CN112626249A - 一种用于鉴定金耳菌x9菌株或包含x9菌株的金耳菌株的scar标记 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食用菌栽培领域，具体涉及一种用于鉴定金耳菌X9菌株或包含X9菌株的金耳菌株的SCAR标记。对金耳菌菌株，使用SCAR标记进行鉴定可将金耳菌X9菌株与其他金耳菌菌株区分开；对金耳菌株，在以SCAR标记鉴定时使用金耳菌株的无性芽孢、担孢子和担孢子培养物(芽孢)进行操作，可将包含X9菌株的金耳菌株与其他金耳菌株区分开。本发明SCAR标记在金耳菌X9菌株和包含X9菌株的金耳菌株中具有高度的特征性，检测结果稳定可靠。
Description
技术领域
本发明属于食用菌栽培领域，具体涉及一种用于鉴定金耳菌X9 菌株或包含X9菌株的金耳菌株的SCAR标记。
技术背景
SCAR(sequence characterized amplified regions，序列特定扩增区) 标记通常是由RAPD、SRAP、SSR标记转化而来。SCAR标记是将特征标记片段从凝胶上回收并进行克隆和测序，根据其碱基序列设计一对特征引物(18-24碱基)；SCAR标记一般表现为扩增片段的有无，可用于快速检测大量个体。SCAR标记所用引物较长且引物序列与模板 DNA完全互补，可在严谨条件下进行扩增，因此结果稳定性好、可重复性强。由于上述优点，SCAR标记成为分子标记在育种实践中能直接应用的首选标记，它也是标记辅助育种中可以直接应用的一类标记[1]。目前在已在香菇[2]、金针菇[3]、杏鲍菇[4]、木耳[5]等食用菌中有应用先例。
现有关于金耳菌种研究的报道都是涉及常规的菌种扩繁方法，对于菌种质量的描述也只涉及有效菌种和无效菌种的区别[6-8]，针对金耳菌种的鉴别及分子标记的开发尚未见报道，属于空白领域。
发明概述
本发明提供一种用于鉴定金耳菌X9菌株或包含X9菌株的金耳菌株的SCAR标记。
根据本发明，SCAR标记的特征序列如SEQ ID NO:1所示，或与 SEQ ID NO:1具有85％以上(例如85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，甚至99.5％，99.6％，99.7％，99.8％或 99.9％)的同一性。
根据本发明，金耳菌X9菌株或包含X9菌株的金耳菌株具有如 SEQ ID NO:4所示的ITS序列。
本发明还提供SCAR标记的引物对U829-S3，如SEQ ID NOs:2和 3所示，用于扩增上述SCAR标记的特征序列。
本发明另提供SCAR标记在鉴定金耳菌X9菌株或包含X9菌株的金耳菌株中的应用。
本发明进一步提供金耳菌X9菌株的鉴定方法，包括下列步骤：
取待鉴定的金耳菌菌株样品，使用真菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，以所得DNA为模板，使用引物对U829-S3进行PCR扩增，扩增产物通过凝胶电泳进行检测，扩增出上述特征条带者判定为金耳菌X9菌株。
本发明还进一步提供包含X9菌株的金耳菌株的鉴定方法，包括下列任一方法：
1)取待鉴定金耳菌株的金耳担孢子，使用真菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，以所得DNA为模板，使用引物对U829-S3进行PCR扩增，扩增产物通过凝胶电泳进行检测，存在上述特征条带者则判定该金耳菌株中包含X9菌株；
2)取待鉴定金耳菌株的金耳担孢子进行培养得到酵母状培养物，对酵母状培养物使用真菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，以所得DNA为模板，使用引物对U829-S3进行PCR扩增，扩增产物通过凝胶电泳进行检测，存在上述特征条带者则判定该金耳菌株中包含X9菌株；
3)取待鉴定金耳菌株的鲜活金耳子实体组织进行培养，从中分离出芽孢，取此芽孢应用真菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，以所得DNA为模板，使用引物对U829-S3进行PCR扩增，扩增产物通过凝胶电泳进行检测，存在上述特征条带者则判定该金耳菌株中包含X9菌株。
发明内容
本发明的各种生物材料如下定义：
金耳：是指包含有金耳菌(学名：Naematelia aurantialba Millanes &Wedin,主要异名：Tremella aurantialba)和毛韧革菌(学名：Sterem hirsutum(Willd.)Fr.)两个物种的复合生物体，如日常所说的金耳子实体。
