DE602005003394T2

DE602005003394T2 - Verfahren zur Abtrennung und Inaktivierung von Virus- und Prionenkontaminationen

Info

Publication number: DE602005003394T2
Application number: DE602005003394T
Authority: DE
Inventors: Maurizio Dattilo
Original assignee: IBSA Institut Biochimique SA
Current assignee: IBSA Institut Biochimique SA
Priority date: 2004-05-04
Filing date: 2005-05-02
Publication date: 2008-09-25
Anticipated expiration: 2025-05-03
Also published as: JP4610409B2; JP2005319302A; EP1593688A1; EP1593688B1; US20050250935A1; ES2296077T3; ITMI20040891A1; CA2506334A1; DE602005003394D1

Description

TECHNISCHER BEREICH
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Kontamination von biologischen Materialien. Die Erfindung beschreibt ein neues Verfahren zur Dekontamination von Viren und/oder Prionen auf Grundlage der Prinzipien von Abtrennung und Inaktivierung.
STAND DER TECHNIK
Es ist wohl bekannt, dass Virus- oder Prionenkontaminationen ein bedeutendes Problem bei der Desinfektion von biologischen Materialien darstellen. Insbesondere, aber nicht ausschließlich, tritt dieses Problem in gewerblichen Downstream-Verfahren für die Reinigung von Zielmolekülen aus Blut, Urin oder Kulturmedien auf. Aufgrund der Empfindlichkeit der Zielmoleküle gegenüber chemischen und nicht chemischen Behandlungen ist die Verwendung von aggressiven Desinfektionsverfahren eigentlich nicht möglich, ohne das Zielmolekül selbst zu schädigen, oder zumindest nicht, ohne das Endprodukt des Verfahrens auf sehr niedrige Konzentrationen zu reduzieren. Insbesondere ist wohl bekannt, dass kleine nicht-behüllte Viren und infektiöse Prionproteine ein schwer lösbares Problem darstellen.
Im Fall von viralen Kontaminationen stehen mehrere Verfahren zur Verfügung, welche zur Sicherheit der Reinigungsverfahren beitragen können. Diese Verfahren werden typischerweise unterteilt in Inaktivierungs- oder Abtrennverfahren. Beispiele für virale Inaktivierungsverfahren sind Hitzebehandlungen (z. B. Pasteurisierung, Lyophilisation/trockene Hitze), Verwendung von Lösungsmitteln, die als Detergenzien wirken, sowie Behandlungen mit hohem oder niedrigem pH-Wert. Beispiele für virale Abtrennverfahren sind Präzipitationsverfahren (z. B. in Ethanol, Polyethylenglykol), Chromatographie (Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Hydrophobe Wechselwirkung, Reversed-Phase-Chromatographie) und Nanofiltration.
EP-A-0 530 173 zeigt die Behandlung einer biologischen Lösung, wobei Harnstoff zu der genannten Lösung hinzugegeben wird und eine somit 8 M Harnstoff enthaltende Zusammensetzung erhalten wird; der Harnstoff kann anschließend mithilfe von Chromatographieverfahren oder Diafiltration entfernt werden.
Es müssen geeignete Validierungsstudien durchgeführt werden, um zu belegen, dass die Dekontamination durch ein Reinigungsverfahren effektiv ist. Solche Studien bedingen, dass zu Beginn des Verfahrens zu dem Material eine bekannte Menge an infektiösem Agens (bekannt als „Spiking") zugegeben wird und dass am Ende des Verfahrens auf das Vorhandensein von verbleibenden Mengen des gleichen Agens geprüft wird. Die Menge an zugegebenem infektiösem Agens (gespiket) wird als Logarithmus zur Basis Zehn und die Effektivität der Reinigung mithilfe des Verfahrens wird als Zahl der Log-Reduktion für das Pathogen ausgedrückt. Zu regulatorischen Zwecken sollte ein Reinigungsverfahren idealerweise eine Wirksamkeit für die gesamte virale Dekontamination von mindestens 12–15 Logs zeigen. Die genannte Effektivität (gesamte Log-Reduktion) sollte auf Grundlage von mindestens drei verschiedenen Reinigungsschritten, welche auf unterschiedlichen Prinzipien beruhen, ermittelt werden. Allerdings ist es bei unterschiedlichen Reinigungsverfahren schwierig, solche Ergebnisse zu erhalten, aufgrund der eingeschränkten Anwendbarkeit der oben erwähnten Verfahren auf den gewerblichen Maßstab oder wegen ihrer Aggressivität gegenüber dem Zielmolekül.
Noch schwieriger ist es, eine Prionenkontamination zu eliminieren, da Prionenkontaminationen nicht so gut dokumentiert sind und in jüngster Zeit große Bedenken in Bezug auf Biosicherheit aufwarfen. Aufgrund ihrer chemischen Natur und ihrer geringen Größe können Prionen mit vielen Arten von Abtrennverfahren, welche für Viren effektiv sind, nicht erfasst werden und auch ihre Inaktivierung ist schwer zu erreichen. Kontakt zu stark alkalischen Lösungen und Harnstoff-induzierte Denaturierung gehören zu den Verfahren, die bekanntlich eine wesentliche Prioneninaktivierung induzieren. Solche Verfahren stellen sich allerdings oftmals als schädlich für die Zielmoleküle heraus und sind daher zur gewerblichen Anwendung nur bedingt verwendbar.
Es besteht daher ein beträchtlicher Bedarf an Verfahren, welche in gewerblichem Maßstab einfach zu implementieren sind. Die genannten Verfahren sollten dazu in der Lage sein, Lösungen, welche Viren und/oder Prionen enthalten, effektiv zu dekontaminieren und gleichzeitig die Aktivität der wertvollen Zielmoleküle zu bewahren.
DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Wir haben nun ein neues Verfahren für die Abtrennung und Inaktivierung von Virus- und Prionenkontaminationen erfunden, das auf Ultrazentrifugation des Testmaterials (Ausgangslösung) in einem Zentrifugenröhrchen basiert, welches eine hochmolekulare Harnstofflösung am Boden des Zentrifugenröhrchens enthält, wobei das Testmaterial über diese Schicht gegeben wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine dritte Lösung, die aus Polysacchariden besteht, als Puffer an der Grenzschicht zwischen den beiden Lösungen eingeschichtet. Im Anschluss an die Ultrazentrifugation bei einem gegebenen Wert g (Gravitationsbeschleunigung) und einem gegebenen Zeitraum werden die Kontaminationsteilchen am Boden des Röhrchens innerhalb der Harnstoffphase sedimentiert, in welcher es zur Inaktivierung kommt. Das Testmaterial, das frei von kontaminierenden Agenzien ist, kann dann selektiv als Überstand gewonnen werden oder entsprechend den Anforderungen möglicherweise mit den anderen beiden Schichten gemischt werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für die Abtrennung und Inaktivierung von Prionen und/oder Viren, welche eine Ausgangslösung kontaminieren. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass Ultrazentrifugation als Abtrennverfahren und hochmolekularer Harnstoff, der am Boden des Zentrifugenröhrchens eingeschichtet ist, als Inaktivierungskomponente verwendet werden.
