CN114085790B - 申氏杆菌jc11、降解含苯酚废液的方法及应用 - Google Patents

申氏杆菌jc11、降解含苯酚废液的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种申氏杆菌JC11、降解含苯酚废液的方法及应用。菌株名称为Shinella sp.JC11，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC 62005)，保藏日期为2021年10月25日，保藏号：GDMCC No.62005。上述申氏杆菌JC11，可耐受苯酚浓度高于4000mg/L，在苯酚浓度为低于3000mg/L，含促生剂条件下，中低温时，3天内降解率可达到80％以上。因此，上述申氏杆菌JC11可应用于高浓度苯酚类溶液的降解中，具有良好应用前景。

Description

申氏杆菌JC11、降解含苯酚废液的方法及应用
技术领域
本申请涉及含酚废水细菌降解领域，具体涉及一种申氏杆菌JC11、降解含苯酚废液的方法及应用。
背景技术
苯酚类化合物广泛存在于化工厂废水、制药厂废水、纺织厂废水、焦化废水、钢铁厂废水和石化废水等工业废水中，我国将苯酚列入环境优先处理的污染物“黑名单”。该类化合物是一类原生质毒物，几乎对所有生物均有毒杀作用，含其污染饮用水水源和农田土壤时，可使鱼虫下等动物死亡，农作物生长受到抑制；长期饮用被酚污染的水或吸入低浓度酚蒸汽将会导致动物体神经系统中毒，而饮用高浓度酚溶液、吸入高浓度酚蒸汽则引起急性中毒；饮用水水源中苯酚类物质的质量浓度达到0.002mg/L，加氯消毒时就会产生氯酚恶臭味。目前，饮用水水源含挥发性酸的浓度不得高于0.001mg/L，其他水源水体中含酸类最高容许浓度为0.002mg/L。因苯酚类易溶于水且结构稳定，在自然界中不断积累，已对生态环境造成损害，严重威胁着人类的健康。
含酚废水的处理主要有两大类，即利用物理或物化方法处理和生物处理方法。物理或物化方法虽然操作较简单，但成本较高，处理不彻底，一般用于含酚废水的前处理。另一类是生物处理方法，其中活性污泥法是最常用的处理手段，利用活性污泥中的微生物降级苯酚类物质，该方法具有操作简单、费用较低、处理效果好和无二次污染等优点。对于高于1000mg/L浓度含酚废水一般利用物理回收的方法进行处理，现阶段可通过筛选高效菌株和构建基因工程菌来降解高浓度(1000～2000mg/L)的含酚废水。
目前，利用细菌生物降解苯酚类的研究中，张菊从甲醇厂污水中分离到了一株芽孢杆菌PD2，可在56h能降解完起始浓度为1800mg/L的苯酚溶液；陈晓华等筛选到一株苍白杆菌CH10，最大苯酚耐受度为1300mg/L，在温度30℃、pH 7.0、接种量5％下，能在48h内将初始浓度为1000mg/L的苯酚溶液降解82.2％。许甜甜等从活性污泥中分离到一株苯酚降解菌Sphingobium sp.，添加0.2g/L酵母膏作为共代谢基质，该菌36h内可将初始浓度为500mg/L苯酚降解68％。因高浓度的苯酚类溶液对细菌有抑制和杀菌作用，尚未见文献报道细菌对起始浓度为2000mg/L以上高浓度苯酚类溶液的降解研究。
发明内容
本申请实施例提供一种申氏杆菌JC11、降解含苯酚废液的方法及应用，以解决对起始浓度为2000mg/L以上高浓度苯酚类溶液降解的技术问题。
第一方面，本申请实施例提供一种申氏杆菌JC11，其保藏编号为：GDMCCNo.62005。
第二方面，本申请实施例提供一种降解含苯酚废液的方法，将上述的申氏杆菌JC11接种到含苯酚废液中进行培养，含苯酚废液中的苯酚起始浓度＞2000mg mg/L。
可选的，将上述的申氏杆菌JC11接种到含苯酚废液中进行培养的步骤包括：
将申氏杆菌JC11的种子液按含苯酚废液体积的1％的接种量接种，并加入促生剂，在温度15～25℃、转速100～180r/min下振荡培养3～8天。
可选的，促生剂包括以下以质量份计的组分：葡萄糖10份，(NH4)2SO4 3份，KH2PO40.5份，Na2HPO4·12H2O 0.5份，MgSO4·7H2O 0.3份，NaCl 1份,鱼粉蛋白胨0.5份。