金耳菌：只含有单纯金耳菌(学名：Naematelia aurantialba,主要异名：Tremellaaurantialba)一个物种的生物体，存在形式以菌丝或担孢子或芽孢等为主。
毛韧革菌：只含有单纯毛韧革菌(学名：Sterem hirsutum)一个物种的生物体。
金耳菌株：包含金耳菌和毛韧革菌两个物种且两个物种间已经建立寄生关系的培养物。如本发明中的JSJ-X9、JSJ-X18、JSJ-H1、JSJ-H3、 NL、YL、YR、CX、QJ、ZY、SC菌株。
金耳菌菌株：只含有单纯金耳菌一个物种的培养物，如本发明中的X9菌株
毛韧革菌菌株：只含有单纯毛韧革菌一个物种的培养物。
金耳人工栽培技术成功后的几十年来，菌种基本上都是从野生金耳子实体中分离得到菌种，然后不断地用子实体转代繁殖使用至今。金耳菌种的分离技术难度较低，可直接从金耳鲜菇中分离出菌种，致使金耳品种保护难度较大。发明人经多年的努力，从福贡高黎贡山采集到的金耳子实体中分离出金耳无性芽孢，并从中筛选培育出金耳菌 X9号菌株，以金耳菌X9号菌株(金耳无性芽孢)与不同的毛韧革菌菌株组合成功培育出适宜工厂化栽培、包含X9菌株、优异的系列金耳菌株。金耳菌X9菌株和包含X9菌株的金耳菌株的研发成本巨大，对于金耳工厂化栽培意义重大，具有极高的经济价值，急需一种有效的手段对金耳菌X9菌株和包含X9菌株的金耳菌株进行品种保护。为找到金耳菌X9菌株和包含X9菌株的金耳菌株的有效保护手段，发明人通过大量的实验，以ISSR标记扩增的序列多态性为基础，开发出了针对金耳菌X9菌株和包含X9菌株的金耳菌株特征性分子标记-SACR 标记。此SCAR标记可识别出金耳菌X9菌株和包含X9菌株的金耳菌株的独有、区别于其他金耳菌菌株和金耳菌株的特征性DNA片段，成为金耳菌X9菌株和包含X9菌株的金耳菌株的身份标识标记，以此SCAR标记对金耳菌菌株或金耳菌株进行鉴定，即可识别出被检测菌株是否为本发明选育的金耳菌X9菌株或包含X9菌株的金耳菌株，从而达到对金耳菌X9菌株和包含X9菌株的金耳菌株的保护目的。
本发明提出的SCAR标记由以下核心要点组成：
1.本发明的SCAR标记适用于单纯金耳菌(不包含毛韧革菌)的培养物或生物材料，经过ITS检测为金耳菌，包括：金耳的无性芽孢、担孢子及担孢子的培养物(有性芽孢)等。
2.本发明SCAR标记的DNA特征序列(NCBI登录号：MW192637) 大小为1369bp，序列信息如下所示：
3.本发明的SCAR标记所使用的引物对U829-S3：
正向引物U829-S3-F：TGTGTGTGTGTGTGTGCGTCTCTGC(SEQ ID NO:2)
反向引物U829-S3-R：TGTGTGTGTGTGTGTGCGGGGGGGG (SEQ ID NO:3)
4.本发明的SCAR标记具有高度的特征性，可用于鉴定金耳菌X9 菌株和包含X9菌株的金耳菌株。以金耳菌X9菌株或包含X9菌株的金耳菌株中金耳菌的基因组DNA为模板，使用上述引物对通过PCR 可扩增出本发明特征条带；以同样的方法对国内可见的其他金耳菌株进行PCR则不能扩增出本发明特征条带。
5.金耳菌(Tremella aurantialba)X9号菌株已保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.20271，保藏日为2020年9月18日。
本发明的SCAR标记在鉴定金耳菌菌株时的鉴定方法为：
取待鉴定的金耳菌菌株样品，使用真菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，以所得DNA为模板，使用引物对U829-S3进行PCR扩增，扩增产物通过凝胶电泳进行检测，扩增出上述特征条带者判定为金耳菌X9菌株。
本发明的SCAR标记在鉴定包含X9菌株的金耳菌株的鉴定方法，包括下列任一方法：
1)取待鉴定金耳菌株的金耳担孢子，使用真菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，以所得DNA为模板，使用引物对U829-S3进行PCR扩增，扩增产物通过凝胶电泳进行检测，存在上述特征条带者则判定该金耳菌株中包含X9菌株；
2)取待鉴定金耳菌株的金耳担孢子进行培养得到酵母状培养物，对酵母状培养物使用真菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，以所得DNA为模板，使用引物对U829-S3进行PCR扩增，扩增产物通过凝胶电泳进行检测，存在上述特征条带者则判定该金耳菌株中包含X9菌株；
