CN112042465A - 一种通过金耳子实体与外源毛韧革菌组合选育金耳新品种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于食用菌栽培领域，具体涉及一种金耳高产抗病新品种的培育方法，通过将不同产地、具有优良性状的金耳的子实体组织块与毛韧革菌进行交叉组合搭配，再通过新的金耳子实体与外源毛韧革菌的循环组合，使外源毛韧革菌的遗传物质替换掉金耳母本中携带的毛韧革菌的遗传物质，从而将两个物种母本的优良性状结合到组合后所得的金耳子实体菌株中，然后通过无性扩繁保持其性状的稳定性以应用于生产，最终形成金耳的新菌株、新品种。本发明为金耳菌株或品种的选育提供了可行的途径，同时也针对由金耳中的毛韧革菌退化造成生产性能退化的金耳菌种的复壮提供了可行的途径。

Description

一种通过金耳子实体与外源毛韧革菌组合选育金耳新品种的 方法

技术领域

本发明属于食用菌栽培领域，具体涉及一种通过金耳子实体与外源毛韧革菌组合选育金耳新品种的方法。

背景技术

现有技术将金耳的生物学特性描述为：金耳是一种寄生真菌，寄生于毛韧革菌，金耳子实体是异质型子实体，是由金耳菌丝和毛韧革菌菌丝组成的复合体，金耳菌丝的生长要依靠毛韧革菌为其提供营养。金耳菌种的研究的报道较少，且通常涉及常规的菌种扩繁方法，对于菌种质量的描述也只涉及有效菌种和无效菌种的区别^[1-3]。

金耳人工栽培技术成功后的几十年来，菌种基本上都是从野生金耳子实体中分离得到菌种，然后不断地用子实体无数代地转代繁殖使用，造成种源来源少，多代营养繁殖后菌种生产性能退化，菌种携带病毒或杂菌等问题，而对于依据生物多样性的原理，人为地将不同遗传背景的金耳菌和毛韧革菌组合创建新的组合，创新菌耳育种的新材料，从中进行金耳新菌株或品种的选育还未见文献报道。

目前商品金耳菌种质量参差不齐，菌株遗传背景不清，生产性状不稳定，金耳菌种经过子实体无数代地转代繁殖使用，造成种源来源少，多代营养繁殖后菌种生产性能退化，菌种携带病毒或杂菌等，通过验证多数菌株的抗病能力较差，特别对于木霉类的杂菌抵抗力较差，栽培袋在培养过程中的污染率高达15％左右，一潮菇转化率为55％左右，一致度为75％左右，不具备优良品种的特性。使用现有商品金耳菌株进行生产所能达到的技术指标较低，无法适应现代农业精细化管理及高效率产出的要求，为了推动金耳栽培产业的升级和发展，急需选育出稳定的高产抗病的金耳新品种。

发明概述

为解决上述问题，扩大金耳新品种选育的种质资源，本发明提出了一种使用金耳子实体与毛韧革菌搭配，人工培育金耳菌与毛韧革菌的大量新组合，并从中选育出金耳优质高产新品种的方法。

发明人对金耳与毛韧革菌的关系进行了深入研究，掌握了金耳子实体组织块与毛韧革菌建立寄生关系的方法：在诱导培养基中使用金耳子实体组织块接种于外源毛韧革菌菌丝上，通过诱导培养能培育出新的金耳子实体。此技术的突破为金耳菌株或品种的选育提供了可行的途径，本发明以此技术为基础提出了一种利用金耳及毛韧革菌的多样性选育高产抗病的金耳新品种的方法。

本发明提供一种通过金耳子实体与外源毛韧革菌组合选育金耳新品种的方法，其包括一至多次迭代组合以外源毛韧革菌部分或全部替换原金耳子实体中毛韧革菌的步骤。

根据本发明，金耳子实体与外源毛韧革菌收集自异地，具有不同遗传背景。

根据本发明，一至多次迭代组合是将收集自异地、具有不同遗传背景的金耳子实体及外源毛韧革菌进行交叉配对组合，诱导培养后产生新的金耳子实体，并将新的金耳子实体与外源毛韧革菌再次组合，以提高外源毛韧革菌的遗传物质在金耳子实体中的占比，重复多次迭代组合培育后使外源毛韧革菌基本上替换掉原金耳子实体中的毛韧革菌，从中选育得到综合了两个物种母本的优良性状的金耳子实体菌株。

