CN107151698B - 鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供鉴定黑色羊肚菌类群中十一个物种的交配型的方法，该方法包括下步骤：1)提取待测菌种的菌株总DNA作为PCR扩增模板；2)以引物对MAT1‑1L/MAT1‑1R进行PCR扩增获得预期条带的菌株，说明含有MAT1‑1交配型，以引物对MAT1‑2L/MAT1‑2R进行PCR扩增获得预期条带的菌株，说明含有MAT1‑2交配型，若只检测到其中一种交配型的菌株，说明只含有父本或母本，出菇能力较差或不能出菇，若2条预期的扩增条带都能检测到的菌株则具有父母本两种交配型，具有出菇能力。运用本发明所提供的对羊肚菌菌种交配型基因检测的引物和检测方法，将大大提高羊肚菌栽培过程中高产、稳产的可靠性。上述交配型基因的分子标记简单便捷易操作，可用于羊肚菌交配型基因鉴定、栽培、菌种选育、物种鉴定、有性生殖演化和系统发育研究中的应用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及鉴定十一种羊肚菌，分别为：(中立羊肚菌(M.tridentina)、光柄半开羊肚菌(M.semilibera)、头丝羊肚菌(M.exuberans)、Mel-13、Mel-14、长白羊肚菌(M.eximioides)、三地羊肚菌(M.eohespera)、格咱羊肚菌(M.purpurascens)、Mel-21、督拿羊肚菌(M.dunalii)和普彻羊肚菌(M.pulchella)交配型基因的分子检测方法和特异引物对。本发明技术适用于羊肚菌菌种选育、栽培、交配型基因、物种鉴定、有性生殖演化和系统发育方面的研发。
背景技术
O’Donnell，Taskin和杜习慧等利用多基因谱系一致性系统发育学物种识别法(GCPSR)，基于LSU、ITS、EF1‐a、RPB1和RPB2共5个基因的核苷酸序列，把羊肚菌属真菌划分为黄色羊肚菌支系(Esculenta Clade)、黑色羊肚菌支系(Elata Clade)和变红羊肚菌支系(Rufobrunnea Clade)。本发明所涉及的十一个物种均属于黑色羊肚菌支系，其中包括一个半开羊肚菌物种。
交配型位点(mating-typelocus，MAT)是调控子囊真菌有性生殖方式的关键因子，并将有性生殖分为异宗配合(heterothallism)、同宗配合(homothallism)及次级同宗配合(secondary homothallism)。异宗配合真菌自交不孕(self-sterile)，其单倍体细胞核中仅携带一种交配型基因(MAT1-1或MAT1-2)，必须通过互补交配型的单倍体进行融合才能完成有性生殖；而同宗配合真菌自交可孕(self-fertile)其单倍体细胞核携带有两种亲和的交配型基因(MAT1-1和MAT1-2)，单个菌株就能完成有性生殖；次级同宗配合真菌也表现为自交可孕，但与同宗配合真菌不同，其单个有性生殖细胞中同时含有两种互补交配型的单倍体细胞核，表现为“独立”完成有性生殖。
迄今为止，现有技术中未见有羊肚菌属内十一个物种(中立羊肚菌(M.tridentina)、光柄半开羊肚菌(M.semilibera)、头丝羊肚菌(M.exuberans)、Mel-13、Mel-14、长白羊肚菌(M.eximioides)、三地羊肚菌(M.eohespera)、格咱羊肚菌(M.purpurascens)、Mel-21、督拿羊肚菌(M.dunalii)和普彻羊肚菌(M.pulchella)的交配型基因和鉴定父母亲本的专用引物对及其应用的报道。羊肚菌属内这十一个物种的有性生殖方式均为异宗配合，在制作菌种的过程中必须有父母亲本同时存在，才具有出菇的可能性，现有技术也没有提供在制作菌种时如何鉴定父母亲本存在，是否具有潜在出菇能力的方法的报道。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前无法鉴定羊肚菌菌种是否可靠的问题，提供一种鉴定黑色羊肚菌类群中十一个物种交配型的方法和所涉及的通用特异引物对，通过特异引物对对PCR扩增后条带的有无，鉴定这十一个物种菌株的交配型，从而确定是否为有效菌株。所提供的引物对可以通用于这十一个羊肚菌物种的交配型鉴定，方法简捷并且结果稳定可靠易观察。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
鉴定黑色羊肚菌类群中十一个物种的交配型的方法，该方法包括下述步骤：1)提取待测菌种的菌株总DNA作为PCR扩增模板；2)以引物对MAT1-1L/MAT1-1R进行PCR扩增，获得预期条带的菌株，说明含有MAT1-1交配型；以引物对MAT1-2L/MAT1-2R进行PCR扩增，获得预期条带的菌株，说明含有MAT1-2交配型，3)检测到MAT1-1交配型和MAT1-2交配型其中一种交配型的菌株，说明只含有父本或母本，出菇能力较差或不能出菇；检测到MAT1-1交配型和MAT1-2交配型2条预期的扩增条带的菌株，说明具有父母本两种交配型，具有出菇能力。
根据所述的鉴定黑色羊肚菌类群中十一个物种的交配型的方法，其中所述的
MAT1-1L/MAT1-1R特异引物对中，MAT1-1L的核苷酸序列为
5’-TTACCTTACTGGACTGGTTC-3’，MAT1-1R的核苷酸序列为
5’-AATGCAAGTAGGTGTCATTC-3’；
所述的MAT1-2L/MAT1-2R特异引物对中，MAT1-2L的核苷酸序列为
5’-TCCTATGAATGCGTAAGTTC-3’，MAT1-2R的核苷酸序列为
5’-GTATTATCACCAACCGTAGC-3’。
根据所述的鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型方法，其中所述的鉴定交配型MAT1-1和MAT1-2的PCR扩增体系相同，均包括2×PCR mix 12.5μL，5μM的正反向引物各1μL，DNA模板20ng，ddH2O补足至25μL。