3)取待鉴定金耳菌株的鲜活金耳子实体组织进行培养，从中分离出芽孢，取此芽孢应用真菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，以所得DNA为模板，使用上述引物对U829-S3进行PCR扩增，扩增产物通过凝胶电泳进行检测，存在上述特征条带者则判定该金耳菌株中包含X9菌株。
发明效果
使用本发明SCAR标记对金耳菌X9菌株与国内市场上其他金耳菌株中分离出的金耳菌菌株进行扩增对比，结果只在用金耳菌X9菌株中扩增得到特征条带，其他金耳菌菌株中不能扩增出该特征条带，并且本结果可稳定重复；使用本发明SCAR标记对包含金耳菌X9菌株的金耳菌株与国内市场上的其他金耳菌株进行扩增对比，结果只在包含金耳菌X9菌株的金耳菌株中扩增得到特征条带，其他金耳菌株中不能扩增出该特征条带，并且结果可稳定重复。证明本发明SCAR标记在金耳菌X9菌株和包含金耳菌X9菌株的金耳菌株中具有特征性。使用本发明SCAR标记对待鉴定菌株进行鉴定：可从国内市场上的金耳菌菌株中区分出金耳菌X9菌株；从国内市场上的金耳菌株中区分出包含金耳菌X9菌株的金耳菌株。
发明人于2020年10月15日使用本发明SCAR标记扩增出的特征性条带的序列信息在NCBI数据库中进行BLAST,结果显示该序列与 NCBI数据库中已发表的序列都不具有同源性(图1)，即该序列在2020 年10月15日时在世界范围内是全新的。
附图说明
为了更清楚地描述本发明的技术方案，下面将结合附图作简要介绍。显而易见，这些附图仅是本申请记载的一些具体实施方式。本发明包括但不限于下列附图：
图1示出SCAR标记序列在NCBI数据库中的BLAST结果；
图2示出12个供试金耳菌菌株(无性芽孢)ITS扩增产物的凝胶电泳图谱；
图3示出12个供试金耳菌菌株(无性芽孢)ITS序列部分峰图；
图4示出12个供试金耳菌菌株(无性芽孢)ITS序列间的比对结果；
图5示出12个供试金耳菌菌株(无性芽孢)的DNA用引物U829 的扩增结果；
图6示出12个供试金耳菌菌株(无性芽孢)的DNA的SCAR标记扩增验证结果；
图7示出11个金耳菌株的担孢子的DNA的SCAR标记扩增验证结果；
图8示出11个金耳菌株的担孢子培养物(芽孢)的DNA的SCAR 标记扩增验证结果；以及
图9示出11个金耳菌株子实体中分离的无性芽孢的DNA的 SCAR标记扩增验证结果。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分，而非全部。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在无需作出创造性劳动前提下所获得的所有变例，都落入本发明要求保护的范围。除非特别说明，本发明百分比为重量百分比。
实施例
1.金耳菌株的收集
通过走访金耳种植户及金耳鲜菇交易市场收集到市场上可见的7 个不同产地的金耳新鲜子实体，通过组织分离法分离纯化后得到金耳菌株，对应产地分别编号为：NL(宁蒗)、YL(云龙)、YR(永仁)、 CX(楚雄)、QJ(曲靖)、ZY(张掖)、SC(四川)；另外，发明人自主培育了4个包含金耳菌X9号菌株的金耳菌株：JSJ-X9、JSJ-X18、 JSJ-H1、JSJ-H3。共收集到11个金耳菌株。
2.金耳菌菌株(无性芽孢)的获取
金耳菌X9号菌株直接扩繁使用，另外将11个金耳菌株的子实体进行表面消毒，每个金耳菌株的子实体取4-6块5×5×5mm3大小的组织块接种到芽孢分离液体培养基中进行搅拌培养(芽孢分离液体培养基配方(1L)：马铃薯200g(煮汁)，蔗糖20g，KH2PO4 4g，MgSO43g)，22℃下培养7天后液体培养物呈浑浊的淡橘黄色，取0.5ml液体菌种接种于芽孢分离固体培养基上(芽孢分离固体培养基配方(1L)：马铃薯200g(煮汁)，蔗糖20g，琼脂18g，KH2PO44g，MgSO4 3g)， 4天后培养基表面长出丝状菌落及酵母状菌落，挑取酵母状菌落转接于芽孢分离固体培养基中，重复转接两次确认培养物中没有丝状菌落只有酵母状菌落生长后，得到11个金耳菌株对应的金耳菌菌株(无性芽孢)编号为:X9(JSJ-X9)、X9(JSJ-X18)、X9(JSJ-H1)、X9(JSJ-H3)、 YB(NL)、YB(YL)、YB(YR)、YB(CX)、YB(QJ)、YB(ZY)、 YB(SC)，加上金耳菌X9号菌株共12个金耳菌菌株参与本发明SCAR 标记的开发。
3.12个金耳菌菌株(无性芽孢)的DNA提取
根据真菌基因组DNA提取试剂盒操作步骤提取12个金耳菌菌株 (无性芽孢)的基因组DNA，并以1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
