CN111887099A - 一种绿木霉菌及采用木霉诱导快速培育茯苓子实体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种采用木霉诱导快速培育茯苓子实体的方法。本发明以瓶栽培茯苓子实体，以木屑为茯苓子实体生长载体，采用绿木霉(Trichoderma virens)菌株Ws01的孢子刺激，有利于子实体早形成，且子实体生长快，仅需22天，比一般固体栽培提早15天以上出菇；培养基透气好，菌丝生长快，营养充足，茯苓子实体形成率高(可100％出菇)，且实现了茯苓子实体不用松木的栽培技术，既有利于充分，又促进了利用各种木料的尾料茯苓原料的中药企业的发展,能带来良好的生态效应、经济效应和社会效应。

Description

一种绿木霉菌及采用木霉诱导快速培育茯苓子实体的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种采用木霉诱导快速培育茯苓子实体的方法。
背景技术
子实体的形态特征是茯苓分类的重要依据，在自然界中茯苓子实体的形成长受到季节和环境条件的限制，在实验室的条件下也较难获得稳定的子实体。熊杰曾用茯苓菌核组织分离所得的菌丝体培养形成子实体，日本富永保人用试管和三角瓶纯培养以及木屑培养得到茯苓子实体，诸发会等通过比较不同固体培养基获得过茯苓子实体产生的最适固体培养条件，侯军等利用茯苓子培养基得到茯苓子实体。培养子实体时间较长，最短需要37天以上，且不能保证100％形成子实体，增加生产成本，降低劳动效率。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明公开了一种采用木霉诱导快速培育茯苓子实体的方法。本发明以瓶栽培茯苓子实体，以木屑为茯苓子实体生长载体，采用木霉孢子刺激，有利于子实体早形成，且子实体生长快，最快仅需22天，比一般固体栽培提早15天以上出菇；培养基透气好，菌丝生长快，营养充足，茯苓子实体形成率高(可100％出菇)，且实现了茯苓子实体不用松木的栽培技术，既有利于茯苓子实体的开发利用，又促进了利用各种木料的尾料茯苓原料的中药企业的发展,能带来良好的生态效应、经济效应和社会效应。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
第一方面，本发明提供了一种绿木霉(Trichoderma virens)菌株Ws01，菌株的ITS基因序列表如SEQ ID NO.1所述，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期为2020年8月6日，保藏编号为GDMCC No.61122。
该菌为链孢霉科真菌，菌丝为有隔分枝，无锁状联合，分生孢子梗是菌丝的短侧枝，侧枝上对称或互生分枝，形成二级和三级分枝，分枝角度为锐角或近于直角，在分枝末端形成瓶状小梗。分生孢子为卵圆形，绿色，簇生于小梗顶端。该菌在马铃薯葡萄糖琼脂平板上的生长状态为：1-2天菌丝为白色，气生菌丝发达，致密丛束状；3-5天后可形成绿色分生孢子。
本发明所述绿木霉菌Ws01经分子生物学技术鉴定，包括进行ITS-PCR扩增和测序，将获得的序列与Genbank中所登录的绿木霉序列比对，与绿木霉(Trichoderma virens)相似性为100％。
第二方面，本发明还提供了一种采用木霉诱导快速培育茯苓子实体的方法，包括如下步骤：
步骤一、制作茯苓子实体固体培养基；
步骤二、茯苓子实体固体培养基加入组培瓶中，然后在茯苓子实体固体培养基中接种含有茯苓菌丝的菌饼，于温度为25-28℃条件下暗培养，在茯苓菌丝长满固体培养基一半体积的组培瓶中，加入木霉孢子10-1000个/瓶，28-30℃继续培养10-15天后，出现菌丝扭结，突起逐渐分化，在光照强度为300-700lux条件下，继续培养8-13天后，得到片齿状的茯苓子实体。
进一步的改进，所述木霉为绿木霉菌Ws01，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2020年8月6日，保藏编号为GDMCC No.61122。