根据所述的鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型方法，其中所述的特异引物对MAT1-1L/MAT1-1R鉴定菌株的MAT1-1交配型的PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
根据所述的鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型方法，其中所述的特异引物对MAT1-1L/MAT1-1R检测菌株的MAT1-1交配型时，获得大小为0.7kb的唯一条带。
根据所述的鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型方法，其中所述的特异引物对MAT1-2L/MAT1-2R鉴定菌株的MAT1-2交配型的PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
根据所述的鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型方法，其中所述的特异引物对MAT1-2L/MAT1-2R，检测菌株MAT1-2交配型时，获得大小为0.4kb的唯一条带。
鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型的PCR引物对：用于检测交配型MAT1-1的特异引物对为MAT1-1L/MAT1-1R，用于检测交配型MAT1-2的特异引物对为MAT1-2L/MAT1-2R。
含有所述的PCR引物对的鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型的试剂。
含有所述的PCR引物对的鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型的试剂盒。
本发明提供鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型的PCR特异引物对：包括用于检测交配型MAT1-1的特异引物对为MAT1-1L/MAT1-1R，和用于检测交配型MAT1-2的特异引物对为MAT1-2L/MAT1-2R。
本发明还提供上述PCR引物对、试剂或试剂盒在鉴定黑色羊肚菌类群中十一个物种交配型、羊肚菌栽培、菌种选育、物种鉴定、有性生殖演化和系统发育研究中的应用。
在本发明中，利用MAT1-1L/MAT1-1R引物对PCR扩增出0.7kb左右唯一条带，表明菌株含MAT1-1交配型；利用MAT1-2L/MAT1-2R引物对PCR扩增出0.4kb左右唯一条带表明菌株含MAT1-2交配型；检测菌株若能检测到两条预期的条带，说明该菌株为含有两种交配型的菌株，可以作为有效栽培菌株，而只检测到其中一条预期的条带，说明该菌株为只具有一种交配型的菌株，不能用于栽培，可以作为育种备选菌株。
经大量实验证实本发明所涉及的十一个羊肚菌物种均是异宗配合真菌，它们的有性生殖过程(出菇)均需要两种交配型结合才能完成，同时首次证实这些物种的子囊孢子均是多核单倍同核体。因此，对菌株交配型的检测是获得有效栽培菌株的前提，对菌种交配型的检测是保证菌种可靠的必要和首要步骤。
本发明基于前期研究工作获得的中立羊肚菌(M.tridentina)、光柄半开羊肚菌(M.semilibera)、头丝羊肚菌(M.exuberans)、Mel-13、Mel-14、长白羊肚菌(M.eximioides)、三地羊肚菌(M.eohespera)、格咱羊肚菌(M.purpurascens)、Mel-21、督拿羊肚菌(M.dunalii)和普彻羊肚菌(M.pulchella))两个交配基因序列的特征，设计了四对特异引物，可以通用于这十一种羊肚菌菌株MAT1-1和MAT1-2交配型的检测。扩增条带为单一条带，条带的有无即可确定菌株的交配型，结果稳定可靠。
本发明中所涉及的十一种羊肚菌交配基因序列和检测方法目前国内外均未报道。本发明中的四对特异引物对，均可以通用于十一种羊肚菌交配型的检测，对于羊肚菌的有性生殖和系统进化研究有重要意义。
引物对MAT1-1L/MAT1-1R可以通用于上述四种羊肚菌的MAT1-1交配型检测。
引物对MAT1-2L/MAT1-2R可以通用于上述四种羊肚菌的MAT1-2交配型检测。
本发明与现有技术相比，其创新点为：中立羊肚菌(M.tridentina)、光柄半开羊肚菌(M.semilibera)、头丝羊肚菌(M.exuberans)、Mel-13、Mel-14、M.eximioides、三地羊肚菌(M.eohespera)、M.purpurascens、Mel-21、督拿羊肚菌(M.dunalii)和M.pulchella)的MAT1-1-1和MAT1-2-1基因序列目前国内外皆未见报道，本发明的四对特异引物对，可以通用于这十一种羊肚菌交配基因保守区段的扩增，通过扩增条带的有无即可鉴定出菌株的交配型，方法简便而结果稳定可靠。此方法还可以进一步用于羊肚菌栽培、菌种选育、物种鉴定、有性生殖演化和系统发育等科学研究中的应用。
附图说明
图1为中立羊肚菌(M.tridentina)单子囊孢子菌株交配型检测电泳图。MAT1-1:MAT1-1L/MAT1-1R引物对扩增交配基因MAT1-1；MAT1-2：MAT1-2L/MAT1-2R引物对扩增交配基因MAT1-2。1～11代表中立羊肚菌子囊孢子单孢菌株X255-1—X255-11。
