CN105087617A - 一种36bplox位点序列的重组载体及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种36bplox位点序列的重组载体及其构建方法与应用，利用Sac？I和Sma？I内切酶切除pBI121载体中的GUS基因。设计特定引物lox66-Cre-5’和Sac？I-cre-3’，利用LA-Taq酶扩增J20(Pc-cre，包含有Cre基因序列)获得lox66-Cre片段。利用T4连接酶将lox66-Cre片段连入除去GUS基因的pBI121载体，经鉴定40号克隆为所需要的阳性克隆，命名为Cre40，Cre40为含有CRE/loxP位点特异性重组系统的表达载体。通过根癌农杆菌介导，将表达载体Cre40转化油菜品种中油821，获得了经过PCR检测为阳性的油菜转基因植株，转基因植株有性杂交试验证明该载体具有位点特异性重组功能。

Description

一种36bplox位点序列的重组载体及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和转基因研究领域，可用于转基因的定向插入和多基因的定向叠加。更具体地讲，本发明涉及一种36bplox特异性重组位点的表达载体，同时涉及到含有lox特异性重组位点表达载体的构建方法，以及该发明在植物转基因和基因工程中的应用。

背景技术

Cre/lox重组系统包括Cre重组酶和lox位点两个部分，Cre重组酶由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，由343个氨基酸组成，它不仅具有催化活性，而且跟限制酶相似，识别特异的DNA序列，如：lox位点，引起重组。

Lox位点是Cre重组酶作用的特异性重组位点，野生的lox位点被称为loxP，由34bp组成，即：ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT，两个13bp的反向重复顺序和8bp的间隔区域构成。Cre重组酶有70％的重组效率，不借助任何辅助因子，作用于多种结构的DNA底物，如线形、环状，甚至超螺旋(被Cre重组酶解螺旋成为线形结构)。Cre重组酶通过与DNA上lox位点的结合，发挥其重组作用(TrinhKR，MorrisonSL2000Site-specificanddirectionalgenereplacementmediatedbyCrerecombinase.JournalofImmunologicalMethods244(1)：185-193.)。

正常loxP是一种回文序列结构，长34bp，由2个13bp的反向重复序列和8bp的非对称间隔序列构成。本发明设计的lox66位点包括1段8bp的非对称间隔序列、1段13bp的反向重复序列、1段13bp的反向重复突变序列及与之相邻的2bp保护序列，杂交实验证明该位点具有正常的重组功能。Lox71位点也存在一个反向重复序列突变位点(YuWC，LambJC，HanFP，BirchlerJA2006Telomere-mediatedchromosomaltruncationinmaize.Proc.Natl.Acad.Sci.103(46)：17331-17336.)，当lox66与lox71发生重组后，形成一个正常的loxp位点和一个具有突变的两个反向重复序列的lox位点，这样就无法进行可逆过程，使得重组发生之后不会回复，为多基因的叠加奠定了基础。

发明内容

本发明的目的是为了能够提供一种36bplox位点序列的重组载体及其构建方法与应用。

一种36bplox位点序列的重组载体及其构建方法，以下步骤：

第一步：MS培养基配方：

铁盐成分：FeSO₄·7H₂O27.8mg/L

Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg/L，

以上溶液均配成100×的母液；

第二步：

筛选培养基：MS+3mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+5mg/LAgNO3+400mg/LCar+13mg/L卡那霉素，

生根培养基：MS+0.2mg/LNAA+400mg/LCar+15mg/L卡那霉素，

YEB培养基：牛肉膏(5g/L)，酵母抽提物(1g/L)，蛋白胨(5g/L)，蔗糖(5g/L)，MgSO₄(2mmol/L)pH7.2，固体培养基含琼脂15g/L，

LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，调整PH至7.0，再补足水至1L，固体培养基含琼脂15g/L；

第三步：质粒DNA的酶切及其产物的纯化，

第四步：DNA的连接；

第五步：连接产物的重组子鉴定。

本发明的有益效果：含有CRE/loxP位点特异性重组系统的表达载体Cre40的构建及其转基因油菜植株的获得，为未来在油菜中实施多基因叠加并对油菜进行基因工程改良、或利用所得材料作为生物反应器生产目的产品等提供了一种新的途径。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1表达载体pBI121质粒图谱。

