BRPI0520725A2 - método para a produção, a manutenção e a derivação de células-tronco adultas, células-troco adultas e agentes celulares terapeuticos resultantes - Google Patents

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Abstract

Esta invenção refere-se a células-tronco adultas multipotentes derivadas de tecido adiposo humano. Em especial, a invenção está relacionada com células- tronco multipotentes derivadas de tecido adiposo humano, que podem ser mantidas em um estado não diferenciado por um longo período de tempo, através da formação de esferas e tendo altas taxas de proliferação, assim como a métodos para isolar e manter as células-tronco adultas, métodos para derivar as células-tronco adultas multipotentes em células nervosas, células de gordura, células de cartilagem, células osteogênicas e células-B do pâncreas que liberam insulina. A invenção também relaciona-se a agentes celulares terapêuticos para o tratamento de osteoartrite, osteoporose e diabetes e para a formação de tecido de mama, que contém células derivadas ou células-tronco adultas. Apesar de as células-tronco multipotentes serem células-tronco adultas, elas têm a capacidade de se derivar em células ásseas, células nervosas, astrócitos, células gordurosas, células condrogênicas ou células-B do pâncreas que liberam insulina e também são efetivas no tratamento de osteoporose, osteoartrite, doenças dos nervos, diabetes, etc. As células-tronco, formam esferas em um meio livre de soro, contendo CORM-2 e podendo assim ser mantidas em um estado não diferenciado por um longo período de tempo. As células-tronco também têm uma alta taxa de proliferação. Dessa forma as células-tronco são úteis como agentes celulares terapêuticos.

Description

MÉTODO PARA A PRODUÇÃO, A MANUTENÇÃO E ADERIVAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO ADULTAS, CÉLULAS-TROCO ADULTAS EAGENTES CELULARES TERAPÊUTICOS RESULTANTES
CAMPO TÉCNICO
A presente invenção refere-se a células-tronco multipotentes adultas, derivadas de tecido adiposohumano e, mais especificamente, a células-tronco multipotenteadultas, derivadas de tecido adiposo da mama humana, quepodem ser mantidas em um estado não diferenciado por um longoperíodo de tempo, pela formação de esferas, com elevadastaxas de proliferação.
A presente invenção refere-se também a ummétodo para isolar e manter células-tronco adultas, um métodopara derivar as células-tronco adultas em células nervosas,células de gordura, células de cartilagem, célulasosteogênicas e células-β do pâncreas que liberam insulina, umagente celular terapêutico para o tratamento da osteoartrite,osteoporose e diabetes e um agente celular terapêutico paraformação de tecido de mama.
ESTADO DA TÉCNICA
A biotecnologia apresenta a possibilidade denovas soluções para a alimentação, o ambiente e os problemasde saúde, com o objetivo de promover a prosperidade humana.Nos últimos anos, a tecnologia da utilização de células-tronco tem sido considerada como uma nova forma de tratardoenças incuráveis. Anteriormente, o transplante de órgãos, aterapia genética, etc., foram apresentadas para o tratamentode doenças humanas incuráveis, mas o seu uso eficiente nãofoi feito devido à rejeição imunológica, um limitadofornecimento de órgãos, um desenvolvimento insuficiente devetores e um conhecimento insuficiente de genes de doenças.
Por este motivo, com o crescente interesse emestudos sobre células-tronco, tem sido reconhecido que ascélulas-tronco totipotentes têm a capacidade de formar todosos órgãos através da proliferação e derivação não só paratratar a maioria das doenças, mas também fundamentalmentepara curar lesões em órgãos. Muitos cientistas têm sugeridotambém a aplicabilidade das células-tronco para a regeneraçãode todos os órgãos e o tratamento de doenças incuráveis,incluindo a doença de Parkinson, vários cânceres, diabetes edanos da espinha.
Células-tronco referem-se a células que nãotêm apenas a capacidade de auto-multiplicação, mas também acapacidade de derivar-se em pelo menos duas células podendoser divididas em células-tronco totipotentes, células-troncopluripotentes, e células-tronco multipotentes.
Células-tronco totipotentes são células que,tendo propriedades totipotentes, são capazes de desenvolver-se em um indivíduo perfeito e tais propriedades são possuídaspor células até o estágio de 8 divisões da célula. Após afecundação de um ovócito e um espermatozóide. Quando estascélulas são isoladas e transplantadas para o útero, elaspodem desenvolver-se em um indivíduo perfeito.
Células-tronco pluripotentes, que são célulascapazes de desenvolver-se em várias células e tecidosderivados das camadas ectodérmicas, mesodérmicas eendodérmicas, derivam-se de uma massa celular internalocalizada no interior dos blastócistos gerados 4-5 dias apósa fertilização. Estas células são chamadas "células-troncoembrionárias" e podem derivar-se em várias outras células detecidos, mas não podem formar novos organismos vivos.
Células-tronco multipotentes, as quais sãocélulas-tronco capazes de derivar-se apenas em célulasespecificas para tecidos e órgãos que contenham essascélulas, estão envolvidas não apenas no crescimento edesenvolvimento de vários tecidos e órgãos nos períodos defeto, neonatal e adulto, mas também na manutenção dahomeostase do tecido adulto e a função de induzir aregeneração de tecidos danificados. Células multipotentesespecíficas para tecidos são denominadas de "células-troncoadultas".
Células-tronco adultas são obtidas pegandocélulas de vários órgãos humanos e derivando-as em células-tronco, com a caracterização de que elas se derivam emtecidos específicos. No entanto, recentemente, experiênciaspara derivar células-tronco adultas em vários tecidos,incluindo células de fígado, foram muito bem sucedidas.
As células-tronco multipotentes foramisoladas primeiramente de medula adulta (Jiang et al, Nature,418:41, 2002) e, em seguida, também encontradas em váriosoutros tecidos adultos (Verfaillie, Trends Cell Biol.,12:502, 2002). Em outras palavras, apesar da medula ser amaior fonte conhecida de células-tronco, as células-troncomultipotentes também foram encontradas na pele, vasossangüíneos, músculos e cérebro (Tomas et al, Nat. Cell Biol.,3:778, 2001 ; Sampaolesi et al, Science, 301: 487, 2003;Jiang et al, Exp. Hematoh, 30:896, 2002). No entanto,células-tronco em tecidos adultos, tais como a medula, sãoraramente encontradas, difíceis de cultivar sem induzir aderivação e muito difíceis de cultivar na ausência de meiosde seleção especifico. Ou seja, é muito dificil manter ascélulas-tronco isoladas in vitro.
