DE3885686T2

DE3885686T2 - Reinigungsverfahren.

Info

Publication number: DE3885686T2
Application number: DE88830362T
Authority: DE
Inventors: Alisa Eshkol; Francois Maillard; Gerald E Stiles
Original assignee: Ares Trading SA
Current assignee: Ares Trading SA
Priority date: 1987-09-11
Filing date: 1988-09-09
Publication date: 1994-04-07
Anticipated expiration: 2008-09-10
Also published as: EP0307373A3; CA1328625C; DE3885686D1; AU605901B2; EP0307373B1; ATE97419T1; AU2140888A; JPH02102A; ES2047043T3; EP0307373A2; JP2914666B2

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung eines biolagischen Materials oder eines hiervan abgeleiteten Produkts. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines biologischen Extraktes, der im wesentlichen frei ist von Verunreinigungen, die Viren oder virus-ähnliche Teilchen enthalten.

Stand der Technik

Die Reinigung biologischer Flüssigkeiten unter Verwendung der Ultrafiltration war aufgrund der Ähnlichkeit der Molekulargewichte verschiedener Bestandteile derartiger Flüssigkeiten mit Problemen verbunden. Während das Konzentrieren (z.B. die Isolierung von Flüssigkeiten, in denen das Verhältnis größerer Moleküle zu kleineren Molekülen erhöht ist) bekannt ist, ist die Verwendung rein physikalischer Techniken, um größere Moleküle von kleineren Molekülen durch Ultrafiltration zu entfernen oder vollständig abzutrennen, nicht dokumentiert worden.
Das Konzentrieren von Viren durch Ultrafiltrationstechniken wurde beschrieben in:
J.D. Gangemi et al. "Arenovirus Concentration by Molecular Filtration", Applied and Environmental Microbiology, vol. 34, No. 3 (Sept., 1977) Seiten 330,2;
G.P. Shibley et al. "New Method for Large-Scale Growth and Concentration of the Epstein-Barr Viruses", Applied and Environmental Microbiology, vol. 40, No. 6 (Dez.,1980) Seiten 1044-1048; und
L.E. Mathes et al. "Purification of Infectious Feline Leukemia Viruses from Larger Volumes of Tissue Culture Fluids", Journal of Clinical Microbioloqy, vol. 5, No. 3 (März, 1977) Seiten 372-4.
EP-A-0 219 295; TATEISHI et al., Lancet, 1985, 1299; TAYL0R, Lancet, 1985, 559; TAYLOR, Lancet, 1985, 1430 offenbaren ein Membranfiltrationsverfahren, um Creutzfeldt-Jakob-Krankheitserreger in Wachstumshormonpräparationen zu entfernen.
Diese Veröffentlichungen und alle anderen darin zitierten Veröffentlichungen werden von dieser Anmeldung vollständig mitumfaßt.

Erfindung

Es wurde gefunden, daß Viren und andere Kontaminanten mit ähnlicher Größe und/oder ähnlichem Molekulargewicht aus biologischen Flüssigkeiten, z.B. Extrakten aus Urin, Hypophysen, anderen Organen und ähnlichem unter Verwendung einer physikalischen Trenntechnik, die eine spezifische Art von Filtermembrane verwendet, entfernt oder hieraus isoliert werden kann.
Insbesondere wird erfindungsgemäß ein Verfahren bereitgestellt, um die virale Infektivität eines biologischen Produktes ohne signifikanten Verlust des Produktes wesentlich zu verringern oder virale Kontaminanten aus einem biologischen Produkt ohne signifikanten Verlust des Produkts im wesentlichen zu entfernen, wobei das Verfahren die Tangentialstromfiltration einer das biologische Produkt enthaltenden Flüssigkeit durch eine Ultrafiltrationsmembran mit einem 100.000 Dalton Rückhaltevermögen und die Wiedergewinnung des biologischen Produktes aus dem Filtrat umfaßt.
Die Filtermembran mit dem 100.000 Dalton Rückhaltevermögen weist die folgenden Merkmale auf:
Retention: Dextranblau ≥ 99%
IgG ≥ 95%
Durchlauf: Albumin ≥ 60%
Insbesondere ist die Filtermembran eine Polysulfonmembran.
Im allgemeinen wird das filtrierte biologische Produkt mit Harnstoff in Kontakt gebracht.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine "PTHK"-Ultrafiltrationsmembran mit einem 100.000 Dalton Rückhaltevermögen von der Firma Millipore, Bedford MAS, verwendet, um Retrovirus- und Slowvirus (d.h. AIDS-, CJD- und ähnliche)-Kontaminanten aus Hypophysenextrakten, die humanes Wachstumshormon (hGH) enthalten, zu entfernen. Das Verfahren ermöglicht Wiedergewinnungen des Produkts von etwa 90% bis etwa 99%.

Vorteile

Das erfindungsgemäße Verfahren weist gegenüber anderen Verfahren zur Reinigung biologischer Flüssigkeiten verschiedene Vorteile auf. Es ist wesentlich einfacher als chemische und/oder thermische Verfahren. Demnach werden auch die Kosten- und Energieaufwendungen, die normalerweise mit herkömmlichen chemischen und/oder Wärmebehandlungen verbunden sind, vermieden.
Weiterhin sind die erfindungsgemäß behandelten Flüssigkeiten gebrauchsfertig, wobei sie entweder alleine oder in Kombination mit anderen herkömmlichen Mitteln, z.B. phosphat-gepufferter Saline, zur Verabreichung an Menschen oder andere Tiere, bevorzugt Säugetiere, verwendet werden.
Andere Vorteile und Merkmale der Erfindung werden anhand der nachfolgenden Beschreibung der Erfindung offenbart.

Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung eines Produktes biologischen Ursprungs, d.h. eines Materials, welches aus Körperflüssigkeiten/Organen abstammt, wobei das Verfahren den Schritt des Filtrierens des unreinen Produktes in flüssiger Form, z.B. in Form einer Lösung, unter Verwendung einer Filtrationsmembran mit einem 100.000 Dalton Rückhaltevermögen umfaßt.
Anders ausgedrückt betrifft die Erfindung die Entfernung von Viren aus biologischen Extrakten unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit bestimmten Eigenschaften.
Falls nicht anders angegeben, sind alle angegebenen Prozentsätze Gewichtsprozente und basieren auf dem Gesamtgewicht der Zusammensetzung.

