CN108018311A - 通过基因编辑特异靶向肌肉组织mstn治疗恶病质 - Google Patents

通过基因编辑特异靶向肌肉组织mstn治疗恶病质 Download PDF

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Abstract

本发明提供了通过基因编辑特异靶向肌肉组织MSTN治疗恶病质。具体地，本发明提供了用于治疗的恶病质的核酸构建物、表达载体和药物组合物。实验证明，本发明可有效地缓解和治疗恶病质。

Description

通过基因编辑特异靶向肌肉组织MSTN治疗恶病质
技术领域
本发明涉及医疗领域，更具体地涉及通过基因编辑特异靶向肌肉组织MSTN治疗恶病质。
背景技术
恶病质(cachexia)可见于多种疾病，包括肿瘤、严重创伤、手术后、吸收不良及严重的败血症等，其中以肿瘤伴发的恶病质最为常见，称为肿瘤恶病质。
恶病质是许多癌症患者(尤其是在疾病晚期阶段)所显示的一种消耗型综合征。恶病质的特征包括：尽管有足够的营养摄入，但是仍发生骨骼肌质量的损失(同时伴随有或不伴随脂肪的减少)。癌症恶病质与生活质量下降，功能表现和生存率下降有关。
现有的研究表明，与癌症相关的肌肉损失是一种独立预测因子，可用于预测与死亡率上升相关的不良结果。此外，与癌症相关的肌肉损失也与不耐受化疗相关。然而，由于恶病质的成因非常复杂，因此目前尚缺乏令人满意的有效治疗手段。
肌肉消耗伴随衰老和多种分解代谢疾病发生，例如癌症、糖尿病、慢性肾脏疾病和心力衰竭，这可导致生活质量显着降低和疾病死亡率增加。
综上所述，本领域迫切需要有效的治疗恶病质的方法和药物，以便对恶病质或其相关症状(如与癌症相关的肌肉萎缩)进行预防、延迟或治疗，从而改善患者的生存质量和提高生存率。
发明内容
本发明的目的就是提供一种有效的治疗恶病质的方法和药物。
在本发明的第一方面，提供了一种核酸构建物，所述的核酸构建物具有式I结构：
A-B-C-D-E
式I
式中，
A为第一启动子；
B为NLS编码序列；
C为Cas9蛋白的编码序列；
D为第二启动子；
E为引导RNA的编码序列，其中所述的引导RNA是靶向Mstn的引导RNA。
在另一优选例中，所述的第一启动子为肌肉组织特异性启动子。
在另一优选例中，所述的肌肉组织特异性启动子包括：dMCK启动子、tMCK启动子、CK6启动子。
在另一优选例中，所述的Cas9蛋白选自下组：SaCas9蛋白、SpCas9蛋白。
在另一优选例中，所述的Cas9蛋白为SaCas9蛋白。
在另一优选例中，所述的第二启动子选自下组：组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子。
在另一优选例中，所述的第二启动子包括：小鼠或人类U6启动子、tRNA启动子。
在另一优选例中，所述的引导RNA的序列如SEQ ID NO.:5所示。
在另一优选例中，所述的肌肉生长抑制素(myostatin)来自人、非人灵长动物、或啮齿动物。
本发明第二方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体含有本发明第一方面所述的核酸构建物。
在另一优选例中，所述的表达载体包括病毒载体。
在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：慢病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体、或其组合。
在另一优选例中，所述的表达载体为8型腺相关病毒。
本发明第三方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第二方面所述的表达载体。
在另一优选例中，所述的宿主细胞是包装细胞。
本发明第四方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有(i)药学上可接受的载体；和(ii)本发明第二方面所述的表达载体。
本发明第五方面，提供了本发明第一方面所述的核酸构建物或本发明第二方面所述的表达载体的用途，用于制备药物，所述药物用于(a)治疗或预防恶病质；和/或(b)治疗或预防肌肉消耗。
在另一优选例中，所述的恶病质是与选自下组的疾病相关的恶病质：肿瘤、败血症、和慢性充血性心衰。
在另一优选例中，所述的肌肉消耗是与选自下组的疾病相关的肌肉消耗：癌症、糖尿病、慢性肾脏疾病、心力衰竭、艾滋病或其组合。
本发明第六方面，提供了一种动物模型的用途，所述的动物模型为非人哺乳动物，并且所述动物模型的体细胞中含有本发明第一方面所述的核酸构建物，所述的动物模型被用作癌症恶病质抵抗型动物模型，或用作耐受肌肉消耗的动物模型。
在另一优选例中，所述的动物模型是被本发明第二方面所述的表达载体所转染的。
在另一优选例中，所述的动物模型被用于筛选治疗或预防恶病质或肌肉消耗症的潜在治疗药物，或用于评价治疗或预防恶病质或肌肉消耗症的药物的治疗效果。
在另一优选例中，所述的动物模型被用作阳性对照。
在另一优选例中，所述的动物为啮齿动物。
在另一优选例中，所述的动物为小鼠、大鼠。
本发明第七方面，提供了一种基因治疗恶病质的方法，包括步骤：给需要的患者施用本发明第二方面所述的表达载体。
在另一优选例中，所述的表达载体为病毒载体。
在另一优选例中，所述的患者为人。
在另一优选例中，所述的患者为肿瘤患者。
本发明第八方面，提供了一种基因治疗肌肉消耗症的方法，包括步骤：给需要的患者施用本发明第二方面所述的表达载体。
在另一优选例中，所述的表达载体为病毒载体。
在另一优选例中，所述的患者为人。
在另一优选例中，所述的患者患有选自下组的疾病：癌症、糖尿病、慢性肾脏疾病、心力衰竭、或其组合。
本发明第九方面，提供了一种核酸分子，所述的核酸分子的序列如SEQ ID NO.:5所示。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了Sa-CRISPR基因编辑体系的结构。其中，特异性靶向肌肉组织的启动子—dMCK(double muscle creatinekinase)启动一条针对靶向Mstn基因的向导RNA(guideRNA，gRNA)。SaCas9基因在EFS启动子下被启动表达，后翻译成SaCas9蛋白。
图2显示了T7E1检测结果。
图3显示了小鼠实验示意图。其中，在第0周注射AAV病毒，第4周接种肿瘤细胞，第8周对小鼠进行表型分析。
图4显示了小鼠肿瘤恶病质模型构建。
图5显示了小鼠肿瘤恶病质模型构建。
图6显示了小鼠肌肉组织T7E1检测结果。
图7显示了小鼠肌肉组织针对靶向基因位置进行深度测序结果。
