CN111328627A

CN111328627A - 一种金耳子实体直接再生培养法

Info

Publication number: CN111328627A
Application number: CN202010250904.5A
Authority: CN
Inventors: 李荣春; 杨林雷
Original assignee: Yunnan Mushroom World Biotechnology Co ltd
Current assignee: Yunnan Mushroom World Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-04-01
Filing date: 2020-04-01
Publication date: 2020-06-26

Abstract

本发明属于食用菌栽培领域，具体涉及一种金耳子实体直接再生培养法，以金耳子实体组织块单独培养，或与外源毛韧革菌一起培养，从而将小的金耳子实体组织块直接生长成大的金耳子实体。该培养法可提高金耳菌种制作的成功率，以及金耳栽培袋的接种成功率，缩短培养周期，有利于金耳的现代化、工厂化栽培。

Description

一种金耳子实体直接再生培养法

技术领域

本发明属于食用菌栽培领域，具体涉及一种金耳子实体直接再生培养法。

背景技术

现有腐生性食用菌栽培都是由子实体或菌丝体培养形成菌丝体的纯培养物(固体或液体菌种)，再用菌丝体的纯培养物(固体或液体菌种)转接到培养料上培养菌丝体，然后诱导菌丝体形成子实体原基，最后培养形成子实体(产品)。木腐菌以香菇^[1,2,3,4]、金针菇^[5,6,7]为代表；草腐菌以双孢蘑菇^[8]、草菇^[9,10,11]为代表，具体工艺如图1所示。

现有寄生菌(银耳和金耳)培养工艺为：混合菌种接种或两种纯菌种混合后接种，先培养出混合菌丝体，再诱导原基产生，最后发育为子实体(蘑菇)。例如，银耳^{[12,13,14,15,16]}的培养工艺可参见图2，而金耳^{[17,18,19,20,21,22,23]}的培养工艺参见图3。

可见，现有的食用菌培养方法都需经历菌种转接到培养料上培养菌丝体，然后诱导菌丝体形成子实体原基，再培养子实体原基逐渐长成小子实体，最后培养形成子实体(产品)的过程。

然而，现有金耳培养工艺中转接时以寄主和寄生菌的混合培养物进行接种，或以两者的分别培养物混合后进行接种，接种到菌种培养基或栽培袋后，两者的混合物首先需要萌发菌丝，以菌丝的形式生长到一定的生理成熟度后通过诱导产生金耳原基(混合菌丝培养之目的是形成金耳子实体原基，而原基是必要步骤)，然后再经过出菇管理获得金耳子实体。金耳子实体培养的关键在于纯金耳菌丝与毛韧革菌菌丝之间的合适配比，只有两者配比合适时才能培养出金耳子实体，反之则不能获得金耳子实体。现行的培养工艺中纯金耳菌丝与毛韧革菌菌丝两者以混合物的形式转接到培养基后两者需重新建立寄生关系，此过程的机制目前并未研究清楚，所以经常出现两者配比不合适的情况，在制作菌种时导致出现无效菌种和菌种状态不一致，在接种栽培袋时导致出现不出菇的菌包(25％)和出菇不整齐(子实体一潮菇成熟度一致率40％)，且培养周期长达70～80天。此外，现有金耳子实体培养技术不适用于现代化、工厂化出菇的需求。

发明概述

本发明提出一种金耳子实体直接再生培养法，用于提高金耳菌种制作的成功率(即，再生率)，以及金耳栽培袋的接种成功率，缩短培养周期，并且适应金耳现代化、工厂化栽培的工艺要求。

发明人在进行金耳基础生物学研究时发现，在适宜配方的培养基中金耳子实体组织块不按照“组织脱分化形成菌丝，然后菌丝再分化形成子实体”的过程发育，可以直接再生长大为新的子实体，其原理为：金耳子实体是异质型子实体，由金耳和毛韧革菌两种菌组成的复合体(即金耳子实体自身同时含两个物种)，纯金耳菌丝的生长要依靠毛韧革菌为其提供营养。由于毛韧革菌菌丝有较强的活力和较强的分解培养基的能力，在金耳子实体组织块接种到适宜配方的培养基后，其中的毛韧革菌菌丝能快速萌发生长，分解利用培养基内的养分，使金耳组织块的营养供应途径在其脱分化之前快速重建，从而使小块的金耳子实体组织在不进行脱分化、再分化的情况下直接恢复生长的能力。即小块金耳子实体中的毛韧革菌和金耳菌的菌丝细胞都可以直接进行细胞分裂、生长，并再生为新的完整的大的金耳子实体。一个1克的金耳子实体小块可以直接生长成为300克、甚至400克大的完整的子实体(蘑菇)，从而实现栽培的目的。

