CN105950625B - 一对特异性识别猪MSTN基因启动子的sgRNA及其编码DNA与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一对特异性识别猪MSTN基因启动子的sgRNA及其编码DNA与应用。本发明提供成套sgRNA，由sgRNA‑L‑1和sgRNA‑R‑2组成；所述sgRNA‑L‑1中识别靶序列的片段的核苷酸序列为序列1；所述sgRNA‑R‑2中识别靶序列的片段的核苷酸序列为序列2。本发明能用于敲除猪基因组中MSTN基因启动子上的MEF3因子结合区，能促进猪肌肉细胞的发育，增加猪的肌肉含量。

Description

一对特异性识别猪MSTN基因启动子的sgRNA及其编码DNA与 应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体一对特异性识别猪MSTN基因启动子的sgRNA及其编码DNA与应用。

背景技术

猪的生长速度和背膘厚是当前养猪业的重要育种目标之一，具有重要的经济价值。但是猪的生长速度和背膘厚是由不同层次的多基因控制的复杂性状，是多个基因及其产物形成的调控网络的作用结果。目前已经发现MSTN、MC4R、JHDM1A、TEF-1、RYR1、COPB1等多个基因都对猪的背膘厚以及生长速度等经济性状有着显著的影响，且上述基因中都含有对背膘厚以及生长速度两种性状有重要影响的QTN位点。如此多的基因，如果通过传统育种技术和方法进行育种选育，将需要几十年甚至上百年的选育时间。

MSTN全称为Myostatin基因，即肌生成抑制素基因，又叫做生长与分化因子8(Growth and differential factor 8,GDF8)。该基因对骨骼肌的生长有重要的负调控作用。MSTN基因自然突变会形成“双肌”性状，肌肉量远高于野生型个体。自1997年来，该性状已经在牛、狗、羊、小鼠以及人上观察到。自从双肌性状发现后，该基因的经济价值迅速得到育种工作者的重视。研究发现，在猪的MSTN基因的启动子序列中存在一个非常重要的QTN位点(MSTN g.447A>G)，该位点突变会导致MSTN转录增强元件不能结合，从而使得在4周龄时，MSTN基因的表达量显著下降，进而促进肌肉生长发育。

CRISPR/Cas9技术是细菌和古细菌在漫长的进化过程中形成的一种抵御噬菌体以及外来核酸分子的获得性免疫系统。目前常用的CRISPR/Cas9系统由Cas9蛋白和一小段单链RNA(sgRNA)组成，单链RNA负责识别靶标DNA序列，Cas9蛋白则会在单链RNA识别的靶位点上将双链DNA切开，从而降解外来核酸分子。Mali等证明CRISPR/Cas9系统能在293T、K562、iPS等多种哺乳动物细胞中进行精确的靶向切割，且打靶效率远超ZFN和TALEN技术，是进行基因功能研究、动植物基因组编辑、培育动植物新品种、制作生物反应器和疾病模型的有效工具。

发明内容

本发明一个目的是提供成套sgRNA。

本发明提供的成套sgRNA，由sgRNA-L-1和sgRNA-R-2组成；

所述sgRNA-L-1中负责识别靶片段的核苷酸序列为序列1；

所述sgRNA-R-2中负责识别靶片段的核苷酸序列为序列2。

上述的成套sgRNA中，所述sgRNA-L-1的核苷酸序列为序列5；

所述sgRNA-R-2的核苷酸序列为序列6。

本发明另一个目的是提供成套DNA分子。

本发明提供的成套DNA分子，由编码上述sgRNA-L-1的DNA分子和编码上述sgRNA-R-2的DNA分子组成。

上述sgRNA-L-1识别的靶片段，为序列表中序列3所示的核苷酸，为猪MSTN基因启动子上MEF3转录因子结合位点上游11bpDNA分子。

上述sgRNA-R-2识别的靶片段，为序列表中序列4所示的核苷酸，为猪MSTN基因启动子上MEF3转录因子结合位点下游185bpDNA分子。

上述的成套sgRNA或上述的成套DNA分子在对猪基因组中MSTN基因启动子上MEF3转录因子结合位点进行基因编辑中的应用也是本发明保护的范围。

上述的成套sgRNA或上述的成套DNA分子在制备对猪基因组中MSTN基因启动子上MEF3转录因子结合位点进行基因编辑产品中的应用也是本发明保护的范。

本发明第三个目的是提供一种对猪基因组中MSTN基因启动子上MEF3转录因子结合位点进行基因编辑的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将上述的成套sgRNA和Cas9蛋白mRNA导入猪中，实现对猪基因组中MSTN基因启动子上MEF3转录因子结合位点的基因编辑。

