CN112021067A - 一种通过金耳无性芽孢与毛韧革菌组合选育金耳新品种的方法 - Google Patents

一种通过金耳无性芽孢与毛韧革菌组合选育金耳新品种的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种选育金耳新品种的方法，通过分离出不同产地的金耳菌株中的无性芽孢和毛韧革菌，然后将不同来源的金耳无性芽孢与毛韧革菌进行交叉组合搭配，使两个物种母本的优良性状结合到组合后所得的金耳子实体菌株中，然后通过无性扩繁保持其性状的稳定性以应用于生产，从而形成金耳的新菌株、新品种。本发明为金耳菌株或品种的选育提供了可行的途径，使用本发明的方法进行金耳菌株选育，获得了高产抗病的金耳重组菌株。

Description

一种通过金耳无性芽孢与毛韧革菌组合选育金耳新品种的 方法
技术领域
本发明属于食用菌栽培领域，具体涉及一种通过金耳无性芽孢与毛韧革菌组合选育金耳新品种的方法。
背景技术
现有技术将金耳的生物学特性描述为：金耳是一种寄生真菌，寄生于毛韧革菌，金耳子实体是异质型子实体，是由金耳菌丝和毛韧革菌菌丝组成的复合体，金耳菌丝的生长要依靠毛韧革菌为其提供营养。金耳选育菌种的研究的报道较少，通常涉及常规的菌种扩繁方法，对于菌种质量的描述也只涉及有效菌种和无效菌种的区别[1-3]。
金耳人工栽培技术成功后的几十年来，菌种基本上都是从野生金耳子实体中分离得到菌种，然后不断地用子实体无数代地转代繁殖使用，造成种源来源少，多代营养繁殖后菌种生产性能退化，菌种携带病毒或杂菌等问题，而对于依据生物多样性的原理，人为地将不同遗传背景的金耳菌和毛韧革菌组合创建新的组合，创新金耳育种的新材料，从中进行金耳新菌株或品种的选育还未见期刊杂志或专利文献的报道。
目前商品金耳菌种质量参差不齐，菌株遗传背景不清，生产性状不稳定，金耳菌种经过子实体无数代地转代繁殖使用，造成种源来源少，多代营养繁殖后菌种生产性能退化，菌种携带病毒或杂菌等，通过验证多数菌株的抗病能力较差，特别对于木霉类的杂菌抵抗力较差，栽培袋在培养过程中的污染率高达15％左右，一潮菇转化率为55％左右，一致度为75％左右，不具备优良品种的特性。使用现有商品金耳菌株进行生产所能达到的技术指标较低，无法适应现代农业精细化管理及高效率产出的要求，为了推动金耳栽培产业的升级和发展，急需选育出稳定的高产抗病的金耳新品种。
发明概述
为解决上述问题，扩大金耳新品种选育的种质资源，本发明提出了一种使用金耳无性芽孢与毛韧革菌搭配，人工培育金耳菌与毛韧革菌的大量新组合，并从中选育出金耳优质高产新品种的方法。
发明人对金耳与毛韧革菌的关系进行了深入研究，掌握了金耳无性芽孢与毛韧革菌建立寄生关系的方法：在诱导培养基中使用金耳无性芽孢接种于毛韧革菌菌丝上，通过诱导培养能培育出新的金耳子实体。此技术的突破为金耳菌株或品种的选育提供了可行的途径，本发明以此技术为基础提出了一种利用金耳及毛韧革菌的多样性选育高产抗病的金耳新品种的方法。
本发明提供一种通过金耳无性芽孢与毛韧革菌组合选育金耳新品种的方法，包括下列步骤：收集不同产地、具有不同遗传背景的金耳菌株，从中分离出纯金耳无性芽孢及纯毛韧革菌；把不同来源的两者交叉组合后诱导培养出金耳子实体；选育得到综合了两个物种母本的优良性状的金耳子实体新菌株(品种)。
根据本发明，用于组合的毛韧革菌为固体培养基或液体培养基内的菌丝培养物。
根据本发明，使用子实体诱导培养基进行子实体诱导培养，以形成新组合的子实体。
根据本发明，子实体诱导培养基配方(基于重量百分比)包括木屑56.8％、棉籽壳25％、麦麸15％、蔗糖3％、硫酸镁0.1％、磷酸二氢钾0.1％。
发明内容
通过收集不同产地的金耳菌株，从中分离出无性芽孢与毛韧革菌的纯培养，将不同产地的金耳无性芽孢与毛韧革菌进行交叉组合搭配，经诱导培养产生新的金耳子实体，成为新金耳品种选育的材料，组合后所得的金耳子实体菌株通过出菇实验筛选出结合了两个物种母本的优良性状的菌株，然后将筛选出的金耳子实体菌株通过无性扩繁应用于生产以保持性状的稳定性，从而形成金耳新品种。
具体而言，本发明的方法包括下列一种或多种甚至全部的具体实施步骤：不同产地的金耳菌株收集及无性芽孢分离，不同产地的毛韧革菌菌株的收集，金耳无性芽孢与毛韧革菌的交叉配对及子实体诱导培养，小金耳纯化，出菇实验，以及菌株综合评价。
(1)金耳菌株收集