基于上述发现和原理，发明人发明了一种金耳子实体直接再生培养法(如图4所示)，其特点是在整个培养过程中，金耳培养物始终以部分或完整的金耳子实体的形态存在，不发生脱分化为菌丝的过程。

本发明提供一种金耳子实体直接再生培养法，其特征在于，以金耳子实体组织块单独培养，或金耳子实体组织块与外源毛韧革菌一起培养，从而将小的金耳子实体组织块直接生长成大的金耳子实体。

根据本发明，金耳子实体组织块的大小没有特别限定，优选为1mm或2mm至20mm的方块，太小的话容易死亡，更大却是可行的。另外，形状也无需特别限定，方形、圆形或其不规则形状都是可行的。

根据本发明，直接再生培养法适用于金耳培养过程中各级菌种以及栽培袋的任一制作。

根据本发明，菌种制作包括金耳子实体母种接种和培养，金耳子实体原种接种和培养，和/或栽培种接种和培养，而栽培袋制作包括栽培袋接种和培养以及采收。

根据本发明，金耳子实体母种接种和培养包括于无菌条件下在金耳子实体母种培养基上接入金耳子实体组织块，培养后金耳子实体组织块膨大再生成小耳，即得金耳子实体母种。

根据本发明，金耳子实体原种接种和培养包括于无菌条件下在金耳子实体原种培养基上单独接入金耳子实体母种的组织块，或先接入毛韧革菌，然后接入金耳子实体母种的组织块，培养后金耳子实体组织块膨大再生成幼耳并长大，即得金耳子实体原种。

根据本发明，金耳子实体栽培种接种及培养包括于无菌条件下在金耳子实体栽培种培养基单独接入金耳子实体原种的组织块，或先接入毛韧革菌，然后接入金耳子实体原种的组织块，培养后金耳子实体组织块膨大再生成幼耳并长大，即得金耳子实体栽培种。

根据本发明，金耳栽培袋接种及培养步骤包括在含金耳栽培袋培养基的栽培袋中单独接入金耳子实体栽培种的组织块，或先接入毛韧革菌，然后接入金耳子实体栽培种的组织块，接种完成后转入出菇房培养，金耳子实体开始再生后，给与加湿，控制CO2浓度，开启光照，培养至金耳子实体整体颜色为亮橘黄色或金黄色时采收。

本发明另提供一种金耳栽培方法，其包括在金耳子实体的母种、原种、栽培种和/或栽培袋制作时任意采用本发明的直接再生培养法，即母种、原种、栽培种和栽培袋制作中的一个或多个制作采用直接再生培养法，优选所有制作均采用直接再生培养法。任选的，各级菌种和栽培袋分开制作，或者从母种、原种和栽培种任一出发进行菌种制作。

本发明还提供一种金耳栽培方法，其包括在栽培袋制作时采用本发明的直接再生培养法。

技术效果

本发明的一种金耳子实体直接再生培养法，使用小的金耳子实体组织块作为菌种，接种后使其在不进行脱分化的情况下直接再生长成新的完整的金耳子实体，区别于现有食用菌培养法。如图5所示，本发明金耳培养步骤，缩短了培养周期，提高了接种成功率。

附图简述

为了更清楚地描述本发明的技术方案，下面将结合附图作简要介绍。显而易见，这些附图仅是本申请记载的一些具体实施方式。本发明包括但不限于下列附图：

图1示出现有腐生性食用菌栽培工艺；

图2示出现有银耳的培养工艺；

图3示出现有金耳的培养工艺；

图4示出本发明金耳子实体直接再生培养法；以及

图5示出现有食用菌培养法与本发明金耳子实体直接再生培养法比对。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分，而非全部。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在无需作出创造性劳动前提下所获得的所有变例，都落入本发明要求保护的范围。

实施例1

1菌种制作

1.1金耳子实体母种

1.1.1金耳子实体母种培养基配方(1L)：

马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂粉20g，KH₂PO₄ 4g，MgSO₄ 3g。

1.1.2金耳子实体母种培养基配制方法：

去皮马铃薯切片加水煮沸15分钟，然后用4层纱布过滤得滤液，准确称取各药品放入可定容的容器内加入滤液并定容至配制量，搅拌使各种药品充分溶解并均匀分散。制作培养皿的分装入锥形瓶用透气膜封口，然后湿热高压(121℃)灭菌25分钟，之后趁热在超净台上分装于无菌培养皿中待冷却后即可使用；制作试管斜面的则加热使琼脂溶解并再次定容至配制量，然后趁热分装入试管，清理干净管壁上的培养基后塞好塞子湿热高压灭菌25分钟，之后趁热倾斜摆放成斜面冷却后即可使用。

