CN103725712A - 一种无物种限制的条件性基因敲除用中间载体及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，更具体地说，涉及一种无物种限制的动物条件性基因敲除方法。本发明提供了一种无物种限制的真核生物条件性基因打靶用的中间载体及其制备方法。利用该中间载体制备用于基因敲除的载体并实现基因敲除。该方法步骤简单、可一次性实现条件性基因敲除、可进行多基因的条件性基因敲除，且消耗低。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，更具体地说，涉及一种无物种限制的动物条件性基因敲除方法。
背景技术
条件性基因敲除（conditional gene knockout）技术是一种条件性定点改变生物体遗传信息的实验方法。现有的技术包括：
一、 传统策略
传统的条件性基因敲除主要是通过Cre／loxP或者Ftp／FRT（主要是Cre／loxP）重组系统在实现的。Cre／loxP含有两种成分：（1）一段长34bp的DNA序列，包含两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。这段34bp序列是Cre重组酶识别的位点，即loxP位点；（2）Cre重组酶，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以介导loxP位点的DNA重组。任何序列的DNA，当其位于两个loxP位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下或者发生缺失(两个loxP位点的方向相同)，或者发生方向倒转(两loxP位点的方向相反)，从而使靶基因发生条件性缺失，即在动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官发生缺失。
以小鼠为例，利用Cre／loxP系统进行条件性基因敲除包括：（1）在体外构建一个在目的基因两端分别含有一个loxP位点的基因序列；（2）将体外构建好的这段基因序列转入小鼠胚胎干细胞内，使其通过同源重组替代细胞基因组内原来的基因序列；（3）将经过处理的胚胎干细胞被重新植入到假孕小鼠的子宫内，使其重新发育成为一个完整的胚胎，最终成为一只基因工程小鼠。
这种方式的条件性基因敲除具有几个特点：（1）周期长：整个过程需要1—2年时间；（2）花费大：公司服务一般需要15万人民币；（3）只限于小鼠，有大鼠的报道，但不普及：只有小鼠的胚胎干细胞具有足够的同源重组效率，以满足构建含有loxP位点的基因序列；只有小鼠的胚胎干细胞才能通过形成配子传代，得到稳定的基因小鼠；（4）基因敲除需要分别位于双链DNA上的两份基因编码DNA序列同时敲除才能实现。传统方法通常只能在一条染色体上实现同源重组，实现两条DNA链同时敲除需要进行细胞上的二次重组或个体的交配才能完成；（5）由于Cre／loxP系统介导loxP位点间的重组，当多个目的基因两端分别含有一个loxP位点的基因序列时，易于发生多loxP位点间的交叉重组，因而不易进行多基因的条件性敲除。
二、核酸内切酶介导的同源重组策略
另外一类条件性基因敲除的策略是利用一类可以编辑的核酸内切酶进行，这类核酸内切酶包括锌指核酸酶（ZFN）技术和转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）技术，以及规律成簇间隔短回文重复系统（clustered regularly interspaced short palindromic repeat; CRISPR-associated，CRISPR/Cas9），可以识别特定的DNA序列，并进行切割造成双链DNA断裂（Double-strand breaks, DSB），在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接（Non-homologous end joining, NHEJ）,造成移码突变（frameshift mutation）导致的基因敲除；在提供模板的条件下，由于DSB促进同源重组，大大提高同源重组效率而发生同源重组修复。如果提供两端分别含有一个loxP位点的同源序列，可以用于条件性基因敲除。
ZFN是由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA识别域是由一系列Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般3～4个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。多个锌指蛋白可以串联起来形成一个锌指蛋白组识别一段特异的碱基序列，与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶是来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域。FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，只在二聚体状态时才有酶切活性，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当两个识别位点相距恰当的距离时（6～8 bp），两个单体ZFN相互作用产生酶切功能。从而达到DNA定点剪切的目的。