Recentemente descobriu-se que tecido adiposoé uma nova fonte de células-tronco multipotentes (Cousin etal, BBRC, 301: 1016, 2003; Miranville et al, Circulation,110:349, 2004; Gronthos et al, J. Cell Physiol., 189:54,2001; Seo et al, BBRC, 328:258, 2005). Ou seja, foi relatadoque um grupo de células não diferenciadas estão incluídas notecido adiposo humano obtido por lipossucção e tem acapacidade de derivar-se em células de gordura, célulasosteogênicas , mioblastos e condroblastos (Zuk et al, TissueEng., 7:211, 2001 ; Rodriguez et al, BBRC, 315:255, 2004).Este tecido adiposo tem a vantagem de poder ser extraído emgrandes quantidades e, assim, torna-se importante como novafonte de células-tronco, que supera as deficiênciasexistentes.
Além disso, estudos recentes usando modelosde experiências com animais indicam que células derivadas detecido adiposo têm a capacidade de regenerar músculos eestimular a derivação de vasos sangüíneos de nervos.
Assim, estas células derivadas de tecidoadiposo recebem atenção como uma nova fonte de células-tronco .
As células-tronco derivadas de tecidoadiposos, conhecidas até agora, incluem células-troncoadultas derivadas de células adiposas humanas, que podemderivar-se em células epiteliais (Brzoska et al., BBRC,330:142, 2005), células-tronco adultas derivadas de célulasadiposas humanas que podem derivar-se em células osteogênicase de gordura (Cao et al, BBRC, 332:370, 2005), células-troncoadultas derivadas de células adiposas humanas que podemderivar-se em células nervosas (Safford et al, BBRC, 294:371,2002), células-tronco derivadas de células adiposas de ratosque podem derivar-se em células de gordura (Ogawa et al.,BBRC, 319:511, 2004), células-tronco derivadas de célulasadiposas de ratos que podem derivar-se em célulasosteogênicas e condrogenicas (Ogawa et al, BBRC, 313:871,2004), células-tronco derivadas de células adiposas humanasque podem derivar-se em células de cartilagem (Biomaterials,25:3211, 2004), células-tronco derivadas de células adiposasde ratos que podem derivar-se em células nervosas (Fujimuraet al, BBRC, 333:116, 2005) e células-tronco derivadas decélulas adiposas que podem derivar-se em células ósseas,células de cartilagem, células nervosas ou células musculares(E. U. Patent No. 6.777.231).
Contudo, a maioria das células-troncoderivadas das células adiposas conhecidas até agora sãocélulas-tronco derivadas de tecido adiposo de animais que nãoseres humanos. Mesmo se elas forem células-tronco derivadasde tecido adiposo humano, elas foram limitadas às derivadasde tecidos obtidos pela lipossucção de gordura abdominal, bemcomo o tipo de células derivadas de células-tronco foi tambémlimitado. Particularmente, as células-tronco isoladas têmbaixas taxas de proliferação e são difíceis de manter numestado não diferenciado por um longo período de tempo tendoassim, aplicação limitada.
Dessa forma, os atuais inventores fizeramextensos esforços para desenvolver células-tronco adultasmultipotentes, que têm altas taxas de proliferação, podem sermantidas num estado não diferenciado por um longo período detempo através da formação de esferas e podem derivar-se emvárias células. Como resultado, eles descobriram que células-tronco multipotentes isoladas de tecido adiposo humano podemderivar-se em várias células, incluindo as célulasosteogênicas, células condrogênicas, células nervosas,astrócitos, células de gordura, e células-β do pâncreas queliberam insulina, têm uma elevada taxa de proliferação epodem ser mantidas em um estado não diferenciado por um longoperíodo de tempo, através da formação de esferas,completando, assim, a presente invenção.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Portanto, é um objetivo da presente invençãofornecer células-tronco adultas multipotentes derivadas detecido adiposo humano, que têm taxas elevadas de proliferaçãoe podem ser mantidas em um estado não diferenciado por umlongo período de tempo, através da formação de esferas, bemcomo um método de produção para as mesmas.
Outro objetivo da presente invenção éfornecer um método para derivar as citadas células-troncomultipotentes em células nervosas, astrócitos, células decartilagem, células osteogênicas, células de gordura ecélulas-β do pâncreas que liberam insulina, assim comoagentes celulares terapêuticos contendo as mencionadascélulas derivadas ou células-tronco adultas.
Para atingir os objetivos acima citados, emum aspecto, a presente invenção fornece um método paraproduzir células-tronco adultas, compreendendo o cultivo debolotas derivadas de tecido adiposo humano em um meiocontendo N-acetil-L-cisteína (NAC) e, em seguida, a coleta decélulas cultivadas, as células-tronco adultas sendocaracterizadas por: (a) mostrar respostas imunológicaspositivas a todos CD73, CD90, CD29, CD44 e CD105, e respostasimunológicas negativas a todos CD33, CD34, CD45, CD4, CD31,CD62p, CD14 E HLA-DR; (b) crescer ligado a um materialplástico, mostrando características morfológicas em formatode fuso e formando esferas em um meio contendo CORM-2, deforma a ser mantidas em um estado não diferenciado por umlongo período de tempo; e (c) que tenha a capacidade sederivar em células da camada mesodérmica.
Na presente invenção, o meio que contém NAC eadicionalmente, contém ácido ascórbico, cálcio, rEGF, ΒΡΕ,insulina e hidrocortisona.
Em outro aspecto, a presente invenção forneceum método para a manutenção de células-tronco adultas em umestado não diferenciado, o método compreendendo o cultivo decélulas-tronco adultas, preparadas de acordo com o citadométodo, em um meio contendo CORM-2, de modo a formar esferas.