Der Begriff „Abtrennung" bezieht sich auf die Trennung des biologischen Ausgangsmaterials (z. B. die Lösung) in zwei Unterfraktionen, in welchen zwei Bestandteile, die im Ausgangsmaterial zusammengemischt wurden, selektiv getrennt werden (in unserem Fall das Zielprotein auf der einen Seite und die Viren/Prionen auf der anderen Seite). Der Begriff „Inaktivierung" bezieht sich auf Reduktion oder Elimination der Infektionsfähigkeit von Viren und Prionen.
Kurz zusammengefasst bezieht sich das Verfahren auf die Herstellung eines flüssigen aus Schichten bestehenden Systems in einem Zentrifugenröhrchen, wobei die hochmolekulare Harnstofflösung die Bodenschicht und die Ausgangslösung die Oberschicht darstellen. Bei der Zentrifugation treten die kontaminierenden Agenzien aus der Ausgangslösung aus und sedimentieren in der unteren Harnstoffphase, in welcher die Inaktivierung stattfindet. Die Ausgangslösung, die auf diese Weise dekontaminiert wurde, kann dann separiert und nach Bedarf verwendet werden.
Ein charakteristisches Merkmal dieses Verfahrens ist, dass es gleichzeitig sowohl Abtrennung als auch Inaktivierung von Viren- und/oder Prionenkontaminationen ermöglicht. Die üblicherweise verwendeten Reinigungsschritte können entweder Abtrennung oder Inaktivierung bewirken, aber nicht beide Ergebnisse erzielen. Die Abtrennung allein gewährleistet noch keine vollständige Desinfektion, da sehr kleine Mengen von kontaminierendem Agens immer noch eine Krankheit hervorrufen können. Die Inaktivierung allein ist nicht ausreichend, da der Vorgang im Allgemeinen unvollständig ist und weil die immunogenen Epitope des kontaminierenden Agens, welche gesundheitsschädlich sein können, persistieren. Das neue Verfahren, das hier vorgestellt wird, bietet sowohl Abtrennung als auch Inaktivierung mithilfe eines einfach anzuwendenden Verfahrens. Obwohl das Szenario nur bei gleichzeitiger Abtrennung und Inaktivierung am erfolgreichsten ist, so ist die Erfindung jedoch auch wertvoll im Fall von Materialien/Kontaminationen, welche nur abgetrennt werden können.
Ein weiterer wichtiger Aspekt ist der minimale Kontakt oder das Ausbleiben eines jeden Kontakts zwischen Molekülen von gewerblichem Interesse, welche möglicherweise in der Ausgangslösung (hierin definiert als „Zielmoleküle") enthalten sind, und der Harnstofflösung mit hoher Denaturierungsstärke. Dieses Merkmal ermöglicht es, die kontaminierenden Agenzien einer aggressiven Behandlung zu unterziehen, ohne dabei die Aktivität der Zielmoleküle, die in der Ausgangslösung vorliegen, zu beeinträchtigen.
Bei der Ausgangslösung, die einer Dekontamination unterzogen wird, handelt es sich typischerweise, aber nicht ausschließlich, um eine biologische Flüssigkeit humanen Ursprungs, wie beispielsweise Blut, Serum, Urin oder um eine andere physiologische Flüssigkeit. Diese Lösung kann Zielmoleküle enthalten, die während des Dekontaminationsverfahrens erhalten bleiben müssen. Die Zielmoleküle können pharmakologisch aktive Substanzen sein, zum Beispiel Proteine (Enzyme, Cytokine, Hormone). Ein Beispiel für ein Zielhormon ist FSH, welches in hoher Konzentration in Urin postmenopausaler Frauen enthalten ist. Das vorliegende Verfahren kann dazu verwendet werden, aus Urin und Produkten von Downstream-Reinigungsverfahren, Viren/Prionen, die von einem Spender stammen, zu entfernen und somit FSH oder andere Zielmoleküle in einer reinen nicht kontaminierten Form wiederzugewinnen.
Dieses Verfahren ist nicht auf medizinische Anwendungen oder Reinigungen von natürlichen Produkten beschränkt. Auch Zwischenprodukte oder Endprodukte aus gewerblichen Reinigungsverfahren von verschiedenen Substraten oder Abfallprodukte aus chemischen Syntheseverfahren oder Fermentationsverfahren usw. können die Ausgangslösung darstellen. Darüber hinaus ist das Verfahren nicht auf Desinfektion von Proben beschränkt, die ursprünglich in flüssiger Form vorliegen, sondern umfasst die Behandlung aller festen Materialien unter der Voraussetzung, dass diese gut in einem flüssigen, typischerweise in einem wässrigen Träger gut löslich sind. Die entstehende Lösung wird als Ausgangslösung in dem hierin beschriebenen Verfahren verwendet; das feste Material kann anschließend aus der dekontaminierten Lösung durch Entfernen des Lösungsmittels mithilfe von Techniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, wiedergewonnen werden. Im Allgemeinen können alle flüssigen Proben, welche mit Viren oder Prionen belastet sind, mithilfe der vorliegenden Erfindung effektiv dekontaminiert werden.
