CN115039639B - 一种银耳液体菌种短周期生产方法及银耳液体菌种的应用 - Google Patents
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Abstract
一种银耳液体菌种短周期生产方法及银耳液体菌种的应用。本发明将银耳菌可亲和混合芽孢或再生组织用液体培养基进行诱导获得银耳菌菌丝，再转接到专用培养基培养，然后将活化的香灰菌母种接种于距离银耳菌菌丝4‑10cm的位置后培养，进行生理诱导，获得双核菌丝，即银耳母种A；将银耳母种A或再生组织接种到不含琼脂的专用共生群落液态培养液中培养，获得液态银耳菌菌种A1或银耳菌再生组织颗粒A2；将银耳伴生菌香灰菌培养获得液态香灰菌菌种B1；将液态银耳菌菌种A1或/和银耳菌再生组织A2与活化的香灰菌母种B1混合后接种到液体发酵罐中共生培养，构建得到液态双菌共生群落A1B1、A2B1、A1A2B1、AB中的一种，供银耳商业化栽培使用。
Description
技术领域
本发明属于食用菌生产技术领域，具体涉及一种通过银耳菌生理诱导构建具有可调控性的银耳和香灰菌液态共生群落实现银耳菌种短周期生产的方法。
背景技术
银耳(Tremella fuciformis Berk)隶属担子菌门(Basidiomycota)银耳纲(Tremellomycetes)银耳目(Tremellales)银耳科(Tremellaceae)。我国人工栽培银耳历史悠久，是世界银耳生产和出口最多的国家。长期以来银耳的人工栽培模式主要为利用自然气候进行银耳的袋料栽培，但随着食用菌产业转型升级，银耳生产栽培正朝着工厂化方向发展，并形成了一定规模。然而，不论是哪种栽培模式，所用的银耳菌种的生产仍然为传统的固体菌种生产模式，其一级种培养需要约30天，二级种培养需要约30天，三级种培养需要7-10天，即传统固体菌种生产需要约60-70天，存在周期长、菌齡不一致、固体菌种人工混种工艺繁琐、生产效率低、成本高、产品质量参差不齐等问题，制约了银耳产业的发展。液体菌种生产方式因其周期短、一致性好、便于集约化和自动化生产接种、可大幅提高生产效率、降低生产成本等优势成为目前工厂化栽培食用菌的首选菌种生产方法。因此，先后有一些相关机构投入研发银耳液体菌种生产技术，以解决阻碍银耳产业发展的技术难题。
中国专利CN103493680A公开了一种银耳液体栽培种培养方法及栽培种专用培养基，其方法是分别用斜面培养基培养香灰菌和银耳菌，然后将香灰菌和银耳菌的菌种分别移入液体培养，再将香灰菌的液体菌种按1-5％的体积百分比混合到银耳菌液体菌种中，并接种到栽培瓶中培养，制备得到栽培种。该方法是：(1)用银耳液体接种到固体栽培种，再将固体栽培种接种到出菇包；(2)采用摇瓶培养银耳菌和香灰菌，装液量100mL/250mL，后将香灰菌按照体积比1-5％混合到银耳液体种中，随即接种到栽培瓶/栽培种(固体)，再将以上固体种接种到栽培袋/出菇包；(3)固体种子瓶/栽培瓶/栽培种需要在23-25℃培养14-20天以备栽培种使用。这种方法是一种银耳液体菌种用于制备栽培瓶的方法，此栽培瓶为固态菌种，需要在23-25℃培养14-20天，再用此菌种搅拌均匀接种于栽培袋/出菇包，并不是实际意义上的液体菌种，仍然采用固体栽培瓶接种菌袋的工艺，接种前需要上下搅拌，工艺繁琐，周期较长。此外，该方法采用的是摇瓶培养液体菌种，这与使用发酵罐发酵培养液体菌种是两个不同的概念，其配方及培养条件也是天壤之别，而且银耳菌和香灰菌在液态条件下一直是单独培养，只有接种栽培瓶之前按比例混合，并没有在液态下实现共生培养。