Na presente invenção, o meio contendo o CORM-2 é preferencialmente um meio livre de soro, queadicionalmente contém uma solução antimicótica, antibiótico,hidrocortisona, insulina, rEGF, FGF, B27 e β-mercaptoetanol.
Em ainda outro aspecto, a presente invençãofornece células-tronco adultas produzidas pelo mencionadométodo e caracterizada por: (a) mostrar respostasimunológicas positiva a todos CD73, CD90, CD29, CD44 e CD105,e respostas imunológicas negativas a todos CD33, CD34, CD45,CD4, CD31, CD62p, CD14 E HLA-DR; (b) crescer ligado a ummaterial plástico, mostrando características morfológicas emformato de fuso, e formando esferas em um meio contendo CORM-2, de forma a ser mantidos em um estado não diferenciado porum longo período de tempo; e (c) que tenha a capacidade sederivar em células da camada mesodérmica.Na presente invenção, as células-troncoadultas são preferencialmente cultivadas em um estado nãodiferenciado por, pelo menos, 16 divisões, e as célulasderivadas da camada mesodérmica são preferencialmentecélulas de cartilagem, células osteogênicas, célulasnervosas, astrócitos, células de gordura e células-β dopâncreas que liberam insulina.
Em ainda outro aspecto, a presente invençãofornece um método para derivar células-tronco adultas emcélulas nervosas, o método compreendendo as etapas de: (a)pré-incubação das células-tronco adultas em um meio DMEMcontendo BME e FBS; e (b) tratamento da sopa pré-incubada comDMSO e BHA, de modo a induzir a derivação de célulasnervosas. A presente invenção fornece, também, um agentecelular terapêutico para o tratamento de doenças nervosas,que contém as mencionadas células nervosas derivadas comosubstâncias ativas.
Em ainda outro aspecto, a presente invençãofornece um método de derivação de células-tronco adultas emcélulas de cartilagem, o método compreendendo o cultivo decélulas-tronco adultas em um meio α-MEM contendo TFG-β 1, L-ascorbatos-2-fosfato e insulina. A presente invenção tambémfornece um agente celular terapêutico para o tratamento daosteoartrite, que contém as mencionadas células de cartilagemderivadas como substâncias ativas.
Em ainda outro aspecto, a presente invençãofornece um método para a derivação de células-tronco adultasem células osteogênicas, o método compreendendo misturar ascélulas-tronco adultas com tricálcico fosfato (TCP) eisotransplantando a mistura. Além disso, a presente invençãofornece um agente celular terapêutico para tratamento dedeficiência óssea, que contém as mencionadas célulasosteogênicas derivadas como substâncias ativas.
Em ainda outro aspecto, a presente invençãofornece um método para derivar células-tronco adultas emcélulas de gordura, o método compreendendo o cultivo decélulas-tronco adultas num meio α-MEM contendo dexametasona,indometacina, insulina e IBMX. Além disso, a presenteinvenção fornece um agente terapêutico celular para formaçãode tecido de mama, que contém as mencionadas células degordura derivadas como substâncias ativas.
Em ainda outro aspecto, a presente invençãofornece um método para a derivação de células-tronco adultasem células-β do pâncreas que liberam insulina, o métodocompreendendo as etapas de: (a) cultivo de células-troncoadultas, em um meio de DMEM com baixa glicose contendonicotinamida, β - Mercaptoetanol e FBS de 12-72 horas; e (b)cultivo células cultivadas meio DMEM com alta glicosecontendo nicotinamida, β-mercaptoetanol e FBS de 4-7 dias.
A presente invenção também fornece um agentecelular terapêutico para o tratamento da diabetes que contémas mencionadas células-β do pâncreas que liberam insulinaderivadas como substâncias ativas.
Em ainda outro aspecto, a presente invençãofornece um agente celular terapêutico para o tratamento dedoenças de nervos contendo as células-tronco adultas quetenham a habilidade de derivar-se em células nervosas, comosubstâncias ativas.
Em ainda outro aspecto, a presente invençãofornece um agente celular terapêutico para o tratamento dediabetes contendo células-tronco adultas que tenham acapacidade de derivar-se em células-β do pâncreas que liberaminsulina, como substâncias ativas.
Em ainda outro aspecto, a presente invençãoprovê um agente celular terapêutico para o tratamento daosteoartrite contendo as células-tronco adultas que tenham acapacidade de derivar-se em células de cartilagem, comosubstâncias ativas.
Em ainda outro aspecto, a presente invençãofornece um agente celular terapêutico para o tratamento dedeficiência óssea contendo as células-tronco adultas quetenham a capacidade de derivar-se em células osteogênicas,como substâncias ativas.
Em ainda outro aspecto, a presente invençãofornece um agente celular terapêutico para a formação detecido de mama contendo as células-tronco adultas que tenhama capacidade de derivar-se em células de gordura, comosubstâncias ativas.
Os objetivos acima e outros objetivos,características e realizações da presente invenção serão maisclaramente entendidas na descrição detalhada e nasreivindicações que as acompanham, a seguir apresentadas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A FIG. 1 mostra fotografias feitas com umaampliação de IOOx de células-tronco multipotentes derivadasde tecido adiposo humano de acordo com a presente invenção.A FIG. 2 mostra o nível de duplicação dapopulação acumulada (CPDL), de células-tronco multipotentesderivadas de tecido adiposo humano, de acordo com a presenteinvenção. A-I e A-2: células-tronco multipotentes derivadasde tecido adiposo humano, de acordo com a presente invenção;e B e C: células-tronco derivadas de células adiposas, deacordo com o estado da técnica.
A FIG. 3 mostra fotografias feitas com umaampliação de 200x de esferas formadas após 7 dias de cultivode células-tronco multipotentes derivadas de tecido adiposode mama humana, de acordo com a presente invenção.
A FIG. 4 é uma fotografia feitas com umaampliação de 200x do formato da esfera formado pelaproliferação de uma célula-tronco em ágar.