Bei der hochmolekularen Harnstofflösung handelt es sich um eine Lösung mit einer Harnstoffkonzentration, die im Wesentlichen im Bereich von 4 M bis 12 M, vorzugsweise im Bereich von 6 M bis 10 M und idealerweise bei 8 M liegt. Die genannten Lösungen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine hohe Inaktivierungskraft gegenüber Viren und Prionen besitzen. Gleichzeitig haben diese Lösungen aufgrund ihrer hohen Molarität eine höhere Dichte im Vergleich zur Ausgangslösung, sodass sie eine schwerere flüssige Phase, die von der Ausgangsphase getrennt ist, bilden, und welche am Boden des Teströhrchens vorgelegt werden kann. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von anderen dekontaminierenden Substanzen als Harnstoff, welche für Dichtewerte und Inaktivierungskräfte sorgen können, die denjenigen der zuvor erwähnten Harnstofflösungen entsprechen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das vorliegende Verfahren die Verwendung einer dritten Lösung („Pufferlösung") mit einer intermediären Dichte, die zwischen der Dichte der Ausgangslösung und der Dichte der Harnstofflösung liegt, und welche als eine flüssige Zwischenphase zwischen den beiden Lösungen positioniert ist. Die genannte Pufferlösung mit intermediärer Dichte enthält inerte Substanzen, wie zum Beispiel Saccharide, Salze, Bestandteile physiologischer Lösung, Puffer usw. und ist vorzugsweise durch einen neutralen oder physiologischen pH-Wert gekennzeichnet. Die Rolle der löslichen Stoffe in der Zwischenlösung besteht im Wesentlichen darin, die Dichte zu regulieren und somit intermediäre Dichtewerte bereitzustellen. Hilfreiche Referenzdichtewerte der Pufferlösung gehören in einen Bereich zwischen 1,0 und 1,32 g/ml, ohne dabei auf diesen beschränkt zu sein. Der Begriff „inert" bezieht sich auf diejenigen löslichen Stoffe, die mit der Ausgangslösung kompatibel sind, d. h. die keine unerwünschten Effekte (Denaturierung, Inaktivierung, Präzipitation usw.) auf die wertvollen Substanzen, die in einer solchen Lösung vorkommen, ausüben. Bei den genannten inerten von Saccharid abgeleiten löslichen Stoffen kann es sich um Monosaccharide, Disaccharide, Oligosaccharide und Polysaccharide handeln. Ein besonders bevorzugter löslicher Stoff ist Saccharose, wobei diese zum Beispiel als Lösung in 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4 mit einem Dichtebereich von 1,0 bis 1,32 g/ml verwendet werden kann. Die genannte Lösung übt keine unerwünschten Effekte auf die Proteine aus, die in der Ausgangslösung enthalten sind, und behindert auch nicht die Teilchensedimentation. Darüber hinaus hat Saccharose den Vorteil, dass sie rasch wasserlöslich ist. Schließlich ist sie kostengünstig und leicht erhältlich, weshalb sie sich für Verfahren in großem Maßstab eignet. In den Beispielen wurde eine Saccharosekonzentration von 10 Gramm-Vol.% verwendet; für unterschiedliche Testmaterialien können jedoch alternative Saccharosekonzentrationen verwendet werden.
In Gegenwart der Pufferlösung besteht das flüssige System, das einer Zentrifugation unterzogen wird, aus drei Schichten, wobei sich die Harnstofflösung am Boden des Röhrchens befindet, die Pufferlösung als Zwischenschicht dient und die Ausgangslösung die obere Schicht darstellt. Nach der Zentrifugation wird die obere Schicht, welche die Ausgangslösung enthält, zusammen mit einem Teil der dazwischen liegenden Schicht („obere Probe") wiedergewonnen, während der Rest der Zwischenschicht zusammen mit der Harnstoffschicht die „untere Probe" bilden. In einer bevorzugten Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens besteht die untere Probe aus der Harnstoffschicht und den unteren zwei Drittel der Zwischenschicht (z. B. Saccharose); umgekehrt besteht die obere Probe aus der Ausgangslösung und dem oberen Drittel der Zwischenschicht (z. B. Saccharose).
Die Verwendung einer Pufferlösung bietet mehrere Vorteile. Die Pufferlösung beseitigt das Risiko einer teilweisen Inaktivierung von Zielmolekülen, die an der Grenzschicht zur Harnstofflösung (welche eine erhöhte Denaturierungsaktivität besitzt) vorliegen, indem sie eine Barriere zwischen der Ausgangslösung und der Harnstoffphase bildet. Am Ende des Verfahrens wird das Risiko einer neuen Kontamination, welche möglicherweise durch Rückfließen oder Mobilisation des Pellets, das sich am Boden des Röhrchens gebildet hat, hervorgerufen werden kann, durch die Pufferlösung gesenkt. Schließlich wird es durch die Pufferlösung am Ende des Verfahrens möglich, die Ausgangslösung einfach und quantitativ durch Absaugen zurückzugewinnen, wodurch die Entnahme von einem Teil der Harnstoffphase verhindert wird. Das Absaugen von einem Teil der Zwischenschicht zusammen mit der Ausgangslösung führt weder zu toxikologischen Problemen noch werden wertvolle Bestandteile der Lösung inaktiviert; das Absaugen erlaubt die Wiedergewinnung von Fraktionen von Zielmolekülen, die möglicherweise während der Verfahrenslaufzeit in die darunter liegende Saccharoseschicht diffundiert sind.
Für das vorliegende Verfahren werden gemeinhin übliche Ultrazentrifugen verwendet. Es werden hierzu keine besonderen Merkmale in Bezug auf die Ultrazentrifugenvorrichtung oder die Zentrifugenröhrchen benötigt. Die Zentrifugationsbedingungen liegen im Allgemeinen im Bereich von 50.000 bis 500.000 g (Gravitationsbeschleunigungen) für einen Zeitraum zwischen 0,5 und 10 Stunden, bevorzugter zwischen 1 und 6 Stunden bei einer Temperatur im Bereich von 2 bis 8°C. Im Vergleich zum Endvolumen des flüssigen Systems besteht die Ausgangslösung vorzugsweise aus ungefähr 70 Vol.%, die Harnstofflösung besteht aus ungefähr 15 Vol.% und die Pufferlösung aus ungefähr 15 Vol.%.
Das hierin beanspruchte Verfahren umfasst Ultrazentrifugation in jedem beliebigen Maßstab, ausgehend vom Labormaßstab bis hin zum gewerblichen Maßstab. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst auch die Verwendung von Vorrichtungen, welche durch unterschiedliche Strukturen gekennzeichnet sein können, aber funktionell denjenigen der Ultrazentrifuge und dem Zentrifugenröhrchen entsprechen.
Das hierin beschriebene Verfahren ist breit anwendbar für die Abtrennung und Inaktivierung von Viren- und Prionenbestandteilen. Zu den Viren, die erfindungsgemäß abgetrennt/inaktiviert werden können, zählen DNA-Viren, RNA-Viren, Retroviren usw., ohne dabei auf diese beschränkt zu sein. Ein Beispiel für ein Retrovirus ist das humane Immundefizienzvirus (HIV); Beispiele für behüllte RNA-Viren sind das Virus der bovinen viralen Diarrhö (BVDV) oder das Hepatitis C-Virus (HCV); ein Beispiel für ein nicht-behülltes DNA-Virus ist das Minute Virus of Mice (MVM); ein Beispiel für ein nicht-behülltes RNA-Virus ist das Hepatitis A-Virus (HAV). Ein Beispiel für ein Prion ist das Scrapie-Prionprotein (PrP^Sc) 236K vom Hamster.