第三方面，本申请实施例提供一种申氏杆菌JC11在降解含苯酚废液中的应用，其特征在于，含苯酚废液中的苯酚起始浓度＞2000mg/L。
上述申氏杆菌JC11，可耐受苯酚浓度高于4000mg/L，在苯酚浓度为低3000mg/L，含促生剂条件下，中低温时，3天内降解率可达到80％以上。因此，上述申氏杆菌JC11可应用于高浓度苯酚类溶液的降解中，具有良好应用前景。
上述JC11菌株为Shinella sp.JC11，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC62005)，保藏日期为2021年10月25日，保藏号：GDMCC No.62005。
附图说明
通过阅读以下参照附图对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显，其中，相同或相似的附图标记表示相同或相似的特征。
图1为申氏杆菌JC11的菌株形态特征图，a为菌落形态图，b为菌体革兰氏染色图；
图2为申氏杆菌JC11基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树。
具体实施方式
下面将详细描述本发明的各个方面的特征和示例性实施例，为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本发明进行进一步详细描述。应理解，此处所描述的具体实施例仅被配置为解释本发明，并不被配置为限定本发明。对于本领域技术人员来说，本发明可以在不需要这些具体细节中的一些细节的情况下实施。下面对实施例的描述仅仅是为了通过示出本发明的示例来提供对本发明更好的理解。
下面将详细描述本发明的各个方面的特征和示例性实施例。此外，下文中所描述的特征、结构或特性可以以任何合适的方式结合在一个或更多实施例中。
第一方面，本申请实施例提供一种申氏杆菌JC11，其保藏编号为：GDMCCNo.62005。
上述申氏杆菌JC11采自苯酚废液。上述菌株为Shinella sp.JC11，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2021年10月25日，保藏号：GDMCCNo.62005。
第二方面，本申请实施例提供一种降解含苯酚废液的方法，将上述的申氏杆菌JC11接种到含苯酚废液中进行培养，含苯酚废液中的苯酚起始浓度＞2000mg。
菌种扩大培养的过程一般为：保藏菌种首先经过琼脂斜面活化，然后经摇瓶(液体)或茄形培养瓶(固体)繁殖培养，最后转入种子罐进行扩大培养。
具体在本申请中，可先将申氏杆菌JC11扩大培养后，然后再接种到含苯酚废液中进行培养。其扩大培养过程包括：
1.斜面试管菌种活化培养。将申氏杆菌JC11，接种于斜面试管培养基，温度25℃培养2～5d，得到斜面菌种；
斜面试管培养基为第一培养基，第一培养基为含苯酚和葡萄糖的无机盐固体培养基。1000mL的含苯酚和葡萄糖的无机盐固体培养基中含苯酚1g、葡糖糖5g，(NH4)2SO4 3g，KH2PO4 0.5g,Na2HPO4·12H2O 0.5g，MgSO4 7H2O 0.3g，NaCl 0.2g,微量元素溶液1mL,琼脂15g蒸馏水1000mL，自然pH。
微量元素溶液：FeSO4·7H2O 0.5g,MnSO4·H2O 0.15g,ZnSO4 0.14g,CoCl2 0.2g，蒸馏水1000mL。
2.将无菌生理盐水加入含活化菌试管斜面中，使菌液浓度高于108/mL。
3.通过液体摇瓶进行扩大培养，得到种子液。在250mL锥形瓶中装入50mL液体摇瓶种子培养基，在高温高压下121℃灭菌20min，待自然冷却至室温，将斜面JC11菌接种到液体摇瓶种子培养基中，在温度15～25℃、转速100～180r/min下振荡培养4～8天，得到液体摇瓶种子液。
液体摇瓶种子培养基为第二培养基，第二培养基为含苯酚和葡萄糖的无机盐液体种子培养基。