图8显示了检测AAV-SaCRISPR-Mstn在体靶向肌肉组织中Mstn基因后肌肉组织的功能恢复情况。其中，左图显示了小鼠肌肉组织重量，右图显示了小鼠后腿抓力检测结果。
图9显示了小鼠肌肉组织切片HE染色结果。
具体实施方式
本发明人经过经过广泛而深入的研究，首次开发了一种通过基因编辑方式有效治疗和缓解恶病质的技术。实验结果表明，采用靶向肌肉Mstn基因的病毒载体，可有效地改善恶病质(或肌肉消耗症)模型动物中的病症，其中包括增加肌肉重量，调高肌肉的功能(如提升肌肉力量)，抑制肌肉萎缩等。在此基础上完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“恶病质”指由肿瘤或其他疾病导致机体过度消耗，体重下降，肌肉(伴或不伴脂肪)丢失。
如本文所用，术语“肌肉消耗症”指由疾病或年龄等因素导致的肌肉减少，力量降低。
肌肉生长抑制素(myostatin)
myostatin是TGF-β超家族中的一员，是一种外分泌的生长因子，绝大多数由成熟骨骼肌分泌。通过自分泌/旁分泌的方式激活smad3和smad2信号通路，触发相关基因转录表达。myostatin被认为是骨骼肌生长的主要调节因子，作为一种负调控因子，低表达时，会导致骨骼肌粗壮，高表达时会导致肌萎缩。
在本发明中，所述的肌肉生长抑制素(myostatin)可来自任何哺乳动物，代表性的例子包括(但并不限于)：人、非人灵长动物、家畜(如牛、猪、羊)、狗、猫、啮齿动物(如小鼠、大鼠)等。
核酸构建物
本发明提供了可用于治疗恶病质或肌肉消耗症的核酸构建物。作为本发明的一种优选方式，所述的核酸构建物自5'至3'端含有上述式I所示的结构。
通常，所述的核酸构建物(或称为多核苷酸构建物)位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的核酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
表达载体
本发明还提供了含有所述的核酸构建物的表达载体。
优选地，所述的表达载体包括病毒载体。代表性的表达载体包括(但并不限于)：慢病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体、或其组合。
在另一优选例中，所述的表达载体为8型腺相关病毒。
药物组合物及施用方法
如本文所用，术语“活性成分”指的是可用于本发明的上述核酸构建物、或含有所述核酸构建物的表达载体。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)或1×105-1×1012个(较佳地1×106-1×1011个，更佳地1×107-1×1010个)病毒载体/次的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
在本发明中，可将所述的表达载体(如病毒载体)直接施用于对象，也可将所述的表达载体与药学上可接受的载体制备成药物组合后进行施用。所述的施用包括静脉注射、肌肉注射或皮下注射。
治疗方法
本发明还提供了一种通过CRISPR/Cas9技术靶向敲除患者的myostatin，尤其是定向敲除肌肉组织中的myostatin，从而改善肌肉以及治疗(或预防)恶病质的方法。
随着基因治疗的发展，临床案例的增多，其理念将会被大众所接受；肿瘤或者炎症等原因导致的肌萎缩可以通过基因治疗的方式靶向myostatin进行改善或逆转。目前的研究表明，敲除myostatin不会导致除肌肉改善之外的严重副作用，通过CRISPR/Cas9技术靶向敲除患者的myostatin，一次性(或少数几次)解决肌萎缩对患者的影响将推动临床治疗的发展。
本发明的主要优点包括：
(a)提供了一种有效的通过基因编辑方式治疗恶病质的手段。
(b)具有组织、细胞和基因的高靶向特异性，有助于控制可能副作用。
(c)疗效持续性长，无需反复给药。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数为重量百分比和重量份数。
实施例1构建AAV-SaCRISPR靶向肌肉组织示意图
实验步骤：
在AAV-GFP质粒结构基础上(从CELL BIOLABS.INC购得)，在两个ITR之间插入dMCK启动子，SaCas9编码序列和Sa-gRNA表达框。
其中，dMCK启动子序列如下：
CCACTACGGGTCTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTGAGCCTCACCCCCACCCCGGTGCCTGGGTCTTAGGCTCTGTACACCATGGAGGAGAAGCTCGCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGATCCACTACGGGTCTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTGAGCCTCACCCCCACCCCGGTGCCTGGGTCTTAGGCTCTGTACACCATGGAGGAGAAGCTCGCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGATCCTCCCTGGGGACAGCCCCTCCTGGCTAGTCACACCCTGTAGGCTCCTCTATATAACCCAGGGGCACAGGGGCTGCCCCCGGGTCAC(SEQ ID NO.:1)
SaCas9蛋白编码序列所编码的氨基酸如下：
MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMAPKKKRKVEASMKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG
(SEQ ID NO.:2)
Sa-gRNA表达框序列如下：
GTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGTCTTCGAGAAGACCTGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTA
(SEQ ID NO.:3)
pA序列如下。
ATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAA(SEQ ID NO.:8)
实施例2
合成和筛选针对靶向Mstn的高活性gRNA
在本实施例中，对多条合成的gRNA进行筛选。方法如下：
(1)合成三条靶向小鼠Mstn序列的gRNA，序列如下：
Mstn guide-1(简称为gRNA 1):GCTGCTGGCCCAGTGGATCTAA(SEQ ID NO.:4)