Die Erfindung wird hierin durch die nachfolgenden Beispiele, ohne dabei auf diese beschränkt zu sein, erläutert.
EXPERIMENTELLER TEIL
Materialien und Verfahren
1. Wahl der Ausgangslösung
Die Ausgangslösung wurde so ausgewählt, dass sie repräsentativ für das Endprodukt eines Reinigungsverfahrens aus einer biologische Probe ist, welche eine potenzielle Virus- oder Prionenkontamination enthält. Des Weiteren sollte die Ausgangslösung geeignete Mengen des Zielmoleküls enthalten.
Daher haben wir das Endprodukt eines Reinigungsverfahrens von Urin postmenopausaler Frauen gewählt, in welchem humanes Follikel-stimulierendes Hormon (FSH) stark angereichert vorliegt. FSH ist ein komplexes heterodimerisches Glykoprotein, dessen Struktur und Funktion durch aggressive Downstream-Behandlungen leicht beschädigt werden kann. Es wurde daher als das repräsentativste Beispiel ausgewählt.
Insbesondere haben wir eine Reinigungscharge von Urin postmenopausaler Frauen verwendet, welche eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml und eine geschätzte FSH-Aktivität von 6578 IE pro mg Protein enthielt, wie mithilfe eines biologischen Assays in vivo in Ratten bestimmt wurde, sowie eine geschätzte FSH-Aktivität von 5893 IE pro mg Protein, wie mithilfe von EIA bestimmt wurde. Der biologische Assay in der Ratte wurde, wie in der Europäischen Pharmacopoeia beschrieben, durchgeführt.
Um die Dekontaminationseffizienz des Verfahrens zu testen, wurden bekannte Mengen von infektiösen Agenzien, welche entsprechend für den Test ausgewählt wurden, in einem Verfahren, das als „Spiking" bekannt ist, zu diesem Material hinzugegeben.
2. Herstellung der Pufferlösung
Als Pufferlösung haben wir eine Lösung von Saccharose in 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4 verwendet. In den folgenden Beispielen betrug die Saccharoselösung 10 Gramm-Vol.%.
3.3 Herstellung der Harnstofflösung
Wir haben eine 8 M Harnstofflösung hergestellt und verwendet.
4.4 Vorbereitung des Zentrifugenröhrchens
7,0 ml Ausgangslösung, zu welchen bekannte Mengen an infektiösem Agens zugegeben (Spiking) wurden, wurden in ein Zentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 12,0 ml gegeben. Die Pufferlösung (1,5 ml) wurde dann am Boden des Röhrchens mithilfe einer Glaskapillare, die an eine Peristaltikpumpe angeschlossen und welche vollständig in der oben erwähnten Lösung eingetaucht war, eingeschichtet. Schließlich wurden 1,5 ml 8 M Harnstofflösung am Boden des Röhrchens mit dem gleichen Verfahren eingeschichtet.
5. Zentrifugationsbedingungen
In den folgenden Beispielen haben wir eine feste Beschleunigung von 250.000 × g für 4 Stunden bei 4°C verwendet. Es wird angenommen, dass alle infektiösen Teilchen bei dieser Kombination von Beschleunigung und Zeit vollständig pelletiert werden. Deshalb wurden diese Bedingungen angewandt, um die Stabilität der Phasen während der Zentrifugation und ihrer Wiedergewinnung zu testen. Die Phasen blieben, wie erforderlich, bis zum Ende aller Experimente voneinander getrennt.
Verwendet haben wir einen Sorvall TH 641 Swinging Bucket Rotor (Ausschwingrotor) mit 12,0-ml-Polyethylenröhrchen.
6. Verfahren zur Inaktivierung und Wiedergewinnung der Testprobe
Am Ende des Zyklus haben wir durch Absaugen die oberen 7,5 ml, die der Phase, welche die Testprobe enthielt, entsprachen, sowie 0,5 ml der Saccharosephase (obere Probe) abgenommen. Das Pellet wurde in den verbleibenden 2,5 ml resuspendiert, indem es mithilfe einer 2,0-ml-Kunststoffpipette aufgezogen und wieder abgegeben wurde, und dann separat entnommen (untere Probe) wurde. Aufgrund der Toxizität von hochmolekularem Harnstoff wurde die untere Probe für Zellinfektionsassays des Weiteren wie folgt behandelt. Die 2,5-ml-Probe wurde 1:10 mit Gewebekulturmedium bis auf ein Endvolumen von 25 ml verdünnt. Diese wurde dann für 20 Minuten bei 500.000 × g ultrazentrifugiert. Zum Schluss wurde das Pellet in 2,5 ml Gewebekulturmedium resuspendiert.
7. Bewertung der Aktivität des Zielmoleküls vor und nach dem Verfahren
Um den Erhalt des Zielmoleküls nach der Zentrifugation unter den oben erwähnten Bedingungen sicherzustellen, wurde ein nicht-gespiketes Röhrchen (d. h. ohne Zugabe von infektiösem Agens, wodurch FSH-Tests nicht möglich oder nicht zuverlässig gewesen wären), in welchem eine FSH-Kontrollprobe enthalten war, vorbereitet, wie für das gespikete Röhrchen beschrieben. Nach der Zentrifugation wurden die obere und untere Probe aus dem nicht-gespiketen Teströhrchen auf FSH-Aktivität mithilfe eines In-vivo-Tests in Ratten und mithilfe von EIA getestet. Es stellte sich heraus, dass sich die FSH-Aktivität in der oberen Probe (97% und 104% für den In-vivo-Test beziehungsweise den EIA-Test) nicht veränderte, während sie in der unteren Probe nicht nachweisbar war.
8.8. Auswahl der Testviren und des Prions
Die folgenden Viren wurden ausgewählt und getestet:
Das Humane Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) wurde als ein Beispiel für ein Retrovirus gewählt.
Das Virus der bovinen viralen Diarrhö (BVDV), ein Modellvirus für das humane Hepatitis C-Virus, wurde als ein Beispiel für ein behülltes RNA-Virus gewählt.
Das Minute Virus of Mice (MVM), ein Modellvirus für Parvovirus B19, wurde als ein Beispiel für ein nicht-behülltes DNA-Virus gewählt.
Das Hepatitis A-Virus (HAV) wurde als ein Beispiel für ein nicht-behülltes RNA-Virus gewählt. Darüber hinaus wurde das Scrapie-Prionprotein (PrP^Sc) 236K vom Hamster als repräsentativ für pathogene Prionproteine gewählt.