1000mL的含苯酚和葡萄糖的无机盐液体培养基中含苯酚3g、葡糖糖5g，(NH4)2SO43g，KH2PO4 0.5g,Na2HPO4·12H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，NaCl 0.5g,微量元素溶液1mL,蒸馏水1000mL，自然pH。
在申氏杆菌JC11进行扩大培养后，接种到高浓度苯酚类溶液中可快速生长，迟缓期短。由于本申请的申氏杆菌JC11，可耐受苯酚浓度高于4000mg/L，在苯酚浓度低于3000mg/L，含促生剂条件下，中低温时，3天内降解率可达到80％以上。因此，上述降解含苯酚废液可采用申氏杆菌JC11对高浓度苯酚类溶液进行降解，其具有操作简单、费用较低、处理效果好和无二次污染等优点。
可选的，将上述的申氏杆菌JC11接种到含苯酚废液中进行培养的步骤包括：
将申氏杆菌JC11的种子液按含苯酚废液体积的1％的接种量接种，并加入促生剂，在温度15～25℃、转速100～180r/min下振荡培养4～8天。
以锥形瓶装载含苯酚废液为例，取锥形瓶，向每个锥形瓶中加入50mL的高浓度苯酚溶液和促生剂，加入苯酚溶液体积的1％的种子液，用封口膜封紧，混匀后放入120 -180r/min，温度12-25℃的条件下进行摇床培养。在该条件下，申氏杆菌JC11进行扩大培养后，接种到高浓度苯酚类溶液中可快速生长，迟缓期短。优选的温度为20～25℃。在该温度下，对苯酚的降解率更高。申氏杆菌JC11的种子液优选的接种量为按含苯酚废液体积的2％。
可选的，促生剂包括以下以质量份计的组分：葡萄糖10份，(NH4)2SO4 3份，KH2PO40.5份，Na2HPO4·12H2O 0.5份，MgSO4·7H2O 0.3份，NaCl 1份,鱼粉蛋白胨0.5份。该种促生剂有助于申氏杆菌JC11快速生长。
第三方面，本申请实施例提供一种申氏杆菌JC11在降解含苯酚废液中的应用，含苯酚废液中的苯酚起始浓度＞2000mg。
实施例1：高浓度苯酚降解菌的筛选与鉴定
1.降解菌的分离纯化
富集培养：将学校实验室含高浓度苯酚的原废液放入灭菌的锥形瓶中进行富集培养，每个锥形瓶装50mL的样品水，装3瓶，标号为1号，2号和3号。然后依次按标号向锥形瓶中加入10μL，20μL，30μL的苯酚溶液，混匀后放入150r/min，温度25℃的条件下进行摇床培养2-3d。
初筛：用稀释平板法分离苯酚降解菌，在无菌操作下，将三个锥形瓶中的富集培养液用十倍稀释法稀释后，各取0.1mL的10-1，10-2和10-3三个浓度的稀释液于含有1000mg/L苯酚的牛肉膏蛋白胨培养基平板中，然后使用无菌的涂布棒进行涂布。每瓶锥形瓶的每种浓度的每种培养基平行三次并做好标签。将涂布完的牛肉膏蛋白胨培养基平板倒置放在25℃恒温箱内培养3-4d后，取单菌落在相应培养基平板上进行纯化，获得纯培养物。
复筛：每日观察材料，等到每个平板上长出可见菌落时，及时挑取菌落至2000mg/L-4000mg/L苯酚的牛肉膏蛋白胨培养基液体培养基中，150r/min，温度25℃的条件下进行摇床培养2-3d。选取耐苯酚，生长速度快的菌株，其中一株菌株名称为JC11，在苯酚浓度为4000mg/L的牛肉膏蛋白胨培养基液体培养基中可生长。
2.降解菌的形态学鉴定
直接观察：将放置在恒温箱中纯化完成的平板拿到光线明亮的地方直接用肉眼观察，菌种形态特征如图1a所示，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中菌落较小，呈米色，表面光滑湿润。
显微镜观察(革兰氏染色)：首先用75％的酒精棉球擦拭桌面，然后点燃酒精灯，再在载玻片上滴加一小滴清水，用灭好菌的接种环取一个单菌落，轻轻的在清水中涂匀，待其自然干，然后滴加1-2滴草酸铵结晶紫染液初染，染色1min，用小水缓慢洗掉染液，再滴加1-2滴碘液媒染，染色1min，水洗，再滴加95％的乙醇脱色20-40s，水洗，最后滴加1-2滴番红复染，染色1min，水洗，待载玻片干后，盖上盖玻片，用油镜观察，菌体颜色、大小、形状如图1b所示，呈革兰氏阴性，杆状，大小(0.3-0.4)μm×(1.4-2.5)μm。