进一步的改进，所述茯苓子实体固体培养基包括以重量百分比计的木屑70％-80％、麸皮15％-25％、玉米1％-5％、蔗糖1％-3％。
进一步的改进，包括如下步骤：
步骤一、在组培瓶内加入松木屑、麸皮、玉米、蔗糖和水，料液比为1:3，装量为容积的1/3，121℃灭菌2h冷却后，接种直径为5-8mm的含茯苓菌丝的菌饼，在25-28℃条件下暗培养，培养4-7天，使茯苓菌丝长满固体培养基一半体积，备用；
步骤二、将绿木霉孢子悬浮液的浓度调整至1000-10000个/mL，备用；
步骤三、在茯苓菌丝已长满固体培养基一半体积的组培瓶中，加入绿木霉孢子10-1000个/瓶，至暂未被茯苓菌丝覆盖部位，在培养温度为28-30℃条件下继续培养10-15天后，出现菌丝扭结，突起逐渐分化，在光照强度为300-700lux的条件下，继续培养8-13天后，得到片齿状的茯苓子实体，呈丛壮；每瓶均可诱导出子实体，出菇率达100％。
一种绿木霉菌，所述绿木霉菌的保藏编号为GDMCC No.61122。
进一步的改进，所述绿木霉菌用于诱导培育茯苓子实体。
附图说明
图1为本发明流程图；
图2为实施例1茯苓子实体图和对比例1茯苓菌丝体图，其中A为实施例1瓶栽培育的茯苓子实体，B为对比例1的茯苓菌丝体图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
如图1所示的一种采用绿木霉诱导快速培育茯苓子实体的方法，包括如下步骤：
步骤一、在组培瓶内加入松木屑、麸皮、玉米、蔗糖和水，料液比为1:3，装量为容积的1/3，121℃灭菌2h冷却后，接种直径为5-8mm的含茯苓菌丝的菌饼，在25-28℃条件下暗培养，培养4-7天(本实施例为4天)，使茯苓菌丝长满固体培养基一半体积，备用；具体的，在380ml的组培瓶内加入180g茯苓子实体固体培养基，121℃灭菌2h冷却后，无菌条件下，接种3g的含茯苓菌丝的菌饼。
步骤二、将木霉孢子悬浮液的浓度调整至1000-10000个/mL，备用。
具体步骤为：木霉孢子为绿木霉菌Ws01，将绿木霉菌Ws01接种于PDA斜面培养基上，28℃培养5天，待产生大量绿色粉末样孢子，往培养好的含斜面菌种的试管内加入5ml无菌水，充分振荡摇匀，用血细胞计数板，在显微镜下进行计数，然后用无菌水稀释到木霉孢子浓度为1×104个/ml，得到木霉孢子悬浮液，备用；
步骤三、在茯苓菌丝已长满固体培养基一半体积的组培瓶中，加入绿木霉孢子10-1000个/瓶(本实施例为100个左右/瓶)，至暂未被茯苓菌丝覆盖部位，在培养温度为28-30℃(本实施例为28℃)、培养10-15天(本实施例为10天)后，出现菌丝扭结，突起逐渐分化，置于光照强度为300-700lux(本实施例为400lux)的条件下，继续培养8-13天(本实施例为8天)后，得到片齿状的茯苓子实体，呈丛壮；每瓶均可诱导出子实体，出菇率达100％，如图2的A所示。
根据以下公式，计算出菇率：
Figure BDA0002654323980000031
实施例2
一种采用绿木霉诱导快速培育茯苓子实体的方法，其茯苓子实体固体培养基包括以重量百分比计的木屑70％、麸皮25％、玉米粉2％、蔗糖3％，加水搅拌均匀，加水量为配置干料的3倍重量；
采用绿木霉诱导快速培育茯苓子实体的方法，其培育方法为：
步骤一、在380ml的组培瓶内加入200g茯苓子实体固体培养基，121℃灭菌2h冷却后，无菌条件下，接种2g的茯苓母种，在25℃条件下，暗培养7天，使茯苓菌丝长满固体培养基一半体积，备用；
步骤二、同实施例1；
步骤三、在茯苓菌丝已长满固体培养基一半体积的组培瓶中，加入绿木霉孢子10个/瓶，至暂未被茯苓菌丝覆盖部位，在培养温度为30℃、培养15天，出现菌丝扭结，突起逐渐分化，置于光照强度为300lux的条件下，继续培养13天后，得到片齿状的茯苓子实体，呈丛壮，出菇率达85％。
实施例3
一种采用绿木霉诱导快速培育茯苓子实体的方法，其茯苓子实体固体培养基包括以重量百分比计的木屑78％、麸皮15％、玉米粉5％、蔗糖2％，加水搅拌均匀，加水量为配置3倍重量；
