CZ19628U1 - Přístroj k zajišťování produkce synchronizovaných adherentně rostoucích buněčných linií - Google Patents

Description

Přistroj k zajišťováni produkce synchronizovaných adherentně rostoucích buněčných linii

Oblast technického řešení

Prezentované technické řešení se týká konstrukce přístroje k zajišťování produkce synchronizovaných adherentně rostoucích buněčných linií, využitelného zejména v biotechnologických labo5 ratořích základního a aplikovaného výzkumu.

Dosavadní stav techniky

K biologickým, biotechnologickým a lékařským laboratořím základního i aplikovaného výzkumu zákonitě patří technologie pěstování buněčných linií. Buněčné linie se využívají k testování léčiv a chemických látek, k produkci bio-produktů a v neposlední řadě k základnímu výzkumu a io zkoumání nemocí, například rakoviny, degenerativních onemocnění, stárnutí apod. Jedním z nedílných aspektů růstu buněčné populace je nesynchronnost jednotlivých buněk, kdy buňky procházejí různými stádii buněčného cyklu různě rychle a tvoří tak heterogenní populaci buněk různých fází růstového cyklu. Tato heterogenita buněčné populace představuje významný problém pro většinu experimentálních procedur, protože buňky z různých fází buněčného cyklu vy15 kazují odlišné fyzické, fyziologické, biochemické a genetické vlastnosti. Mnohé experimentální procedury tak vyžadují jako model pouze synchronní buněčnou populaci, tedy buňky pouze určité fáze buněčného cyklu. Získat homogenní synchronní populaci buněk v dostatečném množství je komplikovaný technologický proces. Pro tyto účely se buňky buď separují, nebo se synchronizace buněčného růstu iniciuje chemicky. Oba přístupy jsou hojně využívané v závislosti na pří20 strojovém vybavení laboratoře, v některých případech se obě metody kombinují. Výhody a nevýhody nejčastěji používaných metod pro získání synchronní buněčné populace jsou shrnuty v následujícím textu.

Iniciační metody jsou synchronizační metody využívající chemikálie, jako jsou inhibitory replikace či inhibitory mitózy, nebo změnu kultivačních podmínek, jako je například sérová nedosta25 tečnost, hormonální nedostatečnost či nedostatečnost růstových faktorů iniciují zastavení proliferace v určité fázi buněčného cyklu. Mechanisticky se zpravidla jedná o důsledky stresového stimulu, který v buňce aktivuje dráhy blokující další proliferaci. Zastavení proliferace pak trvá zpravidla do doby, než stresový signál pomine, například vymytím inhibitoru nebo dodání séra, v některých případech je proliferační inhibice nevratná.

Při metodě buněčné synchronizace pomocí inhibitorů replikace se zejména využívají látky hydroxyurea, thymidin a aphidicolin, jak je popsáno např. ve statích Deborah S.Parris and Robert C.Bates: Synchronization of primary fetal cell cultures with hydroxyurea (1978, Methods in Cell Science 4, 745-747), Whitmore,G.F. and Gulyas.S.: Synchronization of mammalian celte with tritiated thymidine (1966, Science 151, 691-694) nebo Fox,M.H., et al.: Comparison of synchro35 nized Chinese hamster ovary cells obtained by mitotic shake-off hydroxyurea, aphidicolin, or methotrexate. (1987, Cytometry 8, 315-320). Hydroxyurea a thymidin způsobují pokles volných deoxyribonukleotid trifosfátů (dNTP), základních stavebních jednotek DNA, aphidicolin působí jako přímý inhibitor DNA polymeráz. Inhibice replikace synchronizuje buňky na přechodu mezi G1 fází, tedy přípravnou fází pro replikaci, a S fází, tedy replikací DNA. Výhodou této metody je, že opakovanou expozicí buněk inhibitorům replikace je možné docílit velmi homogenní synchronní buněčné populace a že inhibitory replikace jsou zpravidla levné a dostupné látky. Nevýhodou je skutečnost, že expozice replikačních inhibitorů je stres, který v buňce vyvolává komplexní odpověď s těžko předvídatelnými efekty. Ty pak mohou interferovat s experimentální procedurou. Navíc, buňky s již započatou replikací jsou ohroženy nevratnými změnami na úrovni