TALEN技术是利用植物病原菌黄单胞菌（Xanthomonas）自然分泌的蛋白---即激活因子样效应物（TAL effectors, TALEs）能够识别特异性DNA碱基对的功能，设计一串合适的TALEs来识别和结合到任何特定序列，再在TALEs后附加一个非特异性核酸内切酶FokI，构建出TALEN，从而实现了在特定位点切断DNA双链。
CRISPR/Cas9系统存在于大多数的细菌和几乎所有的古细菌中。Cas9 是一种内切酶，在sgRNA （single-guide-RNA）的特异性介导下，对特异的DNA序列进行切割。
不过，（1）这类可以编辑的核酸内切酶介导的同源重组效率并不高；（2）到目前为止，无论是ZFN还是TALEN，对其识别序列都有很多要求，无法实现靶向每一种可能的DNA序列；（3）组装ZFN或TALEN蛋白也是一个耗时、耗力且花费很高的过程，人们一直都没有一种低成本的而且公开能够获得的方法来快速地产生大量的ZFNs或TALENs；（4）基因敲除需要分别位于双链DNA上的两份基因编码DNA序列同时敲除才能实现。本方法也只能在一条染色体上实现同源重组，实现两条染色体同时敲除需要进行细胞上的二次重组或个体的交配才能完成；（5）同样使用了Cre／loxP系统，也易于发生多loxP位点间的交叉重组，因而不易进行多基因的条件性敲除。
参考文献：
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发明内容
针对现有技术中通过已有方法实现条件性基因敲除存在耗时、耗力、成本高，不容易进行两条染色体上的等位基因的一次性敲除，以及不能同时进行多基因的条件性敲除等问题，本发明提供了一种无物种限制的真核生物条件性基因打靶用的中间载体。利用该载体进行的基因敲除，方法步骤简单、可一次性实现条件性基因敲除、可进行多基因的条件性基因敲除，且消耗低。
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种无物种限制的真核生物条件性基因打靶用中间载体。该中间载体pU6-sgRNA-Ubc-Cas9（序列如序列表SEQ ID NO.20所示；载体结构如图5所示）含有：1、利用II s 型限制性内切酶BsmBI切割形成不同粘性末端可将多个U6 promoter调控sgRNA表达的片段一次性连接进载体中，为开源系统。此载体还包含有UbC promoter调控的Cas9，但特点在于在UbC promoter与Cas9之间有一个被双loxp包含的dsRed，在未加入cre删除loxp包含区域的情况下只有dsRed表达，在加入cre删除dsRed之后Cas9才开始表达；2、插入多个U6 promoter调控sgRNA表达的片段的区域使用II s 型限制性内切酶BsmBI切割，形成5’ ACCG 3’和5’ GTTT 3’两个不同的粘性末端。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种制备上述的基因打靶用中间载体的方法。该方法包括以下步骤：
1、 利用限制性内切酶NotI和SacI,由pUbC-loxp-dsRed-loxp-gfp载体（序列如序列表SEQ ID NO. 21所示；载体结构如图6所示）双酶切获得线性质粒；将Back up和Back down的混合退火产物（序列如序列表SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示）与上述线性质粒连接获得pUbC-loxp-dsRed-loxp载体（序列如序列表SEQ ID NO. 22所示；载体结构如图7所示）。
2、 由pUbC-loxp-dsRed-loxp载体，使用限制性内切酶SpeI酶切获得1268bp和8325bp的两段序列，对8325bp这段序列做去磷酸化处理，然后连接1268bp和8325bp这两段序列获得pUbC-1载体。
3、 由pUbC-1载体，使用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切，获得9553bp片段的线性载体。将该线性载体与Cas9 inser up和Cas9 inser down的混合退火产物（序列如序列表SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示）连接获得pUbC-2载体。
4、 由pUbC-2质粒（载体），使用限制性内切酶SpeI酶切，获得线性载体并对其做去磷酸化处理。将该线性载体和SpeI prom up和SpeI prom down的混合退火产物（序列如序列表SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示）连接获得pUbC-3载体。