图2为光柄半开羊肚菌(M.semilibera)单子囊孢子菌株交配型检测电泳图。MAT1-1:MAT1-1L/MAT1-1R引物对扩增交配基因MAT1-1；MAT1-2：MAT1-2L/MAT1-2R引物对扩增交配基因MAT1-2。1～11代表光柄半开羊肚菌子囊孢子单孢菌株D907-1—D907-11。
图3为头丝羊肚菌(M.exuberans)单子囊孢子菌株交配型检测电泳图。MAT1-1:MAT1-1L/MAT1-1R引物对扩增交配基因MAT1-1；MAT1-2：MAT1-2L/MAT1-2R引物对扩增交配基因MAT1-2。1～11代表头丝羊肚菌子囊孢子单孢菌株K63-1～K63-11。
图4为Mel-13单子囊孢子菌株交配型检测电泳图。MAT1-1:MAT1-1L/MAT1-1R引物对扩增交配基因MAT1-1；MAT1-2：MAT1-2L/MAT1-2R引物对扩增交配基因MAT1-2。1～11代表Mel-13子囊孢子单孢菌株D470-1—D470-11。
图5为Mel-14单子囊孢子菌株交配型检测电泳图。MAT1-1:MAT1-1L/MAT1-1R引物对扩增交配基因MAT1-1；MAT1-2：MAT1-2L/MAT1-2R引物对扩增交配基因MAT1-2。1～11代表Mel-14子囊孢子单孢菌株D420-1—D420-11。
图6为长白羊肚菌(M.eximioides)单子囊孢子菌株交配型检测电泳图。MAT1-1:MAT1-1L/MAT1-1R引物对扩增交配基因MAT1-1；MAT1-2：MAT1-2L/MAT1-2R引物对扩增交配基因MAT1-2。1～11代表长白羊肚菌子囊孢子单孢菌株X33-1—X33-11。
图7为三地羊肚菌(M.eohespera)单子囊孢子菌株交配型检测电泳图。MAT1-1:MAT1-1L/MAT1-1R引物对扩增交配基因MAT1-1；MAT1-2：MAT1-2L/MAT1-2R引物对扩增交配基因MAT1-2。1～11代表三地羊肚菌子囊孢子单孢菌株K90-1—K90-11。
图8为格咱羊肚菌(M.purpurascens)单子囊孢子菌株交配型检测电泳图。MAT1-1:MAT1-1L/MAT1-1R引物对扩增交配基因MAT1-1；MAT1-2：MAT1-2L/MAT1-2R引物对扩增交配基因MAT1-2。1～11代表格咱羊肚菌子囊孢子单孢菌株K22-1—K22-11。
图9为Mel-21单子囊孢子菌株交配型检测电泳图。MAT1-1:MAT1-1L/MAT1-1R引物对扩增交配基因MAT1-1；MAT1-2：MAT1-2L/MAT1-2R引物对扩增交配基因MAT1-2。1～11代表Mel-21子囊孢子单孢菌株D488-1—D488-11。
图10为督拿羊肚菌(M.dunalii)单子囊孢子菌株交配型检测电泳图。MAT1-1:MAT1-1L/MAT1-1R引物对扩增交配基因MAT1-1；MAT1-2：MAT1-2L/MAT1-2R引物对扩增交配基因MAT1-2。1～11代表督拿羊肚菌子囊孢子单孢菌株D977-1—D977-11。
图11为普彻羊肚菌(M.pulchella)单子囊孢子菌株交配型检测电泳图。MAT1-1:MAT1-1L/MAT1-1R引物对扩增交配基因MAT1-1；MAT1-2：MAT1-2L/MAT1-2R引物对扩增交配基因MAT1-2。1～11代表普彻羊肚菌子囊孢子单孢菌株K28-1—K28-11。
图12为基于MAT1-1和MAT1-2两个交配型基因的联合分析构建的14个黑色羊肚菌物种最大简约树(Maximumparsimony，MP)树。这十四个物种分别为：梯棱羊肚菌(M.importuna)、六妹羊肚菌(M.sextelata)、七妹羊肚菌(M.eximia)、中立羊肚菌(M.tridentina)、光柄半开羊肚菌(M.semilibera)、头丝羊肚菌(M.exuberans)、Mel-13、Mel-14、M.eximioides、三地羊肚菌(M.eohespera)、M.purpurascens、Mel-21、M.dunalii和M.pulchella)，包括来自不同地域的野生菌株和栽培菌株。
具体实施方式
本发明的鉴定黑色羊肚菌类群中十一个物种的交配型的方法包括下述基本步骤：
1)提取待测菌种的菌株总DNA作为PCR扩增模板；2)以引物对MAT1-1L/MAT1-1R进行PCR扩增，获得预期条带的菌株，说明含有MAT1-1交配型；以引物对MAT1-2L/MAT1-2R进行PCR扩增，获得预期条带的菌株，说明含有MAT1-2交配型，3)检测到MAT1-1交配型和MAT1-2交配型其中一种交配型的菌株，说明只含有父本或母本，出菇能力较差或不能出菇；检测到MAT1-1交配型和MAT1-2交配型2条预期的扩增条带的菌株，说明具有父母本两种交配型，具有出菇能力。
其中MAT1-1L/MAT1-1R特异引物对中，MAT1-1L的核苷酸序列为
5’-TTACCTTACTGGACTGGTTC-3’，MAT1-1R的核苷酸序列为
5’-AATGCAAGTAGGTGTCATTC-3’；
MAT1-2L/MAT1-2R特异引物对中，MAT1-2L的核苷酸序列为
5’-TCCTATGAATGCGTAAGTTC-3’，MAT1-2R的核苷酸序列为
5’-GTATTATCACCAACCGTAGC-3’。鉴定交配型MAT1-1和MAT1-2的PCR扩增体系相同，均包括2×PCR mix 12.5μL，5μM的正反向引物各1μL，DNA模板20ng，ddH2O补足至25μL。特异引物对MAT1-1L/MAT1-1R鉴定菌株的MAT1-1交配型的PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。特异引物对MAT1-1L/MAT1-1R检测菌株的MAT1-1交配型时，获得大小为0.7kb的唯一条带。特异引物对MAT1-2L/MAT1-2R鉴定菌株的MAT1-2交配型的PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。特异引物对MAT1-2L/MAT1-2R，检测菌株MAT1-2交配型时，获得大小为0.4kb的唯一条带。用于检测交配型MAT1-1的特异引物对为MAT1-1L/MAT1-1R，用于检测交配型MAT1-2的特异引物对为MAT1-2L/MAT1-2R。