Beispiel 1: Abtrennung/Inaktivierung von HIV-1
Wir haben eine HIV-1-Stammlösung, LAI-Stamm, verwendet mit einem Titer von 2,63·10⁸ TCID₅₀/ml (Gewebekultur-Infektionsdosis 50% pro Milliliter), wie mithilfe eines quantitativen Assays mit MT4-Zellen bestimmt wurde. Ein Aliquot von 0,4 ml der Virusstammlösung wurde zu 19,6 ml FSH-Lösung hinzugegeben, wodurch sich ein Gesamtvolumen von 20 ml und ein theoretischer Infektionstiter von 5,26·10⁶ ergab. Der effektive Virustiter der gespiketen Lösung wurde anhand eines quantitativen Assays mit MT4-Zellen bestimmt und ergab 4,67·10⁶ TCID₅₀/ml. Ein Aliquot von 7,0 ml der gespiketen Lösung wurde in ein Zentrifugenröhrchen eingebracht und mit 1,5 ml 10 Gramm-Vol.%iger Saccharose in 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4 und mit 1,5 ml 8 M Harnstoff unterschichtet, wie zuvor beschrieben (Teströhrchen).
Ein zweites Röhrchen wurde auf die gleiche Weise vorbereitet und als nicht zentrifugierte Kontrolle (Kontrollröhrchen) verwendet.
Das Teströhrchen wurde bei 250.000 × g für 4 Stunden bei 4°C zentrifugiert und dann die obere und untere Probe abgenommen und entsprechend den zuvor beschriebenen Bedingungen und Verfahren behandelt. Die obere und untere Probe wurden auf gleiche Weise von dem Kontrollröhrchen abgenommen.
Die obere und untere Probe, die sowohl von dem Teströhrchen als auch dem Kontrollröhrchen abgenommen wurden, wurden auf virale Infektiosität getestet.
Ergebnisse vom quantitativen Assay mit MT4 Zellen: Nach der Zentrifugation lag der Virustiter, der im Teströhrchen gefunden wurde, sowohl für die obere als auch die untere Probe unter der Nachweisgrenze, was darauf hindeutet, dass in der unteren Probe komplette Abtrennung und Inaktivierung erreicht wurden. Es wurde berechnet, dass die resultierende Log-Reduktion für Abtrennung und Inaktivierung 4,98 Logs beziehungsweise 5,46 Logs betrug.
In dem Kontrollröhrchen verblieb die gesamte virale Aktivität innerhalb der oberen Probe, während eine nur geringe Infektiosität in der unteren Probe nachgewiesen wurde, möglicherweise aufgrund minimaler Diffusion des Virus in der Saccharosephase während der 4-stündigen Inkubationszeit.
Tabelle 1 zeigt eine Zusammenfassung der Ergebnisse, die in Beispiel 1 gewonnen wurden.
Beispiel 2, Abtrennung/Inaktivierung von BVDV
Wir haben eine BVDV-Stammlösung, Stamm NADL (ATCC VR-534), verwendet mit einem Titer von 1,53·10⁷ Plaque bildenden Einheiten (PFU = Plaque Forming Unit) pro ml, wie mithilfe von Agarose-Plaque-Assay auf MDBK Zellen bestimmt wurde. Ein Aliquot von 0,2 ml Virusstammlösung wurde zu 19,8 ml FSH-Lösung hinzugegeben, wodurch sich ein Gesamtvolumen von 20 ml und ein theoretischer Infektionstiter von 1,53·10⁵ ergab. Der effektive Virustiter der gespiketen Lösung wurde mit Agarose-Plaque-Assay mit MDBK Zellen bestimmt und mit 2,3·10⁵ PFU/ml ermittelt.
Ein Aliquot von 7,0 ml der gespiketen Lösung wurde in ein Zentrifugenröhrchen eingebracht und mit 1,5 ml einer 10 Gramm-Vol.%igen Saccharoselösung in 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, und mit 1,5 ml 8 M Harnstoff unterschichtet, wie zuvor beschrieben (Teströhrchen).
Auf die gleiche Weise wurde ein zweites Röhrchen vorbereitet und als nicht zentrifugierte Kontrolle (Kontrollröhrchen) verwendet.
Das Teströhrchen wurde bei 250.000 × g für 4 Stunden bei 4°C zentrifugiert und dann die obere und untere Probe abgenommen und entsprechend den zuvor beschriebenen Bedingungen und Verfahren behandelt. Die obere und untere Probe wurden auf gleiche Weise von dem Kontrollröhrchen abgenommen.
Die obere und untere Probe, die sowohl von dem Teströhrchen als auch dem Kontrollröhrchen abgenommen wurden, wurden auf virale Infektiosität getestet.
Ergebnisse vom Agarose-Plaque-Assay mit MDBK Zellen: Nach der Zentrifugation lag der Virustiter, der in der oberen Probe des Teströhrchens gefunden wurde, unter der Nachweisgrenze, was darauf hindeutet, dass in der unteren Probe komplette Abtrennung und Inaktivierung erreicht wurden. Die Gesamtinfektiosität, die in der unteren Probe des Teströhrchens wiedergefunden wurde, lag beträchtlich unterhalb der Menge, die eingebracht wurde, was darauf hindeutet, dass eine bedeutende Inaktivierung stattfand. Es wurde berechnet, dass die resultierende Log-Reduktion für Abtrennung und Inaktivierung 5,08 Logs beziehungsweise 3,18 Logs betrug.
In dem Kontrollröhrchen verblieb die gesamte virale Aktivität innerhalb der oberen Probe, während eine nur geringe Infektiosität in der unteren Probe nachgewiesen wurde, möglicherweise aufgrund minimaler Diffusion des Virus in der Saccharosephase während der 4-stündigen Inkubationszeit.
Tabelle 2 zeigt eine Zusammenfassung der Ergebnisse, die in Beispiel 2 gewonnen wurden.
Beispiel 3, Abtrennung/Inaktivierung von MVM
Wir haben eine Stammlösung von MVM, Prototyp-Stamm, verwendet mit einem Titer von 3,27·10⁹ Plaque bildenden Einheiten (PFU) pro ml, wie mithilfe von Agarose-Plaque-Asssay mit A9 Zelle bestimmt wurde. Ein Aliquot von 19,8 ml FSH-Lösung wurde mit 0,2 ml Virusstammlösung gespiket, wodurch sich ein Gesamtvolumen von 20 ml und ein theoretischer Infektionstiter von 3,27·10⁷ ergab. Der effektive Virustiter der gespiketen Lösung wurde mit Agarose-Plaque-Assay mit A9 Zellen bestimmt und mit 5,75·10⁷ PFU/ml ermittelt.
Ein Aliquot von 7,0 ml der gespiketen Lösung wurde in ein Zentrifugenröhrchen eingebracht und mit 1,5 ml einer 10 Gramm-Vol.%igen Saccharoselösung in 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, und mit 1,5 ml 8 M Harnstoff unterschichtet, wie zuvor beschrieben (Teströhrchen).
Auf die gleiche Weise wurde ein zweites Röhrchen vorbereitet und als nicht zentrifugierte Kontrolle (Kontrollröhrchen) verwendet.