2.降解菌的16S rDNA鉴定
用细菌基因组试剂盒提取高浓度苯酚降解菌JC11基因组DNA，用扩增细菌16SrDNA的通用引物27F:5’to 3’-agagtttgatcmtggctcag-(SEQ ID NO.1)、1541R:5’to 3’-aaggaggtgatccagccgca-(SEQ ID NO.2)，扩增JC11菌株的16S rDNA序列，片段DNA纯化后送擎科(长沙)生物科技有限公司测序，具体序列如SEQ ID NO.3所示，序列在NCBI数据库中进行BLAST对比，并构建系统发育树，结果表明JC11菌株与Shinella zoogloeoides在同一个分支上，同源性最高的为99％。综合菌体形态特征和分子生物学特征，申氏杆菌JC11为Shinella sp.。
实施例2申氏杆菌JC11对不同高浓度苯酚溶液的降解
1.斜面试管菌种活化培养。将Shinella sp.JC11菌株，接种于斜面试管培养基，温度25℃培养2～5d，得到斜面菌种；
斜面试管培养基为含含苯酚和葡萄糖的无机盐固体培养基，配方为苯酚1g、葡糖糖5g，(NH4)2SO4 3g，KH2PO4 0.5g,Na2HPO4·12H2O 0.5g，MgSO4 7H2O 0.3g，NaCl 0.2g,微量元素溶液1mL，琼脂15g蒸馏水1000mL，自然pH；
微量元素溶液：FeSO4·7H2O 0.5g,MnSO4·H2O 0.15g,ZnSO4 0.14g,CoCl2 0.2g，蒸馏水1000mL；
2.将无菌生理盐水加入含活化菌试管斜面中，使菌液浓度高于108/mL。
3.通过液体摇瓶进行扩大培养，得到种子液。在250mL锥形瓶中装入50mL液体摇瓶种子培养基，将斜面JC11菌接种到液体摇瓶种子培养基中，在温度15～25℃、转速100～180r/min下振荡培养4～8天，得到液体摇瓶种子液。
所述液体摇瓶种子培养基为：葡糖糖5g，(NH4)2SO4 3g，KH2PO4 0.5g,Na2HPO4·12H2O 0.5g，MgSO4 7H2O 0.3g，NaCl 0.5g，蒸馏水1000mL，自然pH，121℃灭菌20min，待自然冷却至室温后加入苯酚3g、微量元素溶液1mL。
所述微量元素溶液含FeSO4·7H2O 0.5g，MnSO4·H2O 0.15g，ZnSO4 0.14g,CoCl20.2g，蒸馏水1000mL，用孔径为0.45μm的微孔无菌过滤器过滤后使用。
4.高浓度苯酚溶液的降解。将上述种子液按体积比为1％的接种量转接装液量为50mL浓度为2000mg/L的苯酚溶液中，并加入促生剂0.8g，在温度15℃、转速150r/min下振荡培养3天。对照组不接种种子液，其他同上。
促生剂配方为：葡萄糖10份，(NH4)2SO4 3份，KH2PO4 0.5份，Na2HPO4·12H2O 0.5份，MgSO4·7H2O 0.3份，NaCl 1份,鱼粉蛋白胨0.5份。
5.苯酚含量测定。
采用氧化还原滴定法。用移液管吸取苯酚试液10.00mL，置于250mL碘量瓶中，再用移液管吸取10.00mL KBrO3-KBr溶液放入碘量瓶中，加入10mL 6mol/L HCL，迅速加盖水封，立即摇动1～2分钟，再静置5分钟，加入10％ KI 10mL，迅速加盖摇匀，用少量水冲洗瓶盖及瓶上附着物。然后用0.05mol/L Na2S2O3标准溶液滴定至溶液呈黄色，加入淀粉溶液3mL，继续滴定至溶液的蓝色退掉即为终点。记下Na2S2O3标准溶液的用量为V。
空白试验：准确吸取10.00mL KBrO3-KBr标准溶液加入250mL碘量瓶中，并加入10mL去离子水及10mL 6mol/L HCl溶液，迅速加塞振荡1～2分钟，再避光静置5分钟，加入10％ KI 10mL，迅速加盖摇匀，用少量水冲洗瓶盖及瓶上附着物。然后，用0.05mol/LNa2S2O3标准溶液滴定至溶液呈黄色，加入淀粉溶液3mL，继续滴定至溶液的蓝色退掉即为终点。记下Na2S2O3标准溶液的用量为V0；