下面结合附图，用本发明的实施例对本发明作进一步的详细描述。但并不以此来限定本发明。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
中立羊肚菌(M.tridentina)X255单子囊孢子菌株交配型鉴定中立羊肚菌单子囊孢子菌株X255-1—X255-11接种在PDA培养基上，24℃培养7d，挑取适量菌丝体，CTAB法提取DNA，取4μL在1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度。
分别以X255-1—X255-11的DNA为模板，用引物对MAT1-1L/MAT1-1R或1L/1R进行PCR扩增：25μL扩增体系包括2×PCRmix(TIANGENBioInc)12.5μL，5μM的MAT1-1L、MAT1-1R引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸10min。
分别以X255-1—X255-11的DNA为模板，用引物对MAT1-2L/MAT1-2R或2L/2R进行PCR扩增，25μL扩增体系包括2×PCRmix(TIANGENBioInc)12.5μL，5μM的MAT1-2L、MAT1-2R引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸10min。
所有扩增产物在1％(W/V)琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图1的A和B，菌株X255-2、X255-4、X255-6、X255-8和X255-9在引物对MAT1-1L/MAT1-1R扩增时有0.7kb左右唯一条带，而用引物对MAT1-2L/MAT1-2R扩增时无条带，鉴定为交配型MAT1-1菌株。而菌株X255-1、X255-3、X255-5、X255-7、X255-10、X255-11在引物对MAT1-1L/MAT1-1R扩增时无条带，而引物对MAT1-2L/MAT1-2R扩增时有0.4kb左右唯一条带，鉴定为交配型MAT1-2菌株。
实施例2
光柄半开羊肚菌(M.semilibera)单子囊孢子菌株交配型鉴定光柄半开羊肚菌单子囊孢子菌株D907-1—D907-11接种在PDA培养基上，24℃培养7d，挑取适量菌丝体，CTAB法提取DNA，取4μL在1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度。
分别以D907-1—D907-11的DNA为模板，用引物对MAT1-1L/MAT1-1R或1L/1R进行PCR扩增：25μL扩增体系包括2×PCRmix(TIANGENBioInc)12.5μL，5μM的MAT1-1L、MAT1-1R引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸10min。
分别以D907-1—D907-11的DNA为模板，用引物对MAT1-2L/MAT1-2R或2L/2R进行PCR扩增，25μL扩增体系包括2×PCRmix(TIANGENBioInc)12.5μL，5μM的MAT1-2L、MAT1-2R引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸10min。
所有扩增产物在1％(W/V)琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图2的A和B，菌株D907-2、D907-4、D907-6、D907-8和D907-9在引物对MAT1-1L/MAT1-1R扩增时有0.7kb左右唯一条带，而用引物对MAT1-2L/MAT1-2R扩增时无条带，鉴定为交配型MAT1-1菌株。而菌株D907-1、D907-3、D907-5、D907-7、D907-10、D907-11在引物对MAT1-1L/MAT1-1R扩增时无条带，而引物对MAT1-2L/MAT1-2R扩增时有0.4kb左右唯一条带，鉴定为交配型MAT1-2菌株。
实施例3
头丝羊肚菌(M.exuberans)K63单子囊孢子菌株交配型鉴定头丝羊肚菌单子囊孢子菌株K63-1—K63-11接种在PDA培养基上，24℃培养7d，挑取适量菌丝体，CTAB法提取DNA，取4μL在1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度。
分别以K63-1—K63-11的DNA为模板，用引物对MAT1-1L/MAT1-1R或1L/1R进行PCR扩增：25μL扩增体系包括2×PCRmix(TIANGENBioInc)12.5μL，5μM的MAT1-1L、MAT1-1R引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸10min。
分别以K63-1—K63-11的DNA为模板，用引物对MAT1-2L/MAT1-2R或2L/2R进行PCR扩增，25μL扩增体系包括2×PCRmix(TIANGENBioInc)12.5μL，5μM的MAT1-2L、MAT1-2R引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸10min。