Das Teströhrchen wurde bei 250.000 × g für 4 Stunden bei 4°C zentrifugiert und dann die obere und untere Probe abgenommen und entsprechend den zuvor beschriebenen Bedingungen und Verfahren behandelt. Die obere und untere Probe wurden auf gleiche Weise von dem Kontrollröhrchen abgenommen.
Die obere und untere Probe, die sowohl von dem Teströhrchen als auch dem Kontrollröhrchen abgenommen wurden, wurden auf virale Infektiosität getestet.
Ergebnisse vom Agarose-Plaque-Assay mit A9 Zellen: Nach der Zentrifugation lag der Virustiter, der in der oberen Probe des Teströhrchens gefunden wurde, unter der Nachweisgrenze, was darauf hindeutet, dass in der unteren Probe komplette Abtrennung und Inaktivierung erreicht wurden. Die Gesamtinfektiosität, die in der unteren Probe des Teströhrchens wiedergefunden wurde, lag beträchtlich unterhalb der Menge, die eingebracht wurde, was darauf hindeutet, dass ein hohes Maß an Inaktivierung stattfand. Es wurde berechnet, dass die resultierende Log-Reduktion für Abtrennung und Inaktivierung 7,05 Logs beziehungsweise 6,02 Logs betrug.
In dem Kontrollröhrchen verblieb die gesamte virale Aktivität innerhalb der oberen Probe, während eine nur geringe Infektiosität in der unteren Probe nachgewiesen wurde, möglicherweise aufgrund minimaler Diffusion des Virus in der Saccharosephase während der 4-stündigen Inkubationszeit.
Tabelle 3 zeigt eine Zusammenfassung der Ergebnisse, die in Beispiel 3 gewonnen wurden.
Beispiel 4, Abtrennung/Inaktivierung von HAV
Wir haben eine Stammlösung von HAV, HM-Stamm, verwendet mit einem Titer von 2,7·10⁹ Plaque bildenden Einheiten (PFU) pro ml, wie mithilfe von Agarose-Plaque-Asssay mit Frhk-4 Zellen bestimmt wurde. Ein Aliquot von 19,8 ml FSH-Lösung wurde mit 0,2 ml Virusstammlösung gespiket, wodurch sich ein Gesamtvolumen von 20 ml und ein theoretischer Infektionstiter von 2,7·10⁷ ergab. Der effektive Virustiter der gespiketen Lösung wurde mit Agarose-Plaque-Assay mit Frhk-4 Zellen bestimmt und mit 3,82·10⁷ PFU/ml ermittelt.
Ein Aliquot von 7,0 ml der gespiketen Lösung wurde in ein Zentrifugenröhrchen eingebracht und mit 1,5 ml einer 10 Gramm-Vol.%igen Saccharoselösung in 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, und mit 1,5 ml 8 M Harnstoff unterschichtet, wie zuvor beschrieben (Teströhrchen).
Auf die gleiche Weise wurde ein zweites Röhrchen vorbereitet und als nicht zentrifugierte Kontrolle (Kontrollröhrchen) verwendet.
Das Teströhrchen wurde bei 250.000 × g für 4 Stunden bei 4°C zentrifugiert und dann die obere und untere Probe abgenommen und entsprechend den zuvor beschriebenen Bedingungen und Verfahren behandelt. Die obere und untere Probe wurden auf gleiche Weise von dem Kontrollröhrchen abgenommen.
Die obere und untere Probe, die sowohl von dem Teströhrchen als auch dem Kontrollröhrchen abgenommen wurden, wurden auf virale Infektiosität getestet.
Ergebnisse vom Agarose-Plaque-Assay mit Frhk-4 Zellen: Nach der Zentrifugation lag der Virustiter, der in der oberen Probe des Teströhrchens gefunden wurde, unter der Nachweisgrenze, was darauf hindeutet, dass in der unteren Probe komplette Abtrennung und Inaktivierung erreicht wurden. Die Gesamtinfektiosität, die in der unteren Probe wiedergefunden wurde, deutet darauf hin, dass eine Inaktivierung stattfand, obwohl das Ausmaß der Inaktivierung beträchtlich niedriger war als in den vorhergehenden Proben. Es wurde berechnet, dass die resultierende Log-Reduktion für Abtrennung und Inaktivierung 6,88 Logs beziehungsweise 1,49 Logs betrug.
In dem Kontrollröhrchen verblieb die gesamte virale Aktivität innerhalb der oberen Probe, während eine nur geringe Infektiosität in der unteren Probe nachgewiesen wurde, möglicherweise aufgrund minimaler Diffusion des Virus in der Saccharosephase während der 4-stündigen Inkubationszeit.
Tabelle 4 zeigt eine Zusammenfassung der Ergebnisse, die in Beispiel 4 gewonnen wurden.
Beispiel 5, Abtrennung/Inaktivierung von PrP^Sc
Es wurde ein 10%iges Scrapie-Hirn-Homogenat (SBH) unter Verwendung von Gehirnen von Hamster, die mit dem für Hamster adaptierten Agens 236K infiziert waren, hergestellt und, wie von Lee D. C. et al. (Journal of Virological Methods 2000; 84: 77–89) beschrieben, behandelt. Eine 20-ml-Testlösung wurde mit SBH bis auf 1% gespiket.
Eine Referenz-Verdünnungsreihe wurde hergestellt durch Verdünnen der gespiketen Lösung in BSA in Schritten von 0,5 Log.
Ein Aliquot von 7,0 ml der gespiketen Lösung wurde in ein Zentrifugenröhrchen eingebracht und mit 1,5 ml einer 10 Gramm-Vol.%igen Saccharoselösung in 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, und mit 1,5 ml 8 M Harnstoff unterschichtet, wie zuvor beschrieben (Teströhrchen).
Auf die gleiche Weise wurde ein zweites Röhrchen vorbereitet und als nicht zentrifugierte Kontrolle (Kontrollröhrchen) verwendet.
Das Teströhrchen wurde bei 250.000 × g für 4 Stunden bei 4°C zentrifugiert und dann die obere und untere Probe abgenommen und entsprechend den zuvor beschriebenen Bedingungen und Verfahren behandelt. Die obere und untere Probe wurden auf gleiche Weise von dem Kontrollröhrchen abgenommen.
Die obere und untere Probe von Teströhrchen und Kontrollröhrchen wurden mithilfe von Western Blotting (WB) auf das Vorhandensein von PrP^Sc getestet, gemäß Lee D. C. et al. (Journal of Virological Methods 2000; 84: 77–89).
Ergebnisse vom Western Blotting Assay: Der WB Assay mit Referenzverdünnungen ergab eine sichtbare PrP-Bande in dem Verdünnungsbereich zwischen 0 und 4,5 Log.
Sowohl die obere Probe als auch die untere Probe des Teströhrchens wurden mit dem WB bei jeder eingesetzten Verdünnung negativ getestet. Die obere Probe des Kontrollröhrchens wurde mit dem WB über den gesamten Verdünnungsbereich positiv getestet. Die untere Probe des Kontrollröhrchens wurde mit dem WB positiv bis zu einer Verdünnung von 1,0 Log getestet, möglicherweise aufgrund der Diffusion von PrP^Sc in der Saccharosephase während der 4-stündigen Inkubationszeit.