中国专利CN111837818A公开了一种银耳液体菌种的制备方法及应用，其方法是将银耳菌丝接种到液体培养基培养7～10d，得到银耳液体菌种。该方法是：(1)银耳菌和香灰菌单独培养7-10天，再将液体状态下的香灰菌和银耳菌按照1:2的体积比结合接种到基质，并没有在液态下实现共生培养；(2)将银耳菌丝和香灰菌菌丝分别扩大到大发酵罐培养7-10天，后在菌包中按香灰菌和银耳菌1:2的比例，先接种香灰菌，后接种银耳菌的方式进行接种，其整个液体菌种制备时间为14-20天，周期较长，且需要进行2次接种，工艺繁琐。
中国专利CN114532155A公开了一种银耳液体菌种的制备方法，包括以下步骤：a、选取子实体生长至直径5～7cm的银耳原种，作为液体菌种生产的出发菌种；b、取步骤a选取的银耳原种，在无菌条件下用接种刀将子实体和基质表面的老菌丝铲除，剩余菌种用银耳专用混种机将银耳与香灰菌菌丝混合均匀，在19～23℃下恒温恢复培养1～2天；c、在发酵罐中加入液体培养基，灭菌后，接种步骤b所得到的银耳菌种，在20～22℃下恒温培养5～6天，得到银耳液体菌种。该方法采用传统固体原种或银耳生产种为液体菌种的出发菌种，将较优的固体原种去除子实体或较老菌丝，再将原种瓶内剩余的料搅拌混匀放置19～23℃下恒温恢复培养1～2天(同固体菌种的拌种操作)，再将上述固体菌种接种至发酵罐培养5-6天即得银耳液体菌种，其前提条件是获得优质的、香灰菌和银耳菌比例适宜的原种或生产种，并将其用发酵罐液化的过程，实现菌种边搅拌边生产，使银耳菌丝均匀分布，提高一致性。并没有脱离传统银耳固体菌种生产过程，仍然需要拌种等人工操作，该技术方案获得优质液体菌种的前提是获得优质固体原种或生产种。
银耳菌的生长发育离不开其伴生菌——香灰菌(Hypoxylon sp.)，这不同于常规食用菌(如平菇、香菇、木耳等)为单一食用菌，给银耳菌种生产带来一定困难。银耳为二型态真菌，即在环境条件的影响下其存在酵母型及菌丝型两种型态。在常规培养基上常以酵母状芽孢存在，一般的银耳菌菌丝型转接也极容易转向酵母型芽孢态，而芽孢状态的银耳菌与香灰菌混合通常情况下难以稳定出菇。香灰菌和银耳菌之间不仅仅是协同互作关系、也有竞争、甚至是侵害关系，这取决于二者的群落比例，当香灰菌浓度过高时不会出菇，而当银耳菌浓度过高时严重影响产量。因此，如何人为调控二者在特定培养基上的比例，使之处于协同互作关系，是解决银耳液体菌种生产的关键。
发明内容
发明的目的在于解决现有技术存在的问题，提供一种通过银耳菌生理诱导构建具有可调控性的银耳和香灰菌液态共生群落以实现银耳菌种短周期生产的方法。
本发明采取的技术方案如下：
一种银耳液体菌种短周期生产方法，步骤如下：
(1)分离获得银耳菌可亲和混合芽孢或银耳菌再生组织，或者直接采用银耳耳基为出发菌种：所述银耳菌可亲和混合芽孢通过银耳脱毒子实体或银耳担孢子在PDA培养基上培养萌发获得；所述银耳菌再生组织通过银耳脱毒子实体培养再生获得；所述银耳耳基为银耳子实体基部较硬的与培养料面接触的含有银耳菌和香灰菌菌丝的组合体；
(2)将上述获得的银耳菌可亲和混合芽孢或再生组织用液体培养基M1进行第一次诱导，获得银耳菌菌丝；或者将所述银耳菌再生组织接种到不含琼脂的专用共生群落培养液M3中培养3-5天，获得液态银耳菌再生组织颗粒A2；或者将所述银耳耳基接种到不含琼脂的专用共生群落培养液M3中培养2-4天，获得液态双菌共生银耳菌种AB；
所述第一次诱导的方法如下：
a.将银耳菌可亲和混合芽孢或再生组织接种到液体培养基M1，在24±1℃，120-170rpm条件下培养2-4天，得到液体可亲和混合芽孢；所述液体培养基M1配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁2g/L，余为水，定容至1L；
