CN111034537A - 一种快速分离银耳纯菌丝及银耳母种的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种银耳母种的制备方法。本申请通过分离香灰菌丝，制备含香灰菌培养物的木屑培养基，然后将分离得到的银耳纯菌丝与香灰菌丝在含香灰菌培养物的木屑培养基上交合培养制备银耳母种。与传统方法相比，本发明分离的银耳纯菌丝，具有萌发时间短、生长健壮、洁白浓密等特点；银耳纯菌丝的分离及银耳母种制备，都在同一瓶木屑培养基中完成，操作简单方便，避免了多次转接对银耳纯菌丝的损伤和转接过程可能出现的杂菌污染，同时缩短了银耳母种的制备时间，有效地降低了银耳母种制备的成本。

Description

一种快速分离银耳纯菌丝及银耳母种的制备方法

技术领域

本发明涉及食用菌培养技术领域，具体涉及一种银耳母种的制备方法。

背景技术

银耳是担子菌门、银耳纲、银耳目、银耳科、银耳属真菌的子实体，又称作白木耳、雪耳、银耳子等，有“菌中之冠”的美称。银耳一般呈菊花状或鸡冠状，柔软洁白，半透明，富有弹性。银耳作为我国传统的食用菌，历来都是深受广大人民所喜爱的食物。通常作为烹调各类菜肴的主要配料，其中所含有的活性成分银耳多糖具有特殊的保健功能。和普通食用菌菌种最大的不同是银耳菌种具有两种菌种，即不管制备母种、原种或栽培种，在每支试管、每个菌种瓶、每个种植袋中都必须让银耳纯菌丝和伴生菌香灰菌丝在培养基中按比例协调生长，才能培养出有实用价值的，可用于实际种植的有效菌种。

银耳纯菌丝是由担孢子萌发生成，有横膈膜，具明显锁状联合的双核菌丝；白色、淡黄色以及由白色至黄色之间的各种中间色，气生菌丝直立、斜立或平贴于培养基表面，生长速度缓慢。香灰菌丝：香灰菌是银耳栽培中的一个伴生菌，菌丝初无色，大量生长时白色，羽毛状，老菌丝变淡黄色、淡棕色，培养基逐渐由淡褐色变为黑色或黑带绿色。培养基表面的气生菌丝呈细绒状，有时有碳渍的黑疤。木屑培养基：是由木屑、麦麸、蔗糖、石膏粉等按一定比例混合，含水量在55％-65％之间，专门用于栽培食用菌的一类培养基。

传统的银耳纯菌丝分离，大多采用琼脂培养基，孢子萌发困难，极易转变成分生孢子，即使萌发成菌丝，生长也十分缓慢，容易老化变黄，活力下降。因此，寻找一种新的培养基及菌丝分离方法，快速有效地分离出银耳纯菌丝，成为银耳母种制备的关键。

目前，银耳纯菌丝的分离，常采用多孢子分离法和基内菌丝分离法。

(1)多孢子分离法

又称孢子弹射法。它是利用银耳子实层弹射有性孢子(担孢子)萌发成菌丝来获得纯白菌丝的一种方法。孢子弹射法使用的培养基大多为琼脂培养基，孢子在培养基上形成许多乳白色、糊状的小菌落，这是银耳的酵母状分生孢子。不管是银耳担孢子或酵母状分生孢子，在琼脂培养基上，都不容易萌发成菌丝，所以在实际生产中较少应用。

(2)基内分离法

切去银耳子实体，挖出耳基正下方基质块，将基质块用纱布包好，置于底层放有变色硅胶或五氧化二磷干燥剂的玻璃干燥器中强行脱水10-20天，或置于阴凉通风处30天左右风干。利用两种菌丝不同的耐旱力，使不耐旱的香灰菌丝枯死。在无菌箱内，把基质块切开，在基质块的中上层，勾取白色菌丝，接种在琼脂培养基上，获得的纯白菌丝移接斜面培养基中，在萌发的菌丝中进行提纯、转管培养。基内分离法是利用银耳菌丝和香灰菌丝不同的耐旱能力，将两者分开，但可能因干燥不彻底，仍参杂有香灰菌丝；或干燥时间过长，中途可能会污染其他杂菌；若琼脂培养基偏湿或表面存在水滴，培养后则易出现以酵母状分生孢子方式增殖的现象或同时出现银耳纯菌丝与酵母状分生孢子。银耳纯菌丝在琼脂培养基上生长十分缓慢，在室温下培养20天左右，其菌落只有豆粒大小。银耳纯菌丝保存在琼脂培养基上，容易变黄，活力减弱，易胶质化形成小耳片，或转变成酵母状分生孢子，不利于长期保存。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速分离银耳纯菌丝及银耳母种制备方法