Kurz zusammengefasst wurde eine vollständige Abtrennung bis zur Nachweisgrenze des Verfahrens beobachtet, was einer Reduktion von 4,5 Log an infektiöser Ladung entspricht. Da selbst in der unteren Probe des Teströhrchens keine WB-Reaktivität nachgewiesen wurde, kam es gleichermaßen zu einer vollständigen Inaktivierung bis zur Nachweisgrenze, was einer Reduktion von 4,5 Log an infektiöser Ladung entspricht. Tabelle 1 – Ergebnisse aus Beispiel 1, HIV-1

Probe		Volumen	Quantitativer Assay mit MT4 Zellen
Probe		Volumen	TCID₅₀/ml	Gesamt TCID₅₀	Gesamt Log	Log Reduktion
A	Ausgangsprobe	7 ml	4,67·10⁶	3,27·10⁷	7,51
B	Teströhrchen obere Probe	7,5 ml	≤ 45	≤ 3,37·10²	2,53	4,98 (Log A – Log B)
C	Teströhrchen untere Probe	2,5 ml	≤ 45	1,12·10²	2,05	5,46 (Log A – Log C)
D	Kontrollröhrchen obere Probe	7,5 ml	4,21·10⁶	2,95·10⁷	7,47	0,04 (Log A – Log D)
E	Kontrollröhrchen untere Probe	2,5 ml	3,41·10³	8,53·10³	3,93