DNA, protože replikace je celkově velmi zranitelný proces a jakákoliv interference má silně mutagenní a tedy nevratný efekt. Toto je například popsáno v Arnaudeau,C., et al.: Inhibition of DNA synthesis is a potent mechanism by which cytostatic drugs induce homologous recombination in mammalian celte (2000, Mutat. Res. 461, 221-228), Lundin,C,, et al. : Different roles for nonhomologous end joining and homologous recombination following replication arrest in mammalian celte (2002, Mol. Cell Biol. 22, 5869-5878), Saintigny, X, et al. : Characterization of

-1 CZ 19628 Ul homologous recombination induced by replication inhibition in mammalian cells (2001, EMBO J. 20, 3861-3870), Kurose,A., et al.: Effects of hydroxyurea and aphidicolin on phosphorylation of ataxia telangiectasia mutated on Ser 1981 and histone H2AX on Ser 139 in relation to cell cycle phase and induction of apoptosis (2006a, Cytometry A 69, 212-221) nebo Kurose.A., et al.:

Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone H2AX phosphorylation: an indication of DNA damage (2006b, Cell Prolif 39, 231-240). Některé linie pak na aplikaci replikačních inhibitorů reagují bezprostředně zahájením apoptózy a jsou tedy pro tento způsob synchronizace zcela nevhodné, jak je popsáno například v Bolderson.E., et al.: ATM is required for the cellular response to thymidine induced replication fork stress (2004, Hum. io Mol. Genet. 13, 2937-2945), Johnson,C. A., et al.: Hydroxyurea induces apoptosis and regular DNA fragmentation in a Burkitťs lymphoma cell line. Biochim (1992, Biophys. Acta 1136, 1-4) nebo íVoo.G.H., et al.: Molecular mechanisms of hydroxyurea(HU)-induced apoptosis in the mouše fetal brain (2006, Neurotoxicol. Teratol. 28, 125-134). Dalším výrazným omezením je Časová a pracovní náročnost tohoto synchronizačního procesu, například velmi často používaná synchronizace pomocí dvojitého thymidinového bloku trvá u běžné lidské linie až 100 hodin a krom prosté kultivace vyžaduje několikanásobné důkladné promývání kombinované s přidáváním 2-deoxycitidinu, jak je popsáno v Clute,P. and Pines,J.: Temporal and spadal control of cyclin B1 destruction in metaphase (1999, Nat. Cell Biol. 1, 82-87).

Při použití metod buněčné synchronizace pomocí sérové nedostatečnosti zastavují buňky svůj růst v důsledku stresového stimulu obecně označovaného jako hladovění, který brání buňce v zahájení replikace DNA a zastavuje buněčnou proliferaci v G1 fázi, o čemž pojednávají stati Cooper,S.: Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis (2003, Cell Mol. Life Sci. 60, 1099-1106), nebo WilmutJ., et al: Viable offspring derivedfrom fetal and adult mammalian cells (1997, Nátuře 385, 810-813). Výhodou této metody je jednoduchý experimen25 tální postup, kdy není třeba exponovat buňky chemikálii a odpadá tak potřeba komplikovaného vymývání a nákladů spojených s nákupem a manipulací chemikálií. Nevýhodou je skutečnost, že stav hladovění je stres vyvolávající v buňce komplexní odpověď s těžko předvídatelnými efekty. Ty mohou interferovat s plánovanou experimentální procedurou. Celá řada linií reaguje na hladovění iniciací autofagocytózy, tedy procesu, kdy buňka začne chybějící látky získávat degradací některých svých organel, jak je popsáno v Marie Stampe Ostenfeld: Anti-cancer agent siramesine is a lysosomotropic detergent that induces cytoprotective autophagosome accumulation. (2008, Autophagy), případně bezprostředním zahájením apoptózy, viz Lu,C„ et al.: Sérum starvation induces H2AXphosphorylation to regulate apoptosis via p38 MAPK pathway (2008, FEBS Lett. 582, 2703-2708). Tyto linie jsou tak pro tuto metodu zcela nevhodné.