本发明所采取的技术方案是：

分离香灰菌丝：在栽培银耳的菌袋上，接近底部有大理石状斑纹的部分，挖取一小块木屑，接入马铃薯葡萄糖琼脂培养基的试管中。这一部分含香灰菌丝多，接种后放在23-25℃的环境中，经3-5天，即生白色粗壮的菌丝，然后转为黄绿色，再转为黑色。用接种针挑取黑色的部分，接入新试管中。这样转接几次，即得纯香灰菌丝。

制备含香灰菌培养物的木屑培养基：将分离纯化的香灰菌丝接种至消毒好的瓶装木屑培养基上，23-25℃的环境中培养5-7天，待菌丝长至距瓶底约二分之一处时，获得香灰菌培养物；将香灰菌培养物置于灭菌锅121℃，30分钟，杀死香灰菌丝，冷却即得用于分离银耳纯菌丝的含香灰菌培养物的木屑培养基。

分离银耳纯菌丝：选择符合种耳标准(子实体生长28天左右，朵大7cm～8cm，朵型圆正，生长健壮，耳片白且厚，无病害的银耳菌袋，见图1)的银耳子实体作为分离材料，剪取1平方厘米左右的小耳片，用无菌水冲洗2-3次，将其置于75％的酒精或0.1％升汞溶液中浸泡两分钟，杀灭耳片表面的杂菌。将浸泡过杀菌剂的小耳片，立即放入无菌水中，冲洗2-3次，再用无菌纱布吸干水分，接种至消毒好含香灰菌培养物的木屑培养基中。在23-25℃的环境中培养15-20天，待孢子散落至含香灰菌培养物的木屑培养基上，萌发出粗壮、丰满的白毛团，即得银耳纯菌丝。

交合培养：用接种钩勾取上述分离所得香灰菌丝，放在银耳纯菌丝旁边。在室温22℃-25℃培养10-15天，此时白毛团分泌黄色或棕红色水珠，再经3-5天培养，白毛团胶质化，出现银耳原基，即可作为银耳母种。

本申请的有益效果是：

银耳菌虽然是一种木腐菌，但它分解纤维的能力很弱，若直接把银耳纯菌丝单独接种至木屑或棉籽壳培养基上，菌丝生长缓慢或不生长，也无法胶质化长出银耳耳片。香灰菌是银耳菌丝的伴生菌，其生长速度较快，对木质素和纤维素的分解能力强，能将培养基中大分子物质降解成供银耳菌丝分解利用的小分子营养物质，被称为银耳菌丝的“开路先锋”。野生环境状态下，银耳菌的孢子散落在被香灰菌分解的腐木，萌发成银耳菌丝，在合适的温湿度条件下迅速生长并胶质化，最后形成银耳。

本申请利用含香灰菌培养物的木屑培养基作为分离培养基，创造出一种类似野生环境的状态，使银耳孢子能快速萌发，并形成具有很高活力，浓密洁白的银耳纯菌丝。在此含香灰菌培养物的木屑培养基上，银耳孢子萌发时间短，不易转变成酵母状分生孢子，所得的银耳纯菌丝浓密、洁白，并能长期保持活力，不易变黄或胶质化。待银耳纯菌丝形成白毛团后，用接种钩勾取上述分离所得香灰菌丝，放在白毛团旁边。在室温22℃-25℃培养10-15天，此时白毛团分泌黄色或棕红色水珠，再经3-5天培养，白毛团胶质化，出现银耳原基，即可作为银耳母种。而传统的银耳菌种制备方法是在琼脂培养基上单独分离出香灰菌丝和银耳纯菌丝，再将其接种至木屑培养基表面进行交合。

本申请直接在木屑培养基上分离银耳纯菌丝，然后再将香灰菌丝回接至银耳纯菌丝旁，即可制成银耳母种。与传统方法相比，本发明分离的银耳纯菌丝，具有萌发时间短、生长健壮、洁白浓密等特点；银耳纯菌丝的分离及银耳母种制备，都在同一瓶木屑培养基中完成，操作简单方便，避免了多次转接对银耳纯菌丝的损伤和转接过程可能出现的杂菌污染，同时缩短了银耳母种的制备时间，有效地降低了银耳母种制备的成本。