Filtrationssystem

Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Filtrationssystem umfaßt eine Ultrafiltrationsmembran. Es umfaßt weiterhin einen Tangentialstrom, z.B. in Ausführungsformen, in denen Kassettenfiltrationssysteme verwendet werden.
Geeignete Vorrichtungen, um die Erfindung auszuführen, sind von der Firma Millipore in Bedford, Massachusetts, U.S.A, erhältlich.
Bei der Tangentialstromfiltration handelt es sich um eine bekannte Technik zur Trennung größerer (Retentat-) Moleküle von kleineren (Filtrat-) Molekülen. In biologischen Verfahrensanordungen wurde das Verfahren entweder dazu verwendet, das Filtrat, welches durch die Membran tritt, zu sammeln oder den Rückstand, der die Membran nicht passiert, zu konzentrieren.
Während es bekannt ist, Konzentrate von Virusmolekülen und/oder anderen "Verunreinigungen" aus biologischen Flüssigkeiten herzustellen, ist es unbekannt, sie effizient hieraus zu entfernen, so daß eine hoch gereinigte Filtratflüssigkeit erhalten wird, d.h. mit einer Filtrationseffizienz von 90%-95% oder darüber.
Die Filtrationseffizienz gibt das Verhältnis der Filtratmenge zur anfänglichen Flüssigkeits- oder Extraktmenge an.
Demnach ist:
% Filtrationseffizienz = Gewicht des Filtrats/Gewicht der unreinen Flüssigkeit x 100
Bei einer Abtrennungstechnik - im Gegensatz zu Konzentrationstechniken - ist die Filtrationseffizienz relativ gering, etwa 40 bis etwa 50%. Dies liegt daran, weil ein Konzentrat des zurückgehaltenen Materials (d.h. des Rückstands (Retentats)) eine signifikante Menge des Filtrats enthält. Demnach enthält ein derartiges Konzentrat 60-90 Gew.-% des Rückstands (Retentats) und 10-40% des Filtrats.
Im Gegensatz dazu ergeben die Reinigungs- und/oder Abtrennungstechniken der Erfindung sehr geringe Mengen des Filtrats, die mit dem Rückstand verbleiben, d.h. etwa 1ppm oder weniger der biologischen Flüssigkeit geht verloren, wenn die viralen oder anderen Kontaminanten in oder auf der Filtrationsmembran abgefangen werden. In einem bevorzugten System wird der Rückstand mehrere Male, z.B. etwa 8 mal oder mehr, gewaschen. Diese Kontaminanten, d.h. der Rückstand nach dem Waschvorgang, werden anschließend verworfen.
Die verwendete Filtrationsmembran ist in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Ultrafiltrationsmembran mit einem 100.000 Dalton Rückhaltevermögen, die kommerziell in Scheiben- und Kassettensystemen zur Verwendung bei der Behandlung biologischer und pharmazeutischer Materialien verkauft wird. Die Membran selbst wird von der Firma Millipore als "PTHK" bezeichnet, und es handelt sich um einen Polysulfonmembranguß (cast) auf einem Polypropylendichtungsmaterial (sealant) unter Verwendung von 20% Glycerin. Sie wird mit Formaldehyd aufbewahrt.
Eine bevorzugte Membran ist die Millipore PTHK-Ultrafiltrationsmembran. Ihre Merkmale sind wie folgt:
Retention: Dextranblau ≥ 99%
IgG ≥ 95%
Durchlauf: Albumin ≥ 60%
Die Retentionsmarker sind bei einem durchschnittlichen Transmembrandruck von 6,9 - 690 KPa (1-100 psi) konsistent, wobei die Art des Durchtrittsverhaltens sowohl vom Druck als auch vom gelösten Stoff abhängt.

Integrität

Weniger als 2,00 ml/Min. Luftdurchtritt pro 929 cm² (ft²) bei 34,5 KPa (5 psi) Luftdruck, getestet an einer vollständig benetzten Membran.

Chemische Kompatibilität

Die Membran ist mit wäßrigen Lösungen und mit Alkohol bis 20% kompatibel. Der verwendbare pH-Bereich liegt bei 1-14. Sie ist mit NaOH bis zu 1.0 M regenerierbar. Ihre Temperaturgrenze beträgt 50ºC, und sie kann mit einer NaCH oder NaOCl entpyrogenisiert werden.
Diese bevorzugte Membran wird in verschiedenen Publikationen der Firma Millipore beschrieben: AD 841, OM 131, OM 141, und UF 009.
Die Membranen können Systemen, die entweder Scheiben oder Kassetten verwenden, angepaßt werden. Die Membran arbeitet in der Erfindung in jeder Umgebung. Bevorzugterweise werden jedoch Kassettensysteme verwendet. Der Hersteller, Millipore, bezeichnet die Kassettensysteme als "Pellicon"-Kassettensysteme (für größere Volumina) oder "Minitan"-Systeme (für kleinere Volumina). Scheibenmembranen werden in einem gerührten Zellsystem unter Druck verwendet.
Andere verwendbare Filtrationssysteme umfassen SM 16527 von Sartorius und Filtron und ähnliche Systeme.

Filtrationsparameter

Die zu behandelnden biologischen Flüssigkeiten werden durch das Filtrationssystem mit einer Geschwindigkeit von etwa 300 bis etwa 500 ml/Min. oder darüber gepumpt.
Die verwendete Membran kann allgemein als eine mit einer Oberfläche von O,46m²/je Kassette beschrieben werden. Natürlich kann mehr als eine Kassette verwendet werden; in diesem Fall muß die Fließgeschwindigkeit durch das System entsprechend erhöht werden. Für das Minitan-System sind Werte von etwa 120 bis etwa 600 cm² üblich. Für das Pellicon-System sind Werte von etwa 465 bis etwa 46.500 cm² üblich. Diese Bereiche hängen von der Zahl der verwendeten Kassetten ab.
Der ausgeübte Druck variiert von etwa 0,2 bis etwa 1,5 bar, wobei 0,3 bis 1,0 bar bevorzugt wird; es sind jedoch auch höhere Drücke verwendbar.
Die Temperatur ist unkritisch. Bevorzugterweise findet das Filtrationsverfahren jedoch bei einer Temperatur von etwa 2º bis etwa 10ºC statt.
Das Verhältnis zwischen Retentats- und Filtratsstromgeschwindigkeiten ist eine Funktion des verwendeten Gegendrucks. Es kann von etwa 30 bis etwa 60% variieren, wobei ein Verhältnis von etwa 50% bevorzugt wird.