根据本发明，用于组合的金耳子实体为金耳子实体组织块。

根据本发明，用于组合的外源毛韧革菌为固体培养基或液体培养基内的菌丝培养物。

根据本发明，使用子实体诱导培养基进行子实体诱导培养。

根据本发明，子实体诱导培养基的配方(基于重量百分比)为木屑76.8％、米糠20％、蔗糖3％、硫酸镁0.1％、磷酸二氢钾0.1％。

一种复壮金耳菌种的方法，其包括以外源毛韧革菌对金耳母本中的毛韧革菌部分或全部替换的步骤。

发明内容

定义

“基本上”表示至少80％以上，优选90％以上，例如91％，92％， 93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，甚至100％。

“部分”包括小部分或大部分，表示1-99％，例如5％，10％，20％， 25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，90％，“全部”则为 100％。

将不同产地、具有优良性状的金耳的子实体组织块与外源毛韧革菌进行交叉组合搭配，金耳子实体母本携带的毛韧革菌与外源毛韧革菌进行菌丝融合，毛韧革菌能够成功融合的组合可以培养出新的子实体菌株，所得的金耳子实体菌株中就融入了外源毛韧革菌的遗传物质。将所得的新的金耳子实体的组织块再次与外源毛韧革菌进行搭配再次产生金耳子实体，所得的金耳子实体中的外源毛韧革菌的遗传物质的占比将会提高，重复多次后外源毛韧革菌将基本实现对金耳子实体母本中携带的毛韧革菌的替换，从而人工培育创建大量的金耳菌和毛韧革菌的新组合。组合后所得的金耳子实体菌株就有可能结合两个物种母本的优良性状，通过出菇实验筛选出结合了两个物种母本的优良性状的菌株，然后将筛选出的金耳子实体菌株通过无性扩繁应用于生产以保持性状的稳定性，从而形成金耳新品种。

此法可以实现外源毛韧革菌对金耳母本中的毛韧革菌的替换，还可用于复壮由于毛韧革菌退化造成生产性能退化的金耳菌种。

具体而言，本发明的方法包括下列一种或多种甚至全部的具体实施步骤：不同产地的金耳子实体的收集，不同产地的外源毛韧革菌菌株的收集，金耳与毛韧革菌的交叉配对及子实体诱导培养，小金耳纯化，出菇实验，以及菌株综合评价。

(1)不同产地的金耳子实体的收集

采集不同产地的金耳的幼嫩子实体，以吸水纸包裹置于4℃下密封保存，48小时内使用组织分离法进行菌种分离。分离菌种时先将金耳子实体表面消毒，然后取5*5*5mm大小的一块金耳子实体组织块接种于金耳母种培养基上，金耳母种培养基配方为：马铃薯200g，蔗糖 20g，琼脂粉20g，KH₂PO₄ 4g，MgSO₄ 3g。接种后黑暗培养，温度20 ℃，培养25天后金耳子实体组织块再生为小金耳，即可用于与毛韧革菌进行搭配，所得小金耳对应源产地编号为J1、J2、J3……Jn。

(2)不同产地的外源毛韧革菌菌株的收集

在采集不同产地的金耳的幼嫩子实体的同时采集长有金耳子实体的菇木，常温干燥保存，3个月内进行菌种分离。分离菌种时先将菇木表面切削平整，然后消毒，在无菌环境中将菇木劈开，从距离菇木表面5mm以下部位取小块木屑接种于金耳母种培养基上。接种后黑暗培养，温度24℃，培养7天后木屑上萌发的菌丝长成的菌落直径达5cm 时进行纯化，经纯化的培养物即为毛韧革菌菌株，可用于与金耳进行搭配，所得的毛韧革菌菌株对应于金耳源产地编号为G1、G2、 G3……Gn。

(3)金耳与毛韧革菌的交叉配对及子实体诱导培养

金耳与毛韧革菌的配对设计

将不同产地的金耳子实体与毛韧革菌菌株进行两两配对如下所示：

表1：金耳子实体与毛韧革菌配对设计表

	G1	G2	G3	……	Gn
						J1	/	J1+G2	J1+G3	……	J1+Gn
J2	J2+G1	/	J2+G3	……	J2+Gn
						J3	J3+G1	J3+G2	/	……	J3+Gn
……	……	……	……	/	……
						Jn	Jn+G1	Jn+G2	Jn+G3	……	/

子实体诱导培养基制作

诱导培养基配方：木屑76.8％、米糠20％、蔗糖3％、硫酸镁0.1％、磷酸二氢钾0.1％，含水量62％。配制好的培养基装入350ml组培瓶，每瓶装120g，压实，灭菌备用。