采用绿木霉诱导快速培育茯苓子实体的方法，其培育方法为：
步骤一、在380ml的组培瓶内加入150g茯苓子实体固体培养基，121℃灭菌2h冷却后，无菌条件下，接种2g的茯苓母种，在28℃条件下，暗培养5天，使茯苓菌丝长满固体培养基一半体积，备用；
步骤二、同实施例1；
步骤三、在茯苓菌丝已长满固体培养基一半体积的组培瓶中，加入绿木霉孢子1000个/瓶，至暂未被茯苓菌丝覆盖部位，在培养温度为29℃、培养13天，出现菌丝扭结，突起逐渐分化，置于光照强度为700lux的条件下，继续培养10天后，得到片齿状的茯苓子实体，呈丛壮，出菇率为62％。
实施例4：与实施例1相比，加入绿木霉孢子10个/瓶，其它与实施例1相同。
实施例5：与实施例1相比，加入绿木霉孢子1000个/瓶，其它与实施例1相同。
实施例6：与实施例2相比，加入绿木霉孢子100个/瓶，其它与实施例2相同。
实施例7：与实施例2相比，加入绿木霉孢子1000个/瓶，其它与实施例2相同。
实施例8：与实施例3相比，加入绿木霉孢子10个/瓶，其它与实施例3相同。
实施例9：与实施例3相比，加入绿木霉孢子100个/瓶，其它与实施例3相同。
对比例1：在与实施例1其余步骤相同的基础上，不接种绿木霉菌Ws01的孢子，发现无子实体形成，如图2B所示。
对比例2：在与实施例1其余步骤相同的基础上，接种绿木霉菌Ws01的孢子的5000个/瓶，发现无子实体形成。
对比例3：在与实施例1其余步骤相同的基础上，接种绿木霉菌Ws01的孢子的10000个/瓶，发现无子实体形成。
实施例1-9和对比例1-3得到的加入木霉孢子数量对茯苓子实体形成天数和茯苓子实体的出菇率的影响，其结果如表1所示。
表1
木霉孢子数量(个/瓶) 出菇率(％) 培育出子实体的总天数
实施例1 100 100 22
实施例2 10 85 35
实施例3 1000 62 28
实施例4 10 80 32
实施例5 1000 71 22
实施例6 100 91 31
实施例7 1000 59 29
实施例8 10 75 37
实施例9 100 87 33
对比例1 0 0 无
对比例2 5000 0 无
对比例3 10000 0 无
通过表1可以看出，与对比例1相比，实施例1-9中的绿木霉Ws01可诱导茯苓菌丝扭结形成子实体，而在完全无菌培养条件(如对比例1)，茯苓菌丝很难形成子实体；对比例2-3中绿木霉Ws01孢子大于等于5000个/瓶时，绿木霉数量过高将竞争掠夺茯苓菌丝的营养基质，导致其茯苓菌丝无法扭结，无法形成子实体；
另外，通过表1还可以看出，与实施例4-5分别相比，实施例1培育出子实体的天数更短，出菇率也更高；与实施例6-7分别相比，实施例2培育出子实体的天数更短，出菇率也更高；与实施例8-9分别相比，实施例3培育出子实体的天数更短，出菇率也更高；加入绿木霉Ws01孢子的数量为100个/瓶时，比10个/瓶和1000个/瓶，茯苓子实体的出菇率更高。
综上所述，经本发明操作简单，可以快速培育出茯苓子实体，最短仅需22天，出菇率可达100％。有利于茯苓子实体的开发利用，能带来良好的经济效应。
绿木霉专利菌株ITS序列含594bp，如SEQ ID NO.1所示。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但并不仅仅限于说明书和实施方案中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里所示出叙述。
序列表
<110> 怀化学院
<120> 一种绿木霉菌及采用木霉诱导快速培育茯苓子实体的方法
<130> 2020.08.17-2
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 649
<212> DNA
<213> Trichoderma virens
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta tcgagttttg aaacaggttg tagctggctt 60