σ：苯酚的浓度；c：Na2S2O3标准溶液的浓度；V:滴定苯酚试样时消耗Na2S2O3标准滴定溶液的体积，mL；V0——空白实验消耗Na2S2O3标准滴定溶液的体积，mL；
降解率计算：
σ0：同时间段对照组中苯酚溶液浓度；σ：实验组苯酚溶液浓度
实施例3
与实施例2相比，苯酚溶液浓度为2000mg/L，种子液接种量为2％，温度为20℃，其它与实施例2相同。
实施例4
与实施例2相比，苯酚溶液浓度为2000mg/L，种子液接种量为3％，温度为25℃，其它与实施例2相同。
实施例5
与实施例2相比，苯酚溶液浓度为3000mg/L％，种子液接种量为1％，温度为20℃，其它与实施例2相同。
实施例6
与实施例2相比，苯酚溶液浓度为3000mg/L，种子液接种量为2％，温度为25℃，其它与实施例2相同。
实施例7
与实施例2相比，苯酚溶液浓度为3000mg/L，种子液接种量为3％，温度为16℃，其它与实施例2相同。
实施例8
与实施例2相比，苯酚溶液浓度为4000mg/L，种子液接种量为1％，温度为25℃，其它与实施例2相同。
实施例9
与实施例2相比，苯酚溶液浓度为4000mg/L，种子液接种量为2％，温度为15℃，其它与实施例2相同。
实施例10
与实施例2相比，苯酚溶液浓度为4000mg/L，种子液接种量为3％，温度为20℃，其它与实施例2相同。
实施例11申氏杆菌JC11对高浓度苯酚废水原液的降解
取高浓度工业苯酚(浓度高于3000mg/L)废水原液，采用氧化还原滴定法测定工业废液中苯酚含量。JC11种子液按体积比为2％的接种量转接装液量为50mL工业废液中，在24℃，150r/min的条件下，摇床培养，并测定降解率。
将实施例2-11的苯酚降解率测定，其结果如表1所示。
表1
上述申氏杆菌JC11，可在苯酚初始浓度2000mg/L～4000mg/L，温度为15～25℃且申氏杆菌JC11接种量为1～3％的条件下均可有效的降解苯酚。温度为20～25℃相较于15℃，为更适宜温度，在该温度下，对苯酚的降解率相对较高。优选的，接种量为3％，在该接种量下，对苯酚的降解率相对较高。可见，上述申氏杆菌JC11可应用于高浓度苯酚类溶液的降解中，具有良好应用前景。
依照本申请如上文所述的实施例，这些实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该申请仅为所述的具体实施例。显然，根据以上描述，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本申请的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地利用本申请以及在本申请基础上的修改使用。本申请仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
序列表
<110> 怀化学院
<120> 申氏杆菌JC11、降解含苯酚废水的方法及应用
<141> 2021-11-11
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaggaggtga tccagccgca 20
<210> 3
<211> 1287
<212> DNA
<213> 申氏杆菌（Shinella sp.）
<400> 3
gggtgagtaa cgcgtgggaa tctacccatc tctacggaat aactcaggga aacttgtgct 60
aataccgtat acgcccttcg ggggaaagat ttatcggaga tggatgagcc cgcgttggat 120
tagctagttg gtggggtaaa ggcctaccaa ggcgacgatc catagctggt ctgagaggat 180
gatcagccac attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtggggaa 240
tattggacaa tgggcgcaag cctgatccag ccatgccgcg tgagtgatga aggccctagg 300