5、 由pGL3-multi sgRNA载体（序列如序列表SEQ ID NO. 23所示；载体结构如图8所示），使用限制性内切酶BsmBI酶切，获得5508bp片段的线性载体。将MCS up和MCS down的混合退火产物（序列如序列表SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 13所示）与该线性载体连接获得pGL3-multi sgRNA modi载体。由pGL3-multi sgRNA modi载体，使用限制性内切酶ApaI和SacI双酶切，获得4586bp的线性载体。
6、 以pGL3-multi sgRNA modi载体为模板，使用deSalI For和deSalI Rev引物进行PCR（引物序列分别如序列表SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO. 18所示），获得约500bp的 PCR产物（序列如序列表SEQ ID NO. 24所示）。将上述PCR产物使用限制性内切酶ApaI和SacI双酶切，获得酶切产物（序列如序列表SEQ ID NO. 25所示）。将该酶切产物与步骤5所获得的4586bp的线性载体进行连接获得pGL3-multi sgRNA final载体。
7、 由pUbC-3载体，使用限制性内切酶MluI酶切，获得线性载体并做去磷酸化处理。以pGL3-multi sgRNA final载体为模板，使用U6 For和U6 Rev引物PCR（序列如序列表SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 16所示），获得约450bp的PCR产物（序列如序列表SEQ ID NO. 26所示）。对该450bp的PCR产物用限制性内切酶MluI酶切，获得酶切产物（序列如序列表SEQ ID NO. 27所示）。将该酶切产物与pUbC-3载体经过限制性内切酶MluI酶切并去磷酸化所获得的线性载体连接获得pU6-sgRNA-UbC载体。
、 由pU6-sgRNA-UbC载体使用限制性内切酶AgeI和KpnI双酶切获得10069bp的线性载体。以pst1374-nls-flag-cas9-zf载体（序列如序列表SEQ ID NO. 28所示）为模板，使用Cas9 For和Cas9 Rev引物PCR（序列分别如序列表SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10所示）获得4k bp 的PCR产物（序列如序列表SEQ ID NO. 29所示），使用限制性内切酶AgeI和KpnI双酶切该PCR产物获得酶切PCR片段（序列如序列表SEQ ID NO. 30所示）。将该酶切PCR片段与pU6-sgRNA-UbC载体经过AgeI和KpnI双酶切获得10069bp的线性载体连接获得用于基因敲除的中间载体pU6-sgRNA-UbC-Cas9（序列如序列表SEQ ID NO. 20所示；载体结构如图5所示）。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供了上述基因敲除用中间载体在制备基因敲除载体中的用途。
本发明所要解决的第四个技术问题是提供了一种制备基因敲除载体的方法，该方法包括以下步骤：
1、 由中间载体pU6-sgRNA-UbC-Cas9，使用限制性内切酶BsmBI酶切，回收获得14276bp的线性载体。
2、 按照不同的基因敲除对象和不同的个体或者细胞，将特定的目标sgRNA与上述回收的14276bp 长的pU6-sgRNA-UbC-Cas9线性载体进行连接，获得条件性过表达sgRNA/Cas9载体（载体结构如图9所示）。
3、 将条件性过表达sgRNA/Cas9载体导入细胞（如果是在细胞水平实现基因敲除的话）或者个体原核内（如果是在个体原核水平实现基因敲除的话）。在需要的时候加入Cre（序列如序列表SEQ ID NO. 31所示）或CreERT2（序列如序列表SEQ ID NO. 32所示）表达载体（如果是在细胞水平实现基因敲除的话），或者和Cre或CreERT2表达小鼠系交配（如果是在小鼠水平实现基因敲除的话），通过Cre/Loxp系统将控制Cas9表达的红色荧光蛋白（dsRed）和终止序列（STOP）剔除，使得Cas9表达并实现sgRNA介导的基因组特异序列的切割。
相比于现有技术，本发明的优点在于：
（1）简单。采用本发明的方法，只需要构建条件性过表达Cas9和sgRNA载体；
（2）条件性多基因组多位点敲除。采用本发明的方法，可以同时对多基因进行条件性敲除，实现条件性多基因基因组改造的目的；
（3）一次性实现基因敲除。采用本发明的方法，经过条件性表达的Cas9对位于双链DNA上的两份基因编码DNA序列同时剪切，一次性达到基因敲除的目的；
（4）使用更方便、费用更低、耗时更少。以前的条件性基因敲除都需要针对不同的靶点构建一个在目的基因两端分别含有一个loxP位点的基因序列；或需要构建特异靶点的ZFN或是TALEN耗时耗力且费用高；或需要进行一系列的细胞内筛选，等。本发明的方法中，只需改变很短的sgRNA表达序列就可以实现不同位点的特异性条件性敲除，极大地降低了成本；