b.将上述培养好的液体可亲和混合芽孢在8-12℃低温静置6～8天；
c.将上述低温处理后的液体可亲和混合芽孢转接到含琼脂的培养基M2，在23-25℃培养10-12天即获得银耳菌菌丝；所述培养基M2配方为：麦芽糖1-2％，葡萄糖1-2％，酵母粉0.12％，鱼粉蛋白胨0.24％，硫酸镁0.09％，磷酸二氢钾0.13％，小麦全粉0.5％-1％，1/2MS 0.1％-0.126％，琼脂2.5-3.5％，余为水；
(3)将第一次诱导后获得的银耳菌菌丝再次转接到培养基M2，在24±1℃条件下培养8-12天，将银耳伴生菌香灰菌转接到PDA培养基上培养5天，获得活化的香灰菌母种B，然后将活化的香灰菌母种B接种于距离银耳菌菌丝4-10cm的位置后培养3-5天，进行生理诱导，获得双核菌丝，即银耳母种A；
(4)将银耳母种A接种到不含琼脂的专用共生群落液态培养液M3中培养3-5天，获得液态银耳菌菌种A1，所述专用共生群落液态培养液M3的配方为；麦芽糖1-2％，葡萄糖1-2％，酵母粉0.12％，鱼粉蛋白胨0.24％，硫酸镁0.09％，磷酸二氢钾0.13％，小麦全粉0.5％-1％，1/2MS 0.1％-0.126％，余为水；
(5)将活化的香灰菌母种B转接到液态PDA培养基上继续培养2-3天，获得液态香灰菌菌种B1；
(6)将液态银耳菌菌种A1与液态香灰菌菌种B1按27～38：1的质量比混合后接种到液体发酵罐中共生培养，构建液态双菌共生群落A1B1；或者将颗粒状的银耳菌再生组织A2与液态香灰菌菌种B1按27～38：1的质量比混合后接种到液体发酵罐中共生培养，构建液态双菌共生群落A2B1；或者先将液态银耳菌菌种A1和银耳菌再生组织颗粒A2以1：1的质量比混合，再将混合物与液态香灰菌菌种B1，按27-38：1的质量比混合接种到液体发酵罐中共生培养，构建液态双菌共生群落A1A2B1；或者将液态双菌共生银耳菌种AB接种到液体发酵罐中共生培养，构建液态双菌共生群落AB；发酵罐配方为：小麦粉6-8％，糖1-2％，黄豆粉0.2-0.5％，蛋白胨0.17-0.21％，磷酸二氢钾0.13％；在24±1℃条件下共生培养48-96小时，分别获得银耳栽培的双菌共生液体菌种A1B1、A2B1、A1A2B1、AB中的一种；
银耳菌丝诱导时间为29-41天，银耳液体菌种生产周期为5-9天。获得稳定的银耳菌丝后，可以长期稳定保存菌丝，之后的液体菌种制备不需要再次诱导，即液体菌种后续的生产周期均为5-9天。
进一步地，直接采用银耳耳基为出发菌种时，将直径0.5-1mm的银耳耳基转接到培养瓶中，在24±1℃条件下黑暗培养7-10天，获得银耳菌丝较多、香灰菌丝较少的耳基；所用培养瓶的培养料配方为：干料用粉碎的棉籽壳96wt.％、黄豆粉3wt.％、石膏1wt.％，再将总干料0.23-0.27wt.％磷酸二氢钾和总干料0.25-0.30wt.％的硫酸镁溶于水，然后加入干料，调至含水量58-60％，得到培养料。
本发明方法生产的银耳液体菌种的应用，是将上述银耳栽培的双菌共生液体菌种A1B1、A2B1、A1A2B1、AB中的任意一种接种到出菇包，出菇包配方为：干料用棉籽壳96wt.％、黄豆粉3wt.％、石膏1wt.％，再将总干料0.23-0.27wt.％磷酸二氢钾和总干料0.25-0.30wt.％的硫酸镁溶于水，然后加入干料调匀，制备含水量58-60％的出菇包，在24±1℃条件下培养15-20天后移到出菇房进行出菇管理即可。