上述中，所述MSTN基因启动子上MEF3转录因子结合位点的核苷酸序列为序列8第343-353位。

本发明的有益效果是，提供了一对特异性识别猪MSTN基因启动子上MEF3转录因子结合位点的sgRNA，特异性强。在进行启动子序列敲除时，能有效减少CRISPR/Cas9系统引起的脱靶现象，减少非特异性切割对基因组带来的不利影响。本发明提供的该对sgRNA，能通过Cas9系统在细胞或者个体水平对猪MSTN基因的启动子进行修饰，不仅能用于培育高瘦肉率新品种猪，而且能用于猪MSTN基因功能的研究。

附图说明

图1为sgRNA-L-1与sgRNA-R-2共同敲除MSTN基因启动子MEF3转录因子结合区示意图。

图2为琼脂糖凝胶电泳检测sgRNA-L-1与sgRNA-R-2敲除效率。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中成套sgRNA，由sgRNA-L-1和sgRNA-R-2组成。

sgRNA-L-1的核苷酸序列为序列5，其包括sgRNA-L，sgRNA-L的核苷酸序列为序列1，其靶序列为序列3，序列3为猪MSTN基因启动子(部分启动子序列为序列8)上MEF3转录因子结合位点(序列8第343-354位)上游11bpDNA分子；

sgRNA-R-2的核苷酸序列为序列6，其包括sgRNA-R，sgRNA-R的核苷酸序列为序列2，其靶序列为序列4，序列4为猪MSTN基因启动子上MEF3转录因子结合位点下游185bpDNA分子。

实施例1、成套sgRNA及其应用

图1为sgRNA-L-1与sgRNA-R-2共同敲除MSTN基因启动子MEF3转录因子结合区示意图。

一、Cas9系统介导删除猪胚胎中的MSTN基因启动子的成套sgRNA的制备

1、体外转录载体构建

根据猪胚胎中的MSTN基因启动子作为打靶序列设计寡聚核苷酸(Oligo)DNA序列，送可信赖的商业引物合成公司进行合成(每条合成1OD，纯化方式选择PAGE)。具体序列如下：

(1)MSTN-sgL2：

MSTN-sgL-up2：TAGGTTAATCTGCAACTTTAGGAT

MSTN-sgL-dn：AAACATCCTAAAGTTGCAGATTAA

(2)MSTN-sgR2：

MSTN-sgR-up2：TAGGCTGTATTTCTCTGATTACAC

MSTN-sgR-dn：AAACGTGTAATCAGAGAAATACAG

将以上两对oligo DNA分别退火，形成带有粘性末端的双链DNA片段MSTN-sgL2以及MSTN-sgR2。

用限制性内切酶BsmB I对pT7-sgRNA(addgene,Plasimd 65565)载体进行酶切，回收酶切后的片段。将MSTN-sgL2以及MSTN-sgR2片段分别连接到酶切回收后的pT7-sgRNA载体中，得到体外转录载体pT7-MSTN-sgL与pT7-MSTN-sgR。

经过测序，pT7-MSTN-sgL载体为将序列1所示sgRNA-L的编码基因的插入pT7-sgRNA载体的BsmB I酶切位点间得到的载体，与载体上片段融合表达得到sgRNA-L-1；

pT7-MSTN-sgR载体为将序列2所示sgRNA-R的编码基因插入pT7-sgRNA载体的BsmBI酶切位点间得到的载体，与载体上片段融合表达得到sgRNA-R-2。

2、体外转录sgRNA

分别取步骤1中的体外转录载体pT7-MSTN-sgL与pT7-MSTN-sgR，XmnI限制性内切酶单酶切进行线性化，并进行胶回收。取回收后的体外转录载体12μL，按照体外转录试剂盒(Ambion,Maxiscript T7Kit)说明书的要求进行sgRNA的体外转录(无需戴帽和加尾)，得到序列5所示的sgRNA-L-1和序列6所示的sgRNA-R-2。

人工合成Cas9的mRNA，核苷酸序列为序列7。

二、成套sgRNA在Cas9系统介导下删除猪胚胎中的MSTN基因启动子中的应用

1、猪胚胎显微注射

取猪体内受精或者体外受精后的离体胚胎，进行胞质显微注射，将上述一制备的sgRNA-R-1、sgRNA-L-2和Cas9的mRNA混合，得到混合体系，且各物质在体系中的终浓度为12.5ng/μLsgRNA-R-1，12.5ng/μLsgRNA-L-2以及125ng/μLCas9的mRNA；将混合体系按照每个胚胎注射量约为10pL注射到猪胚胎中，得到含有sgRNA的猪胚胎。

共进行53个猪胚胎的显微注射。

注射具体操作参见文献：Lillico,S.G.,et al.,Live pigs produced fromgenome edited zygotes.Scientific Reports,2013.3:p.2847.