所有扩增产物在1％(W/V)琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图3的A和B，菌株K63-2、K63-4、K63-6、K63-8和K63-9在引物对MAT1-1L/MAT1-1R扩增时有0.7kb左右唯一条带，而用引物对MAT1-2L/MAT1-2R扩增时无条带，鉴定为交配型MAT1-1菌株。而菌株K63-1、K63-3、K63-5、K63-7、K63-10、K63-11在引物对MAT1-1L/MAT1-1R扩增时无条带，而引物对MAT1-2L/MAT1-2R扩增时有0.4kb左右唯一条带，鉴定为交配型MAT1-2菌株。
实施例4
Mel-13D470单子囊孢子菌株交配型鉴定Mel-13单子囊孢子菌株D470-1—D470-11接种在PDA培养基上，24℃培养7d，挑取适量菌丝体，CTAB法提取DNA，取4μL在1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度。
分别以D470-1—D470-11的DNA为模板，用引物对MAT1-1L/MAT1-1R或1L/1R进行PCR扩增：25μL扩增体系包括2×PCRmix(TIANGENBioInc)12.5μL，5μM的MAT1-1L、MAT1-1R引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸10min。
分别以D470-1—D470-11的DNA为模板，用引物对MAT1-2L/MAT1-2R或2L/2R进行PCR扩增，25μL扩增体系包括2×PCRmix(TIANGENBioInc)12.5μL，5μM的MAT1-2L、MAT1-2R引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸10min。
所有扩增产物在1％(W/V)琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图4的A和B，菌株D470-2、D470-4、D470-6、D470-8和D470-9在引物对MAT1-1L/MAT1-1R扩增时有0.7kb左右唯一条带，而用引物对MAT1-2L/MAT1-2R扩增时无条带，鉴定为交配型MAT1-1菌株。而菌株D470-1、D470-3、D470-5、D470-7、D470-10、D470-11在引物对MAT1-1L/MAT1-1R扩增时无条带，而引物对MAT1-2L/MAT1-2R扩增时有0.4kb左右唯一条带，鉴定为交配型MAT1-2菌株。
实施例5
Mel-14D420单子囊孢子菌株交配型鉴定Mel-14单子囊孢子菌株D420-1—D420-11接种在PDA培养基上，24℃培养7d，挑取适量菌丝体，CTAB法提取DNA，取4μL在1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度。
分别以D420-1—D420-11的DNA为模板，用引物对MAT1-1L/MAT1-1R或1L/1R进行PCR扩增：25μL扩增体系包括2×PCRmix(TIANGENBioInc)12.5μL，5μM的MAT1-1L、MAT1-1R引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸10min。
分别以D420-1—D420-11的DNA为模板，用引物对MAT1-2L/MAT1-2R或2L/2R进行PCR扩增，25μL扩增体系包括2×PCRmix(TIANGENBioInc)12.5μL，5μM的MAT1-2L、MAT1-2R引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸10min。
所有扩增产物在1％(W/V)琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图5的A和B，菌株D420-2、D420-4、D420-6、D420-8和D420-9在引物对MAT1-1L/MAT1-1R扩增时有0.7kb左右唯一条带，而用引物对MAT1-2L/MAT1-2R扩增时无条带，鉴定为交配型MAT1-1菌株。而菌株D420-1、D420-3、D420-5、D420-7、D420-10、D420-11在引物对MAT1-1L/MAT1-1R扩增时无条带，而引物对MAT1-2L/MAT1-2R扩增时有0.4kb左右唯一条带，鉴定为交配型MAT1-2菌株。
实施例6
长白羊肚菌(M.eximioides)X33单子囊孢子菌株交配型鉴定长白羊肚菌(M.eximioides)单子囊孢子菌株X33-1—X33-11接种在PDA培养基上，24℃培养7d，挑取适量菌丝体，CTAB法提取DNA，取4μL在1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度。
分别以X33-1—X33-11的DNA为模板，用引物对MAT1-1L/MAT1-1R或1L/1R进行PCR扩增：25μL扩增体系包括2×PCRmix(TIANGENBioInc)12.5μL，5μM的MAT1-1L、MAT1-1R引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸10min。
分别以X33-1—X33-11的DNA为模板，用引物对MAT1-2L/MAT1-2R或2L/2R进行PCR扩增，25μL扩增体系包括2×PCRmix(TIANGENBioInc)12.5μL，5μM的MAT1-2L、MAT1-2R引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸10min。