Buněčná synchronizace pomocí inhibitoru mitózy je metoda na rozhranní iniciace a separace. Pro iniciaci synchronizace v mitóze se využívá chemikálií interagujících s tubulinem, které způsobují defekt ve vzniku, zániku Či regulaci mitotického vřeténka. Problém s dělícím vřeténkem buňka vnímá jako stresový stimul, aktivuje se tzv. mitotický checkpoint, který brání dokončení mitózy. Buňky zablokované v mitóze se zpravidla ještě následně separují některou s níže uvedených sepa40 račních technik, nejčastěji vytřepáváním či vymytím. Pro zablokování mitózy jsou nejčastěji využívány tubulámí jedy Kolchicin, viz Andreu, J.M. and TimasheffS.N.: Tubulin bound to colchicine forms polymers different from microtubutes (1982, Proč. Nati. Acad. Sci. U. S. A 79, 67536756), Andreu, J.M., et al.: Polymerization of the tubulin-colchicine complex: relation to microtubule assembly (1983 Biochemistry 22, 1556-1566), Farrell,K.W. and Wilson,L.: Proposed me45 chanism for colchicine poisoning of microtubules reassembled in vitro from Strongylocentrotus purpuratus sperm tail outer doublet tubulin (1980, Biochemistry 19, 3048-3054), Kolcemid, viz Stubblefield,E. et al.:, Synchronized mammalian cell cultures. I. Cell replication cycle and macromolecular synthesis following brief colcemid arrest of mitosis (1967, J. Cell Physiol 69, 345-353), Nocodazol, viz Lee,J.C., et al.: Effects of nocodazole on structures of calf brain tubu50 lin (1980, Biochemistry 19, 6209-6215) nebo Zieve,G.W., et al: Production oflarge numbers of mitotic mammalian cells by use of the reversible microtubule inhibitor nocodazole. Nocodazole accumulated mitotic cells (1980, Exp. Cell Res. 126, 397-405), 2-methoxyestradiol popsaný v patentu: EP 1 284 285 nebo v Attalla,H., et al.: 2-Methoxyestradiol arrests.cells in mitosis without depolymerizing tubulin (1996, Biochem. Biophys. Res. Commun. 228, 467-473), Attalla,H.,

-2CZ 19628 Ul et al.: Cytogenetic chromosomal preparations using 2-methoxyestradiol (1998, Cancer Genet. Cytogenet. 102,139-141), popřípadě Rotenon, viz Srivastava.P. and Panda,D.: Rotenone inhibits mammalian cell proliferation by inhibiting microtubule assembly through tubulin binding (2007, FEBS J. 274, 4788-4801). Výhodou této metody je technologická a ekonomická nenáročnost, přičemž v případě doplnění o separační krok je získaná frakce buněk vysoce homogenní, kdy všechny buňky jsou v mitotícké metafázi. Nevýhodou této metody je, že všechny inhibitory mitózy jsou vysoce toxické látky a jejich použití kromě mikrotubulů dělícího vřeténka ovlivňuje všechny tubulámí struktury buňky, tj. cytoskelet a nucleoskelet. Negativní důsledky provázející použití tubulámích jedů jsou především fragmentace jádra, rozpad Golgiho aparátu a metabolické io změny, jak je popsáno v Minin,A.A.: Dispersal of Golgi apparatus in nocodazole-treated fibroblasts is a kinesin-driven process (1997, J. Cell Sci. 110 (Pt 19), 2495-2505). Tubulámí jedy jsou prokázané mutageny iniciující nevratné genetické změny a častou buněčnou odpovědí na jejich aplikaci je také apoptóza a/nebo zástava další buněčné proliferace, což je popsáno v Davoodpour,P. and Landstrom,M.: 2-Methoxyestradiol-induced apoptosis in prostatě cancer cells requi15 res Smad7 (2005, J. Biol. Chem. 280, 14773-14779), Fox,M.H., et al.: Comparison of synchronized Chinese hamster ovary cells obtained by mitotic shake-off, hydroxyurea, aphidicolin, or methotrexate. (1987, Cytometry 8, 315-320), Li,N., et al.: Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production (2003, J. Biol. Chem. 278, 8516-8525) nebo Verdoodt,B., et al.: Induction of polyploidy and apoptosis after exposure to high concentraiions of the spindle poison nocodazole (1999, Mutagenesis 14, 513-520). Další nevýhodou této metody je relativně malý zisk synchronní frakce, protože vysoká toxicita tubulámích jedů neumožňuje zpravidla jejich dlouhodobou expozici. Mitotická frakce tak vždy tvoří jen část celkové buněčné populace a zisk se pohybuje v rozmezí 25 až 34% mitotických buněk, jak je popsáno v Zieve,G. W., et al: Production of large numbers of mito25 tic mammalian cells by use of the reversible microtubule inhibitor nocodazole. Nocodazole accumulated mitotic cells (1980, Exp. Cell Res. 126, 397-405).