相比现有的液体银耳菌种生产方法，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明采用将银耳菌从酵母状芽孢向菌丝型的诱导专用培养基及其培养方法，完成银耳菌丝的第一次诱导以及生理诱导，用诱导物对银耳菌菌丝进行生理诱导，再采用专用培养基及创新的培养方法获得大量稳定的双核银耳菌菌丝，该菌丝洁白、粗壮、浓密，在专用培养基中能够长期稳定保存或扩繁而不恢复到酵母状芽孢态，解决了一般的银耳菌菌丝型极容易转向酵母型芽孢态，而芽孢态的银耳菌与香灰菌混合通常情况下难实现出菇的问题，并可实现长期保存稳定态的银耳菌菌丝。
(2)在本发明技术方案下稳定状态下的银耳菌菌丝在专用液态培养基中培养3-5天后与香灰菌按照27-38：1的质量比共同接种至发酵罐中培养48-96小时构建银耳菌和香灰菌特定比例的液态双菌共生群落，为产业化银耳栽培的液体菌种，整个液体菌种生产周期为5-9天，实现了银耳菌种的短周期生产，解决了传统固体菌种生长周期长、菌齡不一致、生产效率低、成本高、产品质量参差不齐等问题，以及现有的银耳液态菌种没有从根本上解决银耳和香灰菌的实际比例问题，而是依托其原始比例仅仅进行了液化过程，不能通过人为调控二者的比例，达到稳定出菇的问题。目前的液态菌种仍然没有摆脱固体菌种生产过程、没有实现银耳菌和香灰菌的液态共生培养过程等问题。
(3)本发明技术方案通过银耳菌生理诱导后与香灰菌构建具有可调控性双菌液态共生群落以实现银耳菌种短周期生产的方法，获得特定的香灰菌和银耳菌的液态共生群落，使二者始终处于协同互作关系，避免香灰菌过多不能出菇，或银耳菌过多影响产量等问题。
(4)本发明在展开大量基础研究的基础上，根据银耳和香灰菌菌丝生长C、N、微量元素等营养要求，提供了一种创新的栽培袋配方，使用本发明的液体菌种，栽培袋养菌时间缩短到了15-20天，生物学转化率达到98％以上。
附图说明
图1所示为通过银耳担孢子或组织萌发获得的芽孢；
图2所示为通过银耳组织再生获得的再生组织；
图3所示为第一次诱导获得的银耳菌丝；
图4所示为银耳菌丝的生理诱导；
图5所示为在本发明配方M2中的银耳菌丝，即银耳菌母种A；
图6所示为银耳菌丝在PDA培养基上的生长情况；
图7所示为液态银耳菌菌种A1；
图8所示为液态香灰菌菌种B1；
图9和图10所示为液态银耳菌再生组织颗粒A2；
图11为用耳基制备获得的液态双菌共生银耳菌种AB；
图12为通过发酵罐发酵构建的双菌共生群落A1B1；
图13为通过发酵罐发酵构建的双菌共生群落A2B1；
图14为使用本发明的银耳双菌共生液体菌种的出菇情况(前期)；
图15为使用本发明的银耳双菌共生液体菌种的出菇情况(中期)；
图16为按照实施例3进行的试验过程。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的内容进行进一步的阐述。
实施例1
一种银耳液体菌种短周期生产方法，方法如下：
(1)用脱毒的银耳担孢子在PDA培养基上培养，萌发获得如图1所示的银耳菌可亲和混合芽孢；
(2)将上述获得的银耳菌可亲和混合芽孢用液体培养基M1进行第一次诱导，获得银耳菌菌丝；第一次诱导的方法如下：
a.将银耳菌可亲和混合芽孢接种到液体培养基M1，在24±1℃，150rpm条件下培养2-4天，得到液体可亲和混合芽孢(液体芽孢)；所述液体培养基M1配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁2g/L，余为水，定容至1L；
b.将上述培养好的液体可亲和混合芽孢在8-12℃低温静置7天；