所有扩增产物在1％(W/V)琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图6的A和B，菌株X33-2、X33-4、X33-6、X33-8和X33-9在引物对MAT1-1L/MAT1-1R扩增时有0.7kb左右唯一条带，而用引物对MAT1-2L/MAT1-2R扩增时无条带，鉴定为交配型MAT1-1菌株。而菌株X33-1、X33-3、X33-5、X33-7、X33-10、X33-11在引物对MAT1-1L/MAT1-1R扩增时无条带，而引物对MAT1-2L/MAT1-2R扩增时有0.4kb左右唯一条带，鉴定为交配型MAT1-2菌株。
实施例7
三地羊肚菌(M.eohespera)K90单子囊孢子菌株交配型鉴定三地羊肚菌(M.eohespera)单子囊孢子菌株K90-1—K90-11接种在PDA培养基上，24℃培养7d，挑取适量菌丝体，CTAB法提取DNA，取4μL在1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度。
分别以K90-1—K90-11的DNA为模板，用引物对MAT1-1L/MAT1-1R或1L/1R进行PCR扩增：25μL扩增体系包括2×PCRmix(TIANGENBioInc)12.5μL，5μM的MAT1-1L、MAT1-1R引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸10min。
分别以K90-1—K90-11的DNA为模板，用引物对MAT1-2L/MAT1-2R或2L/2R进行PCR扩增，25μL扩增体系包括2×PCRmix(TIANGENBioInc)12.5μL，5μM的MAT1-2L、MAT1-2R引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸10min。
所有扩增产物在1％(W/V)琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图7的A和B，菌株K90-2、K90-4、K90-6、K90-8和K90-9在引物对MAT1-1L/MAT1-1R扩增时有0.7kb左右唯一条带，而用引物对MAT1-2L/MAT1-2R扩增时无条带，鉴定为交配型MAT1-1菌株。而菌株K90-1、K90-3、K90-5、K90-7、K90-10、K90-11在引物对MAT1-1L/MAT1-1R扩增时无条带，而引物对MAT1-2L/MAT1-2R扩增时有0.4kb左右唯一条带，鉴定为交配型MAT1-2菌株。
实施例8
格咱羊肚菌(M.purpurascens)K22单子囊孢子菌株交配型鉴定格咱羊肚菌(M.purpurascens)单子囊孢子菌株K22-1—K22-11接种在PDA培养基上，24℃培养7d，挑取适量菌丝体，CTAB法提取DNA，取4μL在1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度。
分别以K22-1—K22-11的DNA为模板，用引物对MAT1-1L/MAT1-1R或1L/1R进行PCR扩增：25μL扩增体系包括2×PCRmix(TIANGENBioInc)12.5μL，5μM的MAT1-1L、MAT1-1R引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸10min。
分别以K22-1—K22-11的DNA为模板，用引物对MAT1-2L/MAT1-2R或2L/2R进行PCR扩增，25μL扩增体系包括2×PCRmix(TIANGENBioInc)12.5μL，5μM的MAT1-2L、MAT1-2R引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸10min。
所有扩增产物在1％(W/V)琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图8的A和B，菌株K22-2、K22-4、K22-6、K22-8和K22-9在引物对MAT1-1L/MAT1-1R扩增时有0.7kb左右唯一条带，而用引物对MAT1-2L/MAT1-2R扩增时无条带，鉴定为交配型MAT1-1菌株。而菌株K22-1、K22-3、K22-5、K22-7、K22-10、K22-11在引物对MAT1-1L/MAT1-1R扩增时无条带，而引物对MAT1-2L/MAT1-2R扩增时有0.4kb左右唯一条带，鉴定为交配型MAT1-2菌株。
实施例9
Mel-21D488单子囊孢子菌株交配型鉴定Mel-21单子囊孢子菌株D488-1—D488-11接种在PDA培养基上，24℃培养7d，挑取适量菌丝体，CTAB法提取DNA，取4μL在1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度。
分别以D488-1—D488-11的DNA为模板，用引物对MAT1-1L/MAT1-1R或1L/1R进行PCR扩增：25μL扩增体系包括2×PCRmix(TIANGENBioInc)12.5μL，5μM的MAT1-1L、MAT1-1R引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸10min。
分别以D488-1—D488-11的DNA为模板，用引物对MAT1-2L/MAT1-2R或2L/2R进行PCR扩增，25μL扩增体系包括2×PCRmix(TIANGENBioInc)12.5μL，5μM的MAT1-2L、MAT1-2R引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸10min。