Separační metody využívají rozdílnosti buněk v jednotlivých fázích buněčného cyklu na úrovni fyzikální, kde je velikost daná obsahem DNA, biochemické, kde se posuzují povrchové markéry, nebo fyziologické s hodnocením přilnavosti buněk ke kultivační podložce.

Nejjednodušší metodou tohoto typu je separace pomocí vytřepání či vyplavení mitotícké frakce, kdy při separaci buněk v určité fázi buněčného cyklu je využito poměrně slabé přilnavosti mitotických buněk adherentních linií ke kultivačnímu podložce, což je popsáno například v Terasima,T, and Tolmach,LJ.: Growth and nucleic acid synthesis in synchronously dividing populations ofříeLa cells (1963, Exp. Cell Res. 30, 344-362). Mitotícké buňky většiny adherentních sav35 čích linií tak lze separovat použitím prostých fyzikálních sil jako je vymýtí proudem kapaliny, jak je popsáno například ve spise US 2002/0123144 Al, či setřepáním pomocí vířivého či vibračního pohybu kultivačního média, což popisují například spisy EP 1 284 285 nebo US 3871955. Výhodou této metody je, že je to jediná separační metoda, která primárně nepotřebuje žádné speciální vybavení v podobě složitých a nákladných přístrojů. Primárně metoda nevyžaduje použití syn40 chronizačních chemikálií, i když zisk mitotických buněk je pak velmi malý, a představuje tak pro buňky nejméně stresující metodu. Proces separace je možné provádět v aseptickém boxu, čímž se snižuje riziko kontaminace. Nevýhodou je již uváděný velmi malý zisk mitotícké frakce, kdy mitotícké buňky u normálně exponenciálně rostoucí buněčné populace tvoří jen 1 až 3 %, přičemž ne všechny se podaří separovat. Pro zvýšení výnosu mitotických buněk je metoda velmi často kombinována s použitím inhibitorů mitózy, tedy využitím tubulámích jedů, které jsou silně toxické, jak již bylo uvedeno výše. Metodu lze také kombinovat s ukládáním každé vytřepané či vyplavené mitotícké frakce na led, a teprve po získání dostatečného množství buněk pokračovat v kultivaci převedením do normálních kultivačních podmínek, což je popsáno v Fox,M.H.: Methods far Synchronizing Mammalian Cells (2004, In Cell Cycl Checkpoint Control Protocols).

Lze tak obejít užití toxických inhibitorů mitózy pro zvýšení zisku mitotických buněk, roste však významně technologická náročnost procedury a navíc může docházet k fyziologickým problémům spojených s teplotním Šokem.

-3CZ 19628 Ul

Při metodě separace pomocí protiproudé centrifugační elutriace se využívá rozdílné velikosti buněk, která je primárně determinovaná velikostí jádra tvořícího většinu buněčného objemu, které pak svou velikostí reflektuje stádium buněčného cyklu. Kombinací odstředivé síly a opačně působící síly proudící kapaliny je možné ve zvláštní komoře buňky separovat podle velikosti. K dané proceduře se využívá speciální přístroj, tzv. Elutriátor popsaný v ChangQ., et al.: Cottnterflow centrifugal elutriation as a method of T cell depletion may cause loss of immature CD34+ cells (1997, Bone Marrow Transplant. 19, 1145-1150) nebo v Bachere,E., et al: Separation of Crassostrea gigas hemocytes by density gradient centrifugation and counterflow centrifugal elutriation (1988, Dev. Comp Immunol. 12, 549-559). Výhodou této metody je, že elutriace nevyžaduje použití jakýkoliv chemikálií k barvení buněk a umožňuje separaci velikých kvant buněk za poměrně krátkou dobu. Mezi nevýhody patří jak vysoká pořizovací cena elutriátoru tak časová a pracovní náročnost spojená s jeho údržbou a provozem. Při elutriaci dochází k velikým ztrátám buněk, a je proto nutné zpracovávat extrémní množství buněk naráz, z Čehož plynou zvýšené nároky na jejich pěstování. Získané frakce nejsou zcela homogenní, protože velikost buňky není plnohodnotná determinanta fáze buněčného cyklu. Během elutriace jsou buňky vystaveny nefyziologickým stresujícím podmínkám, když adherentní buněčné kultury musejí být před elutriací převedeny do suspenze, elutriační médium obsahuje Ν,Ν,Ν’,Ν’-ethylendiamintetraoctovou kyselinu (EDTA), buňky jsou vystaveny výkyvům teploty a výsledky jsou ovlivněny také mírou rozpuštěných plynů. Při procesu samotném je zvýšené riziko bakteriální ěi kvasinkové kontaminace buněčné kultury.