A FIG. 5 ilustra fotografias feitas com umaampliação de IOOx, que mostram a expressão de Nestin (tipo 6de proteína intermediária filamentosa- IF), Oct4, SH2, SH3 /4 nas células-tronco multipotentes derivadas do tecidoadiposo humano inventadas, que foram cultivadas como esferasem um meio CORM-2 contendo MEBM e, em seguida, imunocolorido.
A FIG. 6 mostra que células-troncomultipotentes derivadas de tecido adiposo humano, de acordocom a presente invenção, derivadas em células nervosas eastrócitos.
A FIG. 7 mostra fotografias feitas com umaampliação de 200x de células de gordura derivadas de células-tronco multipotentes derivadas de tecido adiposo humano deacordo com a presente invenção. A: contraste da fasederivada; e B: tingidas por óleo 0 com coloração vermelha.A FIG. 8 apresenta mostra fotografias feitascom uma ampliação de IOOx de células de cartilagem derivadasde células-tronco multipotentes derivadas de tecido adiposohumano de acordo com a presente invenção. A: contraste dafase derivada; e B: resultados do fingimento com a coloraçãoazul alcian mostrando resultados da derivação em células decartilagem.
A FIG. 9 apresenta células osteogênicasderivadas de células-tronco multipotentes derivadas de tecidoadiposo humano de acordo com a presente invenção. A: um grupotratado com apenas com TCP; B: um grupo tratado com umamistura de TCP e células-tronco de medula; e C: um grupotratado com uma mistura de TCP com células-tronco derivadasde células adiposas.
A FIG. 10 apresenta os resultados daimunocoloração de células-β do pâncreas que liberam insulinaderivadas de células-tronco multipotentes derivadas de tecidoadiposo humano de acordo com a presente invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO, EREALIZAÇÕES PREFERENCIAIS
A presente invenção refere-se a células-tronco multipotentes isoladas a partir de um tecido adiposoda mama humana.
Na presente invenção, células-troncomultipotentes foram primeiramente isoladas e purificadas dotecido adiposo da mama humana da seguinte forma. Os tecidoadiposo humano isolado foi lavado com PBS (solução salinatamponada de fosfato), cortado finamente e, em seguida,digerido num meio de DMEM suplementado com colagenase tipo 1(1 mg / mL) , a 37 ° C durante 2 horas. Após ser lavado comPBS, o tecido foi centrifugado a 1000 rpm durante 5 minutos.
O sobrenadante foi succionado, e as bolotas restantes nofundo foram lavadas com PBS e, em seguida, centrifugadas a1000 rpm durante 5 minutos. As bolotas resultantes foramfiltradas através de uma malha de ΙΟΟμπι para remover osdetritos, seguido de lavagem com PBS. Em seguida, as bolotasforam incubadas num meio de DMEM (10% FBS, 2mM NAC, 0,2mMácido ascórbico). Depois de um pernoite, as células soltasforam lavadas com PBS, e as células remanescentes foramcultivadas em um meio K-NAC (meio Keratinocyte-SFM + 2 mM NAC+ 0,2 mM ácido ascórbico + 0,09 mM cálcio + 5 ng / mL rEGF +50 μς / 1 mL BPE + 5 μg / mL de insulina + 74 ng / mLhidrocortisona) enquanto o meio foi substituído porintervalos de dois dias, obtendo-se assim uma solução decélulas-tronco multipotentes derivadas de tecido adiposo demama humana.
A taxa de proliferação das células-troncomultipotentes derivadas de tecido adiposo de mama humana foiexaminada, e como resultado, verificou-se que o CPDLgradualmente aumentou até um número de divisões de 16,indicando que as células-tronco têm elevadas taxas deproliferação.
Enquanto isso para a cultura de esferas decélulas-tronco, 5xl04 - IxlO5 células/mL de células-troncomulripotentes isoladas de tecido adiposo foram semeados emcada cavidade de uma placa com 6 cavidades, contendo um meiode MEBM (10 μΜ CORM-2 (Tricarbonyl diclororuthenium (II)dimero), B27, 5 mL de solução antimicótica, antibiótica(100x), 1 μg/mL hidrocortisona, 5μg/mL insulina, 20 ng/mLEGF, 40 ng/mL FGF e β-mercaptoetanol) e, como resultado, elascomeçaram a formar esferas a partir de 3 dias após asemeadura. Isto sugere que as células-tronco têm elevadastaxas de proliferação quando são mantidas em um estado nãodiferenciado.
Métodos para obtenção de células-troncomultipotentes apresentando os desejados antigenos desuperfície da sopa de células-tronco derivadas de tecidoadiposo humano, obtidas acima, incluem um método FACS, queutiliza um citômetro de fluxo com função de triagem (Int.Immunol, 10 (3): 275, 1998), um método utilizando esferasmagnéticas e um método de filmar em movimento panorâmico,usando um anticorpo específico, para reconhecimento decélulas-tronco multipotentes (J. Immunol., 141 (8): 2797,1998). Além disso, métodos para obtenção de células-troncomultipotentes a partir de uma grande quantidade de sopacultivada incluem um método em que anticorpos específicosreconhecem moléculas apresentadas na superfície das células,(daqui em diante designadas por "antigenos de superfície")usadas isoladamente ou em combinação como colunas.
Os métodos de triagem do citômetro de fluxopodem incluir um método de carga de uma gota de água e ummétodo de capturar uma célula. Em qualquer um destes métodos,um anticorpo específico que reconhece um antígeno nasuperfície celular é identificado fluorescentemente, aintensidade da fluorescência de um anticorpo ligado com amolécula ligada a superfície da célula é convertida em umsinal elétrico, de forma que o montante de antigenos pode serquantificado. É também possível separar células queapresentam uma pluralidade de antigenos de superfície atravésda combinação de tipos fluorescentes utilizados para tanto.Exemplos de fluorescências que podem ser usadas neste casoincluem FITC (fluoresceína isotiocianato), PE (ficoeritrina),APC (alloficocianina), TR (Texas Red), Cy 3, CyCromo,Vermelho 613, Vermelho 670, TRI-Cor, Quantum Vermelha, etc.