Biologische Flüssigkeiten

Die biologischen Flüssigkeiten, die in Übereinstimmung mit der Erfindung behandelt werden, d.h. von denen virale und/oder andere Kontaminanten entfernt werden, umfassen eine weite Vielzahl von flüssigen und halbflüssigen Materialien, die von Menschen oder Tieren abstammen, d.h. Geweben oder Flüssigkeiten, die aus Körperteilen stammen. Die bevorzugten Donor- oder Herkunftsorganismen für derartige Gewebe sind Menschen oder andere Säugetiere. Es können jedoch auch Gewebe und andere Flüssigkeiten, die nicht aus Säugetieren stammen, behandelt werden.
Bevorzugterweise werden die zu behandelnden Extrakte oder die zu behandelnden anderen biologischen Flüssigkeiten aus der physikalischen Behandlung von Geweben und Körperflüssigkeiten erhalten, die über den normalen Stoffwechsel des Wirtsorganismus hergestellt werden. Demnach können auch Blut, Urin oder ähnliches behandelt werden.
Zusätzlich können auch Präparationen, die unter Verwendung rekombinanter Techniken hergestellt wurden, z.B. Zubereitungen, die Hormone wie rec-hGH enthalten, unter Verwendung dieses Verfahrens gereinigt werden. Demnach können Zellkulturen, z.B. solche, die genetisch veränderte Säugetierzellen und/oder virale Zellen enthalten, gemäß der Erfindung behandelt werden. Zubereitungen, die Hormone und ähnliche Materialien enthalten, z.B. FSH, LH; HCG, nGH, EGF, Interferone etc., sind die bevorzugten Materialien, die erfindungsgemäß behandelt werden.
Die Art des Gewebes, von dem die Flüssigkeit oder der Extrakt abstammt, ist unkritisch. Bevorzugt stammt das Gewebe jedoch aus Teilen des Körpers, z.B. Organen oder Drüsen aus Säugetieren, erhalten durch herkömmliche Extraktionstechniken. Demnach sind Extrakte aus dem Gehirn, der Leber, dem Herzen etc. aus irgendeinem Säugetier bevorzugt. Extrakte aus dem Gehirn - und insbesondere den Hypophysen - von Menschen, Hamstern, Mäusen, Ratten und ähnlichen Tieren werden bevorzugt. Es können Extraktmischungen verwendet werden.
Die Extraktionstechnik, die verwendet wird, um die zu behandelnde Flüssigkeit aus dem Gewebe, einem anderen zellulären Material oder einer Körperflüssigkeit gemäß der Erfindung zu entfernen, ist unkritisch. Es wird jedoch im allgemeinen bevorzugt, daß die zu erhaltende Flüssigkeit über Schritte wie Lösungsmittel- oder Salzpräzipitation, Ionenaustausch, Chromatographie, Größenausschlußchromatographie und ähnliche Verfahren erhalten wird.
Die zu behandelnde Flüssigkeit muß frei sein von Teilchen; sie muß z.B. über beispielsweise einen 0,45 µm Filter oder eine andere geeignete Filtrationsvorrichtung gereinigt werden.
Gelöste Stoffe und/oder pH-Stabilisatoren wie Harnstoff, NaOH, NH&sub4;HCO&sub3; und Phosphatpuffer liegen in den zu behandelnden biologischen Flüssigkeiten gewöhlich vor. Mischungen sind verwendbar. Es kann eine weite Vielzahl an gelösten Stoffen verwendet werden. Jedoch sollten solche Lösungsmittel vermieden werden, die die Wirksamkeit der Membranen beeinträchtigen.
Geeignete Mengen an Harnstoff und/oder dekontaminierenden Mitteln können ebenfalls verwendet werden, um jegliche kontaminierende Substanz(en), die nach der Behandlung in der Flüssigkeit verbleiben, zu deaktivieren. Die Wirkung von Harnstoff auf die Verringerung der Infektivität von Scrapie- und CJD- Agentien wurde in der Vergangenheit untersucht. Die meisten Forscher (Hunter et al., 1986, Kimberlin und Walker, 1985, March et al., 1984, Prusiner 1982, und Mould, unveröffentlichte Daten 1969) fanden, trotz der Tatsache, daß ihre experimentellen Vorgehensweisen unterschiedlich waren, eine Verringerung der Infektivität um 2-3 log. Die Ergebnisse der Anmelder als auch die der oben angegebenen Forscher unterscheiden sich von den Beobachtungen von Brown et al. (1986), die bei Zugabe von Harnstoff zu 20% Gehirnhomogenaten von mit Scrapie infizierten Hamstern oder mit CJD infizierten Guineaschweinen keine signifikante Wirkung beobachten konnten.
In der Vergangenheit wurde die Verwendung von NaOH zur Inaktivierung der Infektivität empfohlen. NaOH verursacht jedoch eine teilweise Inaktivierung und Modifizierung der hGH-Moleküle, während die Einwirkung von Harnstoff bei Konzentrationen von etwa 2 bis etwa 8 M, bevorzugt bei Verwendung von Lösungen mit 6M Harnstoff, keine beobachtbaren Veränderungen induziert.
Nach der Ultrafiltration wird Harnstoff oder ein anderes geeignetes Mittel angewandt. Hierbei handelt es sich um einen getrennten chemischen Inaktivierungsschritt, um virale Restinfektivität zu entfernen. Nach der Behandlung wird Harnstoff durch Ultrafiltration auf Kassetten mit einem Rückhaltevermögen von 10.000 Dalton entfernt.

Kontaminanten

Die Kontaminanten, die aus biologischen Flüssigkeiten unter Verwendung des erfindungsgemäßen Reinigungsverfahrens entfernt werden, umfassen beliebige Materialien, deren Größen vorschreiben, daß sie durch die 100.000 Dalton Molekulargewichts- Filtrationsmembran während der zielgerichteten Filtration zurückgehalten werden. Demnach handelt es sich bei den viralen oder anderen Kontaminanten, die in Übereinstimmung mit der Erfindung entfernt und beseitigt werden, um menschliche und/oder tierische Viren entsprechender Größe.
Da Gamma-Globolin und Dextranblau die Retentionsmarker für die verwendeten Filtermembranen sind, kann gesagt werden, daß die Molekulargewichte der auf der Membran zurückgehaltenen Kontaminanten leicht größer sind als 100.000, d.h. 110.000 oder darüber.
Virale Kontaminanten, die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und Filtrationssystems entfernbar sind, umfassen die "langsamen" Viren, beispielsweise Scrapie-Virus, Creutzfeld-Jakob-Erkrankungs-Virus (CJD) und ähnliche Viren.
Andere Kontaminanten, die aus biologischen Flüssigkeiten und Extrakten unter Verwendung des erfindungsgemäßen Filtrationssystems entfernbar sind, umfassen herkömmliche Viren, z.B. AIDS (HIV), SV 40, Hepatitis, als auch virus-ähnliche Teilchen, z.B. Prionen und ähnliche. Kombinationen derartiger Verunreinigungen können ebenfalls entfernt werden.
Nach ihrer Entfernung vom gereinigten Hormon oder einer anderen Flüssigkeit werden die auf der Filtrationsmembran verbliebenen Kontaminanten hiervon abgewaschen und durch geeignete Mittel, z.B. durch Verbrennung, Deponierung, Autoklavierung oder Inaktivierung, beseitigt.
Die gereinigte Flüssigkeit wird anschließend geeigneten Techniken zur Lagerung, Handhabung, Verpackung oder einer anderen Verarbeitung der Flüssigkeit unterworfen. Eine derartige Verarbeitung kann die Gefriertrocknung (d.h. Lyophilisierung), Lösungsmittelpräzipitation, Kühlen, Einfrieren (wie sie ist oder in Lösung), Harnstoffbehandlung und ähnliches umfassen. Eine oder mehrere dieser Techniken und/oder andere Verarbeitungstechniken können verwendet werden.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur weiteren Veranschaulichung der Erfindung.

Beispiel 1

Dieses Beispiel zeigt die Aufnahme des Scrapie-Agens in Sorono's hGH (kommerziell erhältlich als "GRORM") und vergleicht die Ausschlußfähigkeit sowohl der 25 nM und 100.000 MW Ultrafilter und die Wirkung einer weiteren Behandlung mit 6 M Harnstoff.

Verfahren Virusquelle

Hamstergehirne, die mit dem 263 K-Stamm von Scrapie infiziert wurden, werden als "slow virus"-Kontaminante verwendet werden. Es wurde gezeigt, daß das Scrapie-Agens die gleichen biologischen und physiochemischen Eigenschaften wie das CJD-Agens aufweist. Der dem Hamster angepaßte Scrapie-Stamm wurde wurde wegen seiner kurzen Inkubationszeit (55-60 Tage nach der intracerebralen (IC) Inokulation der höchsten Virusdosis) und wegen seines großen Virusinfektivitätstiters von 10¹&sup0; LD&sub5;&sub0;/g Gehirn ausgewählt).
Den dem Hamster angepaßten 263 K-Stamm von Scrapie, isoliert von Kimberlin und Walker (1977), applizierte man zweimal in Syrischem Goldhamster durch intracerebrale (IC) Inokulation mit 10% scrapie-infiziertem Gehirnhomogenat in phosphat-gepufferter Saline (PBS), pH 7,4, durchlaufen. Die Hamstergehirne wurde aseptisch aus terminalkranken Tieren entfernt und sofort bei -80ºC eingefroren. Die Gehirne wurden aufgetaut und in steriler phosphat-gepufferter Saline bei pH 7,4 auf eine Endkonzentration von 10% homogenisiert. Die Suspension wurde bei 1500 g 30 Minuten lang zentrifugiert, und der Überstand wurde in 5 ml Aliquote geteilt und bei -80ºC gefroren gelagert.