2、PCR检测

取步骤1中得到的单个含有sgRNA的猪胚胎，放入单细胞裂解液(北京天恩泽，货号130803-1)中反复吹打进行裂解，10000转/分钟离心，取裂解液上清，用以下的两对引物进行巢式PCR反应，扩增胚胎中MSTN基因启动子部分区域。

巢式PCR引物1(扩增长度1348bp)：

MSTN-F：TCTGGTCAAATGAGAAACTGGC

MSTN-R：GAGCTGTTTCCAGGCGAAGTT

巢式PCR引物2(扩增长度1057bp)：

MSTN-MSD-F：CTCTGGTCAAATGAGAAACTGGCAAAGG

MSTN-MSD-R：TTTAATGCCTGCACTGTCTGAGAGAC

将巢式PCR第二轮扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

结果如图2所示，对于未发生MSTN基因启动子上MEF3转录因子结合位点删除的胚胎，扩增片段长度为1057bp；对于发生MSTN基因启动子上MEF3转录因子结合位点的胚胎，扩增片段长度约为827bp。

统计sgRNA在Cas9蛋白介导下对MSTN基因启动子中MEF3因子结合位点的编辑效率，其为发生删除的胚胎/全部注射用胚胎的比例。

结果sgRNA在Cas9蛋白介导下对MSTN基因启动子中MEF3因子结合位点发生删除的胚胎个数为34，编辑效率为64.15％。

实施例2、成套sgRNA的制备

也可以按照下述方法制备成套sgRNA：

根据sgRNA打靶序列设计寡聚核苷酸(Oligo)DNA序列，送可信赖的商业引物合成公司进行合成(每条合成1OD，纯化方式选择PAGE)。具体序列如下：

(1)MSTN-sgL：

MSTN-sgL-up：CACCTTAATCTGCAACTTTAGGAT

MSTN-sgL-dn：AAACATCCTAAAGTTGCAGATTAA

(2)MSTN-sgR：

MSTN-sgR-up：CACCCTGTATTTCTCTGATTACAC

MSTN-sgR-dn：AAACGTGTAATCAGAGAAATACAG

将以上两对Oligo DNA分别退火，形成带有粘性末端的双链DNA片段MSTN-sgL以及MSTN-sgR。

将上述带有粘性末端的双链DNA片段MSTN-sgL和MSTN-sgR分别连入用限制性内切酶BbsI酶切回收后的pX330(addgene,Plasimd 42330，该载体含有Cas9蛋白编码基因，可表达Cas9蛋白)载体中，得到pX330-MSTN-sgL载体与pX330-MSTN-sgR载体。

经过测序，pX330-MSTN-sgL载体为将序列1所示sgRNA-L的编码基因的插入pX330载体的BbsI酶切位点间得到的载体，与载体上片段融合表达得到sgRNA-L-1；

pX330-MSTN-sgR载体为将序列2所示sgRNA-R的编码基因插入pX330载体的BbsI酶切位点间得到的载体，与载体上片段融合表达得到sgRNA-R-2。

将pX330-MSTN-sgL载体和pX330-MSTN-sgR载体共同转入猪胎儿成纤维细胞，得到表达sgRNA和Cas9核酸酶的转基因细胞。

Claims (11)

1.成套sgRNA，由sgRNA-L-1和sgRNA-R-2组成；

所述sgRNA-L-1中负责识别靶片段的核苷酸序列为序列1；

所述sgRNA-R-2中负责识别靶片段的核苷酸序列为序列2。

2.根据权利要求1所述的成套sgRNA，其特征在于：

所述sgRNA-L-1的核苷酸序列为序列5；

所述sgRNA-R-2的核苷酸序列为序列6。

3.成套DNA分子，由编码权利要求1中所述sgRNA-L-1的DNA分子和编码权利要求1中所述sgRNA-R-2的DNA分子组成。

4.权利要求1或2任一项中的所述sgRNA-L-1识别的靶片段，为序列表中序列3所示的核苷酸。

5.权利要求1或2任一项中的所述sgRNA-R-2识别的靶片段，，为序列表中序列4所示的核苷酸。

6.权利要求1或2所述的成套sgRNA或权利要求3所述的成套DNA分子在对猪基因组中MSTN基因启动子中MEF3因子结合位点进行基因编辑中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述IMSTN基因启动子中MEF3因子结合位点的核苷酸序列为序列8第343-353位。

8.权利要求1或2所述的成套sgRNA或权利要求3所述的成套DNA分子在制备对猪基因组中MSTN基因启动子中MEF3因子结合位点进行基因编辑产品中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述IMSTN基因启动子中MEF3因子结合位点的核苷酸序列为序列8第343-353位。

10.一种对猪基因组中MSTN基因启动子进行基因编辑的方法，包括如下步骤：将权利要求1或2所述的成套sgRNA和Cas9蛋白mRNA导入猪中，实现对猪基因组中MSTN基因启动子中MEF3因子结合位点的基因编辑。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述IMSTN基因启动子中MEF3因子结合位点的核苷酸序列为序列8第343-353位。