毛韧革菌菌丝培养

将纯化好的不同产地的毛韧革菌菌种接种到子实体诱导培养基中，24℃下黑暗培养7天后毛韧革菌菌丝覆盖满料面，即可用于与金耳子实体配对。

子实体诱导培养及毛韧革菌遗传物质替换

按照配对设计在毛韧革菌菌丝上接种金耳材料(金耳子实体组织块)，然后22℃下黑暗培养50天，在组培瓶内长出小金耳即为配对成功，取新的小金耳的组织块再次与外源毛韧革菌组合，重复4次以实现外源毛韧革菌对金耳母本中的毛韧革菌的替换，所得的新的金耳子实体保存备用。

(4)小金耳纯化

将重组的且完成了毛韧革菌遗传物质替换的小金耳通过组织分离法进行转接纯化，纯化3次后得到新的金耳菌株。

(5)出菇实验

取纯化得到的金耳菌株，通过组织分离法扩繁为栽培种接种栽培袋，进行出菇实验，记录生产及商品性状指标数据。

(6)菌株综合评价

以各个菌株的生产及商品性状指标数据为基础，对各个重组菌株进行综合评价，筛选出表现优秀的重组菌株。

金耳广泛分布于云南和西藏的三江并流地区，如云南省的丽江、迪庆、怒江保山，西藏的林芝等地，可以方便地采集到野生种质资源，并且从野生的金耳子实体或生长金耳的菇木上分离纯的毛韧革菌的技术已经很成熟，本发明方法是利用不同产地的金耳子实体和外源的毛韧革菌之间遗传物质的差异，进行交叉组合配对培育，使外源的毛韧革菌逐步替换子实体中的毛韧革菌，从而选育出金耳新品种。因此，该方法并不受特定地理和人为环境的限制，可重复实施，具有再现性和实用性。

有益效果

本发明利用金耳及毛韧革菌的种质资源的多样性，收集不同产地、具有不同遗传背景的金耳子实体及外源毛韧革菌进行交叉配对组合产生新的金耳子实体，将新的金耳子实体与外源毛韧革菌再次组合以提高外源毛韧革菌的遗传物质在金耳子实体中的占比，重复多次迭代组合培育选择后使外源毛韧革菌基本替换掉原金耳子实体中的毛韧革菌，人工培育创建大量的金耳菌和毛韧革菌的新组合，创新金耳新品种选育的丰富材料，从中选育得到综合了两个物种母本的优良性状的金耳子实体菌株。

本发明成功结合了母本优良性状的金耳子实体菌株使用无性扩繁的方法应用于生产。

本发明也可用于复壮由于金耳子实体中的毛韧革菌退化造成生产性能退化的金耳子实体菌种。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分，而非全部。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在无需作出创造性劳动前提下所获得的所有变例，都落入本发明要求保护的范围。

实施例

1.1不同产地的金耳子实体的收集

采集到丽江、贡山、维西三地的金耳的幼嫩子实体，以吸水纸包裹置于4℃下密封保存，48小时内使用组织分离法进行菌种分离。分离菌种时先将金耳子实体表面消毒，然后取5*5*5mm大小的一块金耳子实体组织块接种于金耳母种培养基上，金耳母种培养基配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂粉20g，KH₂PO₄ 4g，MgSO₄ 3g。接种后黑暗培养，温度20℃，培养25天后金耳子实体组织块再生为小金耳，置于4℃冰箱保存备用，所得小金耳对应源产地编号为J1、J2、J3。

1.2不同产地的毛韧革菌菌株的收集

在采集丽江、贡山、维西三地的金耳的幼嫩子实体的同时采集长有金耳子实体的菇木，常温干燥保存，3个月内进行菌种分离。分离菌种时先将菇木表面切削平整，然后消毒，在无菌环境中将菇木劈开，在金耳着生点处距离菇木表面5mm以下部位取小块木屑接种于金耳母种培养基上。接种后黑暗培养，温度24℃，培养6天后木屑上萌发的菌丝长成的菌落直径达5cm时进行纯化，经2次纯化后的培养物即为毛韧革菌菌株，置于4℃冰箱保存备用，所得的毛韧革菌菌株对应于金耳源产地编号为G1、G2、G3。