Scrapie-kontaminierte hGH-Aufreinigung

Lyophilisiertes hGH (90% reine monomere menschliche Wachstumshormonproteine) wird in 10,8 ml 0,01 M NH&sub4;HCO&sub3;, pH 8,0 gelöst; 1,2 ml der 10% gereinigten Suspension des mit dem 263 K-Stamm von Scrapieinfizierten Hamstergehirns wird mit Ultraschall behandelt (3x5 Sekunden) und zur hGH-Lösung gegeben, um ein Endvolumen von 12 ml zu ergeben. Eine 2 ml Probe wird entfernt, um den Infektivitätstiter zu bestimmen. Hoher Titer-Challenge (1,2 ml) gereinigte Scrapie-Hamster-Gehirne und (10,8 ml) lyophilisiertes Serono hGH (324 mg) (12 ml Gesamtvolumen erste Testtitration, erwarteter Titer 5x10 /0,05 ml) (-2 ml) Titer unverdünnt bis 10 (132 Hamster) 100.000 MW Filtration zweiter Testtiter (-2 ml) unverdünnt bis 10 (72 Hamster) 6 M Harnstoff übernacht bei 4ºC dritter Test (Gesamtvolumen) nur unverdünnt (60 Hamster) 25nM Filtration fünfter Testtiter (-2 ml) unverdünnt bis 10 (72 Hamster)

Erster Test

Der erwartete Titer war ungefähr 10&sup8;LD&sub5;&sub0;/ml oder 5x10&sup6;LD&sub5;&sub0;/0,05 ml. Die Probe wird um das 10-fache auf bis zu 10&supmin;¹&sup0; verdünnt. 0,05 ml Aliquote an Verdünnungen von unverdünnt bis 10&supmin;¹&sup0; werden in 12 Hamster gespritzt (IC). (Zahl der Tiere: 12 x 11 = 132).
Dieses in diesem und den nachfolgenden Tests zugegebene Verdünnungsmittel war 0,01 M NH&sub4;HCO&sub3;-Puffer, pH 8,0.
Die verbleibenden 10 ml wurden in zwei gleiche Aliquote von 5 ml aufgeteilt. Das 5 ml Aliquot (zweite Testtitration) wurde mit 0,01 M NH&sub4;HCO&sub3; auf 100 ml verdünnt, und es passierte einen Millipore 100.000 MW-Ausschluß-Ultrafilter. Das Filtrat wird durch Ultrafiltration und Lyophilisation konzentriert, und das Endvolumen wird auf 5 ml eingestellt. Eine 2 ml Probe wird für die zweite Testtitration abgenommen.

Zweiter Test

Die Probe wird 10-fach seriell bis zu 10&supmin;&sup5; verdünnt. 0,05 ml Aliquote der unverdünnten und verdünnten Proben werden in die 12 Hamster injiziert (IC). (Zahl der Tiere: 12 x 6 = 72).
Das verbleibende 3 ml-Filtrat wird mit 6 M Harnstoff wie folgt behandelt:
1. 1,40 g Harnstoff (Molekulargewicht 60,02, spezifisches Volumen 0,756) wird zum 3 ml Aliquot gegeben, um eine Endkonzentration von 6 M zu erhalten. Nach einer Übernacht-Behandlung bei 4ºC wird die Lösung durch Ultrafiltration gegen NH&sub4;HCO&sub3;-Puffer dialysiert, um den Harnstoff zu entfernen. Die Lösung wird anschließend lyophilisiert und in 3 ml 0,01 M NH&sub4;HC0&sub3;, pH 8,0, resuspendiert.

Dritter Test

Das Gesamtvolumen, unverdünnt, wird in Hamster injiziert (IC). (Zahl der Tiere: 60).
2. Das zweite 5 ml-Aliquot durchläuft eine Serie von Filtern, bestehend aus 220 nM, 40 nM und 25 nM. Das Filtrat wird durch Ultrafiltration und Lyophilisation konzentriert, und das Endvolumen auf 5 ml mit 10 mM Ammoniumbicarbonat eingestellt. Eine Probe von 2 ml wird für die fünfte Testtitration abgenommen.

Fünfter Test

Die Probe wird 10-fach seriell auf bis zu 10&supmin;&sup5; unter Verwendung von phosphatgepufferter Saline (PBS), enthaltend 100 Einheiten/ml Penicillin und 0,1 mg/ml Streptomycin, verdünnt. 0,05 ml Aliquote der unverdünnten und verdünnten Proben werden in 12 Hamster injiziert (IC). (Zahl der Tiere 12 x 6 = 72).
Das verbleibende 3 ml-Filtrat wird wie folgt behandelt:
3. 1,40 g Harnstoff (Molekulargewicht 60,02, spezifisches Volumen 0,756) wird zum 3 ml-Aliquot gegeben, um eine Endkonzentration von 6 M zu erhalten. Nach der Übernacht-Behandlung bei 4ºC wird die Lösung durch Ultrafiltration gegen NH&sub4;HCO&sub3;-Puffer dialysiert, um den Harnstoff zu entfernen. Die Lösung wird anschließend lyophilisiert und in 3 ml 0,01 M NH&sub4;HCO&sub3;, pH 8,0, resuspendiert.

Sechster Test

Das Gesamtvolumen, unverdünnt, wird in Hamster injeziert (IC). (Zahl der Tiere: 60).
Der Ultrafiltrationsvorgang bei 100.000 MW wurde unter Verwendung einer Tangentialfiltration in einem Minitansystem (Millipore), ausgestattet mit 8 Membranpaketen bei etwa 0,5 bar Druck und 4ºC durchgeführt. Die 25 nm Filtration wurde in einer 600 ml Millipore-Fülleinheit, ausgerüstet mit einem 0,47 mm Swinnex-Filterhalter von Millipore, durchgeführt.

Ergebnisse

Die Wirkungen auf Laboratoriumsrestkontamination unter Verwendung der oben beschriebenen Titrations- und Filtrationsprodukte sind in den nachfolgenden Tabellen angegeben. Tabelle I: erste Testtitration Verdünnung Inkubationszeit (Tage) Zahl der injizierten Tiere tot überlebend keine (unverdünnt) keine Symptome
Der Infektivitätstiter, berechnet nach dem Reed- und Muench- Verfahren, ergibt eine LD&sub5;&sub0; von 105,5/0,05 ml (108,8/g Gehirn). Tabelle II: zweiter Test (100.000 MW Filtration) Verdünnung Inkubationszeit (Tage) Zahl der injizierten Tiere tot überlebend keine (unverdünnt)
Der Infektivitätstiter, berechnet nach dem Reed- und Muench- Verfahren, ergibt eine LD&sub5;&sub0; von 103,1/0,05 ml (106,4/g Gehirn).
Nach der 100.000 MW-Filtration ergibt sich eine Abnahme im Infektivitätstiter von 2,4 log.