Mstn guide-2(简称为gRNA 2):GGGCTGTGTAATGCATGTGCG(SEQ ID NO.:5)
Mstn guide-3(简称为gRNA 3):GCTGTTTCCAGGCGCAGCTTA(SEQ ID NO.:6)
(2)分别将三条gRNA克隆入lentiSaCRISPR v2载体(由lentiCRISPR V2addgene#52961载体(购自addgene公司)，如果如下方式改造而成：将原质粒中的SpCas9序列替换成SaCas9，将原质粒中的Sp-gRNA序列替换成Sa-gRNA序列，SaCas9和Sa-gRNA的序列与实施例1中所示序列相同)
(3)分别包装慢病毒后感染常规的NIH-3T3细胞。
(4)感染后96h收集细胞，通过T7E1检测试剂盒(购自NEB公司)对细胞进行Mstn基因切割情况进行分析。
结果：
如图2显示，由于基因组序列特点等原因，多个gRNA虽然序列与Mstn互补，但是却未表现出切割活性。出乎意料的是，Mstn guide-2这个gRNA表现出显著切割活性，其切割效率非常高，约为50％。
实施例3包装腺相关病毒
在本实施例中，构建基于Mstn guide-2序列的病毒表达载体。实验方法如下：
(1)将Mstn guide-2序列(双链)插入AAV-SaCRISPR(实施例1中制备，并用BsmBI进行切割)的gRNA表达框中，得到AAV-SaCRISPR-Mstn质粒。
按厂商的说明书，将所述质粒包装入8型腺相关病毒(购自汉恒生物，上海)，获得病毒载体AAV8-SaCRISPR-Mstn。
(2)用GFP-2a-Luci替换SaCRISPR-Mstn序列，构建AAV-GFP-2a-Luci质粒作为对照。
GFP-2a-Luci的氨基酸序列如下：
GGGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQID NO.:7)
其中，下划线为2A序列，斜体为GFP，加粗为Luciferase。
按厂商的说明书，将所述质粒包装入8型腺相关病毒(购自汉恒生物，上海)，获得病毒载体AAV8-GFP-2a-Luci，作为对照组病毒。
实施例4.基因编辑特异靶向肌肉组织MSTN的治疗效果
在本实施例中，构建小鼠恶病质模型，并注射靶向小鼠肌肉Mstn基因的AAV病毒，并观察治疗效果。方法如下：
4.1模型构建
(1)购买22只6周龄雄性C57/BL6小鼠，随机分成实验组(n＝6只)和对照组(AAV8-GFP-2a-Luci组：n＝6只，Tumor free control组：n＝10只)。
(2)注射AAV8病毒。分别在对照组和实验组小鼠的后腿腓肠肌上注射AAV8-GFP-2a-Luci和AAV8-SaCRISPR-Mstn病毒。注射剂量为每个点注射5X 1010个病毒，每条腿注射6-8个点。
(3)病毒注射四周后，在小鼠皮下接种LLC肿瘤细胞(Lewis肺癌细胞)诱发肿瘤恶病质产生。
(4)四周后对小鼠表型进行分析。
整个实验方案如图3所示。
结果：
如图4所示，对照组(注射AAV8-GFP-2a-Luci病毒)和实验组(注射AAV8-SaCRISPR-Mstn病毒)在接种肿瘤细胞后，均发生了肿瘤生长(图4，左图)。此外，NMR检测显示，对照组和实验组的脂肪组织持续下降(图4，右图)。
此外，如图5所示，对照组和实验组小鼠的体重(排除肿瘤组织)相比肿瘤接种前有明显下降。
这表明，成功构建了恶病质模型。
4.2靶向效率的检测
在该步骤中，检测AAV-SaCRISPR-Mstn在体靶向肌肉组织的靶向效率。
(1)在第八周(图三)获取小鼠腓肠肌肌肉组织
(2)抽提肌肉组织中的基因组DNA
(3)通过T7E1检测试剂盒进行Mstn基因切割情况进行分析
(4)通过对靶向基因位置进行深度测序(委过华大基因进行测序)评估靶向效率。
实验结果：
如图6所示，在实验组小鼠(AAV-SaCRISPR-Mstn)的肌肉组织中检测到切割活性(箭头所指)。
如图7所示，显示在实验组小鼠肌肉组织中靶向基因组位点的突变效率平均约58％。
4.3治疗效果
在该步骤中，检测AAV-SaCRISPR-Mstn在体靶向肌肉组织的治疗效果。
同一次实验，共22只6周龄雄性C57/BL6小鼠，随机分成实验组(AAV8-SaCRISPR-Mstn：n＝6只)和对照组(AAV8-GFP-2a-Luci：n＝6只；Tumor free control组：n＝10只)，接种肿瘤的野生型小鼠共12只(即AAV8-SaCRISPR-Mstn和AAV8-GFP-2a-Luci)。
(1)实验包括对照组(接种肿瘤，注射AAV8-GFP-2a-Luci病毒，同上)，实验组(接种肿瘤，注射AAV8-SaCRISPR-Mstn病毒，同上)，以及没有接种肿瘤的野生型小鼠。其中，方法同4.1节中所述。
(2)在三组活体小鼠中检测小鼠后腿抓力。
(3)检测三组小鼠肌肉重量。
(4)检测三组小鼠腓肠肌肌肉形态。
实验结果：
如图8所示，显示肿瘤接种后小鼠肌肉重量和抓力均显著下降，提示肿瘤恶病质模型建立成功。在AAV-SaCRISPR-Mstn处理后，相比对照组，小鼠肌肉重量增加约9％，抓力增加约25％，提示小鼠肌肉萎缩状态被明显改善。
如图9所示，肿瘤接种后小鼠肌肉纤维明显萎缩，提示肿瘤恶病质模型建立成功。在AAV-SaCRISPR-Mstn处理后，相比对照组，小鼠肌纤维萎缩状态被明显改善。
讨论
本发明所提供的方法为肌肉萎缩的治疗提供新的可能，伴随基因治疗的发展，靶向效率的提高，安全性的提升，本发明技术会有很大的应用前景。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 通过基因编辑特异靶向肌肉组织MSTN治疗恶病质
<130> P2016-1540
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 497
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> dMCK启动子
<400> 1
ccactacggg tctaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct 60
ggttataatt aacccagaca tgtggctgcc cccccccccc aacacctgct gcctgagcct 120
cacccccacc ccggtgcctg ggtcttaggc tctgtacacc atggaggaga agctcgctct 180
aaaaataacc ctgtccctgg tggatccact acgggtctag gctgcccatg taaggaggca 240