1.1.3金耳子实体母种接种及培养

使用1.1.2中介绍的方法制作好培养基，于无菌条件下在培养基上接入金耳子实体组织块，在18～22℃下黑暗培养30天左右组织块膨大再生成小耳即得金耳子实体母种，可用于制作原种或置于1～4℃冰箱中黑暗保存。

1.2金耳子实体原种

1.2.1金耳子实体原种培养基配方：

棉籽壳83％，豆粕17％，含水量65％，自然pH。

1.2.2金耳子实体原种培养基配制方法：

棉籽壳含水量默认为5％、根据65％的配制含水量、装瓶数量计算各组分用量及水的添加量，按计算结果称取各组分混合搅拌均匀，然后分装入原种瓶，湿热高压(121℃)灭菌3小时。1.2.3金耳子实体原种接种及培养：

使用1.2.2中介绍的方法制作好培养基，于无菌条件下先接入毛韧革菌，然后接入以1.1介绍的方法制作的金耳子实体母种的组织块，于18～22℃下黑暗培养40天左右，金耳子实体组织块膨大再生成幼耳即得金耳子实体原种，可用于制作栽培种或置于1～4℃冰箱中黑暗保存。

1.3金耳子实体栽培种

1.3.1金耳子实体栽培种培养基配方

棉籽壳78.9％，豆粕20％，石膏1％，KH₂PO₄ 0.1％，含水量65％，自然pH。

1.3.2金耳子实体栽培种培养基配制方法

棉籽壳含水量默认为5％，其余原料默认含水量为零，依据65％的配制含水量、装瓶数量计算出各组分用量、水的添加量，按计算结果称取各组分混合搅拌均匀，然后分装入聚丙烯菌种袋中，袋中要留下高度不低于3cm的空间以提供金耳子实体的生长空间，装料后用套环盖封口，湿热高压(121℃)灭菌3小时，冷却至25℃备用。

1.3.3金耳子实体栽培种接种及培养

使用1.3.2中介绍的方法制作好培养基，于无菌条件下先接入毛韧革菌，然后接入以1.2介绍的方法制作的金耳子实体原种的组织块，于18～22℃下黑暗培养40天左右，金耳子实体组织块膨大再生成幼耳即得金耳子实体栽培种，可用于制作栽培袋或置于1～4℃冰箱中黑暗保存。

2栽培袋制作

2.1金耳栽培袋培养基配方：

棉籽壳58.9％，杂木屑25％，豆粕15％，石膏粉1％，KH₂PO₄ 0.1％，含水量65％，自然pH。

2.2金耳栽培袋培养基配制方法：

首先取木屑样品进行含水量测定，棉籽壳含水量默认为5％，其余原料含水量默认为零，依据木屑含水量测定结果、65％的配制含水量、装袋数量计算出实际木屑用量、各组分用量、水的添加量，按计算结果称取各组分，装入拌料机混合搅拌均匀，搅拌时间80min，拌料结束后分装入聚丙烯袋中，装袋后使用铝扣以扎口机封口，或套环盖封口，转入灭菌柜，湿热高压(121℃)灭菌3小时，冷却至25℃以下备用。

2.3金耳栽培袋接种及培养

在以2.2介绍的方法制作的栽培袋中先接入毛韧革菌，然后接入以1.3介绍的方法制作的金耳子实体栽培种的组织块，接种完成后转入出菇房18～20℃黑暗培养，金耳子实体开始再生后，给与加湿(湿度95～100％)，控制CO2浓度(800ppm)，开启光照(LED灯带)，培养至金耳子实体整体颜色为亮橘黄色或金黄色时即可采收。

2.4采收：

用香蕉刀沿着菌袋边缘切断耳基即可。

实施例2

1菌种制作

1.1金耳子实体母种

1.1.1金耳子实体母种培养基配方(1L)：

酵母粉5g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，KH₂PO₄ 4g，MgSO₄ 3g。

1.1.2金耳子实体母种培养基配制方法：

按配制量计算出各组分用量，准确称取各药品放入可定容的容器内加入水并定容至配制量，搅拌使各种药品充分溶解并均匀分散。制作培养皿的分装入锥形瓶用透气膜封口，然后湿热高压(121℃)灭菌25分钟，之后趁热在超净台上分装于无菌培养皿中待冷却后即可使用；制作试管斜面的则加热使琼脂溶解并再次定容至配制量，然后趁热分装入试管，清理干净管壁上的培养基后塞好塞子湿热高压灭菌25分钟，之后趁热倾斜摆放成斜面冷却后即可使用。

