JPH02102A - 精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 限外濾過による生物流体の精製は、かかる流体のいろい
ろな成分の分子量が近似していることに帰因し種々の問
題をはらんでいた。たとえ濃縮（例えば小さな分子に対
するより大きな分子の割合が高められている流体の単離
）が知られているとはいえ、限外濾過を通じて小さい分
子から大きい分子を除去するかまたは完全に分離するた
めの純粋に物理的な手段の使用は、従来の文献に記載さ
れていなかった。

他方、限外濾過手段によるウィルス類の濃縮は次の文献
に記載されている。

Ｊ、Ｄ、Ｇａｎｇｅｍｉ等、「分子濾過によるアレナウ
イルスの濃縮」Δ　１ｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎ
ｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒ。

垣ムｕＲ■ｂ工ｖｏ１．３４．　Ｎｏ、３（１９７７年
、９月）３３０〜３３２頁、 Ｇ、Ｐ、５ｈｉｂｌｅｙ等、「エプスタイン・バールウ
ィルスの大規模増殖と濃縮のための新規な方法」八ｐｐ
ｌｉｅｄ　　ａｎｄ　　ＥｎｖｉｒｏｎＩＩＩｅｎｔａ
ｌ　　Ｍｉｃｒｏｂｔｏｌｏｇｙ＋　　ｖｏｌ。

４０、　Ｎｏ、６　（１９８０年、１２月）　１４０４
〜１０４８頁、およびり、ＥｏＭａｔｈｅｓ等、［多量
の組織培養流体からネコ白血病ウィルスの精製Ｊ　Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒＣ１１ｎ
ｉｃａ１．　ｖｏｌ、５．　Ｎｏ、３（１９７７年、３
月）３７２〜３７４頁。

これらの文献や本明細書に記載されるすべての他の文献
は、引用することにより本明細書の内容となる。

〔発明の概要〕

特殊のタイプの濾過膜を用いる物理的な分離技術を使用
することにより、ウィルスならびに同様なサイズおよび
／もしくは分子量のその他の汚染物が生物流体、例えば
尿、脳下垂体、および他の器官等に由来する抽出物から
除去または単離し得ることを発明した。

好ましい態様としては、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を
含む脳下垂体抽出物からレトロウィルスおよびスローウ
ィルス（すなわち、ＡＩＤＳおよびＣＪＤ等）の汚染物
を除去するために、１００，０００ダルトン・カットオ
フの限外濾過ｒＰＴＨＫＪ膜〔ミリボア社０ｆｉｌｌｉ
ｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ）製〕が使用される。

この方法は、生成物の約９０％〜約９９％の回収が可能
である。

〔発明の長所〕

本発明の方法は、他の生物流体の精製法を陵駕する多数
の長所を有する。例えば、本発明の方法は化学的および
／または熱処理よりも非常に簡便である。従って、通常
の化学的および／または熱処理に一般的に付随するコス
トやエネルギーの消費が避けられる。

さらに、本発明により処理された流体は、ヒトまたは他
の動物、好ましくは補乳類に投与するために単独または
他の適切な剤、例えばリン酸緩衝溶液との組み合わせで
使用するのに好都合である。

本発明の他の長所および態様は、本発明についての次の
記載から明らかになるであろう。

〔発明の記載〕

本発明は、生物起源の生成物（すなわち、体液／器官に
由来する物質）の精製方法であって、１００．０００ダ
ルトン（ｄａｌｔｏｎ）　　・カントオフを有する濾過
膜を用いて溶液としての不純な生成物を濾過する段階を
含んでなる方法を提供する。

別置すれば、本発明は、一定の特性を有する限外濾過膜
を用いる生物学的な抽出物からのウィルスの除去に関す
る。

他に明記しない限り、本明細書に示す全てのパーセンテ
ージは重量パーセンテージであり、そして合計組成物重
量に基づく。

Ｃ濾過システム〕 本発明の方法に使用される濾過システムは、限外濾過膜
を必要とする。ある態様では、例えばカセット濾過シス
テムが使用され、またタンジェンシャル・フロー（ｔａ
ｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗ）を伴う。

本発明の実施に適する装置は、ミリボア社（Ｍｉｌｌｉ
ｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｅｄｆｏ
ｒｄ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ＋　Ｕ、Ｓ、Ａ）
から市販されている。