4.12个金耳菌菌株(无性芽孢)的ITS鉴定
取12个金耳菌菌株(无性芽孢)DNA为模板，利用ITS通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)(SEQ ID NO:5)，和ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC)(SEQ ID NO:6)进行PCR扩增，凝胶检测均能扩增出条带如图2所示，扩增产物进行测序，峰图无套峰或错峰现象，说明测序结果良好(图3)。
利用DNAMAN软件对12个金耳菌菌株(无性芽孢)的ITS序列 (取有效序列486bp)进行比对，一致性为100％(图4)，说明12个金耳菌菌株(无性芽孢)之间在ITS序列上无差别，属于同一种。
测序所得的ITS序列大小为524bp，序列信息为：
GAAAGCTGTCCTTTCGGACGGTTAGAAAGCGCGTCTCCACA GAAGCAAGCGCAACCACAGCGTAGATAATTATCACACCGAGGCG CACGTCGCCAACAAGACGCACTAATGCATTATGAGAGGAGCCGA GCGGTGAAGCCCGGCAAAACCTCCAAGTCCAATTCCACTACGTTC ACTTTAAAAAAAATGAAGAGGGTTGAGAATTTCACGACACTCAA ACAGGTGTGCCCTTCGGAATACCAAAGGGCGCAAGGTGCGTTCA CAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTAT CGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCG TTGTTGAAAGTTGTATTAGATGCGTTTTATTACATCGAGTAGACA TTCTTAAGACATACAAAGGGTGTGTAAAGGGACGCGAGCCTCTTC GAGTTAACAAAGAGGCCCCCGCGAAGGTGCACAGTGTGTGTGTG GATTAGTGAAAGGAGCGTGCACATGCCGTTTTTAAAGG(SEQ ID NO:4)
登录NCBI使用以上序列进行BLAST，查询结果表明，与登录号为DQ400104.1的金耳(Tremella aurantialba)总评分最高为852，同源性为99.57％。根据最新研究结果[9]，金耳学名为Naematelia aurantialba，异名为Tremella aurantialba，所以12个金耳菌菌株(无性芽孢)都为金耳(Naematelia aurantialba)。
5.ISSR分析
5.1金耳菌菌株(无性芽孢)ISSR-PCR体系
反应体系为25uL体系，反应程序为：94℃变性5min，进入循环，循环条件是94℃变性1min，33.7℃退火1min，72℃延伸1min，35 个循环后，72℃延伸10min。
从加拿大哥伦比亚大学所公布的100条随机引物中选定了52条引物进行ISSR分析。经筛选后得到19条能以金耳无性芽孢DNA为模板扩增出多态性条带的引物，其中有4条引物能以金耳无性芽孢DNA为模板扩增出特异性条带。其中，U829号引物能扩增出特征条带，且该条带只在金耳菌X9号系列菌株(金耳菌X9号菌株和从包含金耳菌X9 号菌株的金耳菌株中分离出的金耳菌菌株)中出现，将各供试菌株分为金耳菌X9号系列菌株和其他金耳菌菌株两类(图5)。选取该特异条带进行金耳菌X9号菌株及包含金耳菌X9菌株的金耳菌株的SCAR标记的进一步开发。
5.2SCAR标记的特征条带分析
将U829(TGTGTGTGTGTGTGTGC)(SEQ ID NO:7)引物扩增出的在金耳菌X9号系列菌株中具有特征性的DNA片段切胶纯化进行克隆、测序，得到一段1369bp的序列。
6.SCAR标记引物的设计、合成及SCAR标记的验证
6.1SCAR标记引物的设计及合成
根据特征条带克隆后测序所得到的序列结果，再根据引物设计原则，设计该特征条带的扩增引物对，编号U829-S3，正向引物U829-S3-F： TGTGTGTGTGTGTGTGCGTCTCTGC(SEQID NO:2)，反向引物 U829-S3-R：TGTGTGTGTGTGTGTGCGGGGGGGG(SEQ ID NO:3)。委托测序公司进行合成。
6.2SCAR标记的验证