Tabelle III: dritter Test (100.000 MW Filtration + 6 M Harnstoff)

Das Gesamtvolumen des dritten Tests wurde intracerebral in 58 gesunde Hamster gespritzt. Ein Tier starb sofort nach der Injektion. 46 Hamster zeigten klinische Symptome von Scrapieerkrankungen 126,0 + 13,9 Tage nach der Injektion. Die anderen 11 Tiere blieben am Leben und zeigten keine klinischen Symptome von Scrapie 180 Tage nach der Injektion. Die Sterblichkeitsrate beträgt 80,7% und der Infektivitätstiter, berechnet mit dem Inkubationszeitraum, ergibt eine LD&sub5;&sub0; von 102,9+1,3/g Gehirn.
Nach der 100.000 MW Filtration + 6 M Harnstoff ergibt sich eine Abnahme im Infektivitätstiter von 5,9 + 1,3 log. Tabelle IV: fünfter Test (25 nm Filtration) Verdünnung Inkubationszeit (Tage) Zahl der injizierten Tiere tot überlebend keine (unverdünnt)
Der Infektivitätstiter, berechnet nach dem Reed- und Muench- Verfahren, ergibt eine LD&sub5;&sub0; von 103,4/0,05 ml (106,7/g Gehirn).
Nach der 25 nm-Filtration ergibt sich eine Abnahme im Infektivitätstiter von 2,1 log.

Tabelle V: sechster Test (25 nm-Filtration + 6 M Harnstoff)

Das Gesamtvolumen des sechsten Tests wurde intracerebral in 53 gesunde Hamster injiziert. Ein Tier starb sofort nach der Injektion. 50 Hamster zeigten klinische Symptome von Scrapie 111,7 + 10,6 Tage nach der Injektion. Die anderen zwei Tiere blieben am Leben und zeigten keine klinischen Zeichen von Scrapie 180 Tage nach der Injektion. Die Sterblichkeitsrate beträgt 96,2%, und der Infektivitätstiter, berechnet mit dem Inkubationszeitraum, ergibt eine LD&sub5;&sub0; von 104,2+1/g Gehirn.
Nach der 25 nm-Filtration + 6M Harnstoff ergibt sich eine Abnahme im Infektivitätstiter von 4,6 ± 1,0 log.
Die Proben, die gemäß der Erfindung verarbeitet wurden (d.h. Ultrafiltration unter Verwendung der 100.000 MW-Ausschlußmembran mit oder ohne dem zusätzlichen Harnstoff-Kontaktschritt) zeigten geringere Infektivitätsraten. Im allgemeinen wurde durch die vorliegende Ultrafiltration die Infektivität um 99,6% verringert, d.h. vergleichbar mit Werten, die erhalten wurden, wenn die Proben unter Verwendung eines 25 nm-Filtrationssystems filtriert wurden.
Die Wirkungen der Filtration auf die Infektivität ist in Tabelle VI angegeben. Tabelle VI Experimentelle (s) Verfahren - Proben Infektivität(a) Titer (log) Abnahme der Titer (log) Kontrolle - A Filtration (100.000 MW) - B Filtration (25 nm) - C Filtration (B) + Harnstoff - BU Filtration (C) + Harnstoff - CU (a) Die Infektivitätstiter sind als - log&sub1;&sub0; LD&sub5;&sub0; i.c. Einheiten/ g Gehirn ausgedrückt (Am. J. Hyg. 1938; 27; 493-97). (b) Der Infektivitätstiter, bestimmt durch die Inkubationszeit (J. Comp. Path. 1969; 79; 15-22).
Wenn das 100.000 MW-Ausschluß-Filtrat 6 M Harnstoff (BU) ausgesetzt wurde, war eine stärkere Inaktivierungswirkung zu beobachten als wenn das 25 nm-Filtrat (CU) der gleichen Behandlung unterworfen wurde. Die mittlere Anzahl an Tagen von der Injektion bis zum Auftreten klinischer Symptome betrug 136,5, ± 4,0 (Mittelwert + SEM) für BU und 114 2 ± 2,3 Tage für CU. Der Unterschied war anhand des Studenten-T-Tests und des Wilcoxon-Tests beim Level p < 0,0001 statistisch signifikant. Die Zahl der betroffenen Tiere für BU beträgt 54 aus 58 Tieren und für CU 52 aus 52. Dieser Unterschied ist anhand der chi-Quadratanalyse signifikant, P = 0,0207. Der Grund, weshalb die Kombination der Filtration durch ein 25 nm-Filter + Harnstoff einen geringeren Grad an Scrapie-Entfernung zeigte als die 100.000-Ausschluß-Filtration aus 6 M Harnstoff ist zu diesem Zeitpunkt nicht erklärbar.
Im vorliegenden Experiment wurden die zwei kombinierten Verfahren (100.000 MW-Ausschluß-Filtration + Reinigung des Filtrats mit 6 M Harnstoff) auf ein hoch-infektiöses Gehirnhomogenat mit einem Infektivitätstiter von 10 (8,8) log/g angewandt. Diese zwei Verfahren verringerten die Infektivität um etwa 6 log ohne die Anwendung von irgendwelchen vorhergehenden Schritten oder anschließenden Reinigungsschritten.
Wenn die erfindungsgemäßen Schritte auf bereits gereinigtes hGH angewandt werden, vergrößern sie die Sicherheitsspanne von hGH oder irgendeinem anderen Produkt, bei welchem diese Verfahrensschritte anwendbar sind. Das Produkt sollte deshalb, selbst wenn moderne Technologien verwendet werden, weiterhin diesen zwei Verfahren ausgesetzt werden, da sie die Sicherheit des Produkts signifikant erhöhen. Demgemäß ist die Ko-Verwendung des Filtrationsverfahrens oder des Filtrationsverfahrens mit der Zugabe von Harnstoff alleine und mit anderen Reinigungsverfahren wünschenswert.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt die Behandlung einer Lösung des humanen Menopausen-Gonadotropins (HMG), welches aus Urin unter Verwendung der 100.000 Dalton-Ausschlußmembran gewonnen wurde.
120 ml der Harn-HMG-Lösung (in Wasser) wurden aus der konzentrierten Lösung vor dem letzten Präzipitationsschritt der HMG- Herstellung abgenommen. Sie weist die folgenden Eigenschaften auf:
Menge = 120 ml aus 3281 Liter Urin;
Analyse der Lösung:
Proteine - 4,17 mg/ml Gesamtproteine = 500 mg;
FSH (Biol.) = 1258 UI/ml, entsprechend 46 UA/1 Urin
pH = 7,3;
Diese Lösung wurde mit NH&sub4;HCO&sub3;, 0,1 M, pH 8 auf einen Liter verdünnt.
Die Endlösung wurde tangential unter Verwendung einer 100.000 Ausschluß-PTHK-Membran von Millipore in einer Kassette bei 1 kg/cm² Druck und 6 ± 2ºC Temperatur filtriert. Die Filtration wurde durchgeführt, bis man ein Volumen von 200 ml erhielt; anschließend wurde die Konzentrierung 12 mal wiederholt, wobei jeweils 200 ml NH&sub4;HCO&sub3;, 0,1 M, pH 8 entsprechend dem nachfolgenden Fließschema zugegeben wurden.
Ausgangslösung = 500 mg Protein.
Nach dem 100.000-Ausschluß Filtrat Zurückgehaltener Anteil total Volumen Filtrat zurückgehalten Effizienz
Das oben erhaltene Filtrat wurde über eine 100.000 Dalton-Ausschlußmembran gegeben, und man erhielt:
Eingesetzte Gesamtproteine = 431 mg.
Wiedergewinnung der Proteine:
- Gesammeltes Konzentrat = O.D.x ml = 0,83 x 410 ml = 340 mg.
- Filtrat = 0
Proteinverlust vom Ausschluß von 10.000 = 431 - 340 = 91 mg.
Effizienz =
Das Fließschema des Beispiels II ist wie folgt: FLIEßSCHEMA ULTRAFlLTRATlONSAUSSCHLUß 100.000 MW Ausgangslösung 120ml Verdünnung auf 1 l Konzentrierung durch Ultrafiltration Aus schluß 100.000 konz. Ultrafiltration Ausschluß 100.000 züruckbehalten Präzipitation sammeln entspricht Filtrat fortschreitende Wiedergewinnung % Anmerkung: (1) SDS-Elektrophorese zeigt weniger an geringern Molekulargewichten (2) O.D. = optische Dichte Gesamtfiltrat (aus Ausschluß 100.000) Konzentrierung Ausschluß 10.000 Präzipitation sammeln Filtrat Gewichtsausbeute : 0,104 mg/l Urin FSH-Akivität = 262 IU/l (Bioassay)