所有扩增产物在1％(W/V)琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图9的A和B，菌株D488-2、D488-4、D488-6、D488-8和D488-9在引物对MAT1-1L/MAT1-1R扩增时有0.7kb左右唯一条带，而用引物对MAT1-2L/MAT1-2R扩增时无条带，鉴定为交配型MAT1-1菌株。而菌株D488-1、D488-3、D488-5、D488-7、D488-10、D488-11在引物对MAT1-1L/MAT1-1R扩增时无条带，而引物对MAT1-2L/MAT1-2R扩增时有0.4kb左右唯一条带，鉴定为交配型MAT1-2菌株。
实施例10
督拿羊肚菌(M.dunalii)D977单子囊孢子菌株交配型鉴定督拿羊肚菌(M.dunalii)单子囊孢子菌株D977-1—D977-11接种在PDA培养基上，24℃培养7d，挑取适量菌丝体，CTAB法提取DNA，取4μL在1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度。
分别以D977-1—D977-11的DNA为模板，用引物对MAT1-1L/MAT1-1R或1L/1R进行PCR扩增：25μL扩增体系包括2×PCRmix(TIANGENBioInc)12.5μL，5μM的MAT1-1L、MAT1-1R引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸10min。
分别以D977-1—D977-11的DNA为模板，用引物对MAT1-2L/MAT1-2R或2L/2R进行PCR扩增，25μL扩增体系包括2×PCRmix(TIANGENBioInc)12.5μL，5μM的MAT1-2L、MAT1-2R引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸10min。
所有扩增产物在1％(W/V)琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图10的A和B，菌株D977-2、D977-4、D977-6、D977-8和D977-9在引物对MAT1-1L/MAT1-1R扩增时有0.7kb左右唯一条带，而用引物对MAT1-2L/MAT1-2R扩增时无条带，鉴定为交配型MAT1-1菌株。而菌株D977-1、D977-3、D977-5、D977-7、D977-10、D977-11在引物对MAT1-1L/MAT1-1R扩增时无条带，而引物对MAT1-2L/MAT1-2R扩增时有0.4kb左右唯一条带，鉴定为交配型MAT1-2菌株。
实施例11
普彻羊肚菌(M.pulchella)单子囊孢子菌株交配型鉴定普彻羊肚菌(M.pulchella)单子囊孢子菌株K28-1—K28-11接种在PDA培养基上，24℃培养7d，挑取适量菌丝体，CTAB法提取DNA，取4μL在1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度。
分别以K28-1—K28-11的DNA为模板，用引物对MAT1-1L/MAT1-1R或1L/1R进行PCR扩增：25μL扩增体系包括2×PCRmix(TIANGENBioInc)12.5μL，5μM的MAT1-1L、MAT1-1R引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸10min。
分别以K28-1—K28-11的DNA为模板，用引物对MAT1-2L/MAT1-2R或2L/2R进行PCR扩增，25μL扩增体系包括2×PCRmix(TIANGENBioInc)12.5μL，5μM的MAT1-2L、MAT1-2R引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸10min。
所有扩增产物在1％(W/V)琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图11的A和B，菌株K28-2、K28-4、K28-6、K28-8和K28-9在引物对MAT1-1L/MAT1-1R扩增时有0.7kb左右唯一条带，而用引物对MAT1-2L/MAT1-2R扩增时无条带，鉴定为交配型MAT1-1菌株。而菌株K28-1、K28-3、K28-5、K28-7、K28-10、K28-11在引物对MAT1-1L/MAT1-1R扩增时无条带，而引物对MAT1-2L/MAT1-2R扩增时有0.4kb左右唯一条带，鉴定为交配型MAT1-2菌株。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.鉴定黑色羊肚菌类群中十一个物种的交配型的方法，其特征在于该方法包括下述步骤：1)提取待测菌种的菌株总DNA作为PCR扩增模板；2)以引物对MAT1-1L/MAT1-1R进行PCR扩增，获得预期条带的菌株，说明含有MAT1-1交配型；以引物对MAT1-2L/MAT1-2R进行PCR扩增，获得预期条带的菌株，说明含有MAT1-2交配型，3)检测到MAT1-1交配型和MAT1-2交配型其中一种交配型的菌株，说明只含有父本或母本，出菇能力较差或不能出菇；检测到MAT1-1交配型和MAT1-2交配型2条预期的扩增条带的菌株，说明具有父母本两种交配型，具有出菇能力；
所述的MAT1-1L/MAT1-1R特异引物对中，MAT1-1L的核苷酸序列为
5’-TTACCTTACTGGACTGGTTC-3’，MAT1-1R的核苷酸序列为
5’-AATGCAAGTAGGTGTCATTC-3’；
所述的MAT1-2L/MAT1-2R特异引物对中，MAT1-2L的核苷酸序列为
5’-TCCTATGAATGCGTAAGTTC-3’，MAT1-2R的核苷酸序列为
5’-GTATTATCACCAACCGTAGC-3’；
