛应用，如酿酒工业、生物能源产业等。同时作为模式生物，其拥有遗传背景清晰、基因操作简便、培养周期较短等优点，在基础研究中也有广泛应用。在发酵工业领域，杂交育种是一种传统、高效的提高酿酒酵母生产性能的育种手段。通过将拥有不同优良性状的单倍体进行杂交，而后分离单倍体，可以筛选得到整合不同优良性状的子代单倍体，提高工业生产性能。在基础研究领域，通过杂交不同表型单倍体细胞，而后分离子代单倍体、进行特定表型分组、全基因组关联分析，可以精确定位与特定表型差异相关的基因型差异。
传统酿酒酵母单倍体分选是利用孢子比营养细胞耐热性高的特点，通过58℃热处理杀死营养细胞，而后涂布YPD平板进行分离。这种方法需要大量的人工操作，且未分散的子囊孢子也能耐受58℃热处理条件，因此传统分离酿酒酵母单倍体的方法存在耗时耗力、分离效率低等问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明建立了一种超高通量分离酵母单倍体的方法，所述方法基于流式细胞术，可在短时间内高效分离大量酵母单倍体菌株。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(1)制备酿酒酵母孢子悬液；
(2)利用PI和FDA染料对步骤(1)的孢子悬液进行染色；
(3)使用流式细胞仪检测孢子活性；
(4)利用流式细胞仪分选有活性的孢子，直接将单个活性孢子分选到装有固体培养基的高通量孔板中。
在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括验证孢子生长后单倍体酵母配型。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的孢子悬液可以包括二倍体营养细胞、子囊孢子、不同活性的分生孢子。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的孢子悬液通过蜗牛酶处理产孢样品。
在本发明的一种实施方式中，向产孢样品中加入样品质量2～3％的蜗牛酶，28～30℃振荡孵育25～35min。
在本发明的一种实施方式中，向产孢样品中加入样品质量2.5％的蜗牛酶，30℃振荡孵育30min。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的孢子悬液是通过蜗牛酶处理产孢样品后，添加玻璃珠振荡后得到的；所述玻璃珠振荡具体是：加入占孢子悬液体积35～45％的粒径425～600nm玻璃珠，振荡45～90s，离心去除玻璃珠，收集细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的染色是将孢子悬液与6～8μg/mL PI染料、3～5μg/mL FDA染料混合，避光孵育15～20min。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的染色，具体是：将待分选孢子悬液浓度调整为105～106个细胞/mL，将等体积孢子悬液分别与8μg/mL PI染料、4μg/mL FDA染料混合，避光4℃孵育20min。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)和(4)具体是：对比二倍体营养细胞样品、未处理的产孢样品和所制备的孢子悬液样品，根据分生孢子形态上比营养细胞和子囊孢子小的特性，确定分生孢子所在细胞群；以没有标记任何荧光素的样品为阴性对照、将经PI染色的完全无活性样品为阳性对照，确定死孢子所在细胞群；以没有标记任何荧光素的样品为阴性对照、将经FDA染色的活性样品为阳性对照，确定活性孢子所在细胞群；取经PI和FDA同时染色的样品，过滤后稀释至105～106个细胞/mL，上流式细胞仪检测，分别用FL3和FL4通道在488nm下进行检测，将同时活性孢子细胞群区域最集中部分设门分选至装有固体培养基的高通量孔板中，每孔分选设定为单个孢子。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中，装有固体培养基的高通量孔板中固体培养基为YPD，体积为50μL/孔。
在本发明的一种实施方式中，所述验证是将高通量孔板在30℃培养箱中培养48h后，挑取菌落进行PCR验证菌落配型，所用引物为MAT(5'-AGTCACATCAAGATCGTTTATGG-3')、MAT-a(5'-ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3')和MAT-α(5'-GCACGGAATATGGGACTACTTCG-3')。
本发明还要求保护所述方法在食品、生物领域微生物分离方面的应用。
本发明的有益效果：本发明基于流式细胞术，结合PI和FDA对活细胞和死细胞的染色，可以精确定性、定量考察所制备孢子悬液的质量。利用流式细胞仪分选，可以高通量、高效率的获得大量单倍体(每分钟可以分选5块96孔板，获得约500株单倍体)，免除了常规分离技术所需的平板涂布等繁重的人工操作。同时，可以避免常规热处理不能杀死子囊孢子给最终分选得到菌株中带入的二倍体污染。
附图说明
图1为单孢子细胞群所在位置的确定；A是未处理产孢物的结果；B是仅用蜗牛酶处理后的产孢物的结果；C是蜗牛酶处理后进一步用玻璃珠振荡后的产孢物的结果。