タンジエンシャル・フロー濾過は、小さな（濾過物）分
子からより大きな（残留物）分子の分離についての公知
技術である。生物学的な加工系では、この方法は、膜を
通過する濾過物を集めるか、または膜を通過しない残留
物を濃縮するかのいずれかに使用されてきた。

生物流体からウィルス分子および／または他の不純物を
濃縮する方法が既知であるからといっても、高純度の濾
液が得られるような（すなわち、９０％〜９５％または
それ以上の濾過効率を有する）生物流体から不純物を効
率よく除去することは知られていない。

濾過効率とは、流体または抽出物の初期量に対する濾過
物量の割合を示す。

除去技術（濃縮技術に対立するところの）では、濾過効
率は、約４０〜約５０％と比較的低い。このことは、残
留した濃厚物（すな・わち、残留物）が無視できない量
の濾過物を含むからである。従って、かかる濃厚物は、
６０〜９０（重量）％の残留物および１０〜４０（重量
）％の濾過物を含む可能性がある。

これらに対比し、本発明の精製または除去技術は、残留
物に非常に少量の濾過物を残すに留まる。

すなわち、ウィルスまたは他の汚染物が濾過膜中または
濾過膜上に捕捉される場合には、生物流体の約１ｐｐＩ
Ｉｌ以下が損なわれる。これらの汚染物、すなわち洗浄
操作後の残留物は、その後廃棄される。

本発明で用いられる濾過膜は、生物物質および医薬の処
理において使用するためにディスクおよびカセットシス
テムで市販されている限外濾過膜である。

膜自体は、ミリボア社によりｒ　ＰＴＨＫ　Ｊと表示さ
れており、そして２０％のグリセリンを用いるポリプロ
ピレン目止剤上でキャストされたポリスルホン膜である
。またそれは、ホルムアルデヒドにより保護されている
。

好ましい膜の１つは、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
ＰＴＨＫ限外濾過膜である。その規格は次のとおりであ
る： 保　持ニブルーデキストラン　　≧９９％ＩｇＧ　　　
　　　　　　２９５％ 通　過：アルブミン　　　　　　≧６０％保持マーカー
は、１〜Ｌｏｏｐｓ　ｉの平均膜処理圧において一定で
あり、通過の挙動は圧と溶質とに依存する。

〔保全性〕

十分に湿潤させた膜について、５ｐｓｉの空気圧で試験
した場合、ｆｔ”当たりの空気拡散量は２．００１１ｄ
Ｚ分以下である。

〔化学的な適合性〕

膜は、水および２０％までのアルコール水と適合性であ
る。その使用できるｐＨ範囲は１〜１４である。１．０
ＭまでのＮａＯＨにより再生可能である。

その温度限界は５０℃であり、そしてＮａＯＨまたはＮ
ａ０Ｃ１により発熱物質を除去することができる。

この好ましい膜は、ミリポア社の種々の報告類で検討さ
れている、ＡＤ８４１．０Ｍ１４１．およびＵＦＯＯ９
である。

この膜は、ディスクかまたはカセットのいずれかでシス
テムに設置することができる。しかしながら、カセット
システムを利用するのが好ましい。

製造者（ミリポア）は、そのカセットシステムを「ペリ
コン（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）　Ｊカセットシステム（大容
量用）または「ミニタン（Ｍｉｎｉｔａｎ）　Ｊシステ
ム（小容量用）と称している。ディスク膜は、減圧下に
撹拌容器システムで使用される。

他の有用な濾過システムは、サルトリウス（Ｓａｒｔｏ
ｒｉｕｓ）およびフィルトロン（Ｆｉｌｔｒｏｎ）等の
５Ｍ１６５２７を含む。

〔濾過パラメーター〕

処理される生物流体は、約３００〜約５００ｍ１／分ま
たはそれ以上の速度で濾過システムを介してポンプ輸送
される。

使用される膜は、一般に各カセット単たり０．４６ｍ′
の表面を有すると記載されている。勿論、１以上のカセ
ットを利用することができ、この場合はシステムを通過
する流速を適宜に高めなければならない。ミニタンシス
テムでは、約１２０〜約６００ｃｒＡの表面積が普通で
ある。ベリコンシステムでは、約４６５〜約４６，５０
０−が普通である。これらの範囲は、使用されるカセッ
ト数に対応する。