c.将上述低温处理后的液体可亲和混合芽孢转接到专用的含琼脂的培养基M2，所述培养基M2配方为：麦芽糖1％，葡萄糖1％，酵母粉0.12％，鱼粉蛋白胨0.24％，硫酸镁0.09％，磷酸二氢钾0.13％，小麦全粉0.5％，1/2MS 0.1％，琼脂3.0％，余为水。在23-25℃培养12天，获得第一次诱导后的银耳菌菌丝，如图3所示；
(3)将第一次诱导后获得的银耳菌菌丝再次转接到专用的培养基M2，在24±1℃条件下培养10天，然后如图4所示，将活化的香灰菌母种B接种于距离银耳菌菌丝5cm的位置后培养4天，使银耳菌丝在诱导物B的诱导下获得大量双核菌丝，完成银耳菌菌丝的生理诱导，获得银耳菌母种A。图5所示为具有稳定的银耳菌丝的银耳菌母种A。进行生理诱导时用分隔培养皿或直径大于90mm以上的圆型或方型培养皿盛装诱导培养基，需控制培养基厚度4-6mm；
(4)将银耳母种A接种到不含琼脂的专用共生群落液态培养液M3中培养3天，获得如图7所示的液态银耳菌菌种A1；所述M3配方为；麦芽糖1％，葡萄糖1％，酵母粉0.12％，鱼粉蛋白胨0.24％，硫酸镁0.09％，磷酸二氢钾0.13％，小麦全粉0.5％％，1/2MS 0.1％，余为水；
(5)将银耳伴生菌香灰菌转接到PDA培养基上培养5天，获得活化的香灰菌母种B，再将活化的香灰菌母种B转接到液态PDA培养基上，培养3天，获得如图8所示的液态香灰菌菌种B1；
(6)将液态银耳菌菌种A1和液态香灰菌菌种B1打碎，按35：1的比例混合接种到液体发酵罐中共生培养，构建双菌共生群落A1B1。发酵罐接种量为5-8％，发酵罐配方为：小麦粉6％，糖1％，黄豆粉0.3％，蛋白胨0.2％，磷酸二氢钾0.13％。余为水，在24±1℃条件下共生培养84小时，获得图12所示的银耳栽培的双菌共生液体菌种A1B1，供银耳商业化栽培使用。
银耳液体菌种的整个生产周期为6.5天。
将上述双菌共生液态菌种A1B1接种到出菇包，出菇包配方采用的干料为棉籽壳96％、黄豆粉3％、石膏1％。将干料总量0.23％的磷酸二氢钾、干料总量0.25％的硫酸镁溶解于水中，加入干料拌匀，做成出菇包，控制出菇包含水率为58-60％，在24±1℃条件下培养15天，移到出菇房进行出菇管理，按照常规银耳出菇管理方法即可。本出菇包配方菌丝生长快、出菇早、品质好、生物学转化率高，生物学转化率可达98％以上。图14为本实施例的出菇前期情况，图15为本实施例的出菇中期情况，可见出菇品质很好。
实施例2
一种银耳液体菌种短周期生产方法，方法如下：
(1)用银耳脱毒子实体在PDA培养基上培养萌发获得如图2所示的银耳再生组织；
(2)将上述获得的银耳再生组织转接到专用的不含琼脂的液态培养基M3上，培养基M3的配方为：麦芽糖1.5％，葡萄糖1.5％，酵母粉0.12％，鱼粉蛋白胨0.24％，硫酸镁0.09％，磷酸二氢钾0.13％，小麦全粉1％，1/2MS 0.1％，余为水。在23-25℃，160rpm条件下培养5天，即可获得如图9和图10所示的液态颗粒状银耳菌再生组织A2；
(3)将银耳伴生菌香灰菌转接到PDA培养基上培养5天，获得活化的香灰菌母种B，再将活化的母种转接到液态PDA培养基上，培养2天，获得液态香灰菌菌种B1；
(4)将液态银耳菌再生组织(颗粒)A2和液态香灰菌菌种B1打碎，按27：1的质量比混合接种到液体发酵罐中，构建双菌共生群落A2B1，如图13所示。发酵罐接种量为5-8％，发酵罐配方为：小麦粉8％，糖2％，黄豆粉0.5％，蛋白胨0.21％，磷酸二氢钾0.13％，余为水。在24±1℃条件下共生培养72小时，获得银耳栽培的双菌共生液体菌种A2B1，供银耳商业化栽培使用。
银耳液体菌种的整个生产周期为8天。