Tabelle 2 – Ergebnisse aus Beispiel 2, BVDV

Probe		Volumen	Agarose-Plaque-Assay mit MDBK Zellen
Probe		Volumen	PFU/ml	Gesamt PFU	Gesamt Log	Log Reduktion
A	Ausgangsprobe	7 ml	2,3·10⁵	1,61·10⁶	6,21
B	Teströhrchen obere Probe	7,5 ml	≤ 1,8	≤ 13,5	1,13	5,08 (Log A – Log B)
C	Teströhrchen untere Probe	2,5 ml	4,27·10²	1,06·10³	3,03	3,18 (Log A – Log C)
D	Kontrollröhrchen obere Probe	7,5 ml	1,75·10⁵	1,31·10⁶	6,12	0,09 (Log A – Log D)
E	Kontrollröhrchen untere Probe	2,5 ml	7,42·10³	1,85·10⁴	4,27

Tabelle 3 – Ergebnisse aus Beispiel 3, MVM

Probe		Volumen	Agarose-Plaque-Assay mit A9 Zellen
Probe		Volumen	PFU/ml	Gesamt PFU	Gesamt Log	Log Reduktion
A	Ausgangsprobe	7 ml	5,75·10⁷	4,02·10⁸	8,6
B	Teströhrchen obere Probe	7,5 ml	≤ 4,8	36	1,55	7,05 (Log A – Log B)
C	Teströhrchen untere Probe	2,5 ml	1,53·10²	3,83·10²	2,58	6,02 (Log A – Log C)
D	Kontrollröhrchen obere Probe	7,5 ml	4,81·10⁷	3.6·10⁸	8,56	0,04 (Log A – Log D)
E	Kontrollröhrchen untere Probe	2,5 ml	1,07·10²	2,68·10²	2,43

Tabelle 4 – Ergebnisse aus Beispiel 4, HAV

Probe		Volumen	Agarose-Plaque-Assay mit Frhk-4 Zellen
Probe		Volumen	PFU/ml	Gesamt PFU	Gesamt Log	Log Reduktion
A	Ausgangsprobe	7 ml	3,82·10⁷	2,67·10⁸	8,43
B	Teströhrchen obere Probe	7,5 ml	≤ 4,8	≤ 36	1,55	6,88 (Log A – Log B)
C	Teströhrchen untere Probe	2,5 ml	3,46·10⁶	8,65·10⁶	6,94	1,49 (Log A – Log C)
D	Kontrollröhrchen obere Probe	7,5 ml	3,74·10⁷	2,8·10⁸	8,45	–0,03 (Log A – Log D)
E	Kontrollröhrchen untere Probe	2,5 ml	6,33·10⁵	1,58·10⁶	6,2

Claims

Verfahren zur Abtrennung und Inaktivierung von Viren und/oder Prionen, die eine Ausgangslösung kontaminieren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass Ultrazentrifugation für das Abtrennverfahren verwendet wird, wobei eine hochmolekulare Harnstofflösung als inaktivierender Bestandteil verwendet und auf den Boden des Zentrifugenröhrchens geschichtet wird und die Ausgangslösung über diese Schicht gegeben wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei hochmolekularer Harnstoff in Konzentrationen im Bereich von 6 M bis 10 M vorliegt.
Verfahren gemäß Ansprüchen 1–2, wobei auch eine flüssige Phase, die zwischen der Ausgangslösung und der hochmolekularen Harnstofflösung in dem Zentrifugenröhrchen eingefügt ist, in dem Zentrifugenröhrchen vorliegt.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die dazwischen eingefügte Phase eine Lösung ist, welche eine oder mehrere von Saccharid abgeleitete Substanz(en) enthält.
Verfahren gemäß Ansprüchen 3–4, wobei die dazwischen eingefügte flüssige Phase eine Lösung ist, welche Saccharose enthält, mit einem pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 8 und einer Dichte im Bereich von 1,0 bis 1,32 g/ml.
Verfahren gemäß Ansprüchen 1–5, wobei die Ausgangslösung ein biologisches Material, ein Zwischenprodukt oder ein Endprodukt eines Reinigungsverfahrens oder eine synthetische Lösung ist.
Verfahren gemäß Ansprüchen 1–6, wobei die Ausgangslösung eine Substanz oder mehrere Substanzen von gewerblichem Interesse enthält.
Verfahren gemäß Ansprüchen 1–7, wobei die Ausgangslösung Urin von postmenopausalen Frauen, ein Zwischenprodukt oder ein Endreinigungsprodukt des gleichen ist, und es sich bei der Substanz von gewerblichem Interesse um humanes Follikel-stimulierendes Hormon (FSH) handelt.
Verfahren gemäß Ansprüchen 1–8, wobei die kontaminierenden Agenzien in der Gruppe enthalten sind, die Retroviren, behüllte oder nicht-behüllte RNA-Viren, behüllte oder nicht-behüllte DNA-Viren und infektiöse Prionproteine umfasst.