使用される圧は、約０．２〜約１．５バール、好ましく
は０．３〜１．０バールの範囲内で変動し得るが、より
高圧でも使用することができる。

温度は臨界的でない。しかしながら、濾過方法は約２〜
１０℃の温度で実施するのが一般に好ましい。

残留物の流速と濾過物の流速との比率は、使用される背
圧の関数である。それは約３０〜約６０％との間で変動
することができるが、約５０％の比率が好ましい。

〔生物流体〕

本発明により処理される生物流体、すなわち、そのもの
からウィルスおよび／または他の汚染物が除去されるも
のは、ヒトまたは動物に由来する多様な液体および半流
動体、すなわち体部に由来する組織または流体を包含す
る。かかる組織についての好ましい供給源または器官は
、ヒトおよび他の哺乳類である。しかしながら、非哺乳
類源に由来する組織および他の液体も使用することがで
きる。

処理される抽出物または他の生物流体は、宿主器官の正
常な代謝を経て産生される組織および体液の物理的処理
から得られるものが好ましい。従って、血液および尿等
も処理することができる。

さらに、組換え技術を使用して誘導される調製物、例え
ばｒｅｃ−ｈＧＨのようなホルモンの含有物も本発明の
方法を用いて精製することができる。従って、細胞培養
物、例えば遺伝子工学を施した哺乳類および／またはウ
ィルス性細胞の含有物を本発明に従って処理することが
できる。ホルモン等、例えばＦＳＨ，ＬＨ，ＨＣＧ、　
ｈＧＨ，ＥＧＦ、　インターフェロン等を含有する調製
物が、本発明により処理される好ましい物質である。

流体または抽出物が誘導される組織の種類は臨界的でな
い。しかしながら、組織は、身体の構成員、例えば通常
の抽出技術により哺乳類の器官また腺に由来するものが
好ましい。従って、すべての哺乳類の脳、肝臓、心臓等
に由来する抽出物が好ましい。ヒト、ハムスター、マウ
スおよびラット等の脳の存在物、特に、脳下垂体に由来
する抽出物が好ましい。成長ホルモンを含有する抽出物
がより好ましい。抽出物類の混合物も使用することがで
きる。

Ｍｉ織、本発明の他の細胞性物質または体液から処理さ
れる対象となる流体を取り出すために使用される抽出技
術は、限定されるものでない。しかしながら、流体は、
溶媒もしくは塩沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、
およびサイズ排除クロマトグラフィー等のような手段を
経て得られるものが一般に好ましい。処理される流体は
、粒子が除去された、例えば０．４５ｍのフィルターま
たは他の適当な濾過装置により浄化されたものでなけれ
ばならない。

尿素、ＮａＯＨ、ＮＨＪＣＯｉおよびリン酸緩衝剤の如
き溶質および／またはｐＨ安定剤が、処理される生物流
体中に一般に存在せめられる。混合物も実施可能である
。多様な溶質を使用することができる。

しかしながら、膜の有効性を変更するような前記溶質は
、避けるべきである。

尿素および／または他の脱汚染剤の適当量は、処理後の
流体中に残存するいずれかの汚染物を失活せしめるため
にも使用することができる。スクレーピー（Ｓｃｒａｐ
ｉｅ）およびＣＪＤの感染力の減退についての尿素の作
用は、過去に研究されている。

殆どの研究者（Ｈｕｎｔｅｒ等＋１９８６．　Ｋｉｍｂ
ｅｒｌｉｎおよびＷａｌｋｅｒ、１９８５９Ｍａｒｃｈ
等、　１９８４．　Ｐｒｕｓｉｎｅｒ、　１９８２．な
らびにＭｏｕｌｄ、未公表データ、　１９６９）は、実
際には彼等の実験方法は異なるにもかかわらず感染力の
２〜３０グ（ｌｏｇｓ）の減退を見出している０本発明
者等も前記と同様に、スクレーピー感染ハムスターまた
はＣＪＤ感染モルモットの脳均質物に２０％までの尿素
を添加したものに由来する効果は、明瞭には観察されな
かったとするブラウン（Ｂｒｏｉｍｎ）等の観察と異な
る結果を得ている。

過去においては、感染力の失活のためにＮａＯＨをを使
用することが勧められていた。しかしながら、約２〜約
８Ｍ濃度の尿素、好ましくは６Ｍの尿素溶液にさらした
場合には、何んらの観察し得る変性を生じないにもかか
わらず、ＮａＯＨは、ｈＧＨの部分的な失活および変性
を惹起する。