（5）采用本发明的方法无物种限制，可以针对任何能进行原核注射的物种。
附图说明
图1 条件性过表达Cas9实现条件性定点剪切导致DNA双链断裂过程示意图。
CRISPR/Cas9系统的定向识别和剪切从而导致基因敲除是通过sgRNA和Cas9实现的。通过条件性表达Cas9进而条件性调节CRISPR/Cas9系统的定向识别和剪切，实现条件性基因敲除。首先，将sgRNA和不同类型的Cas9（WT：野生型；D10A：突变型；dead：失活型）序列导入到载体内，sgRNA用U6启动子启动表达，Cas9用Ubc启动子启动表达，在Ubc和Cas9序列之间插入了两端分别含有一个loxP位点的红色荧光蛋白（dsRed）和终止序列（STOP）。整个sgRNA和Cas9表达片断两端分别含有一段绝缘序列（insulator）以保证sgRNA和Cas9的稳定插入和表达。Cre酶介导重组之前，sgRNA正常表达，但由于终止序列的作用，只表达红色荧光蛋白，不表达Cas9，CRISPR/Cas9系统不发生作用；加入Cre重组酶发生重组后，两个loxP位点之间的红色荧光蛋白编码序列和终止序列（STOP）被重组剪切，Cas9及其后面的绿色荧光蛋白表达；这样Cas9和sgRNA结合发生作用，介导定向识别和剪切从而导致基因敲除。
图2条件性过表达Cas9载体转染细胞的荧光照片。
利用lipofactamine2000将带有条件性表达Cas9和sgRNA的质粒和空载pCAG质粒或表达Cre重组酶的pCAG-Cre质粒分别共转染HEK293细胞，72小时后，荧光显微镜下观察并拍照。共转pCAG的细胞大多显示红色荧光，而共转pCAG-Cre的细胞大多显示绿色荧光。
图3 T7EN1酶切鉴定sgRNA/Cas9介导的基因位点特异性c-Maf和MafB切割。
以提取的细胞基因组为模板，使用c-Maf For和c-Maf Rev，MafB For和MafB Rev引物PCR，PCR产物约1k bp，纯化PCR产物。将上述PCR产物取200ng退火，使用T7EN1酶切鉴定，电泳。如果发生DNA链切割，DNA双链退火过程中出现错配，T7EN1将错配链切断，出现切割条带。如图所示，加入针对c-Maf和MafB sgRNA的样品都出现了切割条带，表明细胞基因组的c-Maf和MafB发生了切割。
图4 sgRNA/Cas9介导的基因位点特异性c-Maf和MafB切割结果测序。
以提取的细胞基因组为模板，使用c-Maf For和c-Maf Rev，MafB For和MafB Rev引物PCR，PCR产物约1k bp。纯化PCR产物，进行TA克隆，并送测序。下划线绿色序列为PAM序列；红色标记靶向序列；突变为蓝色标记小写序列；(-)表示剔出；(+)表示插入；(m)表示突变。
图5 载体pU6-sgRNA-UbC-Cas9的结构。
图6载体pUbC-loxp-dsRed-loxp-gfp的结构。
图7载体pUbC-loxp-dsRed-loxp的结构。
图8载体pGL3-multi sgRNA的结构。
图9条件性过表达载体sgRNA/Cas9的结构。
图10 载体pst1374-nls-flag-cas9-zf的结构。
图11 载体pU57-sgRNA-U6的结构。
图12载体pU6-Maf sgRNA-UbC-Cas9的结构。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案做进一步介绍。本实施例以细胞水平条件性敲除c-Maf和MafB为例对一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法做介绍：
实施例1 中间载体pU6-sgRNA-UbC-Cas9的制备
一、pUbC-loxp-dsRed-loxp载体制备
1. pUbC-loxp-dsRed-loxp-gfp载体（序列如序列表SEQ ID NO. 21所示，结构如图6所示）使用限制性内切酶NotI和SacI双酶切，载体上有1个NotI位点和1个SacI位点，酶切后的片段长度为734bp和9698bp。电泳，切胶回收9698bp片段。
2. 将Back up和Back down（序列如序列表SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示）双寡聚核苷酸等摩尔量混合，退火，形成DNA双链。
3. 将Back up和Back down的混合退火产物与回收的9698bp片段使用T4连接酶连接，转化Trans 5α感受态细菌，涂于带有氨苄抗性的琼脂板。
4. 挑细菌克隆摇菌，使用SpeI seq2测序引物测序，正确连接产物pUbC-loxp-dsRed-loxp。
5. 提取足量的pUbC-loxp-dsRed-loxp质粒（载体），即获得pUbC-loxp-dsRed-loxp载体。
二、pUbC-1载体制备