Beispiel 3

Die nachfolgende Tabelle zeigt die Ausbeuten, die erhalten wurden, wobei das erfindungsgemäße Verfahren zum Filtrieren eines Teils eines Fabrikationsansatzes im Vergleich mit dem anderen, normal behandelten Teil verwendet wurde.
Der FSH-Gehalt des Ausgangsschritts betrug: 46 I.U./l Urin. Zusammenfassung des Experiments verglichen mit einem typischen Fabrikationsansatz des follikel-stimulierenden-Hormons (FSH) Fabrikationsansatz A zurückbehalten B Filtrat Ausbeute mg/1 Urin Ausbeute FSH UI/1 Urin FSH spezifische Aktivität UI/mg %-Ausbeute bezüglich der Ausgangslösung (46 UI/1 Urin)
Die Gesamtausbeute des 100.000-Ausschluß-Ultrafiltrationsverfahrens plus Ausschluß 10.000 bezüglich der Fabrikationsausbeute betrug:

Beispiel 4

Unter Verwendung ähnlicher Verfahren, wie sie im Beispiel 1 verwendet wurden, kann SV 40-Virus aus menschlichem Urin entfernt werden. Es wird erwartet, daß die Ergebnisse der Tiertests eine verringerte Infektivität zeigen, wenn 100.000 Dalton-Ausschlußmembrane verwendet werden. Eine Verdünnung und/oder die Zugabe von Harnstoff sollte die Herabsetzung der Infektivität unterstützen.

Beispiel 5

Unter Verwendung ähnlicher Verfahren, wie sie im Beispiel 1 verwendet wurden, kann das AIDS-Virus aus Urin und anderen menschlichen biologischen Flüssigkeiten entfernt werden. Die Ergebnisse der Tiertests sollten zeigen, daß die Filtration mit der erfindungsgemäßen Membran die Infektivität herabsetzt. Weiterhin sollte eine Verdünnung und/oder die Verwendung von Harnstoff allgemein helfen, die Aktivität irgendwelcher Restviren im gereinigten Material zu verringern.

Beispiel 6

Der nachfolgende Text wurde aus einem Protokoll entnommen, welches entwickelt wurde, um die Entfernung von Simian-Virus 40 aus menschlichem Wachstumshormon durch ein PTHK-Membran- Reinigungsverfahren zu untersuchen.

Ziel

Bestimmung der Viruseigenschaften der PTHK-Membran unter Verwendung von Simian-Virus 40 (SV40), welches im Permeat nach der Filtration erscheint.
Die Anfangsuntersuchung soll den Einfluß der kritischen Leistungsvariablen auf die Entfernung eines herkömmlichen Modellvirus, SV40, und auf die gleichzeitige Passage des menschlichen Wachstumshormons unter Verwendung der Millipore-PTHK-Membran, eingebaut in einer Minitan-Vorrichtung, untersuchen. Die erste Aufgabe ist, die Wirkung des Ansatzvolumen auf das Membran-Oberflächenverhältnis zu untersuchen, wenn der Betrieb bei einem Transmembrandruck von 0,5 bar erfolgt. Diese Betriebsbedingung stimmt überein mit dem Produktionsvorgang bei genau 1/10tel. Die zweite Aufgabe ist es, die Wirkung der Betriebsbedingungen zu untersuchen, das Verhältnis der Permeat-Fließgeschwindigkeit zur Retentat-Fließgeschwindigkeit, wobei das Beanspruchungsverhältnis Volumen zu Oberfläche entspannt wird. Zwei Betriebsbedingungen sollen in dieser Weise untersucht werden. Alle anderen Verfahrensbedingungen, d.h. die Harnstoffbehandlung, die Zahl der Waschschritte usw., werden so ausgelegt, daß sie das tatsächliche Herstellungsverfahren simulieren.

Testgegenstand

Herkunft: Ares-Serono
Name : PTHK in der Minitan-Konfiguration
Herkunft: Millipore

Positive Kontrolle

Simian-Virus 40 (SV40)-Herkunft: Virology Department, Microbiological Associates, Inc.

Testsystem

Testsystem : Vero-Zellen für den SV40-Virustest wurden im Biotechnology Services Department Laboratory gehalten. Die Verfahren, um die Veränderung in der Menge des vorliegenden SV40 in den Proben zu beobachten, verwenden Virus-Standard-Quantifizierungsverfahren.

Experimentelle Gestaltung und Verfahren

A. Die Testgegenstandlösung wird mit SV40 versetzt und über ein Filtrationsschema geführt, welches die Filtration bei verschiedenen Betriebsbedingungen einschließt. Proben werden bei verschiedenen Schritten während dem Filtrationsverfahren wie unten beschrieben gesammelt, und die Proben werden bei -70ºC gelagert, bis sie auf den Plaquetiter hin untersucht werden.
B. Der Aufbau und die Durchführung der Filtrationsverfahren steht unter der Verantwortlichkeit des Sponsors. Die Testvorrichtung stellt SV40 bereit, mit dem die Probe versetzt wird, und sie entnimmt die Proben aus den angegebenen Reinigungsschritten für den anschließenden Plaquetest. Die Zielkonzentration des unterzumischenden Virus wird etwa&sup6; pfu/ml nach der Verdünnung im Testmaterial betragen.
Die Plaquetests werden bei geeigneten Verdünnungen durchgeführt, um genaue Titer zu ergeben (Maximum von 3 pro Probe) in abgestimmter Salzlösung (wie unten angegeben).

Verfahren

A. Protokoll A

1.0 Lyophilisiertes h-GH wird in 285 ml 0,01 M Ammoniumbicarbonatpuffer auf 2 mg/ml eingestellt. Drei 1 ml Proben werden für den SV-40- und h-GH-Test zurückbehalten und bei -70ºC gelagert (A1).
2.0 Die 285 ml der h-GH-Stammlösung werden mit 15 ml der SV40-Stammlösung bei etwa 2 x 10&sup7; pfu/ml (eine 1/20 Verdünnung) inokuliert, um einen Endtiter von 10&sup6; pfu/ml zu ergeben. Drei 1 ml Proben dieser inokulierten Lösung werden für SV-40- und h-GH-Tests zurückbehalten und bei -70ºC gelagert (A2). Dieses beimpfte Material wird in drei gleiche Aliquots von 100 ml, je zur Einbringung in die Filtrationsvorrichtung der Protokolle A1, A2, und A3, getrennt.