Další separační metoda průtokové cytometrie, vyhodnocující fluorescenční signál z jednotlivých buněk na speciálním přístroji, označovaná jako FACS, může být doplněna o sortující zařízení, tedy buněčný separátor, jak je popisováno ve stati Rieseberg,M., et al.: Flow cytometry in biotechnology (2001, Appl. Microbiol. Biotechnol. 56, 350-360). Výkonné FACS-Sortery umožňují separovat buňky v závislosti na míře jejich fluorescenčního signálu. Fluorescenční barvení buněk může mít povahu přímého chemického barvení, zprostředkovaného barvení pomocí protilátek s konjugovanou fluorescenční značkou anebo je způsobeno pomocí uměle zavedených genů kódující fluoreskující proteiny. Výhodou této metody je relativně rychlý a velmi přesný způsob separace buněčných populací umožňující více než jedno selekční kritérium. Mezi nevýhody patří velmi vysoká pořizovací cena, velmi náročný provoz a údržba zařízení a rovněž vysoká cena fluorescenčních barev. Pro selekci synchronní populace je nutnost fluorescenčního barvení DNA, které může mít mutagenní efekt. Během sortování jsou buňky exponované intenzivnímu laserovému světlu, které může vyvolat vznik toxických fotoproduktů. Během sortování jsou buňky vystaveny nefyziologickým stresujícím podmínkám, když adherentní buněčné kultury musejí být před sortováním převedeny do suspenze, sortovací médium obsahuje EDTA, buňky jsou vystaveny výkyvům teploty a výsledky jsou závislé na míře rozpuštěných plynů. Při procesu samotném je zvýšené riziko bakteriální či kvasinkové kontaminace buněčné kultury.

Úkolem technického řešení je snaha eliminovat negativní vlivy a významně zjednodušit běžně prováděné synchronizační metody při současném snížení finančních, časových a pracovních nároků u této důležité laboratorní procedury, a to s využitím principu označovaného jako závislost na ukotvení (Anchorage dependence). Tato je definována jako závislost proliferace na ukotvení, tedy adheze, ke kultivačnímu povrchu a je popsána například v Assoian,R.K. and Zhu,X.: Cell anchorage and the cytoskeleton as partners in growth factor dependent cell cycle progression (1997, Curr. Opin. Cell Biol. 9, 93-98) nebo v Zhu,X., et al.: Adhesion-dependent cell cycle progression linked to the expression of cyclin Dl, activation of cyclin E-cdk2, and phosphorylation of the retinoblastoma protein (1996, J. Cell Biol. 133, 391-403). Závislost na ukotvení se týká naprosté většiny adherentně rostoucích savčích buněk a pokud je ukotvení ke kultivačnímu povrchu znemožněno Či přerušeno, dochází k zablokování proliferace. Technické řešení využívá a rozšiřuje tento princip.

Podstata technického řešení

Uvedeného cíle je dosaženo technickým řešením, kterým je přístroj pro zajišťování produkce synchronizovaných adherentně rostoucích buněčných linií vysazených v kultivačních lahvích

-4CZ 19628 Ul naplněných kultivačním médiem, sestávající z pohyblivé plošiny, která je jednak volně zavěšena na nepohyblivém podstavci, jednak je vybavena úchyty pro uchycení kultivační láhve a jednak je k ní připevněn vibrátor propojený kabelem s regulátorem vibrací uloženém v boxu, který je součástí podstavce a uvnitř kterého je uložen bateriový zdroj.