所述黑色羊肚菌类群中的十一个种为中立羊肚菌( M. tridentina) 、光柄半开羊肚菌( M. semilibera) 、头丝羊肚菌( M. exuberans) 、Mel-13、Mel-14、长白羊肚菌( M. eximioides) 、三地羊肚菌( M. eohespera) 、格咱羊肚菌( M. purpurascens) 、Mel-21、督拿羊肚菌( M. dunalii) 和普彻羊肚菌( M. pulchella) 。
2.根据权利要求1所述的鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型方法，其特征在于，所述的鉴定交配型MAT1-1和MAT1-2的PCR扩增体系相同，均包括2×PCR mix 12.5 μL，5 μM的正反向引物各1 μL，DNA模板20 ng，ddH2O补足至25 μL。
3.根据权利要求2所述的鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型方法，其特征在于，所述的特异引物对MAT1-1L/MAT1-1R鉴定菌株的MAT1-1交配型的PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
4.根据权利要求2所述的鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型方法，其特征在于，所述的特异引物对MAT1-1L/MAT1-1R检测菌株的MAT1-1交配型时，获得大小为0.7kb的唯一条带。
5.根据权利要求2所述的鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型方法，其特征在于，所述的特异引物对MAT1-2L/MAT1-2R鉴定菌株的MAT1-2交配型的PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
6.根据权利要求5所述的鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型方法，其特征在于，所述的特异引物对MAT1-2L/MAT1-2R，检测菌株MAT1-2交配型时，获得大小为0.4kb的唯一条带。
7.鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型的PCR引物对，其特征在于：用于检测交配型MAT1-1的特异引物对为MAT1-1L/MAT1-1R，用于检测交配型MAT1-2的特异引物对为MAT1-2L/MAT1-2R；
所述的MAT1-1L/MAT1-1R特异引物对中，MAT1-1L的核苷酸序列为
5’-TTACCTTACTGGACTGGTTC-3’，MAT1-1R的核苷酸序列为
5’-AATGCAAGTAGGTGTCATTC-3’；
所述的MAT1-2L/MAT1-2R特异引物对中，MAT1-2L的核苷酸序列为
5’-TCCTATGAATGCGTAAGTTC-3’，MAT1-2R的核苷酸序列为
5’-GTATTATCACCAACCGTAGC-3’；
所述黑色羊肚菌类群中的十一个种为中立羊肚菌( M. tridentina) 、光柄半开羊肚菌( M. semilibera) 、头丝羊肚菌( M. exuberans) 、Mel-13、Mel-14、长白羊肚菌( M. eximioides) 、三地羊肚菌( M. eohespera) 、格咱羊肚菌( M. purpurascens) 、Mel-21、督拿羊肚菌( M. dunalii) 和普彻羊肚菌( M. pulchella) 。
8.含有权利要求7所述的PCR引物对的鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型的试剂，所述黑色羊肚菌类群中的十一个种为中立羊肚菌( M. tridentina) 、光柄半开羊肚菌( M. semilibera) 、头丝羊肚菌( M. exuberans) 、Mel-13、Mel-14、长白羊肚菌( M. eximioides) 、三地羊肚菌( M. eohespera) 、格咱羊肚菌( M. purpurascens) 、Mel-21、督拿羊肚菌( M. dunalii) 和普彻羊肚菌( M. pulchella) 。
9.含有权利要求7所述的PCR引物对的鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型的试剂盒，所述黑色羊肚菌类群中的十一个种为中立羊肚菌( M. tridentina) 、光柄半开羊肚菌( M. semilibera) 、头丝羊肚菌( M. exuberans) 、Mel-13、Mel-14、长白羊肚菌( M. eximioides) 、三地羊肚菌( M. eohespera) 、格咱羊肚菌( M. purpurascens) 、Mel-21、督拿羊肚菌( M. dunalii) 和普彻羊肚菌( M. pulchella) 。
10.权利要求7所述的PCR引物对或权利要求8所述的试剂或权利要求9所述的试剂盒在鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型、菌种选育、栽培、物种鉴定、有性生殖演化和系统发育中的应用；所述黑色羊肚菌类群中的十一个种为中立羊肚菌( M. tridentina) 、光柄半开羊肚菌( M. semilibera) 、头丝羊肚菌( M. exuberans) 、Mel-13、Mel-14、长白羊肚菌( M. eximioides) 、三地羊肚菌( M. eohespera) 、格咱羊肚菌( M. purpurascens)、Mel-21、督拿羊肚菌( M. dunalii) 和普彻羊肚菌( M. pulchella) 。
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