限外濾過の後に尿素または他の適当な薬剤が使用される
。これは分離した化学的な失活段階であり、残存するウ
ィルスの感染性を除去するためのものである。処理後、
尿素は１０．０００ダルトン・カットオフのカセットを
備える限外濾過により除去される。

〔汚染物〕

本発明の精製方法を用いて生物流体から除去される汚染
物質は、所期の濾過を通じて分子量１００．０００ダル
トンの濾過膜により、それらが残されるに必要なサイズ
を有するすべての物体である。

従って、本発明により除去されそして処分されるウィル
スまたはその他の汚染物は、適当なサイズのヒトおよび
／または動物のウィルスである。

γ−グロブリンおよびブルーデキストランが使用される
濾過膜に対する保持マーカーであることから、その膜上
に残存される汚染物の分子量は、１００．０００よりわ
ずかに大きいもの、すなわち１１　、０００以上である
といえる。

本発明の方法および濾過システムを用いて除去すること
ができるウィルス性汚染物は、いわゆる「スロー」ウィ
ルス、例えばスクレーピーウィルスおよびクロイツフェ
ルド・ヤコブ（ＣｒｅｕｔｚｆｅｌｄＪａｋｏｂ）症候
群のウィルス（ＣＪ　Ｄ）等を包含する。

本発明の濾過システムを用いて生物流体および生物学的
抽出物から除去することができる他の汚染物は、−船釣
なウィルス、例えばＡＩＤＳ（ｌ（ｍ、ＳＶ４０、肝炎
ウィルスならびにウィルス様粒子、例えばプリオン等を
包含する。かかる不純物の混合物も除去することができ
る。

精製ホルモンまたは他の流体から汚染物を除去した後、
濾過膜上に保持される汚染物は、それらから洗い流され
、そして適当な方法、例えば焼却、埋葬、オートクレー
ブまたは不活性化により廃棄される。

次に、精製した流体は、貯蔵、管理、包装または流体の
その他の加工のために適する手段に供される。かかる加
工としては、凍結乾燥、溶媒沈殿、冷凍、凍結（内容物
だけかまたは溶液として）および尿素処理等を挙げるこ
とができる。これらの技術の１以上および／または他の
加工技術を利用することもできる。

以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。

〔実施例〕

この例は、セロノのｈＧＨ（Ｓｅｒｏｎｏ’ｓ　ｈＧＩ
Ｉ）（ｒＧＲＯＲＭ　Ｊとして市販されている）へのス
クレーピー作因の導入および２５ｎＭ限外濾過膜と１０
０．　ＯＯＯＭＷ限外濾過膜との排除能の比較ならびに
さらに６Ｍ尿素による処理効果を示す。

〔方　法〕

一グイ」弓（源 スクレーピー２６３に株で感染したハムスターの脳を「
スローウィルス」汚染物として使用した。スクレーピー
作因は、ＣＪＤ作因と同様な生物学的および物理化学的
特性を有することが示されている。ハムスター適応性ス
クレーピー株は、その短いインキュベーション期間〔ウ
ィルスの最高量の脳内（ＩＣ）接種後５５〜６０日〕お
よびその強いウィルス感染力価（脳のｇ当たりｉｏ”ｔ
、Ｄｓ。）故に選ばれた。

にｉｍｂｅｒｌｉｎおよびＷａｌｋｅｒにより分離され
た（１９７７）スクレーピーのハムスター適応性２６３
に株を、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）　（ｐＨ７，４）中
１０％のスクレービー感染の脳均質物で脳内（ＩＣ）接
種することによりゴールアン・シリアン（ｇｏｌｄｅｎ
　５ｙｒｉａｎ）ハムスター中を２度通過させた。ノ＼
ムスターの脳を末期症状の動物から無菌的に取り出し、
直ちに８０℃で凍結させた。凍結した脳を溶解し、そし
て最終濃度が１０％となるように滅菌リン酸緩衝溶液（
ｐＨ７，４）中で均質化した。懸濁物を１５００　ｇで
３０分間遠心し、次いで上澄を５艷の既知小量に分注し
、そして−８０℃にて冷凍貯蔵した。