图2表达载体Cre40质粒图谱。

图3阳性克隆的酶切鉴定。

图4Cre40转基因植株PCR检测结果。

图5内标PDS基因表达。

图6CRE基因表达。

图7Cre40载体重组功能验证

具体实施方式

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试油菜品种

甘蓝型油菜品种中油821，该品种油菜及其转基因植株种植于中国农业科学院油料作物研究所网室。

1.1.2菌株

大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α、农杆菌菌株EHA105及LBA4404由本实验室保存。

1.1.3载体

pMD18-T载体购自TaKaRa公司

pBI121，pBI-GFP由本实验室保存

1.1.4主要试剂

dNTP、TaqDNA聚合酶和LA-Taq酶。

限制性内切酶。

T₄-DNA连接酶。

CTAB等。

抗生素(氨苄青霉素、卡那霉素等)。

PCR引物。

测序。

文中提及的其余试剂均为国产分析纯产品。

第一步：

MS培养基配方：

铁盐成分：FeSO₄·7H₂O27.8mg/L

Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg/L

以上溶液均配成100×的母液。

第二步：

筛选培养基：MS+3mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+5mg/LAgNO3+400mg/LCar+13mg/L卡那霉素。

生根培养基：MS+0.2mg/LNAA+400mg/LCar+15mg/L卡那霉素。

YEB培养基：牛肉膏(5g/L)，酵母抽提物(1g/L)，蛋白胨(5g/L)，蔗糖(5g/L)，MgSO₄(2mmol/L)pH7.2，固体培养基含琼脂15g/L。

LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，调整PH至7.0，再补足水至1L，固体培养基含琼脂15g/L。

1.2试验方法

1.2.1质粒DNA的酶切及其产物的纯化

1.取上述质粒DNA1.0-2.0μg，加入相应酶的10×Buffer2.0μl，最后加入相应的限制性内切酶，混匀酶切反应体系，37℃酶切2-4小时。

2.在1％的琼脂糖凝胶上电泳，分离片段。

3.凝胶成像照相后，紫外下切割目的片段，采用凝胶回收试剂盒回收目的片段，同上。

取2μl在1％的琼脂糖凝胶上电泳，检测回收目的片段大小和浓度。

1.2.2DNA的连接

1.按外源片段和载体比为1∶1-10∶1的量，加入相应量的片段。取回收的目的片段20-50ng，进行连接。

2.加入10×T₄LigationBuffer1.0μl，3UT₄DNALigase(Promega)，总体积不超过10μl。

3.连接反应程序：10℃3分钟；从10℃经历3分钟升至16℃；16℃3分钟；18℃1分钟；17个循环，后65℃5分钟灭活连接酶。

4.结束后将反应液取5μl至透析膜上加无菌水于4℃透析20分钟，取连接产物和20μl感受态细胞混合，进行电激转化。参数2KΩ，330μF，330-350V。

5.电激后将菌体转入1mlSOC中，37℃200rpm培养50分钟。后铺板于含抗生素的LB培养皿上。

1.2.3连接产物的重组子鉴定

1.挑取单菌落于相应的抗生素LB中，摇菌37℃过夜培养。

2.采用碱裂解法提取质粒。

3.取上述质粒DNA1.0-2.0μg，加入相应酶的10×Buffer2.0μl，最后加入相应的限制性内切酶，混匀酶切反应体系，37℃酶切2-4小时。

4.在1％的琼脂糖凝胶上电泳，检测分离片段大小。是否和预计插入片段相符。如有必要，还可测序分析插入序列。

1.2.4PCR产物与T载体的连接

按照TaKaRa公司T载体试剂盒说明进行，连接产物通过电转导入大肠杆菌感受态中，将电转后的细菌涂于LB/Ampicillin/IPTG/X-Gal的培养基平板上，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆。

试剂：Amp(50mg/ml)：100mgAmp加2ml去离子水500ml，过滤灭菌。

IPTG(0.1M)：1.2gIPTG加水50ml，过滤，4℃贮存。

X-Gal(50mg/ml)：100mg5-溴-4-氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷溶于2ml二甲基

甲酰胺溶液。用铝箔包裹以防因光照而被破坏，-20℃贮存，须过滤。

在LB/Amp上加100μl的0.1MIPTG和20μl的50mg/mlX-Gal使用。

1.2.5油菜的遗传转化和阳性苗的PCR鉴定

1.2.5.1无菌苗的获得

种子用75％的酒精表面消毒30s，用无菌水冲洗2-3次，再用2％的次氯酸钠消毒12-14min，用无菌水清洗5-6次，然后接种于MS固体培养基，在25℃，光照16h条件下培养成苗，苗龄3-4d的子叶柄和下胚轴切段用于转化试验。(子叶柄去生长点，下胚轴切成0.5cm左右的小段)