6. pUbC-loxp-dsRed-loxp载体使用限制性内切酶SpeI酶切，载体上有3个SpeI位点，酶切后的片段长度为126bp，1268bp和8325bp。电泳，切胶回收1268bp片段和8325bp片段。
7. 对8325bp片段使用去磷酸酶处理以防止自连，之后纯化。
8. 将去磷酸化处理后的8325bp片段和回收后的1268bp片段使用T4连接酶连接，转化Trans 5α感受态细菌，涂于带有氨苄抗性的琼脂板。
9. 挑细菌克隆摇菌，使用SpeI seq1和SpeI seq2测序引物测序（序列如序列表SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示），得到正确连接产物pUbC-1。
10. 提取足量的pUbC-1质粒（载体）。
三、pUbC-2载体制备
11. pUbC-1载体使用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切，载体上有1个BamHI位点和1个SacI位点，酶切后的片段长度为48bp和9553bp。电泳，切胶回收9553bp片段。
12. 将Cas9 inser up和Cas9 inser down双寡聚核苷酸等摩尔量混合（序列如序列表SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示），退火，形成DNA双链。
13. 将Cas9 inser up和Cas9 inser down的混合退火产物与回收的9553bp片段使用T4连接酶连接，转化Trans 5α感受态细菌，涂于带有氨苄抗性的琼脂板。
14. 挑细菌克隆摇菌，使用SpeI seq2测序引物测序，得到正确连接产物pUbC-2。
15. 提取足量的pUbC-2质粒（载体）。
三、pUbC-3载体制备
16. pUbC-2载体使用限制性内切酶SpeI酶切，载体上有1个SpeI位点，线性化。
17. 回收线性化片段，对回收后的片段使用去磷酸酶处理以防止自连，之后纯化。
18. 将SpeI prom up和SpeI prom down双寡聚核苷酸等摩尔量混合（序列如序列表SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示），退火，形成DNA双链。
19. 将SpeI prom up和SpeI prom down的混合退火产物与第去磷酸酶处理后的线性化pUbC-2片段使用T4连接酶连接，转化Trans 5α感受态细菌，涂于带有氨苄抗性的琼脂板。
20. 挑细菌克隆摇菌，使用SpeI seq1测序引物测序，得到正确连接产物pUbC-3。
21. 提取足量的pUbC-3质粒（载体）。
四、pGL3-multi sgRNA final载体制备
22. pGL3-multi sgRNA载体（序列如序列表SEQ ID NO. 23所示；载体结构如图8所示）使用限制性内切酶BsmBI酶切，载体上有3个BsmBI位点，酶切后的片段长度为553bp，917bp和5508bp。电泳，切胶回收5508bp片段。
23. 将MCS up和MCS down双寡聚核苷酸等摩尔量混合（序列如序列表SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 13所示），退火，形成DNA双链。
24. 将MCS up和MCS down的混合退火产物与回收后的5508bp片段使用T4连接酶连接，转化Trans 5α感受态细菌，涂于带有氨苄抗性的琼脂板。
25. 挑细菌克隆摇菌，使用U6 Rev测序引物测序，正确连接得产物pGL3-multi sgRNA modi。
26. 提取足量的pGL3-multi sgRNA modi质粒（载体）。
27. 以pGL3-multi sgRNA modi载体为模板，使用deSalI For和deSalI Rev引物PCR（引物序列分别如序列表SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO. 18所示），PCR产物约500bp，纯化PCR产物。
28. 将纯化后的PCR片段使用限制性内切酶ApaI和SacI双酶切，纯化酶切产物。
29. pGL3-multi sgRNA modi载体使用限制性内切酶ApaI和SacI双酶切，载体上有2个ApaI位点和SacI位点，酶切后的片段长度为211bp，867bp和4586bp。电泳，切胶回收4586bp片段。
30. 将上述回收的500bp PCR产物与回收的pGL3-multi sgRNA modi载体4586bp片段使用T4连接酶连接，转化Trans 5α感受态细菌，涂于带有氨苄抗性的琼脂板。
31. 挑细菌克隆摇菌，使用deSal seq测序引物测序，得到正确连接产物pGL3-multi sgRNA final。
32. 提取足量的pGL3-multi sgRNA final质粒（载体）。
五、pU6-sgRNA-UbC载体制备
33. 以pGL3-multi sgRNA final载体为模板，使用U6 For和U6 Rev引物PCR（序列如序列表SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 16所示），PCR产物约450bp，纯化PCR产物。