采集不同产地的金耳的幼嫩子实体，以吸水纸包裹置于4℃下密封保存，48小时内使用组织分离法进行菌种分离。分离菌种时先将金耳子实体表面消毒，然后取5*5*5mm大小的一块金耳子实体组织块接种于金耳母种培养基上，金耳母种培养基配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂粉20g，KH2PO4 4g，MgSO4 3g。接种后黑暗培养，温度20℃，培养25天后金耳子实体组织块再生为小金耳，通过组织分离法纯化两次后即得金耳菌株，可用于分离无性芽孢。
(2)金耳无性芽孢分离
取纯化好的金耳菌株的子实体组织块在液体芽孢分离培养基中进行搅拌培养，芽孢分离培养基配方(1L)为：马铃薯200g(煮汁)，蔗糖20g，KH2PO4 4g，MgSO4 3g，22℃下培养7天后液体菌种基呈淡橘黄色，取0.5ml液体菌种接种于母种培养基上，4天后培养皿表面长出丝状菌落及酵母状菌落，挑取酵母状菌落转接于母种培养基中，重复转接两次确认没有丝状菌落混杂其中后，取样提取DNA进行ITS鉴定，经ITS鉴定确认为金耳菌的酵母状培养物即为金耳无性芽孢，对应金耳母本原产地编号为YB1、YB2、YB3……YBn，保存备用。
(3)不同产地的毛韧革菌菌株的收集
在采集不同产地的金耳的幼嫩子实体的同时采集长有金耳子实体的菇木，常温干燥保存，3个月内进行菌种分离。分离菌种时先将菇木表面切削平整，然后消毒，在无菌环境中将菇木劈开，从距离菇木表面5mm以下部位取小块木屑接种于金耳母种培养基上。接种后黑暗培养，温度24℃，培养7天后木屑上萌发的菌丝长成的菌落直径达5cm时进行纯化，经纯化的培养物即为毛韧革菌菌株，可用于与金耳进行搭配，所得的毛韧革菌菌株对应于金耳源产地编号为G1、G2、G3……Gn。
(4)金耳无性芽孢与毛韧革菌的交叉配对及子实体诱导培养
金耳与毛韧革菌的配对设计
将不同产地的金耳子实体与毛韧革菌菌株进行两两配对如下所示：
表1：金耳子实体与毛韧革菌配对设计表
G1 G2 G3 …… Gn
YB1 / YB1+G2 YB1+G3 …… YB1+Gn
YB2 YB2+G1 / YB2+G3 …… YB2+Gn
YB3 YB3+G1 YB3+G2 / …… YB3+Gn
…… …… …… …… / ……
YBn YBn+G1 YBn+G2 YBn+G3 …… /
子实体诱导培养基制作
诱导培养基配方：木屑56.8％、棉籽壳25％、麦麸15％、蔗糖3％、硫酸镁0.1％、磷酸二氢钾0.1％，含水量62％。配制好的培养基装入350ml组培瓶，每瓶装120g，压实，灭菌备用。
毛韧革菌菌丝培养
将纯化好的不同产地的毛韧革菌菌种接种到子实体诱导培养基中，24℃下黑暗培养7天后革菌菌丝覆盖满料面，即可用于与金耳无性芽孢配对。
子实体诱导培养
按照配对设计在革菌菌丝上接种金耳无性芽孢，然后22℃下黑暗培养60天，在组培瓶内长出小金耳即为配对成功。
(5)小金耳纯化
将配对诱导所得的小金耳通过组织分离法进行转接纯化，纯化3次后得到新的金耳菌株。
(6)出菇实验
取经配对重组且经纯化得到的金耳菌株，通过组织分离法扩繁为栽培种接种栽培袋，进行出菇实验，记录生产及商品性状指标数据。
(7)菌株综合评价
以各个菌株的生产及商品性状指标数据为基础，对各个重组菌株进行综合评价，筛选出表现优秀的重组菌株。
金耳广泛分布于云南和西藏的三江并流地区，如云南省的丽江、迪庆、怒江保山，西藏的林芝等地，可以方便地采集到野生种质资源，并且从野生的金耳子实体或菇木上分离纯的毛韧革菌和从金耳子实体分离金耳无性芽孢的技术已经很成熟，本发明方法是利用不同产地的金耳及其毛韧革菌之间遗传物质的差异，进行交叉组合配对，从而选育出金耳新品种。因此，该方法并不受特定地理和人为环境的限制，可重复实施，具有再现性和实用性。
发明效果：
利用金耳及毛韧革菌的多样性进行高产抗病的金耳新品种的培育方法，通过将不同产地的金耳无性芽孢与毛韧革菌进行交叉组合搭配，诱导培养出重组的金耳子实体菌株，使两个物种母本的优良性状结合到组合后所得的金耳子实体菌株中，然后通过无性扩繁保持其性状的稳定性以应用于生产，从而形成金耳的新菌株、新品种。本发明为金耳菌株或品种的选育提供了可行的途径，已经实际用于指导金耳菌株或品种选育，并成功获得高产抗病的金耳重组菌株或新品种。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分，而非全部。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在无需作出创造性劳动前提下所获得的所有变例，都落入本发明要求保护的范围。