Je výhodné když je plošina na podstavci zavěšena pomocí pružných vzpěr, které jsou v optimálním případě tvořeny vinutými pružinami volně nasazenými na protilehle umístěných čepech.

Je rovněž výhodné když je vibrátor tvořen bezkontaktním motorem vybaveným nevyváženým rotorem a když úchyty jsou tvořeny dvěma elastickými popruhy.

Novost a jedinečnost předkládaného řešení spočívá v tom, že pri odebrání kultivačního povrchu io během mitózy, a to ve stádiu metafáze, dokončí neukotvená buňka mitotický proces pouze do stadia karyokineze, tedy rozdělení jádra, a k následné cytokinezi, tj. úplnému rozdělení buňky na dvě dceřiné, však již nedojde. Buňky tak přetrvávají ve stádiu nedokončená cytokineze, kterou lze označit jako pozdní telofázi. K další proliferaci těchto buněk nedochází, a to až do doby, než dojde ke znovu ukotvení buňky na kultivačním povrchu. Jedná se tedy o indukovanou synchroni15 zaci buněk v pozdní telofázi, která nastává v důsledku změny kultivačních podmínek.

Za výhody předkládaného technického řešení lze považovat skutečnost, že podobně jako některé separační metody nevyužívá nový přístroj žádných synchronizačních chemikálií ani změn chemického složení kultivačního média. Buňky synchronizované pomocí tohoto přístroje nevykazují žádné měřitelné projevy stresu a umožňují následnou dlouhodobou kultivaci. Důležitým faktorem je snadná aplikovatelnost a automatizace metody, konstrukční jednoduchost přístroje, která umožňuje získat relativně veliké množství chemicky neovlivněných synchronních buněk s minimálními náklady na provoz a nulovými nároky na doplňková laboratorní zařízení. Jedná se o kompaktní modul, který svou velikostí a technickým provedením umožňuje umístění do standardního buněčného inkubátoru. Bateriový zdroj umožňuje přístroji dlouhodobý bezzásahový provoz uvnitř inkubátoru za standardních kultivačních podmínek po dostatečně dlouhou dobu, přičemž přístroj nevyžaduje Žádné zvláštní technologické úpravy inkubátoru ěi změnu kultivačního režimu. Přístroj využívá vibrací až o řád silnějších a dlouhodobějších než jsou dosud popsány pro běžné vytřepávací metody, a to v řádech desítek hodin, což způsobuje, že je zajištěno jak vyplavení neinhibovaných mitotických buněk do suspenze, tak iniciace inhibice proliferace těchto buněk, a tedy jejich zablokování v pozdní telofázi.

Přehled obrázků na připojených výkresech

Technické řešení bude blíže objasněno pomocí příkladů jeho provedení znázorněných na připojených výkresech, kde:

obr. 1 je pohled na schématicky vyobrazený přístroj s upevněnou standardní kultivační lahví, obr. 2 je schématické znázornění možného provedení vibrátoru ve formě bezkontaktního nevyváženého motoru, obr. 3 je srovnání populačních profilů (FACS profilů) u normálně rostoucí buněčné populace (graf A) a vytřepané populace získané 18-ti hodinovou kultivací na přístroji dle obr. 1 (graf B), a obr. 4 zobrazuje mikroskopickou analýzu populace buněk získanou 24hodinovou kultivací na přístroji dle obr. 1 s patrnou pozdní telofázi, tj. dvojicí jader, u většiny buněk.

Příklady provedení technického řešeni

Synchronizační přístroj sestává z pohyblivé plošiny 1, která je pomocí sady pružných vzpěr 2 volně zavěšena na nepohyblivém podstavci 3. Pružné vzpěry 2_mohou být vyrobeny z elastomerního materiálu nebo mohou být realizovány ve formě vinutých pružin 21 volně nasazených na protilehle umístěných čepech 22. Plošina I je vybavena úchyty JO, například dvěma elastickými popruhy, pro uchycení kultivační láhve 4 s kultivačním médiem 41 na její homí plochu li. Ke

-5CZ 19628 Ul spodní ploše 12 plošiny I je připevněn vibrátor 5 propojený kabelem 6 s regulátorem 7 vibrací uloženém v boxu 8, jehož homí stěna je tvořena podstavcem 3.