Métodos FACS utilizando um citômetro de fluxoincluem: um método onde a sopa de células-tronco acima sãocoletadas, a partir da qual as células são isoladas, através,por exemplo, de centrifugação e tingidas diretamente comanticorpos; e um método em que as células são cultivadas ecrescem em um meio adequado e, em seguida, são tingidas comanticorpos. O tingimento das células é feito misturando-se umanticorpo primário que reconhece um antigeno de superfíciecom uma amostra de célula alvo e incubando a mistura em gelode 30 minutos a 1 hora. Quando o anticorpo primário éidentificado fluorescentemente, as células são isoladas comum citômetro de fluxo após sua lavagem. Quando o anticorpoprimário não é identificado fluorescentemente, as célulasreagiram com o anticorpo primário e um anticorpo secundárioidentificado fluorescentemente, tendo uma atividade deligação ao anticorpo primário, elas são misturados apóslavagem e incubadas em água gelada de 30 minutos a 1 hora.
Após a lavagem, as células tingidas com os anticorposprimários e secundários são isoladas por um citômetro defluxo.
Diversos antígenos de superfície podemincluir antígenos associados de forma hematopoiética, osantígenos de superfície de células mesenquimatosas, eantígenos específicos de neurônios do sistema nervoso. Osantígenos associados de forma hematopoiética incluem CD34,CD45, etc., os antígenos de superfície de célulasmesenquimatosas incluem SH-2, SH-3, etc., e os antígenosespecíficos de células de neurônios do sistema nervosoincluem NSE, GFAP, etc. 0 uso isolado ou combinado deanticorpos que reconhecem os antígenos de superfície acimadescritos permite que as células desejadas sejam obtidas.
As células-tronco multipotentes adultasisoladas, de acordo com a presente invenção foram analisadasutilizando um citômetro de fluxo e, como resultado,apresentaram respostas positivas para CD73, CD90, CD29, CD44,e CDl 05.
Além disso, as células-tronco multipotentesmostraram respostas imunológicas negativas a todos CD33,CD34, CD45, CD4, CD31, CD62p, CD 14 e HLA-DR.
Além disso, verificou-se que células-troncomultipotentes adultas isoladas, de acordo com a presenteinvenção, são células-tronco multipotentes, que podemderivar-se em células nervosas, astrócitos, célulasosteogênicas, células de cartilagem, células de gordura ecélulas-β do pâncreas que liberam insulina.
EXEMPLOS
Daqui em diante, a presente invenção serádescrita mais detalhadamente através de exemplos. Deve serconsiderado, no entanto, que estes exemplos são apenasilustrativos, não sendo apresentados com fins de limitar oobjetivo da invenção.
Exemplo 1: Isolamento de células-troncomultipotentes a partir de tecido adiposo
Tecido adiposo foi isolado de tecido de mamade mulheres distribuídas pelo Centro de Câncer de Mama,Universidade Nacional de Seoul (Seoul National University) ,lavado com PBS e, em seguida, cortado finamente. 0 tecidocortado foi digerido em um meio de DMEM suplementado comcolagenase tipo 1 (lmg/mL), a 37°C durante 2 horas. 0 tecidodigerido foi lavado com PBS e, em seguida, centrifugado a1000 rpm durante 5 minutos. 0 sobrenadante foi succionado, eas bolotas restantes no fundo foram lavadas com PBS e, emseguida, centrifugadas a 1000 rpm durante 5 minutos. Asbolotas resultantes foram filtradas através de uma malha comΙΟΟμιη para remover detritos, seguido de uma lavagem com PBS.
As células resultantes foram incubadas num meio de DMEM (10%FBS, 2 mM NAC, 0,2 mM ácido ascórbico) . Após um pernoite, ascélulas soltas foram lavados com PBS e cultivadas em meio dequeratinócito-SFM (contendo 2 mM NAC, 0,2 mM ácido ascórbico,0,09 mM de cálcio, 5 ng/mL rEGF, 50 yg/mL ΒΡΕ, 5pg /mL deinsulina e 74 ng/mL hidrocortisona), enquanto o meio erasubstituído em intervalos de dois dias, assim isolando ascélulas-tronco multipotentes. A FIG. 1 mostra fotografiastiradas com ampliação de 100x de células-tronco multipotentesderivadas de tecido adiposo humano, isoladas como descritoacima.
Exemplo 2: Exame da taxa de proliferação decélulas-tronco derivadas de tecido adiposo
O tecido adiposo foi obtido a partir dediferentes amostras de tecidos de mama humana, de acordo como método de isolamento, conforme descrito no Exemplo 1. Demodo a examinar a taxa de proliferação de células-troncomultipotentes derivadas de tecido adiposo de mama humanoisolado, 2x IO5 das células foi semeado em um frasco T-75 e,em seguida, foi medido o CPDL (nível cumulativo de duplicaçãoda população) e apresentado como uma função do número dedivisões. CPDL é um índice indicativo da taxa de proliferaçãode células e é expresso conforme a seguinte equação.CPDL = In (Nf/Ni)/In2, ondeNi: o número inicial de células semeadas; e
Nf: o número final de células.Como resultado, como mostrado em "A-I" e "A-2" da FIG. 2, ascélulas-tronco adultas (hMAD-MCSl e hM AD-MC S2), de acordocom a presente invenção mostrou um valor de CPDL de cerca de50 em um número de 16 divisões.
Entrementes, "B" e "C" da FIG. 2 mostram os valores da CPDLdas células-tronco derivadas de tecido adiposo humanoanteriores (Lin et al, Stem Cells and Development, 14:92,2005; Zuk et al, Tissue Eng., 7:211, 2001), como função donúmero de divisões. Como mostrado na FIG. 2, os valores deCPDL das células foram 30-35 e 21 no número de divisão 7 e13, respectivamente.
Esses resultados sugerem que células-troncoadultas, de acordo com a presente invenção, têm taxas deproliferação muito elevadas.
Exemplo 3: Características imunológicas dascélulas-tronco multipotentes derivadas de células adiposas.