使用SCAR标记引物U829-S3对各种金耳生物材料的DNA进行 PCR扩增验证，引物浓度为10uM，扩增体系为30uL，扩增程序为： 94℃变性5min，进入循环，循环条件是94℃变性1min，66.9℃退火1 min，72℃延伸1min，35个循环后，72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
6.2.1SCAR标记在金耳菌菌株(无性芽孢)中的验证
以12个金耳菌菌株(无性芽孢)的DNA为模板使用引物U829-S3 进行PCR扩增验证，结果只在金耳菌X9号系列菌株中能扩增出目的特征条带，引物U829-S3可将金耳菌X9号系列菌株与其他金耳菌菌株区分开。经多次重新制备金耳菌菌株(无性芽孢)提取DNA进行验证，结果表现一致(图6)。
6.2.2SCAR标记在金耳菌株中的验证
6.2.2.1金耳菌株的担孢子
取11个金耳菌株正在产孢的子实体以悬钩法在无菌环境中收集干燥、未萌发的担孢子，所得金耳担孢子使用真菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，以所得DNA为模板使用引物U829-S3进行PCR 扩增验证，结果只在包含金耳菌X9号菌株的金耳菌株的担孢子DNA中能扩增出目的特征条带，引物U829-S3能将包含金耳菌X9号菌株的金耳菌株的担孢子DNA与其他金耳菌株的担孢子DNA区分开，即可将包含金耳菌X9号菌株的金耳菌株与其他金耳菌株区分开。经多次重新收集金耳菌株的担孢子提取DNA进行验证，结果表现一致(图7)。
6.2.2.2金耳菌株的担孢子培养物(芽孢)
取11个金耳菌株正在产孢的子实体收集担孢子，将收集到的担孢子在固体或液体培养基中培养得到芽孢，取样使用真菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，以所得DNA为模板使用引物U829-S3进行PCR扩增验证，结果只在包含金耳菌X9号菌株的金耳菌株的担孢子培养物(芽孢)的DNA中能扩增出目的特征条带，引物U829-S3能将包含金耳菌X9号菌株的金耳菌株的担孢子培养物(芽孢)与其他金耳菌株的担孢子培养物(芽孢)区分开，即可将包含金耳菌X9号菌株的金耳菌株与其他金耳菌株区分开。经多次重新制备金耳菌株的担孢子培养物(芽孢)提取DNA进行验证，结果表现一致(图8)。
6.2.2.3金耳菌株子实体中分离的无性芽孢
取11个金耳菌株的子实体组织块，接种到芽孢分离培养基中分离出无性芽孢，取样使用真菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，以所得DNA为模板使用引物U829-S3进行PCR扩增验证，结果只在包含金耳菌X9号菌株的金耳菌株的无性芽孢的DNA中能扩增出目的特征条带，引物U829-S3能将包含金耳菌X9号菌株的金耳菌株的无性芽孢与其他金耳菌株无性芽孢区分开，即可将包含金耳菌X9号菌株的金耳菌株与其他金耳菌株区分开。经多次重新制备金耳菌株的无性芽孢提取DNA进行验证，结果表现一致(图9)。
6.2.2.4金耳菌株子实体组织
取11个金耳菌株的子实体组织块，使用真菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，以所得DNA为模板使用引物U829-S3进行PCR 扩增，经多次重复结果只有JSJ-H1号金耳菌株子实体组织DNA中不稳定地扩增出目的特征条带且条带较弱，其余金耳菌株的子实体组织 DNA中都未扩增出特征条带。
7.金耳SCAR标记的开发结果
根据本SCAR标记在金耳的各种生物材料的DNA中的PCR扩增验证结果显示，本发明的SCAR标记在应用于纯金耳菌(不包含毛韧革菌)的生物材料时具有高度的特征性，可以特征地识别出金耳菌X9 号菌株和包含金耳菌X9号菌株的金耳菌株，而应用于金耳子实体组织时则不具有特征性。根据此特点将本发明的SCAR标记总结为：
引物对U829-S3：
正向引物U829-S3-F：TGTGTGTGTGTGTGTGCGTCTCTGC(SEQ ID NO:2)
反向引物U829-S3-R：TGTGTGTGTGTGTGTGCGGGGGGGG (SEQ ID NO:3)
特征条带大小1369bp，序列信息如SEQ ID NO:1所示。
适用范围：金耳无性芽孢、金耳担孢子、金耳担孢子培养物(芽孢)。
使用效果：金耳菌X9号菌株和包含金耳菌X9号菌株的金耳菌株中可扩增出特征条带。
参考文献
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SEQUENCE LISTING
<110> 云南菌视界生物科技有限公司