スクレーピー　　ｈＧＨの 凍結乾燥ｈＧＨ（９０％純度の単量体ヒト成長ホルモン
タンパク）を０．０１ＭのＮＩ＋４．）ｌｃＯ３（１）
Ｈ８，０）１０　、８　ｙｄｌに溶解しておき、スクレ
ーピー２６３に株怒染ハムスターの脳の１０％の浄化懸
濁液１．２ｍｌを超音波処理（３×５秒）し、次いで前
記ｈＧＨ溶液に添加して最終容量を１２ｍ１とした。サ
ンプル２ｍｌを抜き取り感染力価を測定した。

斉力」■昼劇ｌ戊狡 予測力価：約１０１１ＬＤ”／ｍｊ！または５　Ｘ　１
０６ＬＤ５′１０．０５ｄ。

サンプルを１０−　”まで１０倍ずつくり返し希釈した
。未希釈から１０−　”までの各段階の希釈物の既知小
量０．０５＋＋＋７！を各１２匹のハムスターに脳内接
種した（動物の数：　１２　Ｘ　１１＝１３２）。

ここで添加される希釈剤も次のアッセイで添加される希
釈剤も０．０１モルＮＨ，ＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８，０
）であった。

残りの１０ｍ１を２個の等しい既知小量の５　ｍｌに分
配した。５　ｍｌの既知小遣（第２番目のアッセイ力価
）を０．ＯＩＭのＮＨ，）ｌｃＯ３で１００−まで希釈
し、１００．０００カツトオフ限外濾過膜を通過させた
。この濾液を限外濾過により濃縮し次いで凍結乾燥し、
そして最終容量を５−に調整した。２ｍｌのサンプルを
抜き取り第２番目のアッセイ力価に供した。

−２目のアッセイ 前記サンプルを連続的に１０倍ずつ１０−Ｓまで希釈し
、未希釈のサンプルおよび各希釈サンプルの既知小量の
０．０５−を各１２匹のハムスターに脳内接種した（動
物の数：　１２Ｘ　６　＝７２）。

残りの濾過物３　ｍｌを次のように６Ｍ尿素で処理した
。

（１）この３　ｍｌの既知小量に１．４０ｇの尿素（分
子量６０．０２、比容積０．７５６）を添加して６Ｍの
最終濃度とした。４°Ｃで一夜処理した後、溶液をＮＨ
４１１Ｃ（ｈ緩衝液に対して限外濾過により透析して尿
素を除去した。次に、この溶液を凍結乾燥した後、０．
０１ＭのＮＨ４１ＣＯ，（ｐＨ８，０）　３　ｍｌに再
）種？蜀した。

＃、３　　のアッセイ 前記の全量を未希釈のままハムスターの脳内に注入した
（動物の数：６０）。

（２）第２の５　ｍｌの既知小量を２２０ｎＭ、４０ｎ
Ｍおよび２５ｎＭから成る一連の濾過膜を通過させた。

濾液を限外濾過により濃縮し次いで凍結乾燥し、そして
最終容量を１０ｍＭの炭酸アンモニウムで５−に調整し
た。２ｒＲＩｌのサンプルを抜き取り第５番目のアッセ
イ力価の測定に供した。

−Ｊ５　目のアッセイ サンプルを、１００単位／　ｍｌのペニシリンおよび０
、１■／　ｍｌのストレプトマイシンを含有するリン酸
緩衝溶液（ＰＢＳ）で１０−５まで連続的に１０倍ずつ
希釈した。未希釈および各希釈サンプルの既知小量ｏ、
ｏｓｍｌを各１２匹のハムスターに脳内接種した（動物
数：　１２Ｘ　６　＝７２）。

残りの３−の濾液を次のように処理した。

（３）この３１Ｒ１の既知小量に１．４０ｇの尿素（分
子量６０．０２、比容積０．７５６）を添加して６Ｍの
最終濃度とした。４℃で一夜処理した後、溶液をＮＨ４
ＨＣＯ３緩衝液に対して限外濾過により透析して尿素を
除去した。次に、この溶液を凍結乾燥した後、０．０１
ＭのＮＨ４１１ＣＯｉ（ｐＨ８，０）　３−に再懸濁し
た。

７６　目のアッセイ 前記の全量を未希釈のままハムスターの脳内に注入した
（動物の数：６０）。

１００、ＯＯＯＭＨにおける限外濾過操作は、８パケツ
トの膜を装備したミニタンシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ）におけるタンジェンシャル（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ
）濾過を用い、約０．５バールの圧の下に４℃で実施し
た。