34. 上述纯化后的PCR片段使用限制性内切酶MluI酶切，纯化酶切产物。
35. pUbC-3载体使用限制性内切酶MluI酶切，载体上有1个MluI位点，线性化。
36. 回收线性化片段，对回收后的片段使用去磷酸酶处理以防止自连，之后纯化。
37. 将上述酶切回收的PCR产物与去磷酸酶处理后的线性化pUbC-3片段使用T4连接酶连接，转化Trans 5α感受态细菌，涂于带有氨苄抗性的琼脂板。
38. 挑细菌克隆摇菌，使用MluI seq测序引物测序，正确连接得产物pU6-sgRNA-UbC。
39. 提取足量的pU6-sgRNA-UbC质粒（载体）。
六、pU6-sgRNA-UbC-Cas9载体制备
40. 以pst1374-nls-flag-cas9-zf（序列如序列表SEQ ID NO. 28所示，结构如图10所示）载体为模板，使用Cas9 For和Cas9 Rev引物PCR（序列分别如序列表SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10所示），PCR产物约4k bp，纯化PCR产物。
41. 上述纯化后的PCR片段使用限制性内切酶AgeI和KpnI双酶切，纯化酶切产物。
42. pU6-sgRNA-UbC载体使用限制性内切酶AgeI和KpnI双酶切，载体上有1个AgeI位点和1个KpnI位点，酶切后的片段长度为21bp和10069bp。电泳，切胶回收10069bp片段。
43. 将上述酶切回收后的4k PCR产物与回收后的pU6-sgRNA-UbC 10069bp片段使用T4连接酶连接，转化Trans 5α感受态细菌，涂于带有氨苄抗性的琼脂板。
44. 挑细菌克隆摇菌，使用Cas9 seq和SpeI seq2测序引物测序（序列如序列表SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 4所示），反向引物中间区域测通以保证无突变，正确连接得产物pU6-sgRNA-UbC-Cas9。
45. 提取足量的pU6-sgRNA-UbC-Cas9质粒（载体），即得中间载体pU6-sgRNA-UbC-Cas9（序列如序列表SEQ ID NO. 20所示；载体结构如图5所示）。
实施例2 条件性过表达pU6-Maf sgRNA-UbC-Cas9载体的制备
1. 中间载体pU6-sgRNA-UbC-Cas9使用限制性内切酶BsmBI酶切，载体上有2个BsmBI位点，酶切后的片段长度为25bp和14276bp。电泳，切胶回收14276bp片段。
2. 以pU57-sgRNA-U6（序列如序列表SEQ ID NO. 33所示，结构如图11所示）载体为模板，分别使用Maf-arr-For1和Maf-arr-Rev1，Maf-arr-For2和Maf-arr-Rev2，Maf-arr-For3和Maf-arr-Rev3，Maf-arr-For4和Maf-arr-Rev4，Maf-arr-For5和Maf-arr-Rev5引物PCR（序列分别如序列表SEQ ID NO. 34 - 43所示），PCR产物约500bp，纯化PCR产物。
3. 上述纯化后的PCR片段使用限制性内切酶BsmBI酶切，纯化酶切产物。
4. 将上述酶切回收后的各种酶切产物等摩尔量混合，与回收后的pU6-sgRNA-UbC-Cas9 14276bp片段使用T4连接酶连接，转化Trans 5α感受态细菌，涂于带有氨苄抗性的琼脂板。
5. 挑细菌克隆摇菌，使用arr-5’ seq和arr-3’ seq测序引物测序（序列如序列表SEQ ID NO. 44和SEQ ID NO. 45所示），反向引物中间区域测通以保证无突变，正确连接得产物pU6-Maf sgRNA-UbC-Cas9（序列如序列表SEQ ID NO. 46所示）。
6. 提取足量的pU6-Maf sgRNA-UbC-Cas9载体（序列如序列表SEQ ID NO. 46所示，结构如图12所示）。
实施例3细胞水平验证诱导敲除效果
1. 将pU6-Maf sgRNA-UbC-Cas9质粒转染至Cre/ERT2过表达ES细胞系，通过红色荧光分选获得阳性ES细胞。
2. 加入4-OH-Tamoxifen诱导Cre入核，通过Cre/Loxp系统将控制Cas9表达的红色荧光蛋白（dsRed）和终止序列（STOP）剔除，使得Cas9表达并实现sgRNA介导的基因组特异序列的切割（参见图1及附图说明）。
3. 48h后收获细胞，提取基因组。
以上述基因组为模板，使用c-Maf For和c-Maf Rev，MafB For和MafB Rev引物PCR（序列分别如序列表SEQ ID NO. 47-50所示），PCR产物约1k bp，纯化PCR产物。
将上述PCR产物取200ng退火，使用T7EN1酶切鉴定，电泳，切割效果下图3所示。
将PCR产物进行TA克隆，使用使用c-Maf For和c-Maf Rev，MafB For和MafB Rev引物测序（序列分别如序列表SEQ ID NO. 47-50所示）。分析测序结果，肯定细胞基因组c-Maf和MafB发生不同种类的切割（图4）。