实施例
1.1不同产地的金耳菌株收集及无性芽孢分离
1.1.1不同产地的金耳子实体的收集；
采集到丽江、贡山、维西三地的金耳的幼嫩子实体，以吸水纸包裹置于4℃下密封保存，48小时内使用组织分离法进行菌种分离。分离菌种时先将金耳子实体表面消毒，然后取5*5*5mm大小的一块金耳子实体组织块接种于金耳母种培养基上，金耳母种培养基配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂粉20g，KH2PO4 4g，MgSO4 3g。接种后黑暗培养，温度20℃，培养25天后金耳子实体组织块再生为小金耳，置于4℃冰箱保存备用，所得小金耳对应原产地编号为J1、J2、J3。
1.1.2金耳无性芽孢分离
取纯化好的金耳菌株的子实体组织块在液体芽孢分离培养基中进行搅拌培养，芽孢分离培养基配方(1L)为：马铃薯200g(煮汁)，蔗糖20g，KH2PO4 4g，MgSO4 3g，22℃下培养7天后液体菌种基呈淡橘黄色，取0.5ml液体菌种接种于母种培养基上，4天后培养皿表面长出丝状菌落及酵母状菌落，挑取酵母状菌落转接于母种培养基中，重复转接两次确认没有丝状菌落混杂其中后，取样提取DNA进行ITS鉴定，经ITS鉴定确认为金耳菌的酵母状培养物即为金耳无性芽孢，对应金耳母本原产地编号为YB1、YB2、YB3，保存备用。
1.2不同产地的毛韧革菌菌株的收集
在采集丽江、贡山、维西三地的金耳的幼嫩子实体的同时采集长有金耳子实体的菇木，常温干燥保存，3个月内进行菌种分离。分离菌种时先将菇木表面切削平整，然后消毒，在无菌环境中将菇木劈开，在金耳着生点处距离菇木表面5mm以下部位取小块木屑接种于金耳母种培养基上。接种后黑暗培养，温度24℃，培养6天后木屑上萌发的菌丝长成的菌落直径达5cm时进行纯化，经2次纯化后的培养物即为毛韧革菌菌株，置于4℃冰箱保存备用，所得的毛韧革菌菌株对应于金耳源产地编号为G1、G2、G3。
1.3金耳无性芽孢与毛韧革菌的交叉配对及子实体诱导培养
1.3.1金耳无性芽孢与毛韧革菌的配对设计
将不同产地的金耳子实体与毛韧革菌菌株进行两两配对，共有6个组合处理，如表3所示：
表3：金耳子实体与毛韧革菌配对表
G1 G2 G3
YB1 / YB1+G2 YB1+G3
YB2 YB2+G1 / YB2+G3
YB3 YB3+G1 YB3+G2 /
1.3.2子实体诱导培养基制作
为每个组合准备25瓶诱导培养基，配方：木屑56.8％、棉籽壳25％、麦麸15％、蔗糖3％、硫酸镁0.1％、磷酸二氢钾0.1％，含水量62％。配制好的培养基装入350ml组培瓶，每瓶装120g，压实，灭菌备用。
1.3.3毛韧革菌菌丝培养
将纯化好的不同产地的毛韧革菌菌种接种到子实体诱导培养基中，每个菌株接种50瓶，24℃下黑暗培养7天后革菌菌丝覆盖满料面，即可用于与金耳无性芽孢配对。
1.3.4子实体诱导培养
按照配对组合设计在革菌菌丝上接种金耳无性芽孢液体培养物0.5ml，每个组合接种25瓶，然后22℃下黑暗培养60天，在组培瓶内长出小金耳即为配对成功，以两种菌的母本编号对重组的金耳子实体菌株进行编号分别为：YB1G2、YB1G3、YB2G1、YB2G3、YB3G1、YB3G2。
1.4小金耳纯化
选取各个编号的重组菌株中生长状态最佳的金耳子实体，通过组织分离法进行转接纯化，纯化3次后保存备用。
1.5出菇实验
取纯化后的重组金耳菌株，通过组织分离法扩繁为栽培种接种栽培袋，进行出菇实验，金耳栽培袋培养基配方：棉籽壳58.9％，杂木屑25％，豆粕15％，石膏粉1％，KH2PO40.1％，含水量65％，自然pH，每袋。同时取母本金耳菌株进行出菇实验作为对照，记录生产性状及商品性状数据。
1.6菌株综合评价
以各个重组菌株的生产性状及商品性状指标数据为基础，对各个重组菌株进行综合评价，筛选出表现优秀的重组菌株为YB1G2号菌株。
该重组菌株较母本菌株J1G1在产量、成品率、污染率几个指标上提升显著，如表2所示。
表2：重组菌株与母本的生产性能对比
Figure BDA0002674942970000081
使用本发明的方法进行金耳菌株选育，获得了高产抗病的金耳重组菌株，编号为YB1G2，较母本菌株产量提升7.17％(41.01g/袋)、成品率提升20.34％、污染率下降3.16％。
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Claims (5)