<120> 一种用于鉴定金耳菌X9菌株或包含X9菌株的金耳菌株的SCAR标记
<130> SPI204780-43
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1369
<212> DNA
<213> SCAR标记
<400> 1
ttgtgtgtgt gtgtgtgcgt ctctgcgagt aagcattatt gtatgcgagt ctgcgcagat 60
gtgcgtcggg tgagatccgg caaactcggg cggagcctat ctctgcatga ttcaaaagtc 120
atagcgactg aagcactttt gcatgcggca gcacgccacg cagacacgca gacacgcagc 180
atcgcagaca cgcagcatcg cagcatcgca gcatcgcagc atcgcagcca agcatcgcag 240
acacgcatcg caacaaactg ccgacaatgt ccacgtcgac gccgtcgttc tcgccaaaca 300
cgtcgtcctc gccgatcccg acgatcgacc tgtcgtccga ctctgcggcg cggcaggcag 360
agctgatccg ccgcgcgctg agcacggtcg ggttctttgt ggtggtgaat tcgggggtgg 420
cggcgggcga ggtagccggg atgtttcaca atgtacgtgt gtgaagagac tgtcgaggga 480
gagtgtgtgt cgagtgagag catgtcgagc gagagagcaa gtcgagcgag agagcggtgt 540
cgagtgtgtc gagcgagaga ggtgttgagc tcgagagcgt gtcgagtcag tcgctgacgc 600
agacagatga aagcgctatt cgccaacccg cgcgaggtga aagaagcgta tcccgcagac 660
aagattggtt cgggctacat caagccgctc gcgcagagtc tcgggccgta ccgccgcgat 720
tacagagagt gagtgctggg gcggggctgc tagctgcgtg ctcggtcgtt gtgctcggtc 780
gtgcgtgctc ggtcgttgtg ctcggtcgtg cgtgctcggt cgttgtgctc ggtcgttgtg 840
ctcggtcgtt gtgctcggtc gttgtgctcg ttctcgtgct cgtgccgagg actaggacta 900
ggacctccga caggagcatg accacgacca cgactcggtc tcgacgacca gatcagctag 960
ctaatgacca gagcattcca gtacggccgg caatctgcac actggaagca gcccctgccg 1020
ccgccgttca aggacggctc ggccgctctc gccgatatga aggcgtttta ccggtcgtgc 1080
catgatacct ctgagcgctt gctcgagctc tttgcgctcg ctttggatgt gagtgacggt 1140
ggcctctgcg ctgtgccttc tgttcttcgt cttctacgtc tctgcatctc ctctcgtctc 1200
ttgtcgtctg tcatacgtct ctcctgacgc tcctctctat ggaatgcacc gacgatccag 1260
gtcttcgatt cttcgatttt gtccttgtcc ttgtgccagt gctgccactg ctccacctgt 1320
ctctgcgttc agcccctccc cccccccccc cgcacacaca cacacacaa 1369
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 正向引物U829-S3-F
<400> 2
tgtgtgtgtg tgtgtgcgtc tctgc 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 反向引物U829-S3-R
<400> 3
tgtgtgtgtg tgtgtgcggg ggggg 25
<210> 4
<211> 524