aggcctgggg acacccgaga tgcctggtta taattaaccc agacatgtgg ctgccccccc 300
cccccaacac ctgctgcctg agcctcaccc ccaccccggt gcctgggtct taggctctgt 360
acaccatgga ggagaagctc gctctaaaaa taaccctgtc cctggtggat cctccctggg 420
gacagcccct cctggctagt cacaccctgt aggctcctct atataaccca ggggcacagg 480
ggctgccccc gggtcac 497
<210> 2
<211> 1087
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> SaCas9蛋白
<400> 2
Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp
1 5 10 15
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25 30
Glu Ala Ser Met Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile
35 40 45
Thr Ser Val Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile
50 55 60
Asp Ala Gly Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu
65 70 75 80
Gly Arg Arg Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg
85 90 95
His Arg Ile Gln Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu
100 105 110
Thr Asp His Ser Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val
115 120 125
Lys Gly Leu Ser Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu
130 135 140
Leu His Leu Ala Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu
145 150 155 160
Glu Asp Thr Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn
165 170 175
Ser Lys Ala Leu Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln Leu Glu Arg
180 185 190
Leu Lys Lys Asp Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg Phe Lys Thr
195 200 205
Ser Asp Tyr Val Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala
210 215 220
Tyr His Gln Leu Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu
225 230 235 240
Glu Thr Arg Arg Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe
245 250 255
Gly Trp Lys Asp Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys
260 265 270
Thr Tyr Phe Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala
275 280 285
Asp Leu Tyr Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg
290 295 300
Asp Glu Asn Glu Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu
305 310 315 320
Asn Val Phe Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys
325 330 335
Glu Ile Leu Val Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser
340 345 350
Thr Gly Lys Pro Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His Ile Lys Asp
355 360 365
Ile Thr Ala Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln
370 375 380
Ile Ala Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu
385 390 395 400
Glu Leu Thr Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln
405 410 415
Ile Ser Asn Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys
420 425 430
Ala Ile Asn Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr Asn Asp Asn Gln
435 440 445
Ile Ala Ile Phe Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys Lys Val Asp Leu
450 455 460
Ser Gln Gln Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu
465 470 475 480
Ser Pro Val Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn
485 490 495
Ala Ile Ile Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu
500 505 510
Ala Arg Glu Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met Ile Asn Glu Met
515 520 525
Gln Lys Arg Asn Arg Gln Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg
530 535 540
Thr Thr Gly Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu
545 550 555 560
His Asp Met Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro
565 570 575
Leu Glu Asp Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp His Ile
580 585 590
Ile Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu
595 600 605
Val Lys Gln Glu Glu Asn Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln
610 615 620
Tyr Leu Ser Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys
625 630 635 640
His Ile Leu Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys
645 650 655
Lys Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln
660 665 670
Lys Asp Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg
675 680 685
Gly Leu Met Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp
690 695 700
Val Lys Val Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg
705 710 715 720
Lys Trp Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala
725 730 735
Glu Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp
740 745 750
Lys Lys Leu Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu
755 760 765
Glu Lys Gln Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr
770 775 780
Lys Glu Ile Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe
785 790 795 800
Lys Asp Tyr Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Glu
805 810 815
Leu Ile Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn
820 825 830
Thr Leu Ile Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp
835 840 845
Lys Leu Lys Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr
850 855 860
His His Asp Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln
865 870 875 880
Tyr Gly Asp Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly
885 890 895
Asn Tyr Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys
900 905 910
Lys Ile Lys Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr
915 920 925
Asp Asp Tyr Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys
930 935 940
Pro Tyr Arg Phe Asp Val Tyr Leu Asp Asn Gly Val Tyr Lys Phe Val
945 950 955 960
Thr Val Lys Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val
965 970 975
Asn Ser Lys Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn
980 985 990
Gln Ala Glu Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Asn Asn Asp Leu Ile Lys Ile
995 1000 1005
Asn Gly Glu Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Leu Leu
1010 1015 1020
Asn Arg Ile Glu Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr Arg Glu Tyr
1025 1030 1035