1.一种通过金耳无性芽孢与毛韧革菌组合选育金耳新品种的方法，包括下列步骤：收集不同产地、具有不同遗传背景的金耳菌株，从中分离出纯金耳无性芽孢及纯毛韧革菌；两者交叉组合后诱导培养金耳子实体；选育得到综合了两个物种母本的优良性状的金耳子实体菌株。
2.权利要求1所述的方法，其中用于组合的毛韧革菌为固体培养基或液体培养基内的菌丝培养物。
3.权利要求1或2所述的方法，其中使用子实体诱导培养基进行诱导培养，从而形成新组合的子实体。
4.权利要求3所述的方法，其中诱导培养基的配方(基于重量百分比)包括木屑56.8％、棉籽壳25％、麦麸15％、蔗糖3％、硫酸镁0.1％、磷酸二氢钾0.1％。
5.权利要求1-4任一项所述的方法，其包括下列步骤：不同产地的金耳菌株收集及无性芽孢分离，不同产地的毛韧革菌菌株的收集，金耳无性芽孢与毛韧革菌的交叉组合配对及子实体诱导培养，小金耳纯化，出菇实验，以及菌株综合评价。
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Denomination of invention: A Method for Breeding a New Variety of Auricularia auricula by Combining Asexual Spores of Auricularia auricula with Trichoderma

Effective date of registration: 20230726

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Pledgor: YUNNAN MUSHROOM WORLD BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.

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