1.3金耳与毛韧革菌的交叉配对及子实体诱导培养

1.3.1金耳与毛韧革菌的配对设计

将不同产地的金耳子实体与毛韧革菌菌株进行两两配对，共有6 个组合处理，如表2所示：

表2：金耳子实体与毛韧革菌配对表

	G1	G2	G3
				J1	/	J1+G2	J1+G3
J2	J2+G1	/	J2+G3
				J3	J3+G1	J3+G2	/

1.3.2子实体诱导培养基制作

为每个组合准备25瓶诱导培养基，配方：木屑、米糠、硫酸镁、磷酸二氢钾、蔗糖，含水量62％。配制好的培养基装入350ml组培瓶，每瓶装120g，压实，灭菌备用。

1.3.3外源毛韧革菌菌丝培养

将纯化好的不同产地的毛韧革菌菌种接种到子实体诱导培养基中，每个菌株接种50瓶，24℃下黑暗培养7天后毛韧革菌菌丝覆盖满料面，即可用于与金耳子实体组织块配对。

1.3.4子实体诱导培养及毛韧革菌遗传物质替换

按照配对组合设计在外源毛韧革菌菌丝上接种金耳母本子实体组织块，每个组合接种25瓶，然后22℃下黑暗培养50天，在组培瓶内长出小金耳即为配对成功，取新的小金耳的组织块再次与外源毛韧革菌组合，重复4次以实现外源毛韧革菌对金耳母本中的毛韧革菌的替换，以两种菌的母本编号对重组的且替换了毛韧革菌遗传物质的新金耳子实体菌株进行编号分别为：J1G2、J1G3、J2G1、J2G3、J3G1、J3G2。

1.4小金耳纯化

选取各个编号的重组菌株中生长状态最佳的金耳子实体，通过组织分离法进行转接纯化，纯化3次后保存备用。

1.5出菇实验

取纯化后的重组金耳菌株，通过组织分离法扩繁为栽培种接种栽培袋，进行出菇实验，金耳栽培袋培养基配方：棉籽壳58.9％，杂木屑 25％，豆粕15％，石膏粉1％，KH₂PO₄0.1％，含水量65％，自然pH，每袋1公斤干重。同时取母本金耳菌株进行出菇实验作为对照，记录生产性状及商品性状数据。

1.6菌株综合评价

以各个重组菌株的生产性状及商品性状指标数据为基础，对各个重组菌株进行综合评价，筛选出表现优秀的重组菌株为J2G3号菌株。

该金耳重组菌株较母本菌株J2G2在产量、成品率、污染率几个指标上提升显著，如表3所示。

表3：重组菌株与母本的生产性能对比

使用本发明的方法进行金耳菌株选育，获得了高产抗病的金耳重组菌株，编号为J2G3，较母本菌株产量提升6％(34.91g/袋)、成品率提升8％、污染率下降9.1％。

参考文献

[1]陈芝兰,何建清,张涪平.金耳分离驯化试验简报[J].食用菌, 2005,27(6):14-15.

[2]田果廷,赵丹丹,赵永昌.金耳有效菌种的制备技术研究[J]. 西南农业学报,2010,23(05):1620-1624.

[3]刘正南,郑淑芳.金耳的生理特性及有效优良菌种的制备原理 (续)[J].中国食用菌,1995(06):9-11。

Claims (9)

1.一种通过金耳子实体与外源毛韧革菌组合选育金耳新品种的方法，其包括一至多次迭代组合培养以使外源毛韧革菌部分或全部替换原金耳子实体中毛韧革菌的步骤。

2.权利要求1所述的方法，其中金耳子实体与外源毛韧革菌收集自异地，具有不同遗传背景。

3.权利要求1或2所述的方法，其中一至多次迭代组合是将收集自异地、具有不同遗传背景的金耳子实体及外源毛韧革菌进行交叉配对组合，诱导培养后产生新的金耳子实体，并将新的金耳子实体与外源毛韧革菌再次组合，以提高外源毛韧革菌的遗传物质在金耳子实体中的占比，重复多次迭代组合培育后使外源毛韧革菌基本上替换掉原金耳子实体中的毛韧革菌，从中选育得到综合了两个物种母本的优良性状的金耳子实体菌株。

4.权利要求1所述的方法，其中用于组合的金耳子实体为金耳子实体组织块。

5.权利要求1所述的方法，其中用于组合的外源毛韧革菌为固体培养基或液体培养基内的菌丝培养物。

6.权利要求3所述的方法，其中使用子实体诱导培养基进行子实体诱导培养。

7.权利要求6所述的方法，其中子实体诱导培养基的配方(基于重量百分比)为木屑76.8％、米糠20％、蔗糖3％、硫酸镁0.1％、磷酸二氢钾0.1％。

8.权利要求1-7任一项所述的方法，其包括下列步骤：不同产地的金耳子实体的收集，不同产地的外源毛韧革菌菌株的收集，金耳与毛韧革菌的交叉配对及子实体诱导培养，小金耳纯化，出菇实验，以及菌株综合评价。

9.一种复壮金耳菌种的方法，其包括以外源毛韧革菌对金耳母本中的毛韧革菌部分或全部替换的步骤。