<212> DNA
<213> ITS序列
<400> 4
gaaagctgtc ctttcggacg gttagaaagc gcgtctccac agaagcaagc gcaaccacag 60
cgtagataat tatcacaccg aggcgcacgt cgccaacaag acgcactaat gcattatgag 120
aggagccgag cggtgaagcc cggcaaaacc tccaagtcca attccactac gttcacttta 180
aaaaaaatga agagggttga gaatttcacg acactcaaac aggtgtgccc ttcggaatac 240
caaagggcgc aaggtgcgtt cacaaagatt cgatgattca ctgaattctg caattcacat 300
tacttatcgc atttcgctgc gttcttcatc gatgcgagag ccaagagatc cgttgttgaa 360
agttgtatta gatgcgtttt attacatcga gtagacattc ttaagacata caaagggtgt 420
gtaaagggac gcgagcctct tcgagttaac aaagaggccc ccgcgaaggt gcacagtgtg 480
tgtgtggatt agtgaaagga gcgtgcacat gccgttttta aagg 524
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> ITS通用引物ITS1
<400> 5
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> ITS通用引物ITS4
<400> 6
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> U829引物
<400> 7
tgtgtgtgtg tgtgtgc 17
Claims (6)
1.一种用于鉴定金耳菌X9菌株或包含X9菌株的金耳菌株的SCAR标记，其特征序列如SEQ ID NO:1所示，或与SEQ ID NO:1具有85％以上(例如85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，甚至99.5％，99.6％，99.7％，99.8％或99.9％)的同一性。
2.权利要求1所述的SCAR标记，其中金耳菌X9菌株和包含X9菌株的金耳菌株具有如SEQID NO:4所示的ITS序列。
3.一种引物对U829-S3，如SEQ ID NOs:2和3所示。
4.SCAR标记在鉴定金耳菌X9菌株或包含X9菌株的金耳菌株中的用途。
5.一种金耳菌X9菌株的鉴定方法：
取待鉴定的金耳菌菌株样品，使用真菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，以所得DNA为模板，使用引物对U829-S3进行PCR扩增，扩增产物通过凝胶电泳进行检测，扩增出上述特征条带者判定为金耳菌X9菌株。
6.一种包含X9菌株的金耳菌株的鉴定方法，包括下列任一方法：
1)取待鉴定金耳菌株的金耳担孢子，使用真菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，以所得DNA为模板，使用引物对U829-S3进行PCR扩增，扩增产物通过凝胶电泳进行检测，存在上述特征条带者则判定该金耳菌株中包含X9菌株；
2)取待鉴定金耳菌株的金耳担孢子进行培养得到酵母状培养物，对酵母状培养物使用真菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，以所得DNA为模板，使用引物对U829-S3进行PCR扩增，扩增产物通过凝胶电泳进行检测，存在上述特征条带者则判定该金耳菌株中包含X9菌株；
3)取待鉴定金耳菌株的鲜活金耳子实体组织进行培养，从中分离出芽孢，取此芽孢应用真菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，以所得DNA为模板，使用引物对U829-S3进行PCR扩增，扩增产物通过凝胶电泳进行检测，存在上述特征条带者则判定该金耳菌株中包含X9菌株。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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