1.2.5.2根癌农杆菌的活化

将-80℃保存的含构建好质粒的农杆菌菌液解冻，涂于含有抗生素的YEB固体培养基28℃暗培养。2d后挑取单菌落于含有抗生素的YEB液体培养基，在28℃，转速200r/min摇床上培养至OD600值为0.6-1.0备用。

1.2.5.3根癌农杆菌的培养及转化

离心收集活化的农杆菌(5000r/min，8min)，用MS+1mg/L2，4-D+500mg/LMES+200μmol/LAS重悬培养液稀释至OD600值为0.2左右用于浸染。

将切好的子叶柄与下胚轴于农杆菌浸染液中浸泡8min(其间不断振荡以均匀浸染)。于MS+1mg/L2，4-D+500mg/LMES+200μmol/LAS中暗培养2d，转入MS+3mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+5mg/LAgNO3+400mg/LCar延迟筛选培养基中培养5-7d，25℃，光照16h。再转入MS+3mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+5mg/LAgNO3+400mg/LCar+筛选抗生素的筛选培养基中，外植体在上述培养基中，每隔20d用原培养基(筛选培养基)继代培养一次。待分化出绿色小芽后转入新鲜培养基(筛选培养基)中培养，待分化出的绿芽长到3cm左右时，移入MS+0.2mg/LNAA+400mg/LCar+筛选抗生素的生根培养基中生根。

待再生的植株在生根培养基中根系发育良好后，经过逐步炼苗后移入温室生长。

注：筛选培养基中卡那霉素浓度为13mg/L，生根培养基中卡那霉素浓度为15mg/L。

1.2.5.4阳性苗的PCR快速检测

1.称取约50mg的叶片，用70％的乙醇擦洗叶片，放入Eppendorf管中，用钻头研磨。

2.加入600μlDNA提取液，混匀，室温放置1h。

DNA提取液

500mMNaCl

50mMEDTA

0.38％(W/V)Sodiumbisulfate

1.25％(W/V)SDS

100mMTris-HCl(pH8.0)

8.3mMNaOH

3.12000rpm离心10min，取上清，移入新的Eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿(1∶1V/V)，混匀。

4.12000rpm离心5min，取上清，移入新的Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，放置10min。

5.12000rpm离心5min。

6.弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤一次。

7.沉淀干燥后用20μlTE(pH7.5)溶解。以0.5μl为模板进行PCR扩增筛选阳性植株。

1.2.6阳性转基因植株Cre酶表达水平的RT-PCR分析

1.2.6.1幼叶总RNA的提取

步骤按上海生工公司Trizol试剂盒说明书进行：

1.称取约0.10g植物材料，液氮中将组织碾磨成粉末，趁液氮尚未挥发完全时，将粉末转移到1.5ml离心管中。

2.在样品中加入1mlTrizol，震荡混匀。室温放置5min。加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30sec。然后于室温放置5min，12，000rpm，4℃离心10min。

3.将上清液小心转移到RNase-free1.5ml离心管里，加入等体积的异丙醇，室温下放置5min。12，000rpm，4℃离心10min。

4.移去上清液，保留RNA沉淀。用70％酒精洗涤两次，每次700μl，12000rpm，4℃离心5min。

5.空气干燥RNA。用30～50μlDEPC-H₂O溶解，置于-70℃保存备用。

6.测定样品在260nm和280nm的吸收值确定RNA的质量。按1OD＝40μgRNA计算RNA的产率。OD₂₆₀/₂₈₀在1.8～2.0视为RNA的纯度很高。

7.进行甲醛变性琼脂糖电泳，确定RNA的完整性和污染情况。如果出现两条清晰的条带(由于胶的浓度与上样量的不同有时呈现3条带)，且最大两条条带(28SRNA：18SRNA)的亮度比约为2∶1时，则总RNA的完整性良好。

1.2.6.2cDNA第一链的合成

eDNA第一链的合成步骤按美国Promega公司反转录试剂盒说明书进行。

1.将1μg总RNA加入微量离心管，用水补充体积至10μl，70℃温育10min，短暂离心后置于冰上。

2.依照所列顺序加入以下试剂以建立一个20μl的反应体系(依据RNA的量，反应体积可以增减)：见表1

表1

3.将反应体系混匀后42℃温育1h；95℃加热5min，冷却到4℃，存于-20℃备用。

1.2.6.3RT-PCR表达分析

以目的基因序列为引物，以PDS基因作内标来确定PCR时的模板量，进行半定量RT-PCR表达分析。

2结果与分析

以植物表达载体pBI121(图1)为基础构建含有Cre/loxP位点特异性重组系统的表达质粒。

2.1包含Cre/loxP位点特异性重组系统的载体Cre40的构建

以双元载体pBI121为基础，将lox66-Cre片段替换pBI121的GUS基因即获得载体Cre40(图2)。

2.1.1lox66-Cre片段的获得

以lox66-Cre-5’(5’-TAACCCGGGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAACGGTACCATGTCCAATTTACTGACCGTACACC-3’)和SacI-cre-3’-new(5’-TAAGAGCTCTAATCGCCATCTTCCAGCAGGCGCAC-3’)为一对引物，利用La-Taq酶扩增J20(Pc-cre，包含有Cre基因序列)获得lox66-Cre片段。

2.1.2lox66-Cre片段与PBI121载体的连接

电泳并回收片段，用SacI和SmaI双酶切，同时pBI121质粒也用SacI和SmaI双酶切，切除GUS基因，分别回收片段和载体，利用NEB的T4连接酶连接过夜，连接产物2μL电转Ep1300感受态，37℃复苏1h，涂板Kan/LB平板。

2.1.3阳性克隆的筛选

用引物lox66-Cre-5’和SacI-cre-3’-newPCR筛选阳性克隆，以J20为阳性对照。在阳性克隆中随机挑选三个克隆进行酶切鉴定。

酶切鉴定20，29，40号克隆，通过SacI和SmaI双酶切后电泳检测(图3)。

在图3中，1-3泳道分别是20，29，40号克隆质粒的双酶切，4泳道是载体片段，5泳道是lox66-Cre片段，含有少量片段自连产物。

40号克隆命名为Cre40，结构是PBI121上GUS基因被lox66-Cre片段替代(35S-lox66-Cre-Tnos)，经过测序Cre40序列正确，可以用于下面的转基因。

2.2载体Cre40在油菜中的转化与鉴定

按照标准的转基因程序，以13mg/L的卡那霉素为筛选压力，15mg/L的卡那霉素为生根筛选压力进行油菜的转基因，以NPTII基因为PCR筛选序列，进行筛选，共获得3棵阳性苗。

Cre40载体的15株苗中有三株有条带，且与阳性对照大小相符。分别命名为：cre40-1、cre40-2、cre40-3。

2.3转基因植株中Cre酶表达水平的RT-PCR分析

实验结果表明：Cre40转基因植株中2号植株表达量最高，3号植株表达量最低(图6)。后期实验优先选用2号做杂交试验。

2.4Cre40载体重组功能验证

实验结果表明：选用2号植株与含有lox71位点载体的油菜转基因植株杂交，红色荧光蛋白正常表达(图7)，表明lox位点发生了重组，Cre40载体具有正常的重组功能。

本发明的积极效果：含有CRE/loxP位点特异性重组系统的表达载体Cre40的构建及其转基因油菜植株的获得，为未来在油菜中实施多基因叠加并对油菜进行基因工程改良、或利用所得材料作为生物反应器生产目的产品等提供了一种新的途径。

为了举例说明本发明的实现，描述了上述的具体实施方式。但是本发明的其他变化和修改，对于本领域技术人员是显而易见的，在本发明所公开的实质和基本原则范围内的任何修改/变化或者仿效变换都属于本发明的权利要求保护范围。

Claims (7)

1.一种36bplox位点序列的重组载体及其构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步：MS培养基配方：

铁盐成分：FeSO₄·7H₂O27.8mg/L

Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg/L，

以上溶液均配成100×的母液；

第二步：

筛选培养基：MS+3mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+5mg/LAgNO3+400mg/LCar+13mg/L卡那霉素，

生根培养基：MS+0.2mg/LNAA+400mg/LCar+15mg/L卡那霉素，

YEB培养基：牛肉膏(5g/L)，酵母抽提物(1g/L)，蛋白胨(5g/L)，蔗糖(5g/L)，MgSO₄(2mmol/L)pH7.2，固体培养基含琼脂15g/L，

LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，调整PH至7.0，再补足水至1L，固体培养基含琼脂15g/L；