２５ｎｍの濾過は、０．４７ｍのスウィンネックス・フ
ィルター・ホルダー・ミリポア（Ｓｗｉｎｎｅｘ　Ｆｉ
ｌｔｅｒＨｏｌｄｅｒ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を装備し
たミリポア６００ｄ装填用ユニツトにおいて実施した。

猪−来 前述の測定法および濾過調製物を用いる実験室汚染の残
留に対する効果を次の表に、示す。

リード（Ｒｅｅｄ）およびムユンヒ（Ｍｕｅｎｃｈ）の
方法に従って計算した感染性力価は、１０’・’１０．
０５ｍ！（脳の１ｇ当たり１０”１）のＬ［ｌ、。値を
示した。

のア　セイ　１００　ＯＯＯＭＨ リードおよびムユンヒの方法に従って計算した感染性力
価は、１０”１１０．０５ａｄ　（脳の１ｇ当たり１０
ｈ１）のｔ、ＯＳ。値を示した。

１００、ＯＯＯＭＷ濾過後は、２．４　ｌｏｇ、の感染
力価の減退が存在する。

第３番目のアッセイ用サンプルの全量を５８匹の乳離し
たハムスターに脳内接種した。１匹の動物は、接種処置
後直ちに死んでしまった。４６匹のハムスターは、接種
後１２６．０±１３．９日でスクレーピー症状の徴候を
示した。残りの１１匹の動物は、接種後１８０日目でも
生存し、そしてスクレーピー症状の徴候を全く示さなか
った。死亡率は８０．７％で、かつインキュページ四ン
期間により計算した感染性力価は、脳の１ｇ当たり１０
”・軸１．３のＬｌ）Ｓ。値を示した。

１００、　ＯＯＯＭ−濾過＋６Ｍ尿素処理後は、５．９
±１、３　ｌｏｇの感染性力価の減退が存在する。

リードおよびムユンヒの方法に従って計算した感染力価
は、１０３・’１０．０５ｍ　（脳の１ｇ当たり１０６
・７）のＬＤ、。値を示した。

２５ｎｍ濾過後は、２．１　ｌｏｇの感染性力価の減退
が存在する。

第６番目のアッセイ用サンプルの＆８量を５３匹の乳離
したハムスターに脳内接種した。１匹の動物は、接種処
置後直ちに死んでしまった。５０匹のハムスターは、接
種後１１１．７　＋　１０．６日でスクレーピー症状の
徴候を示した。残りの２匹の動物は、接種後１８０日目
でも生存し、そしてスクレーピー症状の徴候を全く示さ
なかった。死亡率は９６．２％で、かつインキュベーシ
ョン期間により計算した感染性力価は、脳の１ｇ当たり
１０′・２宜１　のＬＤ、。値を示した。

２５ｎｍ濾過＋６Ｍ尿素処理後は、４．６±１．０　ｌ
ｏｇの感染性力価の減退が存在する。

本発明に従って処理したサンプル（すなわち、１００、
ＯＯＯＭＷカットオカットオフ膜限外濾過し、そして尿
素と接触せしめる段階を有しないか、または有すもの）
は、より低い比率の感染性を示した。

一般に、感染性は９９．６％減退した（すなわち、サン
プルを２ｎｍ濾過システムを使用して濾過した場合に比
較して）。

感染性に対する濾過の効果を第６表に示した。

第６表 （ａ）感染力価は、滴定の終点（Ａｎ＋、　Ｊ、　Ｈｙ
ｇ、　２７：４９３〜９７　（１９３８）参照〕または
インキュベーション時間（Ｊ、　Ｃｏｓ＋ｐ、　Ｐａｔ
ｈｏｌ、　７９：１５〜２２（１９６９）参照〕による
（ｂ）の測定により、脳の１ｇ当たりの一１０ｇ＋ｅＬ
Ｄｓｏｉ、ｃ、単位で表シタ。

６Ｍの尿素にさらした１００．　ＯＯＯＭＷカフトオカ
ットオフ膜５ｎ−濾液（ＣＵ）に対して処理した場合よ
りも強い不活化効果を示した。感染から症状の徴候の発
現までの平均日数は、ＢＵについては１３６．５　＋／
−４，０日（平均＋ＳＦＡＭ）であり、ＣＵについては
１１４．２　＋　／−２，３日であった。この相違は、
ｐ　＜０．０００１のレベルでＴ−試験およびウイルコ
キソン（Ｗｉ　１ｃｏｘｏｎ）試験に携わる研究者にと
って統計上有意である。ＢