CZ302682B6 - Zpusob produkce synchronizovaných adherentne rostoucích bunecných linií a prístroj pro provádení tohoto zpusobu - Google Patents

Abstract

Zpusob produkce synchronizovaných adherentne rostoucích bunecných linií, jehož podstata spocívá v tom, že kultivacní láhev (4) naplnená kultivacním médiem (41) s vysazenou adherentní bunecnou linií se podrobuje v inkubátoru po dobu 6 až 30 hodin pri standardních kultivacních podmínkách stálým vibracím o velikosti 1 až 100 kmitu/sec zpusobujícím vyplavování slabe adherujících mitotických bunek do kultivacního média (41) a iniciaci inhibice proliferace u techto bunek, a po stanoveném casovém úseku se vyplavená suspenzní frakce bunek odebere k vysazení do nové kultivacní láhve nebo ke zpracování pro analýzu. Prístroj pro realizaci zpusobu sestává z pohyblivé plošiny (1), která je jednak volne zavešena na nepohyblivém podstavci (3), jednak je vybavena úchyty (10) pro uchycení kultivacní láhve (4) a jednak je k ní pripevnen vibrátor (5) propojený kabelem (6) s regulátorem (7) vibrací uloženém v boxu (8), který je soucástí podstavce (3) a uvnitr kterého je uložen bateriový zdroj (9).

Description

Způsob produkce synchronizovaných adherentně rostoucích buněčných linií a přístroj pro provádění tohoto způsobu

Oblast vynálezu

Prezentovaný vynález se týká nového způsobu produkce synchronizovaných adherentně rostoucích buněčných linií, využitelného zejména v biotechnologických laboratořích základního a aplikovaného výzkumu, a popisuje rovněž konstrukci přístroje pro provádění tohoto způsobu,

Dosavadní stav techniky

K biologickým, biotechnologickým a lékařským laboratořím základního i aplikovaného výzkumu is zákonitě patří technologie pěstování buněčných linií. Buněčné linie se využívají k testování léčiv a chemických látek, k produkci bioproduktů a v neposlední radě k základnímu výzkumu a zkoumání nemocí, například rakoviny, degenerativních onemocnění, stárnutí apod. Jedním z nedílných aspektů růstu buněčné populace je nesynchronnost jednotlivých buněk, kdy buňky procházejí různými stádii buněčného cyklu různě rychle a tvoří tak heterogenní populaci buněk různých fází růstového cyklu. Tato heterogenita buněčné populace představuje významný problém pro většinu experimentálních procedur, protože buňky z různých fází buněčného cyklu vykazují odlišné fyzické, fyziologické, biochemické a genetické vlastnosti. Mnohé experimentální procedury tak vyžadují jako model pouze synchronní buněčnou populaci, tedy buňky pouze určité fáze buněčného cyklu. Získat homogenní synchronní populaci buněk v dostatečném množství je kom25 pl i kovaný technologický proces. Pro tyto účely se buňky buď separují, nebo se synchronizace buněčného růstu iniciuje chemicky. Oba přístupy jsou hojně využívané v závislosti na přístrojovém vybavení laboratoře, v některých případech se obě metody kombinují. Výhody a nevýhody nejčastěji používaných metod pro získání synchronní buněčné populace jsou shrnuty v následujícím textu. Iniciační metody jsou synchronizační metody využívající chemikálie, jako jsou inhibitory replikace či inhibitory mitózy, nebo změnu kultivačních podmínek, jako je například sérová nedostatečnost, hormonální nedostatečnost či nedostatečnost růstových faktorů iniciují zastavení proliferace v určité fázi buněčného cyklu. Mechanisticky se zpravidla jedná o důsledky stresového stimulu, který v buňce aktivuje dráhy blokující další proliferaci. Zastavení proliferace pak trvá zpravidla do doby, než stresový signál pomine, například vymytím inhibitoru nebo dodá35 ní séra, v některých případech je proliferační inhibice nevratná.

Při metodě buněčné synchronizace pomocí inhibitorů replikace se zejména využívají látky hydroxyurea, thymidin a aphidicolin, jak je popsáno např. ve statích Deborah S. Parris and Robert C. Bates: Syne hronizat ion of primary fetal cell cultures with hydroxyurea (1978, Methods in Cell

Science 4, 745 až 747), Whitmore, G. F. and Gulyas, S.: Synchronization of mammalian cells with tritiated thymidine (1966, Science 151, 691 až 694) nebo Fox, Μ. H., et aí: Comparison of synchronized Chinese hamster ovary cells obtained by mitotic shake-off, hydroxyurea, aphidicolin, or methotrexote. (1987, C ytometry 8, 315 až 320). Hydrourea a thymidin způsobují pokles volných deoxyribonukleotidtrifosfátů (dNTP), základních stavebních jednotek DNA, aphidicolin působí jako přímý inhibitor DNA polymeráz. Inhibice replikace synchronizuje buňky na přechodu mezi GI fází, tedy přípravnou fází pro replikaci, a S fází, tedy replikací DNA. Výhodou této metody je, že opakovanou expozicí buněk inhibitorům replikace je možné docílit velmi homogenní synchronní buněčné populace a že inhibitory replikace jsou zpravidla levné a dostupné látky. Nevýhodou je skutečnost, že expozice replikačních inhibitorů je stres, který v buňce vyvolává komplexní odpověď s těžko předvídatelnými efekty. Ty pak mohou interferovat s experimentální procedurou. Navíc, buňky sjiž započatou replikací jsou ohroženy nevratnými změnami na úrovni DNA, protože replikace je celkově velmi zranitelný proces a je jakákoliv interference má silně mutagenní a tedy nevratný efekt. Toto je například popsáno v Arnaudeau, C, et al.: Inhibition of DNA synthesis is a polent mechanism by which cytostatic drugs induce homologous recombination in mammalian cells (2000, Mutat. Res. 461, 221 až 228), Lundin, C.

- 1 CZ 302682 B6 et al.: Different roies for nonhomologous endfoining and homologous recombination following replication arrest in mammalian cells (2002, Mol. Cell Biol. 22, 5869 až 5878), Saintigny, Y, et al.: Characterization of homologous recombination induced by replication inhibition in mammalian cells (2001, EMBO J. 20. 3861 až 3870), Kurose, A., et al.: Effects of hydroxyurea and aphidicolin on phosphorylaíion of ataxia telangiectasia mutated on Ser 1981 and hisione Η2ΛΧ on Ser J39 in re lat ion to cell cycle phase and induction of apoptos is (2006a, Cytometry A 69, 212 až 221) nebo Kurose, A., et al.: Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone 112AX phosphorylaíion: an indication of DNA damage (2006b, Cell Prolif 39, 231 až 240). Některé linie pak na aplikaci replikačních inhibitorů reagují bezprostřední ně zahájením apoptózy a jsou tedy pro tento způsob synchronizace zcela nevhodné, jak je popsáno například v Bolderson, E., et al.: ATM is required for the cellular response to thymidine induced replication fork stress (2004, Hum. Mol. Genet. 13, 2937 až 2945), Johnson, C. A., et al.: Hydroxyurea induces apoptosis and regular DNA fragmentation in a Burkitťs lymphoma cell line. (1992, Biochim. Biophys. Acta 1136, 1 až 4) nebo Woo, G. H. et al.; Molecular mechanistns of hydroxyurea!HfJ)-induced apoptosis in the mouše fetal brain (2006, Neurotoxicol. Teratol.

28, 125 až 134), Dalším výrazným omezením je časová a pracovní náročnost tohoto synchronizačního procesu, například velmi často používaná synchronizace pomocí dvojitého thymidlnového bloku trvá ii běžné lidské linie až 100 hodin a krom prosté kultivace vyžaduje několikanásobné důkladné promývání kombinované s přidáváním 2-deoxycitidinu, jak je popsáno v Clute, P.

and Pines, J.: Temporal and spadal control of cyclin Bl destruction in metaphase (1999, Nat. Cell Biol, 1,82 až 87).

Při použití metod buněčné synchronizace pomocí sérové nedostatečnosti zastavují buňky svůj růst v důsledku stresového stimulu obecně označovaného jako hladovění, který brání buňce v zahájení replikace DNA a zastavuje buněčnou proliferaci v Gl fázi, o čemž pojednávají statí ('naper. S.; Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis (2003, Cell Mol. Life Sci. 60. 1099 až 1106), nebo fYitrnut, I„ et al.: Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells (1997, Nátuře 385, 810 až 813). Výhodou této metody je jednoduchý experimentální postup, kdy není třeba exponovat buňky chemikálií a odpadá tak potřeba komplici kovaného vymývání a nákladů spojených s nákupem a manipulací chemikálií. Nevýhodou je skutečnost, že stav hladovění je stres vyvolávající v buňce komplexní odpověď s těžko předvídatelnými efekty. Ty mohou interferovat s plánovanou experimentální procedurou. Celá řada linií reaguje na hladovění iniciací autofagocytózy, tedy procesu, kdy buňka začne chybějící látky získávat degradací některých svých orgáneI, jak je popsáno v Marie Stampe Onstenfeld: Anti35 cancer agent siramesine is a lysosomotropic detergent that induces cytoprotective autophagosome accumulation. (2008, Autophagy). případně bezprostředním zahájením apoptózy, viz Lu, C., et al.: Sérum starvation induces H2AXphosphorylaíion to regulate apoptosis via p38 MAPK pathway (2008, FEBS Lett, 582, 2703-2708). Tyto linie jsou tak pro tuto metodu zcela nevhodné.

to

Buněčná synchronizace pomocí inhibitoru mitózy je metoda na rozhraní iniciace a separace. Pro iniciaci synchronizace v mitóze se využívá chemikálií interagujících s tubu línem, které způsobují defekt ve vzniku, zániku či regulaci mitotického vřeténka. Problém s dělicím vřeténkem buňka vnímá jako stresový stimul, aktivuje se tzv. mitotický checkpoint, který brání dokončení mitózy.

Buňky zablokované v mitóze se zpravidla ještě následně separují některou s níže uvedených separačních technik, nejčastěji vytřepáváním či vymytím. Pro zablokování mitózy jsou nejčastěji využívány tubulámí jedy Kolchicin, viz Andreu, J. M. and Timashejf, S. N.: Tubulin bound to colchicine forms polymers different from microtubules (1982, Proč. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 79, 6753 až 6756), Andreu, J. M., et aí: Polymerization of the tubulin-colchicine complex: relation to microtubule assembly (1983 Biochemistry 22, 1556 až 1566), Farrel, K. W. and Wilson, L,: Proposed mechanism for colchicine poisoning of microtubules reassembled in vitro from Strongylocentrotus purpuratus sperm tail outer doublet tubulin (1980, Biochemistry 19, 3048 až 3054), Kolcem id, viz Stubblefield, E. et aí: Synchronized mammalian cell cul tur es. I. Cell replication cycle and macromolecular synthesis following brief colcemid arrest of mitosis (1967,

J. Celí Physiol 69, 345-353), Nocodazol, viz Lee, J. C., et aí: Effects of nocodazole on . 9 CZ 302682 B6 structures of calf hrain tubulin (1980, Biochemistry 19, 6209 až 6215) nebo Zieve, G. W., et al.: Production of large numbers of mitotic mammalian cells hy use of the reversible microtubule inhibitor nocodazole. Nocodazole accumulated mitotic cells (1980, Exp. Cell Res. 126, 397 až 405), 2-methoxyestradiol popsaný v patentu: EP 1 284 285 nebo v At talia, H.. et al.: 25 Methoxyestradiol arrests cells in mitosis wilhout depolymerizing tubulin (1996, Biochem. Biophys. Res. Commun. 228, 467 až 473), Attala, H., et al.: Cytogenetic chromosomal preparátions using 2-methoxyestradiol (1998, Cancer Genet. Cytogenet. 102, 139 až 141), popřípadě Rotenon, viz Srivastava, P. and Panda, D.: Rotenone inhibits mammalian cell proliferation by inhibiting microtubule assembly through tubulin binding (2007, FEBS J. 274, io 4788 až 4801). Výhodou této metody je technologická a ekonomická nenáročnost, přičemž v případě doplnění o separační krok je získaná frakce buněk vysoce homogenní, kdy všechny buňky jsou v mitotické metafázi. Nevýhodou této metody je, že všechny inhibitory mitózy jsou vysoce toxické látky a jejich použití kromě mikrotubulů dělícího vřeténka ovlivňuje všechny tubulámí struktury buňky, tj. cytoskelet a nucleoskelet. Negativní důsledky provázející použití tubulámích jedů jsou především fragmentace jádra, rozpad Golgiho aparátu a metabolické změny, jak je popsáno v Minin, A. A.: Dispersal of Golgi apparatus in nocodazole-treated fibroblasts is a kinesin-driven process (1997, J. Cell. Sci. Í10 (Pt 19), 2495 az 2505). Tubulární jedy jsou prokázané mutageny iniciující nevratné genetické změny a častou buněčnou odpovědí na jejich aplikaci je také apoptóza a/nebo zástava další buněčné proliferace, což je popsáno v Davoodpour, P. and Landstrom, M.: 2-Methoxyestradiol-induced apoptosis in prostatě cancer cells requires Smad7 (2005, J. Biol. Chem. 280, 14773 až 14779), Fox, Μ. H., et al.: Comparison of synchronized Chinese hamster ovary cells obtained by mitotic shake-off, hydroxyurea, aphidicolin, or methotrexate. (1987, Cyíometry 8, 315 až 320), Li, N, et al.: Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production (2003, J. Biol. Chem. 278, 8516 až 8525) nebo Verdoodt, B., et al.: Induction of polyploidy and apoptosis after exposure to high concentrations of the spindle poison nocodazole (1999, Mutagenesis 14, 513 až 520). Další nevýhodou této metody je relativně malý zisk synchronní frakce, protože vysoká toxicita tubulámích jedů neumožňuje zpravidla jejich dlouhodobou expozici. Mitotická frakce tak vždy tvoří jen ěást celkové buněčné populace a zisk se pohybuje v rozmezí 25 až 34 % mitotických buněk, jak je popsáno v Zieve, G. W., et al.: Production of large numbers of mitotic mammalian cells by use of the reversible microtubule inhibitor nocodazole. Nocodazole accumulated mitotic cells (1980, Exp. Cell Res. 126, 397 až 405).

Separační metody využívají rozdílnosti buněk v jednotlivých fázích buněčného cyklu na úrovni fyzikální, kde je velikost daná obsahem DNA, biochemické, kde se posuzují povrchové markéry, nebo fyziologické s hodnocením přilnavosti buněk ke kultivační podložce.

Nejjednodušší metodou tohoto typuje separace pomocí vytřepání čí vyplavení mitotické frakce, kdy při separaci buněk v určité fázi buněčného cyklu je využito poměrně slabé přilnavosti mitotických buněk adherentních linií ke kultivační podložce, což je popsáno například v Terasima, T. and Tolmach, L. J.: Growth and nucleic aeid synthesis in synchronously dividing populations of HeLa cells (1963, Exp. Cell Res. 30, 344 až 362). Mitotické buňky většiny adherentních savčích linií tak lze separovat použitím prostých fyzikálních sil jako je vymýtí proudem kapaliny, jak je popsáno například ve spise US 2002/0 123 144 A1, či setřepáním pomocí vířivého či vibračního pohybu kultivačního média, což popisují například spisy EP 1 284 285 nebo US 3 871 955. Výhodou této metody je, zeje to jediná separační metoda, která primárně nepotřebuje žádné speciální vybavení v podobě složitých a nákladných přístrojů. Primárně metoda nevyžaduje použití synchronizačních chemikálií, i když zisk mitotických buněk je pak velmi malý, a představuje tak pro buňky nejméně stresující metodu. Proces separace je možné provádět v aseptickém boxu, čímž se snižuje riziko kontaminace. Nevýhodou je již uváděný velmi malý zisk mitotické frakce, kdy mitotické buňky u normálně exponenciálně rostoucí buněčné populace tvoří jen 1 až 3 %, přičemž ne všechny se podaří separovat. Pro zvýšení výnosu mitotických buněk je metoda velmi často kombinována s použitím inhibitorů mitózy, tedy využitím tubulámích jedů, kteréjsou silně toxické, jak již bylo uvedeno výše. Metodu lze také kombinovat s ukládáním každé vytřepané či

-3 CZ 302682 B6 vyplavené mitotické frakce na led, a teprve po získání dostatečného množství buněk pokračovat v kultivaci převedením do normálních kultivačních podmínek, což je popsáno v Fox, Μ. H.: Methods for Synchronizing Mammalian Cells (2004, In Cell Cyci Checkpoint Control Protocols). Lze tak obejít užití toxických inhibitorů mítózy pro zvýšení zisku mitotických buněk, roste však významně technologická náročnost procedury a navíc může docházet k fyziologickým problémům spojeným s teplotním šokem.

Při metodě separace pomocí protiproudé centrifugační elutriace se využívá rozdílné velikosti buněk, která je primárně determinovaná velikostí jádra tvořícího většinu buněčného objemu, ío které pak svou velikostí reflektuje stádium buněčného cyklu. Kombinací odstředivé síly a opačně působící síty proudící kapaliny je možné ve zvláštní komoře buňky separovat podle velikosti.

K dané proceduře se využívá speciální přístroj, tzv. „Elutriátor“ popsaný v Chang, Q., et al.: Counterfiow centrifugal elutriation as a method of T cell depletion may cause loss of immature CD34- cells (1997, Bone Marrow Trans plant. 19, 1145 až 1150) nebo v Bachere, E., et ai:

Separation of Crassostrea gigas hemocytes by density gradient centrifugation and counterfiow centrifugal elutriation (1988. Dev. Comp. Immunol. 12, 549 až 559). Výhodou této metody je, že elutriace nevyžaduje použití jakýkoliv chemikálií k barvení buněk a umožňuje separaci velikých kvant buněk za poměrně krátkou dobu. Mezi nevýhody patří jak vysoká pořizovací cena elutriátoru, tak časová a pracovní náročnost spojená sjeho údržbou a provozem. Při elutriaci dochází

2o k velikým ztrátám buněk, a je proto nutné zpracovávat extrémní množství buněk naráz, z čehož plynou zvýšené nároky na jejich pěstování. Získané frakce nejsou zcela homogenní, protože velikost buňky není plnohodnotná determinanta fáze buněčného cyklu. Během elutriace jsou buňky vystaveny nefyziologickým stresujícím podmínkám, když adherentní buněčné kultury musejí být před elutriaci převedeny do suspenze, elutriační médium obsahuje Ν,Ν,Ν',Ν'-ethylendiamin25 tetraoctovou kyselinu (EDTA), buňky jsou vystaveny výkyvům teploty a výsledky jsou ovlivněny také mírou rozpuštěných plynů. Při procesu samotném je zvýšené riziko bakteriální či kvasinkové kontaminace buněčné kultury.

Další separační metoda průtokové cytometrie, vyhodnocující fluorescenční signál z jednotí i vých jo buněk na speciálním přístroji, označovaná jako FACS, může být doplněna o sortující zařízení, tedy buněčný separátor, jak je popsáno ve stati Rieseberg, M., et al.: Flow cytometry in biotechnology (2001, Appl. Microbiol. Biotechnol. 56, 350 až 360). Výkonné FACS-Sortery umožňují separovat buňky v závislosti na míře jejich fluorescenčního signálu. Fluorescenční barvení buněk může mít povahu přímého chemického barvení, zprostředkovaného barvení pomocí protilátek s konjugovanou fluorescenční značkou anebo je způsobeno pomocí uměle zavedených genů kódujících fluoreskující proteiny. Výhodou této metody je relativně rychlý a velmi přesný způsob separace buněčných populací umožňující více než jedno selekční kritérium. Mezi nevýhody patří velmi vysoká pořizovací cena, velmi náročný provoz a údržba zařízení a rovněž vysoká cena fluorescenčních barev. Pro selekci synchronní populace je nutnost fluorescenčního barvení DNA, které může mít mutagenní efekt. Během sortování jsou buňky exponované intenzivnímu laserovému světlu, který může vyvolat vznik toxických fotoproduktů. Během sortování jsou buňky vystaveny nefyziologickým stresujícím podmínkám, když adherentní buněčné kultury musejí být před sortováním převedeny do suspenze, sortovací médium obsahuje EDTA, buňky jsou vystaveny výkyvům teploty a výsledky jsou závislé na míře rozpuštěných plynů. Při procesu samot45 ném je zvýšené riziko bakteriální či kvasinkové kontaminace buněčné kultury.

Úkolem vynálezu je snaha eliminovat negativní vlivy a významně zjednodušit běžně prováděné synchronizační metody při současném snížení finančních, časových a pracovních nároků u této důležité laboratorní procedury, a to s využitím principu označovaného jako závislost na ukotvení (Anchorage dependence). Tato je definována jako závislost proliferace na ukotvení, tedy adheze, ke kultivačnímu povrchu a je popsána například v Assoian, R. K. and Zhu, X.: Cell anchorage and the cytoskeleton as partners in growth factor dependent cell cycle progression (1997, Curr. Opin. Cell Biol. 9, 93 až 98) nebo v Zhu, X, et al.: Adhesion-dependent cell cycle progression linked to the expression of cyclin Dl, activation of cyclin E-cdk2, and phosphorylation of the retinoblastoma protein (1996, J. Cell Biol. 133, 391 až 403). Závislost na ukotvení se týká

-4CZ 302682 B6 naprosté většiny adherentně rostoucích savčích buněk a pokud je ukotvení ke kultivačnímu povrchu znemožněno či přerušeno, dochází k zablokování proliferace. Vynález využívá a rozšiřuje tento princip.

Podstata vynálezu

Uvedeného cíle je dosaženo vynálezem, kterým je způsob produkce synchronizovaných adherentně rostoucích buněčných linií, jehož podstata spočívá vtom, že kultivační láhev naplnění kultivačním médiem s vysazenou adherentní buněčnou linií se podrobuje v inkubátoru po dobu 6 až 30 hodin při standardních kultivačních podmínkách stálým vibracím o velikosti 1 až 100 kmitů/sec způsobujícím vyplavování slabě adherujících mitotických buněk do kultivačního média a iniciaci inhibice proliferace u těchto buněk, a po stanoveném časovém úseku se vyplavená suspenzní frakce buněk odebere k vysazení do nové kultivační láhve nebo ke zpracování pro analýzu.

Dále je podstatou vynálezu přístroj pro realizaci produkce synchronizovaných adherentně rostoucích buněčných linií vysazených v kultivačních láhvích naplněných kultivačním médiem, sestávající z pohyblivé plošiny, která je jednak volně zavěšena na nepohyblivém podstavci, jednak je vybavena úchyty pro uchycení kultivační láhve a jednak je k ní připevněn vibrátor propojený kabelem s regulátorem vibrací uloženém v boxu, který je součástí podstavce a uvnitř kterého je uložen bateriový zdroj.

Je výhodné, když je plošina na podstavci zavěšena pomocí pružných vzpěr, které jsou v optimálním případě tvořeny vinutými pružinami volně nasazenými na protilehle umístěných čepech.

Je rovněž výhodné když je vibrátor tvořen bezkontaktním motorem vybaveným nevyváženým rotorem a když úchyty jsou tvořeny dvěma elastickými popruhy.

Novost a jedinečnost předkládaného řešení spočívá vtom, že při odebrání kultivačního povrchu během mitózy, a to ve stádiu metafáze, dokončí neukotvená buňka mitotický proces pouze do stadia karyokineze, tedy rozdělení jádra, a k následné cytokinezi, tj. úplnému rozdělení buňky na dvě dceřinné, však již nedojde. Buňky tak přetrvávají ve stádiu nedokončená cytokineze, kterou lze označit jako pozdní telofázi. K další proliferaci těchto buněk nedochází, a to až do doby, než dojde ke znovu ukotvení buňky na kultivačním povrchu. Jedná se tedy o indukovanou synchronizaci buněk v pozdní telofázi, která nastává v důsledku změny kultivačních podmínek.

Za výhody předkládaného vynálezu lze považovat skutečnost, že podobně jako některé separační metody nevyužívá žádných synchronizačních chemikálií ani změn chemického složení kultivačního média. Buňky synchronizované touto metodou nevykazují žádné měřitelné projevy stresu a umožňují následnou dlouhodobou kultivaci. Důležitým faktorem je snadná aplíkovatelnost a automatizace metody. Nedílnou součástí řešení je rovněž konstrukčně jednoduchý přístroj pro zajištění realizace výše uvedené metody, který umožňuje získat relativně veliké množství chemicky neovlivněných synchronních buněk s minimálními náklady na provoz a nulovými nároky na doplňková laboratorní zařízení. Jedná se o kompaktní modul, který svou velikostí a technickým provedením umožňuje umístění do standardního buněčného inkubátoru. Bateriový zdroj umožňuje přístroji dlouhodobý bezzásahový provoz uvnitř inkubátoru za standardních kultivačních podmínek po dostatečně dlouhou dobu, přičemž přístroj nevyžaduje žádné zvláštní technologické úpravy inkubátoru či změnu kultivačního režimu. Přístroj využívá vibrací až o řád silnějších a dlouhodobějších než jsou dosud popsány pro běžné vytře pávací metody, a to v řádech desítek hodin, což způsobuje, že je zajištěno jak vyplavení neinhibovaných mitotických buněk do suspenze, tak iniciace inhibice proliferace těchto buněk, a tedy jejich zablokování v pozdní telofázi.

-5CZ 302682 B6

Přehled obrázků na výkresech

Vynález bude blíže objasněn pomocí příkladů jeho provedení znázorněných na připojených výkresech, kde obr. 1 je pohled na schématicky vyobrazený přístroj s upevněnou standardní kultivační láhví, obr. 2 je schématické znázornění možného provedení vibrátoru ve formě bezkontaktního nevyváženého motoru, io obr. 3 je srovnání populačních profilů (FACS profilů) u normálně rostoucí buněčné populace (graf A) a vy třepané populace získané 18—ti hodinovou kultivací na přístroji dle obr. 1 (graf B) a obr. 4 zobrazuje mikroskopickou analýzu populace buněk získanou 24hodinovou kultivací na is přístroji dle obr. 1 s patrnou pozdní telofází, tj. dvojicí jader, u většiny buněk.

Příklady provedení vynálezu

Synchronizační přístroj sestává z pohyblivé plošiny i, která je pomocí sady pružných vzpěr 2 volně zavěšena na nepohyblivém podstavci 3. Pružné vzpěry 2 mohou být vyrobeny z elastomerního materiálu nebo mohou být realizovány ve formě vinutých pružin 21 volně nasazených na protilehle umístěných čepech 22. Plošina 1 je vybavena úchyty 10, například dvěma elastickými popruhy, pro uchycení kultivační láhve 4 s kultivačním médiem 41 na její horní plo25 chu 1 1. Ke spodní ploše 12 plošiny i je připevněn vibrátor 5 propojený kabelem 6 s regulátorem 2 vibrací uloženém v boxu 8. jehož horní sténaje tvořena podstavcem 3.

Vibrátor 5 je v popisovaném případě znázorněném na obr. 2 elektromechanické provedení a je tvořen bezkontaktním motorem 51 vybaveným nevyváženým rotorem 52. Pohon vibrátoru 5 je

3o zajištěn bateriovým zdrojem 9, například olověným gelovým akumulátorem, uloženým v boxu 8 a vybaveným konektory 91 pro umožnění dobíjení. Regulátor 7 vibrací je tak vlastně regulátor otáček motoru 51.

Při provádění synchronizace u linií buněk s dobře vyplav itel nou mitotickou frakcí se kultivační láhev 4 s kultivačním médiem 41 obsahujícím exponenciálně rostoucí adherentní buněčnou linii uchytí na pohyblivou plošinu i přístroje pomocí úchytů 10 a přístroj se umístí do inkubátoru. Následně se sepne a nastaví adekvátní míra vibrací pomocí regulátoru 7 a buňky se inkubují po dobu 6 až 30 hodin za stálých vibrací při standardních kultivačních podmínkách. Po stanoveném časovém úseku se vyplavená suspenzní frakce buněk odebere a vysadí do nové kultivační láhve 4 nebo misky, případně se přímo zpracuje pro analýzu. Při provádění synchronizace u linií se špatně vyplavitelnou mitotickou frakci se do média před zahájením synchronizace může přidat inertní abrazivum, které usnadňuje vyplavování mitotických buněk.

Konkrétní výsledky experimentů uváděného způsobu produkce synchronizovaných adherentně rostoucích buněčných linií jsou doloženy těmito příklady:

Příklad č. 1: Synchronizace lidské buněčné linie U-2-OS

Adherentní lidská buněčná linie U-2-OS (osteosarkom) byla vysazena do standardní kultivační láhve v celkovém počtu 9x10⁵ buněk a kultivována ve standardním kultivačním médiu obsahujícím 90% D-MEM a 10% fetální bovinní sérum za standardních kultivačních podmínek po dobu 24 hodin. Následně se médium vyměnilo za čerstvé a kultivační láhev se uchytila na vibrační plošinu přístroje a přístroj i s láhví se umístil do standardního kultivačního inkubátoru typu

Heraeus BB16 se standardním kultivačním režimem, tj. 100% vlhkost, teplota 37 °C, 5% CO₂- Po

-6CZ 302682 B6 umístění do inkubátoru se ručně aktivoval vibrační mód přístroje na hodnotu 20 kmitů za sekundu. Po 18-ti hodinové inkubaci se odebralo médium spolu s vyplavenými buňkami. Část buněčné suspenze o hmotnosti 500 g se po dobu 10 minut zkoncentrovala centrifugací a ihned zafixovala pomocí 70% ethanolu a následně zpracovala po FACS analýzu, jejíž výsledek je patr5 ný z obr. 3, graf B). Zbývající část buněčné suspenze se rozdělila do čtyř nových kultivačních Petriho misek a nechala dále inkubovat za standardních kultivačních podmínek. Jednotlivé misky pak byly sklízeny po 4, 6, 9 a 15 hodinách a zpracovány pro FACS analýzu k monitoringu průběhu buněčného cyklu.

Příklad č. 2: Využití synchronizované U-2-OS linie pro analýzu efektivity aphidicolinu v indukci exprese fragilních míst

Adherentní lidská buněčná linie U-2-OS (osteosarkom) byla vysazena do standardní kultivační i5 láhve v celkovém počtu 9x10⁵ buněk a kultivována ve standardním kultivačním médiu obsahujícím 90% D-MEM a 10% fetální bovinní sérum za standardních kultivačních podmínek po dobu hodin. Následně se médium vyměnilo za čerstvé a kultivační láhev se uchytila na vibrační plošinu přístroje a přístroj i s láhví se umístil do standardního kultivačního inkubátoru typu Heraeus BB16 se standardním kultivačním režimem, tj. 100% vlhkost, teplota 37 °C, 5% CO₂. Po umístění do inkubátoru se ručně aktivoval vibrační mód přístroje na hodnotu 20 kmitů za sekundu. Po 18ti hodinové inkubaci se odebralo médium spolu s vyplavenými buňkami. Buněčná suspenze se rozdělila do čtyř nových kultivačních Petriho misek. Jedna miska sloužila jako kontrolní a k ostatním miskám se přidalo 0.1, 0.2 a 0.4 μΜ Aphidicolinu. Misky se dále kultivovaly za standardních kultivačních podmínek. Po 18ti hodinách se misky pravidelně každou hodinu kontrolovaly pod inverzním mikroskopem a vyhodnocoval se celkový počet kulatých, tj. mitotických, buněk. Jakmile četnost mitotických buněk u dané misky dosáhla přibližně deseti procent, miska se sklidila a zpracovala pro analýzu zlomů mitotických chromozomů běžným způsobem popsaným například ve stati Margaret A. Leversha, (1998 In Cell Biology: A Laboratory Handbook, Julio E. Cells, Ed. (ACADEMIC PRESS, San Diego), chap. 11, pp. 428 až 436).

Příklad č. 3: Synchronizace lidské buněčné linie BJ

Adherentní lidská buněčná linie BJ (předkožkové fibroblasty) byla vysazena do standardní kulti35 vační láhve v celkovém počtu 10x10⁵ buněk a kultivována ve standardním kultivačním médiu obsahujícím 90% D-MEM a 10% fetální bovinní sérum za standardních kultivačních podmínek po dobu 24 hodin. Poté se médium vyměnilo za čerstvé a přidalo se do něj 200mg sterilizované agarózy sloužící jako inertní abrazivum usnadňující vyplavení mitotických buněk. Následně se kultivační láhev uchytila na vibrační plošinu přístroje a přístroj i s láhví se umístil do standardní40 ho kultivačního inkubátoru typu Heraeus BB16 se standardním kultivačním režimem, tj, 100% vlhkost, teplota 37 °C, 5% CO₂. Po umístění do inkubátoru se ručně aktivoval vibrační mód přístroje na hodnotu 5 kmitů za sekundu. Po 18-ti hodinové inkubaci se odebralo médium spolu s vyplavenými buňkami a agarózou. Buněčná suspenze se rozdělila do pěti nových kultivačních Petriho misek a buňky se nechaly sednou 3 hodinovou inkubací za standardních kultivačních podmínek. Následně se z misek odsálo veškeré médium obsahující agarózu, buňky se opláchly fosfátovým pufrem (PBS) a následně se přidalo nové standardní kultivační médium. Následovala další inkubace kdy jednotlivé misky byly sklizeny po 1, 3, 6, 12 a 18 hodinách po oplachu a zpracovány pro FACS analýzu k monitoringu průběhu buněčného cyklu.

Průmyslová využitelnost

Způsob produkce synchronizovaných adherentně rostoucích buněčných linií a přístroj pro provádění tohoto způsobu jsou využitelné zejména pro využití v biotechnologických laboratořích základního a aplikovaného výzkumu, které se věnují in-vitro kultivaci adherentních buněčných linií, jež potřebují z nejrůznějších důvodů synchronizovat.

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   5 I. Způsob produkce synchronizovaných adherentně rostoucích buněčných linií, vyznačující se tím, že kultivační láhev naplněná kultivačním médiem s vysazenou adherentní buněčnou linií se podrobuje v inkubátoru po dobu 6 až 30 hodin při standardních kultivačních podmínkách stálým vibracím o velikosti 1 až lOOkmitů/sec způsobujícím vyplavování slabě adherujících mitotických buněk do kultivačního média a iniciaci inhibice proliferace u těchto jo buněk, a po stanoveném časovém úseku se vyplavená suspenzní frakce buněk odebere k vysazení do nové kultivační láhve nebo ke zpracování pro analýzu.
2. 2. Přístroj pro realizaci způsobu podle nároku 1 produkce synchronizovaných adherentně rostoucích buněčných linií vysazených v kultivačních láhvích (4) naplněných kultivačním médiem is (41), vyznačující se tím, že sestává z pohyblivé plošiny (1), která je jednak volně zavěšena na nepohyblivém podstavci (3), jednak je vybavena úchyty (10) pro uchycení kultivační láhve (4) a jednak je k ní připevněn vibrátor (5) propojený kabelem (6) s regulátorem (7) vibraci uloženém v boxu (8), kterýje součástí podstavce (3) a uvnitř kterého je uložen bateriový zdroj (9).
3. 3. Přístroj podle nároku 2, vyznačující se tím, že plošina (1) je na podstavci zavěšena pomocí pružných vzpěr (2).
4. 4. Přístroj podle nároku 3, vyznačující se tím, že pružné vzpěry (2) jsou tvořeny

   25 vinutými pružinami (21) volně nasazenými na protilehle umístěných Čepech (22).
5. 5. Přístroj podle některého z nároků 2 až 4, vyznačující se tím, že vibrátor (5) je tvořen bezkontaktním motorem (51) vybaveným nevyváženým rotorem (52).

   io
6. 6. Přístroj podle některého z nároků 2 až 5, vyznačující se tím, že úchyty (10) jsou tvořeny dvěma elastickými popruhy.