附图说明

图1是银耳种耳标准品，银耳种耳标准品朵大、圆正、耳片厚、无病害。

图2是银耳耳片在灭菌后含香灰菌培养物的木屑培养基上萌发的银耳纯菌丝。

图3是银耳纯菌丝在琼脂培养基上的生长状况：偏黄、易胶质化。

具体实施方式

实施例1

本实施例为一种快速分离银耳纯菌丝及银耳母种的制备方法，其具体制备步骤如下：

(1)分离香灰菌丝：在栽培银耳的菌袋上，接近底部有大理石状斑纹的部分，挖取一小块木屑，接入马铃薯葡萄糖琼脂培养基的试管中。这一部分含香灰菌丝多，接种后放在23-25℃的环境中，经3-5天，即生白色粗壮的菌丝，然后转为黄绿色，再转为黑色。用接种针挑取黑色的部分，接入新试管中。这样转接几次，即得纯香灰菌丝。

(2)制备含香灰菌培养物的木屑培养基：将分离纯化的香灰菌丝接种至消毒好的瓶装木屑培养基上，23-25℃的环境中培养5-7天，待菌丝长至距瓶底约二分之一处时，获得香灰菌培养物；将香灰菌培养物置于灭菌锅121℃，30分钟，杀死香灰菌丝，冷却即得用于分离银耳纯菌丝的含香灰菌培养物的木屑培养基。

(3)分离银耳纯菌丝：选择符合种耳标准的银耳子实体作为分离材料，剪取1平方厘米左右的小耳片，用无菌水冲洗2-3次，将其置于75％的酒精或0.1％升汞溶液中浸泡两分钟，杀灭耳片表面的杂菌。将浸泡过杀菌剂的小耳片，立即放入无菌水中，冲洗2-3次，再用无菌纱布吸干水分，接种至消毒后含香灰菌培养物的木屑培养基中。在23-25℃的环境中培养15-20天，待孢子散落至含香灰菌培养物的木屑培养基上，萌发出粗壮、丰满的白毛团，即得银耳纯菌丝(图2)。

(4)交合培养：用接种钩勾取上述分离所得香灰菌丝，放在银耳纯菌丝旁边。在室温22℃-25℃培养10-15天，此时白毛团分泌黄色或棕红色水珠，再经3-5天培养，白毛团胶质化，出现银耳原基，即可作为银耳母种。

实施例2

本实施例为银耳纯菌丝在琼脂培养基上的生长情况(图3)。

将实施例1中符合种耳标准的银耳子实体作为分离材料，剪取1平方厘米左右的小耳片，用无菌水冲洗2-3次，将其置于75％的酒精或0.1％升汞溶液中浸泡两分钟，杀灭耳片表面的杂菌。将浸泡过杀菌剂的小耳片，立即放入无菌水中，冲洗2-3次，再用无菌纱布吸干水分，接种至消毒后的琼脂培养基中。

实施例3

本实施例为银耳纯菌丝在木屑培养基上的生长情况。

将实施例1中符合种耳标准的银耳子实体作为分离材料，剪取1平方厘米左右的小耳片，用无菌水冲洗2-3次，将其置于75％的酒精或0.1％升汞溶液中浸泡两分钟，杀灭耳片表面的杂菌。将浸泡过杀菌剂的小耳片，立即放入无菌水中，冲洗2-3次，再用无菌纱布吸干水分，接种至消毒后的木屑培养基中。

实施例1、2、3结果对比如下：

银耳纯菌丝在不同培养基上的生长情况

实施例4

本实施例为传统制种方法下，银耳母种的制备过程。

1、孢子分离：在超净工作台上，将消毒过的种耳,用剪刀剪取拇指大小的耳片,挂在钢钩上,迅速移入装有马铃薯葡萄糖琼脂培养基的三角瓶内。耳片距离培养基约2-3厘米,不可接触到瓶壁,随手把棉塞塞入瓶口，置于25℃条件下培养24小时。当看到培养基上方有雾状的孢子后，再搬入超净工作台内，取出钢钩和耳片，塞好绵塞，置于25℃培养2-3天。此时在培养基的表面上，就能看到白色糊状、边缘光滑的菌落，这就是银耳孢子。用接种针挑取少量银耳孢子，转接至新的琼脂培养基试管中继续培养，待孢子萌发，即得银耳纯菌丝。

2、香灰菌丝分离：在栽培银耳的菌袋上，接近底部有大理石状斑纹的部分，挖取一小块木屑，接入马铃薯葡萄糖琼脂培养基的试管中。这一部分含香灰菌丝多，接种后放在23-25℃的环境中，经3-5天，即生白色粗壮的菌丝，然后转为黄绿色，再转为黑色。用接种针挑取黑色的部分，接入新试管中。这样转接几次，即得纯香灰菌丝。

3、交合培养：将一块带琼脂培养基似米粒大的银耳纯菌丝,转接到另一支琼脂斜面上,置于22-24℃下培养5-7天。待银耳菌丝直径达1厘米以上时,在其旁边接入一小点带琼脂培养基的香灰菌丝,在相同温度下继续培养7天左右,出现绣球状白毛团。10天后在白毛团上方出现无色或淡黄色水珠，即得银耳试管原种。将试管原种上的白毛团，连同部分香灰菌，一起转接到灭菌后的木屑培养基，置于22-25℃培养15天左右，接种块会出现浓白色的菌丝；20天左右菌丝开始扭结，并出现棕色水珠，再培养5天左右，出现子实体原基，即得银耳母种。

本发明与传统制种方法的对比

制种方法	转接次数	操作难易程度	污染机率	制作花费时间
					传统制种	≧5次	复杂	较高	45-60天
本发明制种	2-3次	简单	很小	30-40天

Claims (10)

1.一种银耳母种制备方法，其特征在于：所述银耳母种制备方法步骤如下：

1)分离香灰菌丝：将未纯化的香灰菌丝接种入培养基，等到香灰菌丝颜色转为黑色，挑取黑色部分，接种入新培养基，连续转接得纯香灰菌丝；

2)制备含香灰菌培养物的木屑培养基：将分离纯化的香灰菌丝接种至消毒好的木屑培养基上，培养获得香灰菌培养物；将香灰菌培养物灭菌，冷却即得含香灰菌培养物的木屑培养基；

3)分离银耳纯菌丝：选择符合种耳标准的银耳子实体作为分离材料，剪取耳片，杀灭耳片表面的杂菌；然后吸干小耳片表面水分，接种至所述含香灰菌培养物的木屑培养基中；培养得银耳纯菌丝；

4)交合培养：勾取纯香灰菌丝，接种在银耳纯菌丝旁边培养，待出现白毛团胶质化，出现银耳原基，得银耳母种。

2.根据权利要求1所述的银耳母种制备方法，其特征在于：步骤1)分离香灰菌丝中在栽培银耳的菌袋上挖取一块0.2-0.4cm³带有香灰菌丝的木屑，接入马铃薯葡萄糖琼脂培养基的试管中。

3.根据权利要求1所述的银耳母种制备方法，其特征在于：步骤1)中将接种入培养基的香灰菌丝放在23-25℃的环境中。

4.根据权利要求1所述的银耳母种制备方法，其特征在于：步骤2)中，将分离纯化的香灰菌丝接种至消毒好的瓶装木屑培养基上，23-25℃的环境中培养5-7天。

5.根据权利要求1所述的银耳母种制备方法，其特征在于：步骤3)中，符合种耳标准的银耳子实体为生长25-30天，朵大7-8cm，无病害的银耳菌袋。

6.根据权利要求1所述的银耳母种制备方法，其特征在于：步骤3)中，剪取的耳片面积为0.9～1.1cm²。

7.根据权利要求1所述的银耳母种制备方法，其特征在于：步骤3)中，剪取的耳片用无菌水冲洗2-3次，并进行灭菌溶液浸泡灭菌。

8.根据权利要求7所述的银耳母种制备方法，其特征在于：所述灭菌溶液为75％的酒精或0.1％升汞溶液，浸泡时间为1.5～2分钟。

9.根据权利要求1所述的银耳母种制备方法，其特征在于：步骤3)中，将浸泡过杀菌溶液的小耳片，立即放入无菌水中，冲洗2-3次，再用无菌纱布吸干水分，接种至消毒好后香灰菌培养物的木屑培养基中；在23-25℃的环境中培养15-20天，待孢子散落至含香灰菌培养物的木屑培养基上，萌发出粗壮、丰满的白毛团，即得银耳纯菌丝。

10.根据权利要求1所述的银耳母种制备方法，其特征在于：步骤4)中用接种钩勾取上述分离所得香灰菌丝，放在银耳纯菌丝旁边，在室温22-25℃培养10-15天，此时白毛团分泌黄色或棕红色水珠，再经3-5天培养，白毛团胶质化，出现银耳原基，即可作为银耳母种。

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