A.1. Protokoll A1

1.0 100 ml des beimpften Materials werden durch eine PTHK-Minitan (8 Stapel) bei 0,5 bar Transmembrandruck filtriert. Eine Reihe von 9 Waschungen wird durchgeführt, um die gesamte Menge des h-GH wiederzugewinnen. Jeder Waschschritt besteht aus dem Filtrieren von 100 ml Lösung, bis das Ausgangsvolumen auf zwischen 15 bis 20 ml verringert wurde. Dieses verbleibende Volumen wird wiederum auf bis zu 100 ml mit 0,01 M Ammoniumbicarbonatlösung vor dem nächsten Waschschritt verdünnt. Nach der ersten Filtration und den 9 Waschungen gibt sich ein Endvolumen von 800-850 ml des filtrierten Produkts.
2.0 Drei 1 ml Proben dieses filtrierten Produkts werden zurückbehalten und bei -70ºC zur Analyse (A3) von sowohl SV-40 als auch h-GH gelagert.
3.0 100 ml dieses filtrierten Produktes werden auf etwa 10 ml unter Verwendung eines PTGC-Minitan S-Systems konzentriert. Diese 10 ml werden zurückbehalten (A4), bei -70ºC gelagert und auf SV-40 und h-GH getestet.
4.0 Zu den verbleibenden 700-750 ml PTHK-filtriertem h- GH wird Harnstoff zugegeben, um eine Harnstoffkonzentration von 6 M zu erhalten. Diese Lösung wird über Nacht (16 Stunden) bei 4ºC gelagert.
5.0 Eine Reihe von 7 0,01 M Ammoniumbicarbonatwaschungen unter Verwendung eines PTGC-Minitans wird durchgeführt, um den Harnstoff nach der Behandlung zu entfernen. Das Anfangsvolumen von 750 ml wird auf 100 ml verringert. Anschließend wird 1 l 0,01 M Ammoniumbicarbonat zugegeben. Dieses Lösungsvolumen wird wiederum auf 100 ml verringert. Dieses Waschverfahren wird insgesamt sieben mal wiederholt, um den Harnstoff zu entfernen. Nach den Waschungen wird das System mit bis zu 300 ml 0,01 M Ammoniumbicarbonat gewaschen, um das gesamte h-GH wiederzugewinnen.
6.0 Drei 4 ml Proben dieses derart verarbeiteten h-GH- Produkts werden zurückbehalten und bei -70ºC gelagert, um später SV-40 und h-GH-Analysen durchzuführen (A5).

A.2. Protokoll A2

1.0 100 ml des beimpften Materials werden durch eine PTHK-Minitan (1 Stapel) bei einer 1:1 Filtrat zu Permeat-Fließgeschwindigkeitsaufspaltung filtriert. Die h-GH-Lösung wird wie im Protokoll A.1.1 beschrieben bei diesen Bedingungen gewaschen.
2.0 Drei 1 ml Proben des filtrierten Produktes werden zurückbehalten (A6) und bei -70ºC für SV-40- und h- GH-Analysen gelagert.

A.3. Protokoll A3

1.0 100 ml des beimpften Materials werden durch eine PTHK-Minitan (1 Stapel) bei einer 5:1 Filtrat zu Permeat-Fließgeschwindigkeitsaufspaltung filtriert. Die h-GH-Lösung wird wie im Protokoll A.1.1 beschrieben bei diesen Bedingungen gewaschen.
2.0 Drei 1 ml Proben des filtrierten Produkts werden zurückbehalten (A7) und bei -70ºC für SV-40- und h- GH-Analysen gelagert.

C. Kontrollen

C.1. Einfrier-Auftau-Kontrolluntersuchung

Aufgabe: Es sollte bestimmt werden, ob SV40 bei Konzentrationen, die etwa denen der Proben in Protokoll A entsprechen, bei -70ºC eingefroren und aufgetaut werden kann, um den Virustiter zu bestimmen.
1.0 SV40-Stammlösung bei 10&sup7; pfu/ml wird seriell verdünnt auf 10, 10² und 10³ pfu/ml in 0,01 M Ammoniumbicarbonat.
2.0 Man läßt 1 ml Proben von jeder Konzentration bei Raumtemperatur für eine Zeitdauer stehen, die gleich ist zu der im Protokoll A (etwa 4 Stunden) und testet sofort auf SV-40 ohne weitere Behandlung (C1).
3.0 Aliquote aller drei Konzentrationen werden bei -70ºC für eine Zeitdauer eingefroren, die der im Protokoll A1 verwendeten Lagerzeit gleicht.
4.0 Alle drei Konzentrationen werden auf Raumtemperatur aufgetaut und auf SV-40 getestet (C2).

C.2. Gepufferte Toxizität (Arnmoniumbicarbonat und h-GH)

Aufgabe: Es soll die Toxizität sowohl von 0,01 M Ammoniumbicarbonatpuffer und h-GH in diesem Puffer auf den SV40-Plaquetest bestimmt werden.
1.0 Eine Lösung von 0,01 M Ammoniumbicarbonat wird mit der SV-40-Stammlösung auf eine Konzentration von 10&sup4; pfu/ml versetzt. Diese Probe wird auf SV-40 getestet (C8) und der Titer mit dem der SV-40-Standardkurve verglichen.
2.0 0,01 M Ammoniumbicarbonat wird seriell 10 x (Probe C9) und 100 x (Probe C10) in Gewebekulturmedium verdünnt. Jede dieser Proben wird mit SV-40-Stammlösung auf eine Konzentration von 10&sup4; pfu/ml beimpft und getestet.
3.0 SV-40-Stammlösung mit 10&sup7; pfu/ml wird 1/20 verdünnt in h-GH-Stammlösung in 0,01 M Ammoniumbicarbonat, um eine SV40-Endkonzentration von etwa 10&sup6; pfu/ml herzustellen. Diese Lösung wird auf SV-40-Titer getestet (Probe C7).

C.3. 6 M Harnstoff-Kontrolle

Aufgabe: Es soll die Virusinaktivierungsfähigkeit einer Behandlung mit 6 M Harnstoff von SV-40-Virus bestimmt werden.
1.0 5 ml der SV40-Stammlösung werden verwendet, um 95,0 ml der h-GH-Stammlösung bei 2 mg/m1 in 0,01 M Ammoniumbicarbonat auf eine Endkonzentration von 10&sup6; pfu/ml SV40 zu beimpfen.
2.0 Drei 1 ml Proben werden abgenommen (C3) und bei -70ºC für SV-40- und h-GH-Analysen auf bewahrt.
3.0 Harnstoff wird auf eine Endkonzentration von 6 M Harnstoff zugegeben und 16 Stunden bei 4ºC stehengelassen.
4.0 Der Harnstoff wird durch Filtration unter Verwendung einer PTGC-Minitan, wie im Protokoll A.1. beschrieben, entfernt.
5.0 Drei 4 ml Proben dieser filtrierten Lösung werden für SV-40- und h-GH-Analysen zurückbehalten und bei -70ºC gelagert (C4).