将上述双菌共生液态菌种接种到出菇包，出菇包所用配方中的干料为：棉籽壳96％、黄豆粉3％、石膏1％，将干料总量0.25％的磷酸二氢钾，干料总量0.25％的硫酸镁加水溶解，加入干料拌匀，制作成含水率58-60％的出菇包，在24±1℃条件下培养15天，移到出菇房进行出菇管理，按照常规银耳出菇管理方法即可。
实施例3
一种银耳液体菌种短周期生产方法，方法如下：
(1)直接采用银耳耳基为出发菌种，银耳耳基为银耳子实体基部较硬的与培养料面接触的含有银耳菌和香灰菌菌丝的组合体；
(2)将直径0.5-1mm的银耳耳基转接到用350mL广口组培瓶装料1/2的培养瓶中，在24±1℃条件下黑暗培养7-10天，获得大量银耳菌丝较多、香灰菌丝较少的耳基。所用培养瓶的培养料配方采用的干料为粉碎的棉籽壳96％、黄豆粉3％、石膏1％，将干料总量0.25％的磷酸二氢钾，干料总量0.28％的硫酸镁加水溶解，然后加入干料，调成含水量60％的培养料。
(3)将上述获得的耳基或料面到基内2cm内的银耳和香灰菌丝团转接到不含琼脂的专用共生群落液态培养液M3，不含琼脂的专用共生群落液态培养液M3的配方为：麦芽糖1.5％，葡萄糖1.5％，酵母粉0.12％，鱼粉蛋白胨0.24％，硫酸镁0.09％，磷酸二氢钾0.13％，小麦全粉1％，1/2MS 0.12％，余为水。在23-25℃，160rpm条件下培养2天，即可获得液态双菌共生银耳菌种AB，如图11所示；
(4)将上述的液态双菌共生银耳菌种AB接种到液体发酵罐中，构建双菌共生群落AB。发酵罐接种量为5-8％，发酵罐配方为：小麦粉6％，糖1％，黄豆粉0.3％，蛋白胨0.21％，磷酸二氢钾0.13％，余为水。在24±1℃条件下共生培养48小时，获得银耳栽培的双菌共生液体菌种AB，供银耳商业化栽培使用。
银耳液体菌种生产周期总共为4天。
将上述双菌共生液态菌种接种到出菇包，出菇包所用配方中的干料为：棉籽壳96％、黄豆粉3％、石膏1％，将干料总量0.27％的磷酸二氢钾，干料总量0.30％的硫酸镁加水溶解，加入干料拌匀，制作成含水率58-60％的出菇包，在24±1℃条件下培养15天，移到出菇房进行出菇管理，按照常规银耳出菇管理方法即可。图16显示了本实施例的液态双菌共生银耳菌种AB在培养2天、3天、4天、6天(2d、3d、4d、6d)下的长势，由图可见，在本实施例方案下，液体菌种培养2d后最佳。
实施例4
一种银耳液体菌种短周期生产方法，方法如下：
(1)用银耳脱毒子实体分离获得银耳菌可亲和混合芽孢和银耳菌再生组织；
(2)将上述获得的银耳菌可亲和混合芽孢用液体培养基M1进行第一次诱导，获得银耳菌菌丝；第一次诱导的方法如下：
a.将银耳菌可亲和混合芽孢接种到液体培养基M1，在25℃，150rpm条件下培养3天，得到液体可亲和混合芽孢；液体培养基M1配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁2g/L，余量为水，定容为1L；
b.将上述培养好的液体可亲和混合芽孢在10℃低温静置8天；
c.将上述低温处理后的液体可亲和混合芽孢转接到含琼脂的培养基M2，在25℃培养10天即获得银耳菌菌丝；培养基M2配方为：麦芽糖2％，葡萄糖2％，酵母粉0.12％，鱼粉蛋白胨0.24％，硫酸镁0.09％，磷酸二氢钾0.13％，小麦全粉0.8％，1/2MS 0.126％，琼脂3.5％，余量为水；
(3)将第一次诱导后获得的银耳菌菌丝再次转接到培养基M2，在25℃条件下培养8天，然后将活化的香灰菌母种B接种于距离银耳菌菌丝4cm的位置后培养4天，进行生理诱导，获得双核菌丝，即银耳母种A；