Leu Glu Asn Met Asn Asp Lys Arg Pro Pro Arg Ile Ile Lys Thr
1040 1045 1050
Ile Ala Ser Lys Thr Gln Ser Ile Lys Lys Tyr Ser Thr Asp Ile
1055 1060 1065
Leu Gly Asn Leu Tyr Glu Val Lys Ser Lys Lys His Pro Gln Ile
1070 1075 1080
Ile Lys Lys Gly
1085
<210> 3
<211> 452
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> Sa-gRNA表达框
<400> 3
gtacaaaaaa gcaggcttta aaggaaccaa ttcagtcgac tggatccggt accaaggtcg 60
ggcaggaaga gggcctattt cccatgattc cttcatattt gcatatacga tacaaggctg 120
ttagagagat aattagaatt aatttgactg taaacacaaa gatattagta caaaatacgt 180
gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt ttgcagtttt aaaattatgt tttaaaatgg 240
actatcatat gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt cttggcttta tatatcttgt 300
ggaaaggacg aaacaccggg tcttcgagaa gacctgtttt agtactctgg aaacagaatc 360
tactaaaaca aggcaaaatg ccgtgtttat ctcgtcaact tgttggcgag atttttttct 420
agacccagct ttcttgtaca aagttggcat ta 452
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> Mstn guide-1
<400> 4
gctgctggcc cagtggatct aa 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> Mstn guide-2
<400> 5
gggctgtgta atgcatgtgc g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> Mstn guide-3
<400> 6
gctgtttcca ggcgcagctt a 21
<210> 7
<211> 817
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> GFP-2a-Luci
<400> 7
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Tyr
225 230 235 240
Ser Asp Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu
245 250 255
Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu Asp Ala Lys
260 265 270
Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro Leu Glu Asp Gly Thr
275 280 285
Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg Tyr Ala Leu Val Pro
290 295 300
Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu Val Asp Ile Thr Tyr
305 310 315 320
Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala Glu Ala Met Lys Arg
325 330 335
Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val Cys Ser Glu Asn Ser
340 345 350
Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu Phe Ile Gly Val Ala
355 360 365
Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg Glu Leu Leu Asn Ser
370 375 380
Met Gly Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val Ser Lys Lys Gly Leu
385 390 395 400
Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro Ile Ile Gln Lys Ile
405 410 415
Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly Phe Gln Ser Met Tyr
420 425 430
Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe Asn Glu Tyr Asp Phe
435 440 445
Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile Ala Leu Ile Met Asn
450 455 460
Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Ala Leu Pro His Arg
465 470 475 480
Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp Pro Ile Phe Gly Asn
485 490 495
Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val Val Pro Phe His His
500 505 510
Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu Ile Cys Gly Phe Arg
515 520 525
Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu Phe Leu Arg Ser Leu
530 535 540
Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val Pro Thr Leu Phe Ser
545 550 555 560
Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu
565 570 575
His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser Lys Glu Val Gly Glu
580 585 590
Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile Arg Gln Gly Tyr Gly
595 600 605
Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr Pro Glu Gly Asp Asp
610 615 620
Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe Phe Glu Ala Lys Val
625 630 635 640
Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val Asn Gln Arg Gly Glu
645 650 655
Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly Tyr Val Asn Asn Pro
660 665 670
Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly Trp Leu His Ser Gly
675 680 685
Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe Phe Ile Val Asp Arg
690 695 700
Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln Val Ala Pro Ala Glu
705 710 715 720
Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile Phe Asp Ala Gly Val
725 730 735
Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu Pro Ala Ala Val Val
740 745 750
Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys Glu Ile Val Asp Tyr
755 760 765
Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu Arg Gly Gly Val Val
770 775 780
Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly Lys Leu Asp Ala Arg
785 790 795 800
Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys Gly Gly Lys Ile Ala
805 810 815
Val
<210> 8
<211> 133
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> pA
<400> 8
atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa 60
taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg 120
ggaggttttt taa 133

Claims (11)

1.一种核酸构建物，其特征在于，所述的核酸构建物具有式I结构：
A-B-C-D-E
式I
式中，
A为第一启动子；
B为NLS编码序列；
C为Cas9蛋白的编码序列；
D为第二启动子；
E为引导RNA的编码序列，其中所述的引导RNA是靶向Mstn的引导RNA。
2.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述的第一启动子为肌肉组织特异性启动子。
3.如权利要求2所述的核酸构建物，其特征在于，所述的肌肉组织特异性启动子包括：dMCK启动子、tMCK启动子、或CK6启动子。
4.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述的第二启动子包括：小鼠或人类U6启动子或tRNA启动子。
5.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有权利要求1所述的核酸构建物。
6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体包括病毒载体。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求5所述的表达载体。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有(i)药学上可接受的载体；和(ii)权利要求5所述的表达载体。
9.如权利要求1所述的核酸构建物或权利要求2所述的表达载体的用途，其特征在于，用于制备药物，所述药物用于(a)治疗或预防恶病质；和/或(b)治疗或预防肌肉消耗。
10.一种动物模型的用途，其特征在于，所述的动物模型为非人哺乳动物，并且所述动物模型的体细胞中含有权利要求1所述的核酸构建物，所述的动物模型被用作癌症恶病质抵抗型动物模型，或用作耐受肌肉消耗的动物模型。
11.一种核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子的序列如SEQ ID NO.:5所示。
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