As células-tronco multipotentes derivadas detecido adiposo obtidas no Exemplo 1 foram lavadas com PBS etratadas com tripsina. As células tratadas foram coletadas ecentrifugadas a 1000 rpm durante 5 minutos. O sobrenadantefoi descartado e, então, elas foram lavadas com uma misturade 2% FBS e PBS, seguida de centrifugação a 1000 rpm, durante5 minutos. O sobrenadante foi descartado, e as células foramsuspensas em PBS, e IxlO5 células para cada amostra foramcolocadas em uma placa com cavidades. Um anticorpo (anticorpomonoclonal anti-humano de rato R-ficoeritrina conjugado) foicolocado em cada cavidade e incubado em gelo durante 40minutos. Após a incubação o meio foi centrifugado a 1000 rpmdurante 5 minutos. O sobrenadante foi removido e as célulasforam lavadas com PBS e centrifugadas a 1000 rpm por 5minutos. Mais uma vez, o sobrenadante foi removido e ascélulas foram lavadas com PBS e centrifugadas a 1000 rpmdurante 5 minutos. Após remover o sobrenadante, as célulasforam preparadas com 1% de paraformaldeido e analisadasutilizando um citômetro de fluxo.
Tabela 1: FACS análise de antigenos desuperfície de células-tronco derivadas de células adiposas
<table>table see original document page 20</column></row><table>
Como resultado, conforme mostrado na tabela1, as células-tronco adultas derivadas de tecido adiposo, deacordo com a presente invenção, apresentaram respostaspositivas de 91% ao CD73, 97% ao CD90, 96% ao CD29, 83% aoCD44, e 80% ao CD105. Além disso, as células-tronco dainvenção mostraram respostas imunológicas negativas a todosos CD33, CD34, CD45, CD4, CD31, CD62p, CD14 e HLA-DR.
Exemplo 4: Formação de esferas das células-tronco multipotentes derivadas de tecido adiposo5xl04- lxl05/mL células-tronco multipotentesderivadas de tecido de mama humana obtidas no Exemplo 1 foramsemeadas nas cavidades de uma placa com 6 cavidades contendoum meio MEBM livre de soro contendo 10 μΜ CORM-2, 5 mL desolução antimicótica antibiótica (100X), 1 μg/mLhidrocortisona, 5 μ9/ιη]1 de insulina, 20 ng/mL de EGF, 40ng/mL de FGF, B27 e β-mercaptoetanol. Como resultado, ascélulas começaram a formar esferas de 3-7 dias após asemeadura e, como mostrado na FIG. 3 e FIG. 4, as célulasproliferaram a formar esferas mesmo entre 7-10 dias após asemeadura.
Além disso, as células-tronco, de acordo coma presente invenção, foram cultivadas em ágar. Comoresultado, como mostrado na FIG. 4, as células formaramesferas.
Entrementes, 5xl04 células-tronco obtidas noExemplo 1 foram semeadas em cada cavidade de uma placa com 24cavidades e mediu-se o número de esferas a cada número dedivisões (ver tabela 2). Como resultado, conforme mostrado natabela 2, as células mantiveram esferas, indicando que ascélulas podem ser proliferadas e mantidas por um longoperíodo de tempo. Além disso, como mostrado na FIG. 5, 0ct4apresentou-se positivo, indicando que as células têm uma altataxa de proliferação enquanto forem mantidas em um estado nãodiferenciado.
Tabela 2
<table>table see original document page 21</column></row><table>Exemplo 5: Análise da imunocoloração decélulas-tronco derivadas de tecido adiposo
Esferas de células-tronco derivadas de tecidoadiposo obtidas no Exemplo 4 foram lavadas três vezes com PBSe marcadas com 4% paraformaldeído contendo PBS durante 30minutos. Após lavar três vezes com PBS, as esferas foramimpregnadas com PBS contendo 0,1% de Triton-X 100 durante 10minutos. Após terem sido lavadas três vezes com PBS,permitiu-se que as esferas reagissem com 10% de NGS por 1hora e, então, com PBS contendo um anticorpo primário,durante uma noite. Após terem sido lavadas três vezes comPBS, permitiu-se que as esferas reagissem com um anticorposecundário em uma câmara escura durante 1 hora. Após teremsido lavadas três vezes com PBS, as esferas foram montadas.
Como resultado, conforme mostrado na FIG. 5,as esferas de células-tronco multipotentes, de acordo com apresente invenção, apresentaram respostas positivas a todosos Nestin, o que pode ser considerado como um marcador decélulas progenitoras de nervos, 0ct4, que podem serconsideradas um marcador de células não diferenciadas, e SH2(CD105) E SH3/4 (CD73), que são marcadores de células-troncomesenquimatosas.
Exemplo 6: Derivação de células-troncomultipotentes derivadas de células adiposas em célulasnervosas e astrócitos
As células-tronco multipotentes derivadas detecido adiposo obtidas no Exemplo 1 foram pré-incubadas em ummeio DMEM suplementado com 1 mM BME e 10% de FBS, durante 24horas. Após a preincubação, as células-tronco foram incubadasem um meio para indução para derivação em células nervosas,contendo 1% de DMSO e 100 μΜ BHA (butil hidroxanisole) ,durante 90 minutos, de modo a induzir a derivação em célulasnervosas, seguido por imunocoloração (FIG. 6) . Comoresultado, conforme mostrado na FIG. 6, as células-troncomultipotentes derivadas de tecido adiposo humano, de acordocom a presente invenção, mostraram respostas positivas aoGFAP (proteína glial fibrilar ácida), que é um antígenoespecífico para astrócitos no sistema nervoso, e MAP2(microtubule associado a protein2), que é uma substânciaespecífica da célula nervosa.
Fotografias na primeira linha da FIG. 6mostram resultados de um grupo de controle negativo, queindica que células derivadas não mostram fluorescência deFITC e TRITC, espontaneamente. A fotografia MAP2 no ladoesquerdo da segunda linha mostra a fluorescência vermelha deTRITC, indicando que MAP2 foi apresentado. Da fotografia dafase de contraste e da fotografia Merge, verificou-se que afluorescência vermelha era uma fluorescência emitida porcélulas nas quais o MAP2 era apresentado. Além disso, afotografia GFAP no lado esquerdo da terceira linha mostrou af luorescência verde do FITC e, da fotografia da fase decontraste e da fotografia Merge, foi visto que afluorescência verde era a fluorescência emitida por célulasem que o GFAP era apresentado. Estes resultados sugerem quecélulas-troncoos multipotentes derivados de células adiposashumanas, de acordo com a presente invenção, derivam-se emcélulas nervosas e astrócitos.