(4)将银耳母种A接种到不含琼脂的专用共生群落液态培养液M3中培养4天，获得液态银耳菌菌种A1，所述专用共生群落液态培养液M3的配方为；麦芽糖2％，葡萄糖2％，酵母粉0.12％，鱼粉蛋白胨0.24％，硫酸镁0.09％，磷酸二氢钾0.13％，小麦全粉0.8％，1/2MS0.126％，余量为水；
(5)将所得银耳菌再生组织接种到不含琼脂的专用共生群落培养液M3中培养4天，获得液态银耳菌再生组织颗粒A2；
(6)将银耳伴生菌香灰菌转接到PDA培养基上培养5天，获得活化的香灰菌母种B，再将香灰菌母种B转接到液态PDA培养基上继续培养3天，获得液态香灰菌菌种B1；
(7)将液态银耳菌菌种A1与液态银耳菌再生组织颗粒A2按1：1的质量比混合得到A1A2，再将A1A2与液态香灰菌菌种B1按30：1的质量比混合后接种到液体发酵罐中共生培养，构建液态双菌共生群落A1A2B1。发酵罐配方为：小麦粉6％，糖1％，黄豆粉0.5％，蛋白胨0.21％，磷酸二氢钾0.13％，余量为水；在25℃条件下共生培养72小时，获得银耳栽培的双菌共生液体菌种A1A2B1。
银耳液体菌种生产周期为7天。
将上述银耳栽培的双菌共生液体菌种A1A2B1接种到出菇包，出菇包所用配方中的干料为：棉籽壳96％、黄豆粉3％、石膏1％，将干料总量0.23％的磷酸二氢钾，干料总量0.28％的硫酸镁加水溶解，加入干料拌匀，制作成含水率58-60％的出菇包，在24±1℃条件下培养15天，移到出菇房进行出菇管理即可。
除非另有说明，本发明所述百分比均为质量百分比。
以上实施例只是本发明的部分典型实施例，并非对本发明保护范围的限定，凡是在本发明权利要求书的技术方案限定范围内的实施例，均属于本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种银耳液体菌种短周期生产方法，其特征在于，步骤如下：
(1)分离获得银耳菌可亲和混合芽孢或银耳菌再生组织，或者直接采用银耳耳基为出发菌种：所述银耳菌可亲和混合芽孢通过银耳脱毒子实体或银耳担孢子在PDA培养基上培养萌发获得；所述银耳菌再生组织通过银耳脱毒子实体培养再生获得；所述银耳耳基为银耳子实体基部较硬的与培养料面接触的含有银耳菌和香灰菌菌丝的组合体；
(2)将上述获得的银耳菌可亲和混合芽孢或再生组织用液体培养基M1进行第一次诱导，获得银耳菌菌丝；或者将所述银耳菌再生组织接种到不含琼脂的专用共生群落培养液M3中培养3-5天，获得液态银耳菌再生组织颗粒A2；或者将所述银耳耳基接种到不含琼脂的专用共生群落培养液M3中培养2-4天，获得液态双菌共生银耳菌种AB；
所述第一次诱导的方法如下：
a.将银耳菌可亲和混合芽孢或再生组织接种到液体培养基M1，在24±1℃，120-170rpm条件下培养2-4天，得到液体可亲和混合芽孢；所述液体培养基M1配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁2g/L，余为水，定容至1L；
b.将上述培养好的液体可亲和混合芽孢在8-12℃低温静置6～8天；
c.将上述低温处理后的液体可亲和混合芽孢转接到含琼脂的培养基M2，在23-25℃培养10-12天即获得银耳菌菌丝；所述培养基M2配方为：麦芽糖1-2％，葡萄糖1-2％，酵母粉0.12％，鱼粉蛋白胨0.24％，硫酸镁0.09％，磷酸二氢钾0.13％，小麦全粉0.5％-1％，1/2MS0.1％-0.126％，琼脂2.5-3.5％，余为水；
(3)将第一次诱导后获得的银耳菌菌丝再次转接到培养基M2，在24±1℃条件下培养8-12天，将银耳伴生菌香灰菌转接到PDA培养基上培养5天，获得活化的香灰菌母种B，然后将活化的香灰菌母种B接种于距离银耳菌菌丝4-10cm的位置后培养3-5天，进行生理诱导，获得双核菌丝，即银耳母种A；