1.1.3金耳子实体母种接种及培养

1.2金耳子实体原种

1.2.1金耳子实体原种培养基配方：

玉米芯80.9％，麦麸18％，石膏1％，KH₂PO₄ 0.1％，含水量68％，自然pH。

1.2.2金耳子实体原种培养基配制方法：

首先取玉米芯样品进行含水量测定，依据玉米芯含水量测定结果、68％的配制含水量、装瓶数量计算出实际玉米芯用量及水的添加量，按计算结果称取各组分混合搅拌均匀，然后分装入原种瓶，湿热高压(121℃)灭菌3小时。

1.2.3金耳子实体原种接种及培养：

1.3金耳子实体栽培种

1.3.1金耳子实体栽培种培养基配方

玉米芯60.9％，棉籽壳20％，麦麸18％，石膏1％，KH₂PO₄ 0.1％，含水量68％，pH自然。

1.3.2金耳子实体栽培种培养基配制方法

棉籽壳默认含水量5％，其余原料默认含水量为零，依据68％的配制含水量、装瓶或装袋数量计算出实际各组分用量、水的添加量，按计算结果称取各组分混合搅拌均匀，然后分装。湿热高压(121℃)灭菌3小时，冷却至25℃备用。

1.3.3金耳子实体栽培种接种及培养

2栽培袋制作

2.1金耳栽培袋培养基配方：

玉米芯50.9％，棉籽壳30％，麦麸18％，石膏粉1％，KH₂PO₄ 0.1％，含水量65％，自然pH。

2.2金耳栽培袋培养基配制方法：

首先取玉米芯样品进行含水量测定，棉籽壳含水量默认为5％，其余原料含水量默认为零，依据玉米芯含水量测定结果、65％的配制含水量、装袋数量计算出实际木屑用量、各组分用量、水的添加量，按计算结果称取各组分，装入拌料机混合搅拌均匀，搅拌时间80min，拌料结束后分装入聚丙烯袋中，装袋后使用铝扣以扎口机封口，或套环盖封口，转入灭菌柜，湿热高压(121℃)灭菌3小时，冷却至25℃以下备用。

2.3金耳栽培袋接种及培养

2.4采收：

用香蕉刀沿着菌袋边缘切断耳基即可。

实施例3

1菌种制作

1.1金耳子实体母种

1.1.1金耳子实体母种培养基配方(1L)：

黄豆粉5g，蔗糖20g，琼脂粉20g，KH₂PO₄ 4g，MgSO₄ 3g。

1.1.2金耳子实体母种培养基配制方法：

准确称取各药品放入可定容的容器内加入水并定容至配制量，搅拌使各种药品充分溶解并均匀分散。制作培养皿的分装入锥形瓶用透气膜封口，然后湿热高压(121℃)灭菌25分钟，之后趁热在超净台上分装于无菌培养皿中待冷却后即可使用；制作试管斜面的则加热使琼脂溶解并再次定容至配制量，然后趁热分装入试管，清理干净管壁上的培养基后塞好塞子湿热高压灭菌25分钟，之后趁热倾斜摆放成斜面冷却后即可使用。

1.1.3金耳子实体母种接种及培养

1.2金耳子实体原种

1.2.1金耳子实体原种培养基配方：

玉米芯83.9％，豆粕15％，石膏1％，KH₂PO₄ 0.1％，含水量68％，自然pH。

1.2.2金耳子实体原种培养基配制方法：

1.2.3金耳子实体原种接种及培养：

1.3金耳子实体栽培种

1.3.1金耳子实体栽培种培养基配方

玉米芯63.9％，棉籽壳20％，豆粕15％，石膏1％，KH₂PO₄ 0.1％，含水量68％，自然pH。

1.3.2金耳子实体栽培种培养基配制方法

首先取玉米芯样品进行含水量测定，棉籽壳含水量默认为5％，其余原料默认含水量为零，依据玉米芯含水量测定结果、68％的配制含水量、装袋数量计算出实际玉米芯用量、各组分用量、水的添加量，按计算结果称取各组分混合搅拌均匀，然后分装入聚丙烯菌种袋中，袋中要留下高度不低于3cm的空间以提供金耳子实体的生长空间，装料后用套环盖封口，湿热高压(121℃)灭菌3小时，冷却至25℃备用。