Vibrátor 5 je v popisovaném případě znázorněném na obr. 2 elektromechanického provedení a je tvořen bezkontaktním motorem 51 vybaveným nevyváženým rotorem 52. Pohon vibrátoru 5 je zajištěn bateriovým zdrojem 9, například olověným gelovým akumulátorem, uloženým v boxu 8 a vybaveným konektory 9i pro umožnění dobíjení. Regulátor 7 vibrací je tak vlastně regulátor otáček motoru 51.

Při provádění synchronizace u linií buněk s dobře vyplavitelnou mitotickou frakcí se kultivační láhev 4 s kultivačním médiem 41 obsahujícím exponenciálně rostoucí adherentní buněčnou linii io uchytí na pohyblivou plošinu I přístroje pomocí úchytů 10 a přístroj se umístí do inkubátoru.

Následně se sepne a nastaví adekvátní míra vibrací pomocí regulátoru 7 a buňky se inkubují po dobu 6 až 30 hodin za stálých vibrací při standardních kultivačních podmínkách. Po stanoveném časovém úseku se vyplavená suspenzní frakce buněk odebere a vysadí do nové kultivační lahve 4 nebo misky, případně se přímo zpracuje pro analýzu. Při provádění synchronizace u linií se špatně vyplavitelnou mitotickou frakcí se do média před zahájením synchronizace může přidat inertní abrazivum, které usnadňuje vyplavování mitotických buněk.

Konkrétní výsledky experimentů uváděného způsobu produkce synchronizovaných adherentně rostoucích buněčných linií jsou doloženy těmito příklady:

Příklad 1: Synchronizace lidské buněčné linie U-2-OS

Adherentní lidská buněčná linie U-2-OS (osteosarkom) byla vysazena do standardní kultivační lahve v celkovém počtu 9 χ 10⁵ buněk a kultivována ve standardním kultivačním médiu obsahujícím 90% D-MEM a 10% fetální bovinní sérum za standardních kultivačních podmínek po dobu 24 hodin. Následně se médium vyměnilo za čerstvé a kultivační láhev se uchytila na vibrační plošinu přístroje a přístroj i s lahví se umístil do standardního kultivačního inkubátoru typu He25 raeus BB16 se standardním kultivačním režimem, tj. 100% vlhkost, teplota 37 °C, 5% CO₂. Po umístění do inkubátoru se ručně aktivoval vibrační mód přístroje na hodnotu 20 kmitů za sekundu. Po 18ti hodinové inkubaci se odebralo médium spolu s vyplavenými buňkami. Část buněčné suspenze o hmotnosti 500 g se po dobu 10 minut zkoncentrovala centrifugací a ihned zafixovala pomocí 70% ethanolu a následně zpracovala pro FACS analýzu, jejíž výsledek je patrný z obr. 3, graf B. Zbývající část buněčné suspenze se rozdělila do čtyř nových kultivačních Petriho misek a nechala dále inkubovat za standardních kultivačních podmínek. Jednotlivé misky pak byly sklízeny po 4, 6, 9 a 15 hodinách a zpracovány pro FACS analýzu k monitoringu průběhu buněčného cyklu.

Příklad 2: Využití synchronizované U-2-OS linie pro analýzu efektivity aphidicolinu v indukci exprese fragilních míst

Adherentní lidská buněčná linie U-2-OS (osteosarkom) byla vysazena do standardní kultivační lahve v celkovém počtu 9 χ 10⁵ buněk a kultivována ve standardním kultivačním médiu obsahujícím 90% D-MEM a 10% fetální bovinní sérum za standardních kultivačních podmínek po dobu 24 hodin. Následně se médium vyměnilo za čerstvé a kultivační láhev se uchytila na vibrační plošinu přístroje a přístroj i s lahví se umístil do standardního kultivačního inkubátoru typu Heraeus BB16 se standardním kultivačním režimem, tj. 100% vlhkost, teplota 37 °C, 5% CO₂. Po umístění do inkubátoru se ručně aktivoval vibrační mód přístroje na hodnotu 20 kmitů za sekundu. Po 18ti hodinové inkubaci se odebralo médium spolu s vyplavenými buňkami. Buněčná suspenze se rozdělila do Čtyř nových kultivačních Petriho misek. Jedna miska sloužila jako kontrolní a k ostatním miskám se přidalo 0,1, 0,2 a 0,4 μΜ Aphidicolinu. Misky se dále kultivovaly za standardních kultivačních podmínek. Po 18ti hodinách se misky pravidelně každou hodinu kontrolovaly pod inverzním mikroskopem a vyhodnocoval se celkový počet kulatých, tj. mitotických, buněk. Jakmile Četnost mitotických buněk u dané misky dosáhla přibližně deseti procent, miska se sklidila a zpracovala pro analýzu zlomů mitotických chromozomů běžným způsobem popsa50 ným například ve stati Margaret A.Leversha, (1998 In Cell Biology: A Laboratory Handbook, Julio E.Celis, Ed. (ACADEMIC PRESS, San Diego,) chap. 11, pp. 428-436).