Exemplo 7: Derivação de células-troncomultipotentes derivadas de células adiposas em células degorduraAs células-tronco multipotentes derivadas detecido adiposo obtidas no Exemplo 1 foram incubadas em ummeio α-MEM contendo 5% FBS, 1 μΜ dexametasona, 200 μΜindometacina, 10 μg/mL de insulina e 0,5 mM IBMX (3-isobutilico-l-metilxantina ), durante 2 semanas para induçãoda derivação em células de gordura e, então, analisadosutilizando-se um método de tingimento de óleo O de coloraçãovermelha. Como resultado, conforme mostrado na FIG. 7, foiobservado que as células-tronco multipotentes derivadas detecido adiposo humano derivaram-se em células de gordura.
Exemplo 8: Derivação de células-troncomultipotentes derivadas de células adiposas em células decartilagem
IO7 células/mL de células-troncomultipotentes derivadas de tecido adiposo, obtidas no Exemplo1 foram colocadas no centro de cada cavidade de um prato com24 cavidades em um montante de 10 μΐ. Em seguida, as célulasforam incubadas em um meio de α-MEM contendo 5% FBS, lOng/mLTFG-β 1, 50 μΜ L-ascorbato-2-fosfato e 6,25 μg/mL insulinadurante 2 semanas, de modo a induzir derivação em células decartilagem . Então, se as células-tronco multipotentes foramderivadas em células de cartilagem, foi analisado utilizandoo método de coloração azul Alcian. Como resultado, conformemostrado na FIG. 8, as células-tronco multipotentes derivadasde tecido adiposo humano derivaram-se em células decartilagem.
Exemplo 9: Derivação de células-troncomultipotentes derivadas de células adiposas em célulasosteogênicas107 células/mL de células-tronco adultasderivadas de tecido adiposo, obtidas no Exemplo 1 forammisturadas com TCP (tricálcio fosfato) e isotransplantadassubcutaneamente em cães. Após 14 dias, o tecido foi tratado eanalisado utilizando o método de coloração H&E. Comoresultado, conforme mostrado na FIG. 9, um grupo (A) tratadocom TCP apenas mostrou a permeação de células inflamatóriasem uma porção em volta do TCP e um grupo (B) tratado com umamistura de TCP e células-tronco de medula mostraram respostasinflamatórias permanecendo intactas em volta do TCP. Noentanto, em um grupo (C) tratado com uma mistura de TCP ecélulas-tronco derivadas de células adiposas, a maior parteda TCP foi absorvida, e osteogênese inicial típica foiobservada, e células parecidas com ósteoblastos, célulasparecidas com multinuclear osteoclastos e matrizes ósseastambém foram observadas. Estes resultados indicam quecélulas-tronco multipotentes derivadas de tecido adiposohumano derivaram-se em células osteogênicas.
Exemplo 10: Derivação de células-troncomultipotentes derivadas de células adiposas em células-β dopâncreas que liberam insulina
As células-tronco multipotentes derivadas detecido adiposo, obtidas no Exemplo 1 foram incubadas em ummeio DMEM com baixa glicose contendo 10 mmol/L nicotinamida,1 mmol/L β-mercaptoetanol e 10% de FBS por 24 horas e, emseguida, incubadas em um meio DMEM com alta glicose contendo10 mmol/L de nicotinamida, 1 mmol/L β-mercaptoetanol e 5%FBS, durante 5 dias, de modo a induzir a derivação emcélulas-β do pâncreas que liberam insulina. Após a indução daderivação, as células foram analisadas por imunocoloração, eos resultados são mostrados na FIG. 10. Como mostrado na FIG.10, C-peptídeo e insulina estavam presentes nas células. Comoconhecido no estado da técnica, proinsulina, que estádividido em insulina e C-peptídeo, é produzida nas células-βdo pâncreas que liberam insulina. Assim, os resultados acimaindicam que células-tronco multipotentes derivadas de tecidoadiposo, de acordo com a presente invenção, derivaram-se emcélulas-β do pâncreas que liberam insulina.
Embora a presente invenção tenha sidodescrita em detalhes no que se refere a característicasespecíficas, ficará evidente àqueles habilitados para oestado da técnica que esta descrição é apenas para umarealização preferencial não limitante o escopo da presenteinvenção. Assim, o escopo substancial da presente invençãoserá definido pelas reivindicações e equivalentes delasanexos.
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
Conforme descrito acima em detalhes, apesarde células-tronco multipotentes, de acordo com a presenteinvenção, serem células-tronco adultas, elas podem derivar-seem mais tipos diferentes de células do que aquelas células-tronco adultas derivadas de células adiposas anteriores.
Particularmente, as células-tronco multipotentes adultas dainvenção têm a capacidade de derivar-se em células nervosas,astrócitos, células de gordura, células condrogenicas,células osteogênicas, ou células-β do pâncreas que liberaminsulina e são eficazes no tratamento da osteoporose,osteoartrite, doença de nervos, diabetes, etc., sendo úteistambém para a formação de tecido de mama. Além disso, ascélulas-tronco adultas da invenção formam esferas em um meiolivre de soro, a fim de que possam ser isoladas com elevadograu de pureza, mantidas num estado não diferenciado por umlongo período de tempo e ter uma alta taxa de proliferação.Assim, as células-tronco adultas da invenção são úteis comoagentes celulares terapêuticos.

Claims (22)

1. Método para produção de células-troncoadultas, contendo bolotas derivadas do cultivo de tecidoadiposo humano em um meio contendo N-acetil-L-cisteína (NAC)e, em seguida, coletando as células cultivadas, sendo que ascélulas-tronco adultas são caracterizadas por:(a) mostrar respostas imunológicas positivasa todos CD73, CD90, CD29, CD44 e CD105, e respostasimunológicas negativas a todos CD33, CD34, CD45, CD4, CD31,CD62p, CD14 E HLA-DR;(b) crescer ligado a um material plástico,mostrando características morfológicas em formato de fuso, eformando esferas em um meio contendo CORM-2, de forma a sermantidos em um estado não diferenciado por um longo períodode tempo; e(c) que tenha a capacidade se derivar emcélulas da camada mesodérmica.