caaacgaagc atgtgcacgc ctggctcatc cactccttca acctctgtgc acttattgta 120
gatcggtgta aaggttagtt tggttaacaa actagctgta aagcctttct acgttttact 180
acaaacgctt cagttataga atgtattatc gcgtataacg catctttata caactttcag 240
caacggatct cttggctctc gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgtg 300
aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac cttgcgctct ctggtattcc 360
ggagagcatg cctgtttgag tgtcatggaa ttctcaacct tcaatacttt tttgtattga 420
aaggcttgga cttggaggct ttgtgctggc tgctcgttca gtcggctcct ctgaaatgca 480
ttagcgtgaa ttactacgga tcgcttcagc gtgataatta tctgcgctgt ggtcgtgaag 540
tgttaataag tttgcgcttc taatcgtcct tcattggaca attaacaacc ctgacttctg 600
acctcaaatc aggtaggact acccgctgaa cttaagcata tcaaaaagg 649

Claims (6)

1.一种采用木霉诱导快速培育茯苓子实体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、制作茯苓子实体固体培养基；
步骤二、茯苓子实体固体培养基加入组培瓶中，然后在茯苓子实体固体培养基中接种含有茯苓菌丝的菌饼，于温度为25-28℃条件下暗培养，在茯苓菌丝长满固体培养基一半体积的组培瓶中，加入木霉孢子10-1000个/瓶，28-30℃继续培养10-15天后，出现菌丝扭结，突起逐渐分化，在光照强度为300-700lux条件下，继续培养8-13天后，得到片齿状的茯苓子实体。
2.如权利要求1所述的采用木霉诱导快速培育茯苓子实体的方法，其特征在于，所述木霉为绿木霉菌Ws01，绿木霉菌Ws01的保藏编号为GDMCC No.61122。
3.如权利要求1所述的采用木霉诱导快速培育茯苓子实体的方法，其特征在于，所述茯苓子实体固体培养基包括以重量百分比计的木屑70％-80％、麸皮15％-25％、玉米1％-5％、蔗糖1％-3％。
4.如权利要求1所述的采用木霉诱导快速培育茯苓子实体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、在组培瓶内加入松木屑、麸皮、玉米、蔗糖和水，料液比为1:3，装量为容积的1/3，121℃灭菌2h冷却后，接种直径为5-8mm的含茯苓菌丝的菌饼，在25-28℃条件下暗培养，培养4-7天，使茯苓菌丝长满固体培养基一半体积，备用；
步骤二、将木霉孢子悬浮液的浓度调整至1000-10000个/mL，备用；
步骤三、在茯苓菌丝已长满固体培养基一半体积的组培瓶中，加入木霉孢子10-1000个/瓶，至暂未被茯苓菌丝覆盖部位，在培养温度为28-30℃条件下继续培养10-15天后，出现菌丝扭结，突起逐渐分化，在光照强度为300-700lux的条件下，继续培养8-13天后，得到片齿状的茯苓子实体，呈丛壮；每瓶均可诱导出子实体，出菇率达100％。
5.一种绿木霉菌，其特征在于，所述绿木霉菌的保藏编号为GDMCC No.61122。
6.如权利要求5所述的绿木霉菌，其特征在于，所述绿木霉菌用于诱导培育茯苓子实体。
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