gttgtaaagc tctttcaccg gtgaagataa tgacggtaac cggagaagaa gccccggcta 360
acttcgtgcc agcagccgcg gtaatacgaa gggggctagc gttgttcgga attactgggc 420
gtaaagcgca cgtaggcggg tatttaagtc aggggtgaaa tcccggagct caactccgga 480
actgcctttg atactgggta cctagagtat ggaagaggta agtggaattc cgagtgtaga 540
ggtgaaattc gtagatattc ggaggaacac cagtggcgaa ggcggcttac tggtccatta 600
ctgacgctga ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 660
ccgtaaacga tgaatgttag ccgtcggcat gcatgcatgt cggtggcgca gctaacgcat 720
taaacattcc gcctggggag tacggtcgca agattaaaac tcaaaggaat tgacgggggc 780
ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgcagaacc ttaccagccc 840
ttgacatgtc ggtcgcggat tacagagatg ttttccttca gttaggctgg accgaacaca 900
ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 960
cgcaaccctc gcccttagtt gccagcattc agttgggcac tctaagggga ctgccggtga 1020
taagccgaga ggaaggtggg gatgacgtca agtcctcatg gcccttacgg gctgggctac 1080
acacgtgcta caatggtggt gacagtgggc agcgagacag cgatgtcgag ctaatctcca 1140
aaagccatct cagttcggat tgcactctgc aactcgagtg catgaagttg gaatcgctag 1200
taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1260
acaccatggg agttggtttt acccgaa 1287

Claims (4)

1.一种申氏杆菌（Shinella sp.）JC11，其特征在于，其保藏编号为：GDMCC No.62005。
2.一种降解含苯酚废液的方法，其特征在于，将权利要求1所述的申氏杆菌（Shinella sp.）JC11接种到含苯酚废液中进行培养，所述含苯酚废液中的苯酚起始浓度＞2000 mg/L。
3.根据权利要求2所述的降解含苯酚废液的方法，其特征在于，所述将权利要求1所述的申氏杆菌（Shinella sp.）JC11接种到含苯酚废液中进行培养的步骤包括：
将所述申氏杆菌（Shinella sp.）JC11的种子液按含苯酚废液体积的1%的接种量接种，并加入促生剂，在温度15～25℃、转速100～180 r/min下振荡培养3~8天；
所述促生剂包括以下以质量份计的组分：葡萄糖10份，(NH4)2SO4 3份，KH2PO4 0.5份，Na2HPO4·12H2O 0.5份，MgSO4·7H2O 0.3份，NaCl 1份， 鱼粉蛋白胨0.5份。
4.一种如权利要求1所述的申氏杆菌（Shinella sp.）JC11在降解含苯酚废液中的应用，其特征在于，所述含苯酚废液中的苯酚起始浓度＞2000 mg/L。
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