2. Método para produção de células-troncoadultas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por omeio contendo NAC conter adicionalmente ácido ascórbico,cálcio, rEGF, ΒΡΕ, insulina e hidrocortisona.
3. Método para a manutenção de células-troncoadultas em um estado não diferenciado, caracterizado porcompreender a cultura de células-tronco adultas preparadaspelo método de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em uma meiocontendo CORM-2, de modo a formar esferas.
4. Método para a manutenção de células-troncoadultas num estado não diferenciado, caracterizado por o meioconter CORM-2 ser um meio livre de soro, que adicionalmentecontém solução antimicótica antibiótica, hidrocortisona,insulina, rEGF, FGF, B27 e β-mercaptoetanol.
5. Células-tronco adultas produzidas pelométodo das reivindicações 1 e 2 e caracterizadas por:(a) mostrar respostas imunológicas positivasa todos CD73, CD90, CD29, CD44 e CD105, e respostasimunológicas negativas a todos CD33, CD34, CD45, CD4, CD31,CD62p, CD14 E HLA-DR;(b) crescer ligado a um material plástico,mostrando características morfológicas em formato de fuso, eformando esferas em um meio contendo CORM-2, de forma a sermantidos em um estado não diferenciado por um longo períodode tempo; e(c) que tenha a capacidade se derivar emcélulas da camada mesodérmica.
6. Células-tronco adultas, de acordo com areivindicação 5, caracterizadas por as células-tronco adultasserem cultivadas em um estado não diferenciado por pelo menos 16 divisões.
7. Células-tronco adultas, de acordo comreivindicação 5, caracterizadas por células derivadas damesoderme serem selecionadas a partir do grupo constituídopor: células de cartilagem, células osteogênicas, célulasnervosas, astrócitos, células de gordura e células-β dopâncreas que liberam insulina.
8. Método para derivação de células-troncoadultas em células nervosas, caracterizado por compreender asetapas de:(a) pré-incubar as células-tronco adultas dequalquer uma das reivindicações entre as reivindicações de 5a 7, em um meio de DMEM contendo BME e FBS; e(b) o tratamento da sopa pré-incubada com DMSO e BHA, de modoa induzir a derivação em células nervosas.
9. Agente celular terapêutico para tratamentode doença dos nervos, caracterizado por conter célulasnervosas derivadas pelo método da reivindicação 8, comoingredientes ativos.
10. Método para derivar células-troncoadultas em células de cartilagem, caracterizado porcompreender a cultura de células-tronco adultas de qualqueruma das reivindicações entre as reivindicações de 5 a 7 em ummeio α-MEM contendo TFG-β 1, L-ascorbatos-2-fosfato einsulina.
11. Agente celular terapêutico paratratamento de osteoartrite, caracterizado por conter célulasde cartilagem derivadas pelo método da reivindicação 10, comoingredientes ativos.
12. Método para derivar células-troncoadultas em células osteogênicas, caracterizado porcompreender a etapa de misturar as células-tronco adultas, dequalquer uma das reivindicações entre as reivindicações de 5a 7, com tricálcico fosfato (TCP) e isotransplantar amistura.
13. Agente celular terapêutico para otratamento da deficiência óssea, caracterizado por contercélulas osteogênicas derivadas, pelo método da reivindicação 12, como ingredientes ativos.
14. Método para derivar células-troncoadultas em células de gordura, caracterizado por compreendera cultura de células-tronco adultas, de qualquer uma dasreivindicações entre as reivindicações de 5 a 7, em um meioα-MEM contendo dexametasona, indometacina, insulina e IBMX.
15. Agente celular terapêutico para formaçãode tecido de mama, caracterizado por conter células degordura derivadas pelo método da reivindicação 14, comoingredientes ativos.
16. Método para derivar células-troncoadultas em células-β do pâncreas que liberam insulina,caracterizado por compreender as etapas de:(a) cultura de células-tronco adultas dequalquer uma das reivindicações entre as reivindicações de 5a 7, em um meio de DMEM com baixa glicose contendonicotinamida, β - Mercaptoetanol e FBS, durante 12-72 horas;e(b) cultura de células cultivadas em um meioDMEM com alta glicose, contendo nicotinamida, β-mercaptoetanol e FBS, durante 4-7 dias.
17. Agente celular terapêutico para otratamento de diabetes, caracterizado por conter células-β dopâncreas que liberam insulina derivadas pelo método dareivindicação 16, como ingredientes ativos.
18. Agente celular terapêutico para otratamento da doença de nervos caracterizado por conter ascélulas-tronco adultas de qualquer uma das reivindicaçõesentre as reivindicações de 5 a 7, que tenham a capacidade dederivar-se em células nervosas, como ingredientes ativos.
19. Agente celular terapêutico para otratamento da diabetes caracterizado por conter células-tronco adultas de qualquer uma das reivindicações entre asreivindicações de 5 a 7, que têm a capacidade de derivar-seem células-β do pâncreas que liberam insulina, comoingredientes ativos.
20. Agente celular terapêutico para otratamento de osteoartrite caracterizado por conter ascélulas-tronco adultas de qualquer uma das reivindicaçõesentre as reivindicações de 5 a 7, que têm a capacidade dederivar-se em células de cartilagem, como ingredientesativos.
21. Agente celular terapêutico para otratamento de deficiência óssea caracterizado por conter ascélulas-tronco adultas de qualquer uma das reivindicaçõesentre as reivindicações de 5 a 7, que tenha a capacidade dederivar-se em células osteogênicas.
22. Agente celular terapêutico para formaçãode tecido de mama caracterizado por conter as células-troncoadultas de qualquer uma das reivindicações entre asreivindicações de 5 a 7, que tenha a capacidade de derivar-seem células de gordura, como ingredientes ativos.
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