Claims (10)
1.一种无物种限制的真核生物条件性基因打靶用中间载体，其特征为：
利用II s 型限制性内切酶BsmBI切割形成不同粘性末端可将多个U6 promoter调控sgRNA表达的片段一次性连接进载体中，为开源系统；
此载体包含有UbC promoter调控的Cas9，但特点在于在UbC promoter与Cas9之间有一个被双loxp包含的dsRed，在未加入cre删除loxp包含区域的情况下只有dsRed表达，在加入cre删除dsRed之后Cas9才开始表达；
插入多个U6 promoter调控sgRNA表达的片段的区域使用II s 型限制性内切酶BsmBI切割，形成5’ ACCG 3’和5’ GTTT 3’两个不同的粘性末端。
2. 如权利要求1所述的一种无物种限制的真核生物条件性基因打靶用中间载体，其特征为载体结构如图5所示。
3. 如权利要求2所述的一种无物种限制的真核生物条件性基因打靶用中间载体，其特征为序列如序列表SEQ ID NO.20所示。
4. 权利要求1-3任意一项所述的一种无物种限制的真核生物条件性基因打靶用中间载体在制备基因打靶载体中的用途。
5. 由权利要求3所述的一种无物种限制的真核生物条件性基因打靶用中间载体制备获得的条件性过表达pU6-Maf sgRNA-UbC-Cas9载体，其特征为序列如序列表SEQ ID NO. 46所示。
6.一种制备如权利要求3所述的一种无物种限制的真核生物条件性基因打靶用中间载体的方法，其特征为包括以下步骤：
(1)利用限制性内切酶NotI和SacI,由序列如序列表SEQ ID NO. 21所示的pUbC-loxp-dsRed-loxp-gfp载体双酶切获得线性质粒；将序列分别如序列表SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的Back up和Back down的混合退火产物与上述线性质粒连接获得序列如序列表SEQ ID NO. 22所示的pUbC-loxp-dsRed-loxp载体；
(2)由pUbC-loxp-dsRed-loxp载体，使用限制性内切酶SpeI酶切获得1268bp和8325bp的两段序列，对8325bp这段序列做去磷酸化处理，然后连接1268bp和8325bp这两段序列获得pUbC-1载体；
(3)由pUbC-1载体，使用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切，获得9553bp片段的线性载体；将该线性载体与序列分别如序列表SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示的Cas9 inser up和Cas9 inser down的混合退火产物连接获得pUbC-2载体；
(4)由pUbC-2载体，使用限制性内切酶SpeI酶切，获得线性载体并对其做去磷酸化处理；将该线性载体和序列如序列表SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示的SpeI prom up和SpeI prom down的混合退火产物连接获得pUbC-3载体；
(5)由序列如序列表SEQ ID NO. 23所示的pGL3-multi sgRNA载体，使用限制性内切酶BsmBI酶切，获得5508bp片段的线性载体；将序列分别如序列表SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 13所示的MCS up和MCS down的混合退火产物与该线性载体连接获得pGL3-multi sgRNA modi载体；由pGL3-multi sgRNA modi载体，使用限制性内切酶ApaI和SacI双酶切，获得4586bp的pGL3-multi sgRNA modi的线性载体；
(6)以pGL3-multi sgRNA modi载体为模板，使用序列分别如序列表SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO. 18所示的引物deSalI For和deSalI Rev进行PCR，获得约500bp的序列如序列表SEQ ID NO. 24所示的PCR产物；将该PCR产物使用限制性内切酶ApaI和SacI双酶切，获得序列如序列表SEQ ID NO. 25所示的酶切产物；将该酶切产物与上步所获得的4586bp的pGL3-multi sgRNA modi的线性载体进行连接获得pGL3-multi sgRNA final载体；
(7)由pUbC-3载体，使用限制性内切酶MluI酶切，获得线性载体并做去磷酸化处理；以pGL3-multi sgRNA final载体为模板，使用序列分别如序列表SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 16所示的引物U6 For和U6 Rev 进行PCR，获得约450bp的序列如序列表SEQ ID NO. 26所示的PCR产物；对该450bp的PCR产物用限制性内切酶MluI酶切，获得序列如序列表SEQ ID NO. 27所示酶切产物；将该酶切产物与pUbC-3载体经过限制性内切酶MluI酶切并去磷酸化所获得的线性载体连接获得pU6-sgRNA-UbC载体；