-6CZ 19628 Ul

Příklad 3: Synchronizace lidské buněčné linie BJ

Adherentní lidská buněčná linie BJ (předkožkové fibroblasty) byla vysazena do standardní kultivační lahve v celkovém počtu 10 χ 10⁵ buněk a kultivována ve standardním kultivačním médiu obsahujícím 90% D-MEM a 10% fetální bovinní sérum za standardních kultivačních podmínek po dobu 24 hodin. Poté se médium vyměnilo za čerstvé a přidalo se do něj 200 mg sterilizované agarózy sloužící jako inertní abrazivum usnadňující vyplavení mitotických buněk. Následně se kultivační láhev uchytila na vibrační plošinu přístroje a přístroj i s lahví se umístil do standardního kultivačního inkubátoru Heraeus BB16 se standardním kultivačním režimem, tj. 100% vlhkost, teplota 37 °C, 5% CO₂. Po umístění do inkubátoru se ručně aktivoval vibrační mód přístroje io na hodnotu 5 kmitů za sekundu. Po 18ti hodinové inkubaci se odebralo médium spolu s vyplavenými buňkami a agarózou. Buněčná suspenze se rozdělila do pěti nových kultivačních Petriho misek a buňky se nechaly sednout 3 hodinovou inkubací za standardních kultivačních podmínek. Následně se z misek odsálo veškeré médium obsahující agarózu, buňky se opláchly fosfátovým pufrem (PBS) a následně se přidalo nové standardní kultivační médium. Následovala další inku15 bace kdy jednotlivé misky byly sklízeny po 1, 3, 6, 12 a 18 hodinách po optachu a zpracovány pro FACS analýzu k monitoringu průběhu buněčného cyklu.

Průmyslová využitelnost

Způsob produkce synchronizovaných adherentně rostoucích buněčných linií a přístroj pro provádění tohoto způsobu jsou využitelné zejména pro využití v biotechnologických laboratořích zá20 kladního a aplikovaného výzkumu, které se věnují in-vitro kultivaci adherentních buněčných linií, jež potřebují z nej různějších důvodů synchronizovat.

Claims (4)

1. NÁROKY NA OCHRANU

   1. Přístroj k zajišťování produkce synchronizovaných adherentně rostoucích buněčných linií vysazených v kultivačních lahvích (4) naplněných kultivačním médiem (41), vyznačující

   25 se t í m , že sestává z pohyblivé plošiny (1), která je jednak volně zavěšena na nepohyblivém podstavci (3), jednak je vybavena úchyty (10) pro uchycení kultivační láhve (4) a jednak je k ní připevněn vibrátor (5) propojený kabelem (6) s regulátorem (7) vibrací uloženém v boxu (8), který je součástí podstavce (3) a uvnitř kterého je uložen bateriový zdroj (9).
2. 2. Přístroj podle nároku 1, vyznačující se tím, že plošina (1) je na podstavci zavě3o Sena pomocí pružných vzpěr (2).
3. 3. Přístroj podle nároku 2, vyznačující se tím, že pružné vzpěry (2) jsou tvořeny vinutými pružinami (21) volně nasazenými na protilehle umístěných Čepech (22).
4. 4. Přístroj podle některého z nároků laž3, vyznačující se tím, že vibrátor (5) je tvořen bezkontaktním motorem (51) vybaveným nevyváženým rotorem (52).

   35 5. Přístroj podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že úchyty (10) jsou tvořeny dvěma elastickými popruhy.