(4)将银耳母种A接种到不含琼脂的专用共生群落液态培养液M3中培养3-5天，获得液态银耳菌菌种A1，所述专用共生群落液态培养液M3的配方为；麦芽糖1-2％，葡萄糖1-2％，酵母粉0.12％，鱼粉蛋白胨0.24％，硫酸镁0.09％，磷酸二氢钾0.13％，小麦全粉0.5％-1％，1/2MS 0.1％-0.126％，余为水；
(5)将活化的香灰菌母种B转接到液态PDA培养基上继续培养2-3天，获得液态香灰菌菌种B1；
(6)将液态银耳菌菌种A1与液态香灰菌菌种B1按27～38：1的质量比混合后接种到液体发酵罐中共生培养，构建液态双菌共生群落A1B1；或者将颗粒状的银耳菌再生组织A2与液态香灰菌菌种B1按27～38：1的质量比混合后接种到液体发酵罐中共生培养，构建液态双菌共生群落A2B1；或者先将液态银耳菌菌种A1和银耳菌再生组织颗粒A2以1：1的质量比混合，再将混合物与液态香灰菌菌种B1，按27-38：1的质量比混合接种到液体发酵罐中共生培养，构建液态双菌共生群落A1A2B1；或者将液态双菌共生银耳菌种AB接种到液体发酵罐中共生培养，构建液态双菌共生群落AB；发酵罐配方为：小麦粉6-8％，糖1-2％，黄豆粉0.2-0.5％，蛋白胨0.17-0.21％，磷酸二氢钾0.13％；在24±1℃条件下共生培养48-96小时，分别获得银耳栽培的双菌共生液体菌种A1B1、A2B1、A1A2B1、AB中的一种；
银耳菌丝诱导时间为29-41天，银耳液体菌种生产周期为5-9天。
2.根据权利要求1所述的一种银耳液体菌种短周期生产方法，其特征在于，直接采用银耳耳基为出发菌种时，将直径0.5-1mm的银耳耳基转接到培养瓶中，在24±1℃条件下黑暗培养7-10天，获得银耳菌丝较多、香灰菌丝较少的耳基；所用培养瓶的培养料配方为：干料用粉碎的棉籽壳96wt.％、黄豆粉3wt.％、石膏1wt.％，再将总干料0.23-0.27wt.％磷酸二氢钾和总干料0.25-0.30wt.％的硫酸镁溶于水，然后加入干料，调至含水量58-60％，得到培养料。
3.权利要求1或2所述方法生产的银耳液体菌种的应用，将上述银耳栽培的双菌共生液体菌种A1B1、A2B1、A1A2B1、AB中的任意一种接种到出菇包，出菇包配方为：干料用棉籽壳96wt.％、黄豆粉3wt.％、石膏1wt.％，再将总干料0.23-0.27wt.％磷酸二氢钾和总干料0.25-0.30wt.％的硫酸镁溶于水，然后加入干料调匀，制备含水量58-60％的出菇包，在24±1℃条件下培养15-20天后移到出菇房进行出菇管理即可。
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Denomination of invention: A short cycle production method for Tremella fuciformis liquid strain and its application Granted publication date: 20221122 Pledgee: Industrial Bank Co.,Ltd. Kunming Branch Pledgor: YUNNAN MUSHROOM WORLD BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2024980032116 |
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