图2为37℃蜗牛酶处理30min对孢子悬液质量的影响；其中，G1:R7是对Gate1中R7所在区域的局部放大图。
图3为37℃蜗牛酶处理60min对孢子悬液质量的影响；其中，G1:R7是对Gate1中R7所在区域的局部放大图。
图4为45℃蜗牛酶处理30min对孢子悬液质量的影响；其中，G1:R7是对Gate1中R7所在区域的局部放大图。
图5为45℃蜗牛酶处理60min对孢子悬液质量的影响；其中，G1:R7是对Gate1中R7所在区域的局部放大图。
图6菌落PCR验证细胞配型结果。
具体实施方式
实施例1制备酿酒酵母孢子悬液
(1)二倍体酵母菌株在YPD液体培养基(酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)中30℃、220rpm活化18h后，以10％的接种量转接于50mL新鲜YPD液体培养基中，30℃、220rpm培养24h。4000rpm离心5min，收集细胞，用生理盐水洗涤两次后，涂布于固体产孢培养基中(醋酸钾20g/L，琼脂粉20g/L)，26℃培养3天。收集固体产孢培养基上的菌泥，重悬于5mL生理盐水中，获得未经处理的孢子悬液。
(2)向步骤(1)未经处理的孢子悬液中加入2.5％(w/w)蜗牛酶(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号A600870-0001)，30℃振荡孵育30min。获得用蜗牛酶处理后的孢子悬液。
(3)向步骤(2)处理后的孢子悬液中加入35～45％(v/v)的425～600nm玻璃珠，振荡1min。4000rpm离心1min收集细胞，用生理盐水洗涤两次，最后用5mL生理盐水重悬，制备获得经蜗牛酶处理结合玻璃珠振荡处理的孢子悬液。
实施例2孢子细胞群所在位置的确定
利用子囊孢子和营养细胞比单倍体孢子形态小的特性，根据流式细胞仪的正向散射光信号(FSC)确定单倍体孢子细胞所在区域(图1)。分别对未处理的产孢样品(实施例1步骤(1)制备获得)、仅用蜗牛酶处理所得的孢子悬液样品(实施例2步骤(1)制备获得)和蜗牛酶处理后进一步用玻璃珠振荡制备的孢子悬液样品(实施例1步骤(3)制备获得)进行流式细胞分析，结果如图1所示。图1A中，未经处理的样品细胞群在图中右上区域；图1B中，仅经过蜗牛酶处理消化子囊壁后，一部分单倍体孢子得到分离，在流式图中表现为有一部分细胞向左下区域分离；在图1C中，蜗牛酶处理后添加玻璃珠振荡进一步打散孢子，在流式图中表现为分离出的单倍体孢子比例增加，单倍体孢子细胞群与营养细胞及子囊孢子细胞群分离更明显。
实施例3 PI和FDA染料对酿酒酵母孢子悬液染色
称取0.01g PI，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液定容至10mL。稀释至10μg/mL得到PI荧光染料。4℃避光保存。称取0.01g FDA，用丙酮定容至5mL。用PBS(pH 7.4)缓冲溶液稀释至2μg/mL得到FDA荧光染料。4℃避光保存。将实施例1制备的孢子悬液稀释至105～106个细胞/mL，将2mL孢子悬液分别与8μg/mL PI染料、4μg/mL FDA染料等体积混合，避光4℃孵育20min。
实施例4最佳孢子悬液制备条件的确定
以往的研究中，常用于破碎酵母子囊壁释放四分孢子的手段主要是利用酶消化子囊壁，从而释放单倍体孢子。但具体的处理种类繁多，缺乏对不同条件处理效果的定量考察。以相同细胞浓度下没有标记任何荧光素的样品为阴性对照、将经PI染色的完全无活性样品为阳性对照，确定死孢子所在细胞群；以没有标记任何荧光素的样品为阴性对照、将经FDA染色的活性样品为阳性对照，确定活性孢子所在细胞群。固定条件后，用PI和FDA染料同时对蜗牛酶在不同温度(30℃和45℃)处理酵母产孢物不同时间(30min和60min)后得到的孢子悬液进行染色，染色剂用量与实施例3相同。在流式细胞仪上比较不同温度、不同处理时间对蜗牛酶破碎子囊壁释放四分孢子效果的影响(图2～3)。流式细胞仪检测10,000个颗粒后分析结果发现(表1)，37℃条件下，蜗牛酶消化子囊壁的效果较45℃条件下要好(释放的总孢子数更多)。随着酶处理时间的延长，消化子囊壁释放孢子的效果逐步提升，但长时间的酶处理，对孢子的活性有副作用，可能是由于体系中的蜗牛酶会进一步消化孢子的细胞壁、细胞膜。综合考虑，在仅用蜗牛酶处理的情况下，37℃处理60min制备的孢子悬液质量较好，在流式细胞仪所检测的10,000个颗粒中，孢子占比达到20.10％，其中活孢子所占百分比为90.05％。
表1不同酶处理条件对孢子分散效果和孢子活性的影响
为获得质量更好的孢子悬液，在蜗牛酶处理后，用玻璃珠振荡，进一步对酵母产孢物进行处理，振荡条件为：加入40％(v/v)的425～600nm玻璃珠，振荡1min。4000rpm离心1min收集细胞，用生理盐水洗涤两次，最后用5mL生理盐水重悬。利用PI和FDA对处理后样品进行染色(染色剂用量与实施例3相同)，用流式细胞仪检测处理效果。如图4～5所示，相较于仅用蜗牛酶处理的情况，进一步进行玻璃珠振荡能有效的促进孢子释放，但对孢子的活性也有较大的负面影响。在延长酶处理时间之后，玻璃珠振荡导致孢子失活的情况尤其明显，这可能是由于酶处理时间的延长，本身就对一部分孢子的细胞壁等结构有一定影响，使得其对玻璃珠振荡带来的机械力更加敏感，更容易在振荡中破碎失活。综合考虑，在用蜗牛酶处理后进一步加玻璃珠振荡的情况下，蜗牛酶37℃处理30min后加玻璃珠振荡的策略制备的孢子悬液质量最好，在流式细胞仪所检测的10,000个颗粒中，孢子占比达到26.56％，其中活孢子所占百分比为90.05％(表2)。