1.3.3金耳子实体栽培种接种及培养

2栽培袋制作

2.1金耳栽培袋培养基配方：

杂木屑83.9％，麦麸15％，石膏粉1％，KH₂PO₄ 0.1％，含水量62％，自然pH。

2.2金耳栽培袋培养基配制方法：

棉籽壳含水量默认为5％，其余原料含水量默认为零，依据62％的配制含水量、装袋数量计算出实际各组分用量、水的添加量，按计算结果称取各组分，装入拌料机加水充分混合搅拌均匀，拌料结束后分装入聚丙烯袋中，装袋后使用铝扣以扎口机封口，或套环盖封口，转入灭菌柜，湿热高压(121℃)灭菌3小时，冷却至25℃以下备用。

2.3金耳栽培袋接种及培养

2.4采收：

用香蕉刀沿着菌袋边缘切断耳基即可。

效果例

目前本发明已经用于指导实际金耳菌种制作及栽培多个批次，现将实施结果列于下表：

利用金耳子实体组织块以营养生长的方式直接长大，形成大的完整的金耳子实体，期间不脱分化为菌丝的特性，以金耳子实体作为金耳培养过程中各级菌种及栽培袋的菌种和目标培养物。在母种制作时，子实体再生率99.67％，培养周期28天；在制作原种时，子实体再生率99.75％，培养周期40天；在制作栽培种时，子实体再生率99.83％，培养周期40天；在制作栽培袋时，子实体再生率99.93％，培养周期55天。

上表中的子实体再生率是指作为接种种子使用的小子实体组织块最后长大成为新的大的子实体的百分比。

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Claims

1.一种金耳子实体直接再生培养法，其特征在于，以金耳子实体组织块单独培养，或与外源毛韧革菌一起培养，从而将小的金耳子实体组织块直接生长成大的金耳子实体。

2.权利要求1所述的直接再生培养法，其中金耳子实体组织块的大小为直径或边长1mm或2mm以上，优选2-20mm。

3.权利要求1或2所述的直接再生培养法，其中该培养法适用于金耳培养过程中各级菌种以及栽培袋的任一制作。

4.权利要求3所述的直接再生培养法，其中菌种制作包括金耳子实体母种接种和培养，金耳子实体原种接种和培养，和/或栽培种接种和培养，而栽培袋制作包括栽培袋接种和培养以及采收。

5.权利要求4所述的直接再生培养法，其中金耳子实体母种接种和培养包括于无菌条件下在金耳子实体母种培养基上接入金耳子实体组织块，培养后金耳子实体组织块膨大再生成小耳，即得金耳子实体母种。

6.权利要求4所述的直接再生培养法，其中金耳子实体原种接种和培养包括于无菌条件下在金耳子实体原种培养基上单独接入金耳子实体母种的组织块，或先接入毛韧革菌，然后接入金耳子实体母种的组织块，培养后金耳子实体组织块膨大再生成幼耳，即得金耳子实体原种。

7.权利要求4所述的直接再生培养法，其中金耳子实体栽培种接种及培养包括于无菌条件下在金耳子实体栽培种培养基单独接入金耳子实体原种的组织块，或先接入毛韧革菌，然后接入金耳子实体原种的组织块，培养后金耳子实体组织块膨大再生成幼耳，即得金耳子实体栽培种。

8.权利要求4所述的直接再生培养法，其中金耳栽培袋接种及培养步骤包括在含金耳栽培袋培养基的栽培袋中单独接入金耳子实体栽培种的组织块，或先接入毛韧革菌，然后接入金耳子实体栽培种的组织块，接种完成后转入出菇房培养，金耳子实体开始再生后，给与加湿，控制CO2浓度，开启光照，培养至金耳子实体整体颜色为亮橘黄色或金黄色时采收。

9.一种金耳栽培方法，其包括在金耳子实体的母种、原种、栽培种和/或栽培袋制作时任意采用权利要求1或2所述的直接再生培养法，以及任选的，各级菌种和栽培袋分开制作，或者从母种、原种和栽培种任一出发进行菌种制作。

10.一种金耳栽培方法，其包括在栽培袋制作时采用权利要求1或2所述的直接再生培养法。

11.权利要求10的金耳栽培方法，其中栽培袋制作包括金耳栽培袋接种及培养步骤。

12.权利要求11所述的金耳栽培方法，其中金耳栽培袋接种及培养步骤包括在含金耳栽培袋培养基的栽培袋中单独接入金耳子实体栽培种的组织块，或先接入毛韧革菌，然后接入金耳子实体栽培种的组织块，接种完成后转入出菇房培养，金耳子实体开始再生后，给与加湿，控制CO2浓度，开启光照，培养至金耳子实体整体颜色为亮橘黄色或金黄色时采收。