C.4. 10 K Dalton UF-Kontrolle

Aufgabe: es soll die PTGC-Minitan bewertet werden.
Anmerkung: Proben aus diesem Experiment werden nur falls erforderlich gelagert und analysiert, d.h. die Probe A4 zeigt einen signifikanten SV40-Verlust.
1.0. 5 ml der SV40-Stammlösung werden mit 95 ml der h-GH- Stammlösung in 0,01 M Ammoniumbicarbonat bei 2 mg/ml auf eine Endkonzentration von etwa 10&sup4; pfu/ml SV40 vermischt.
2.0 Drei 1 ml Proben werden zurückbehalten (C5) und bei -70ºC für die SV-40-Analyse gelagert.
3.0 Die beimpfte Lösung wird unter Verwendung der PTGC- Minitan auf ein Endvolumen von etwa 10 ml konzentriert.
4.0 Drei 1 ml Proben des 10 ml Volumens werden zurückbehalten und bei -70ºC gelagert (C6).

Materialien

1.0 SV40-Stammlösung mit 2 x 10&sup7; pfu/ml.
2.0 Lyophilisiertes h-GH : 1,5 g.
3.0 Ammoniumbicarbonat.
4.0 Harnstoff.
5.0 Steriles Wasser.
6.0 Filtereinheiten.
Protokoll A: 10 PTHK-Minitan-Pakete
4 PTGC-Minitan-Pakete
4 Minitaneinheiten
Membran: Zwei Membrane werden aus PLMK, PKMK und PZHK ausgewählt.
Die Auswahl wird auf der Grundlage der h- GH-Passage durchgeführt.
Die h-GH-Passage wird bei Millipore in Bedford unter Verwendung von h-GH, welches von Ares-Serono an Millipore gesandt wurde, vorherbestimmt.

Proteinbestimmung

Die Proteinbestimmung bei den Feed- und Permeatlösungen wird mit Hilfe des Farbbindungsverfahrens von Brandford durchgeführt (Anal. Biochem. 72,248 (1976)).
Es wird das BioRad-Proteintest-Farbreagenz auf (500-006) verwendet. Beim Standard handelt es sich um gereinigtes Hypophysen-hGH (1 mg/ml), welches bei -20ºC oder darunter gelagert wird.
1. Das Testverfahren ist wie folgt
a. Standardkurve
Die Standardkurve wird für jeden neuen Behälter mit Farbreagenzkonzentrat bestimmt. Hypophysen-hGH (0,1 mg/ml) Destilliertes Wasser Farbreagenzkonzentrat
* Die Spalten repräsentieren Volumina in µl
* Die Tests wurden dreifach durchgeführt, mit Ausnahme der Blindwertlösung.
* Nach einer Inkubation von 15 Minuten werden die OD (595 nm) der Standardproben gegen den Reagenz-Leerwert aufgezeichnet.
* Die Standardkurve wird dadurch erhalten, daß die OD (595 nm) gegen die Konzentrationen des Standards aufgetragen wird.
* Die Steigung der Standardkurve wird anschließend berechnet.
b) Präperation der hGH-Probe
* Die hGH-Lösung wird mit destilliertem Wasser verdünnt, um etwa 1-2 mg Protein/ml zu erhalten.
* Ein geeignetes Volumen der verdünnten Probe, enthaltend 5 bis 20 ug, wird in die Teströhrchen gegeben. Das Gesamtvolumen wird mit Wasser auf 800 aufgefüllt.
* 200 µl des Farbreagenzkonzentrats werden anschließend zugegeben und vermischt.
* Die OD (595 nm) wird nach 15 Minuten Inkubation gegen den Reagenz-Leerwert aufgezeichnet.
2. Bestimmung der hGH-Konzentration:
OD (hGH) x Steigung der Standardkurve/Volumen der verdünnten Probe = ... µg/ml Probenkennzeichnung Proben code Probenkennzeichung Volumen pro Probe (ml) geschätzte Konzentration (pfu/ml) Anzahl an Verdünnung Stamm rekonstituiert h-GH Beimpfter h-GH-Feed h-GH h-GH nach PTHK-Filtration gemäß Protokoll A1 h-GH nach PTHK-Filtration, konzentriert 10x über 10.000 Dalton Ultrafiltration Harnstoffgewaschene h-GH-Lösung nach Harnstoffentfernung h-GH nach PTHK-Filtration gemäß Protokoll A2 h-GH nach PTHK-Filtration gemäß Protokoll A3 Probenkennzeichnung Probencode Probenkennzeichung Volumen pro Probe (ml) geschätzte Konzentration (pfu/ml) Anzahl an Verdünnungen Einfrieren/Auftauen Kontrolle SV40-Stammlösung, verdünnt auf 10³ pfu/ml SV40-Stammlösung, verdünnt auf 10² pfu/ml SV40-Stammlösung, verdünnt auf 10 pfu/ml Aufgetaute Kontrollen 6 M Harnstoff Kontrolle beimpfter hGH-Feed bei 10&sup6; pfu/ml Harnstoff-behandeltes h-GH nach Harnstoffentfernung über 10.000 Dalton UF-Waschschritt 10.000K-UK-Kontrolle: beimpfter h-GH-Feed bei 10&sup4; pfu/ml Retentat nach 10.000 Dalton UF 10-fache Konzentration Puffertoxizität: beimpftes h-GH bei 10&sup6; pfu/ml Puffertoxizität: Ammoniumbicarbonat puffer Ammoniumbicarbonat verdünnt 10x in Gewebekulturmedium Ammoniumbicarbonat verdünnt 100x in Gewebekulturmedium
Anhand der oben beschriebenen Beispiele konnte gezeigt werden, daß die Filtration unter Verwendung der 100.000 Dalton Ausschluß-Filtermembran in einem Kassettensystem mit einem gereinigten Extrakt gereinigte Hormonextrakte menschlichen oder anderen Säugetier-Ursprungs ergibt, aus denen virale Kontaminanten effektiv entfernt wurden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist demnach ein industriell anwendbares Verfahren, durch welches biologische Flüssigkeiten in einem kommerziellen Maßstab gereinigt werden können. Weiterhin verringert die in dieser Anmeldung offenbarte Verwendung von Harnstoff als ein Dekontaminationsmittel und die Verwendung anderer Techniken, z.B. von Verdünnungstechniken, die Wahrscheinlichkeit, daß virale Infektionen an Empfänger von biologischen Flüssigkeiten, die erfindungsgemäß behandelt wurden, weitergegeben werden.
Es ist selbstverständlich, daß der Fachmann an der Erfindung vernünftige Veränderungen vornehmen kann, ohne hierdurch vom Erfindungsgedanken abzuweichen.

Claims

1. Verfahren, um die virale Infektivität eines biologischen Produktes ohne signifikanten Verlust des Produkts im wesentlichen zu verringern oder virale Kontaminanten aus einem biologischen Produkt ohne signifikanten Verlust des Produkts im wesentlichen zu entfernen, dadurch gekennzeichnet, daß es die Tangentialstromfiltration einer das biologische Produkt enthaltenden Flüssigkeit durch eine Ultrafiltrationsmembran mit einem 100.000 Dalton Rückhaltevermögen und die Wiedergewinnung des biologischen Produktes aus dem Filtrat umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Membran die folgenden Merkmale aufweist:

Retention: Dextranblau ≥ 99%

IgG ≥ 95%

Durchlauf: Albumin ≥ 60%

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das gefilterte biologische Produkt mit Harnstoff in Kontakt gebracht wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das biologische Produkt menschliches Wachstumshormon ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Ultrafiltrationsmembran die virale Infektivität um wenigstens 99,6% verringert, während eine Wiedergewinnung des Produkts von wenigstens 90% ermöglicht wird.