第三步：质粒DNA的酶切及其产物的纯化，

第四步：DNA的连接；

第五步：连接产物的重组子鉴定。

2.根据权利要求1所述的一种36bplox位点序列的重组载体及其构建方法，其特征在于，所述质粒DNA的酶切及其产物的纯化，包括以下步骤：

取上述质粒DNA1.0-2.0μg，加入相应酶的10×Buffer2.0μl，最后加入相应的限制性内切酶，混匀酶切反应体系，37℃酶切2-4小时；

在1％的琼脂糖凝胶上电泳，分离片段；

凝胶成像照相后，紫外下切割目的片段，采用凝胶回收试剂盒回收目的片段，同上。取2μl在1％的琼脂糖凝胶上电泳，检测回收目的片段大小和浓度。

3.根据权利要求1所述的一种36bplox位点序列的重组载体及其构建方法，其特征在于，所述DNA的连接，包括以下步骤：

按外源片段和载体比为1∶1-10∶1的量，加入相应量的片段。取回收的目的片段20-50ng，进行连接；

加入10×T₄LigationBuffer1.0μl，3UT₄DNALigase(Promega)，总体积不超过10μl；

连接反应程序：10℃3分钟；从10℃经历3分钟升至16℃；16℃3分钟；18℃1分钟；17个循环，后65℃5分钟灭活连接酶；

结束后将反应液取5μl至透析膜上加无菌水于4℃透析20分钟，取连接产物和20μl感受态细胞混合，进行电激转化。参数2KΩ，330μF，330-350V；

电激后将菌体转入1mlSOC中，37℃200rpm培养50分钟。后铺板于含抗生素的LB培养皿上。

4.根据权利要求1所述的一种36bplox位点序列的重组载体及其构建方法，其特征在于，所述连接产物的重组子鉴定，包括以下步骤：

挑取单菌落于相应的抗生素LB中，摇菌37℃过夜培养。

采用碱裂解法提取质粒。

取上述质粒DNA1.0-2.0μg，加入相应酶的10×Buffer2.0μl，最后加入相应的限制性内切酶，混匀酶切反应体系，37℃酶切2-4小时。

在1％的琼脂糖凝胶上电泳，检测分离片段大小。是否和预计插入片段相符。如有必要，还可测序分析插入序列。

5.一种36bplox位点序列的重组载体的应用，其特征在于，包括以下步骤：

第一步：无菌苗的获得，种子用75％的酒精表面消毒30s，用无菌水冲洗2-3次，再用2％的次氯酸钠消毒12-14min，用无菌水清洗5-6次，然后接种于MS固体培养基，在25℃，光照16h条件下培养成苗，苗龄3-4d的子叶柄和下胚轴切段用于转化试验；

第二步：根癌农杆菌的活化，将-80℃保存的含构建好质粒的农杆菌菌液解冻，涂于含有抗生素的YEB固体培养基28℃暗培养。2d后挑取单菌落于含有抗生素的YEB液体培养基，在28℃，转速200r/min摇床上培养至OD600值为0.6-1.0备用；

第三步：根癌农杆菌的培养及转化，离心收集活化的农杆菌(5000r/min，8min)，用MS+1mg/L2，4-D+500mg/LMES+200μmol/LAS重悬培养液稀释至OD600值为0.2左右用于浸染；将切好的子叶柄与下胚轴于农杆菌浸染液中浸泡8min(其间不断振荡以均匀浸染)。于MS+1mg/L2，4-D+500mg/LMES+200μmol/LAS中暗培养2d，转入MS+3mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+5mg/LAgNO3+400mg/LCar延迟筛选培养基中培养5-7d，25℃，光照16h。再转入MS+3mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+5mg/LAgNO3+400mg/LCar+筛选抗生素的筛选培养基中，外植体在上述培养基中，每隔20d用原培养基(筛选培养基)继代培养一次。待分化出绿色小芽后转入新鲜培养基(筛选培养基)中培养，待分化出的绿芽长到3cm左右时，移入MS+0.2mg/LNAA+400mg/LCar+筛选抗生素的生根培养基中生根。

6.根据权利要求5所述的一种36bplox位点序列的重组载体的应用，其特征在于，还包括以下步骤：阳性苗的PCR快速检测，

称取约50mg的叶片，用70％的乙醇擦洗叶片，放入Eppendorf管中，用钻头研磨；

加入600μlDNA提取液，混匀，室温放置1h；

DNA提取液包括：

12000rpm离心10min，取上清，移入新的Eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿(1∶1V/V)，混匀；

12000rpm离心5min，取上清，移入新的Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，放置10min；

12000rpm离心5min；

弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤一次；

沉淀干燥后用20μlTE(pH7.5)溶解。以0.5μl为模板进行PCR扩增筛选阳性植株。

7.一种只有36bplox位点序列的重组载体，其特征在于，其关键序列为Cre40所示的核苷酸序列。