(8)由pU6-sgRNA-UbC载体使用限制性内切酶AgeI和KpnI双酶切获得10069bp的线性载体；以序列如序列表SEQ ID NO. 28所示的pst1374-nls-flag-cas9-zf载体为模板，使用序列分别如序列表SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10所示的引物Cas9 For和Cas9 Rev 进行PCR获得序列如序列表SEQ ID NO. 29所示的4k bp 的PCR产物，使用限制性内切酶AgeI和KpnI双酶切该PCR产物获得序列如序列表SEQ ID NO. 30所示的酶切PCR片段；将该酶切PCR片段与pU6-sgRNA-UbC载体经过AgeI和KpnI双酶切获得10069bp的线性载体连接获得用于基因敲除的序列如序列表SEQ ID NO. 20所示的中间载体pU6-sgRNA-UbC-Cas9。
7. 一种由权利要求3所述的一种无物种限制的真核生物条件性基因打靶用中间载体制备条件性过表达pU6-sgRNA-UbC-Cas9载体的方法，其特征为包括以下步骤：
(1)由中间载体pU6-sgRNA-UbC-Cas9，使用限制性内切酶BsmBI酶切，回收获得14276bp的线性载体；
(2)将特定的目标sgRNA与上述回收的14276bp 长的pU6-sgRNA-UbC-Cas9线性载体进行连接，获得条件性过表达pU6-sgRNA-UbC-Cas9载体。
8. 一种由权利要求3所述的一种无物种限制的真核生物条件性基因打靶用中间载体制备条件性过表达pU6-Maf sgRNA-UbC-Cas9载体的方法，其特征为包括以下步骤：
(1)由中间载体pU6-sgRNA-UbC-Cas9，使用限制性内切酶BsmBI酶切，回收获得14276bp大小的pU6-sgRNA-UbC-Cas9线性载体；
(2)以序列如序列表SEQ ID NO. 33所示的pU57-sgRNA-U6载体为模板，分别使用序列分别如序列表SEQ ID NO. 34 - 43所示的引物Maf-arr-For1和Maf-arr-Rev1、Maf-arr-For2和Maf-arr-Rev2、Maf-arr-For3和Maf-arr-Rev3、Maf-arr-For4和Maf-arr-Rev4以及Maf-arr-For5和Maf-arr-Rev5 进行PCR，PCR产物约500bp，纯化PCR产物；将该纯化后的PCR片段使用限制性内切酶BsmBI酶切，纯化酶切产物；
(3)将上述酶切回收后的各种酶切产物等摩尔量混合，与回收获得的14276bp大小的pU6-sgRNA-UbC-Cas9线性载体片段使用T4连接酶连接，转化Trans 5α感受态细菌，涂于带有氨苄抗性的琼脂板；
(4)挑细菌克隆摇菌，使用序列分别如序列表SEQ ID NO. 44和SEQ ID NO. 45所示的arr-5’ seq和arr-3’ seq测序引物测序，反向引物中间区域测通以保证无突变，正确连接得序列如序列表SEQ ID NO. 46所示产物pU6-Maf sgRNA-UbC-Cas9；
(5)提取足量的序列如序列表SEQ ID NO. 46所示的pU6-Maf sgRNA-UbC-Cas9载体。
9. 一种无物种限制的条件性基因敲除方法，其特征为：在细胞水平实现基因敲除或在个体原核水平实现基因敲除时将条件性过表达pU6-sgRNA-UbC-Cas9载体导入细胞，需要时加入序列如序列表SEQ ID NO. 31所示的Cre或序列如序列表SEQ ID NO. 32所示的CreERT2表达载体；在小鼠水平实现基因敲除时，用Cre或CreERT2表达小鼠系交配，通过Cre/Loxp系统将控制Cas9表达的红色荧光蛋白dsRed和终止序列STOP剔除，使得Cas9表达并实现sgRNA介导的基因组特异序列的切割。
10.一种无物种限制的条件性基因敲除方法，其特征为包括以下步骤：
(1)将pU6-Maf sgRNA-UbC-Cas9质粒转染至Cre/ERT2过表达ES细胞系，通过红色荧光分选获得阳性ES细胞；
(2)加入4-OH-Tamoxifen诱导Cre入核，通过Cre/Loxp系统将控制Cas9表达的红色荧光蛋白dsRed和终止序列STOP剔除，使得Cas9表达并实现sgRNA介导的基因组特异序列的切割。
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| CN201410023541.6A CN103725712B (zh) | 2014-01-17 | 2014-01-17 | 一种无物种限制的条件性基因敲除用中间载体及其制备方法和用途 |
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