表2不同酶处理后加玻璃珠振荡对孢子分散效果和孢子活性的影响
实施例5流式细胞分选
利用实施例4的最优的孢子悬液制备条件制备孢子悬液样品，利用PI和FDA同时染色的样品，过滤后稀释至105～106个细胞/mL，上流式细胞仪检测，根据PI发射红色荧光波长、FDA发射绿色荧光波长，在488nm激发光作用下，分别用FL3和FL4通道检测红色和绿色荧光信号，所得数据用Submit 5.4软件分析，确定活性孢子所在区域。将同时活性孢子细胞群区域最集中部分设门分选至装有固体YPD培养基(酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L)的高通量孔板中，每孔分选设定为单个孢子。共处理51034个孢子，筛选获得9600个单倍体孢子。
实施例6验证分选细胞配型
对实施例3分离的单倍体孢子进行验证。将高通量孔板在30℃培养箱中培养48h后，挑取菌落进行PCR验证菌落配型，所用引物为MAT
(5'-AGTCACATCAAGATCGTTTATGG-3')、MAT-a(5'-ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3')和MAT-α(5'-GCACGGAATATGGGACTACTTCG-3')。PCR条件为：95℃10min，(95℃30s，55℃45s，72℃35s)×30循环，72℃10min。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，条带大小为544bp的菌落为a型，条带大小为404bp的菌落为α型。
菌落PCR验证细胞配型结果如图6所示。对20个孢子进行验证，分离准确率达80％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种基于流式细胞术超高通量分离酿酒酵母单倍体的方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agtcacatca agatcgttta tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
actccacttc aagtaagagt ttg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcacggaata tgggactact tcg 23

Claims (10)

1.一种超高通量分离酵母单倍体的方法，其特征在于，基于流式细胞术进行分离，所述方法包括如下步骤：
(1)采用蜗牛酶和/或玻璃珠振荡处理孢子悬液；
(2)利用PI和FDA染料对步骤(1)的孢子悬液进行染色；
(3)使用流式细胞仪检测孢子活性；
(4)利用流式细胞仪分选有活性的孢子，直接将单个活性孢子分选到装有固体培养基的高通量孔板中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中是向产孢样品中加入样品质量2～3％的蜗牛酶，28～30℃振荡孵育25～35min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的孢子悬液是通过蜗牛酶处理产孢样品后，添加玻璃珠振荡后得到的；所述玻璃珠振荡具体是：加入占孢子悬液体积35～45％的粒径425～600nm玻璃珠，振荡45～90s，离心去除玻璃珠，收集细胞。
4.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，孢子悬液包括二倍体营养细胞、子囊孢子、不同活性的分生孢子。
5.根据权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，步骤(2)将孢子悬液与6～8μg/mLPI染料、3～5μg/mL FDA染料混合，避光孵育15～20min。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，将染色后的样品在488nm下检测荧光信号强度。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将检测后活性孢子细胞群区域最集中的部分设门分选至装有固体培养基的高通量孔板中，每孔分选设定为单个孢子。
8.根据权利要求1～6任一所述的方法，其特征在于，步骤(4)后对分选的孢子进行配型验证。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述验证是将孢子细胞培养，挑取菌落进行PCR验证菌落配型；PCR所用引物为MAT：5'-AGTCACATCAAGATCGTTTATGG-3'、MAT-a：5'-ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3'和MAT-α：5'-GCACGGAATATGGGACTACTTCG-3'。
10.权利要求1～9任一所述的方法在食品、生物领域微生物分离方面的应用。
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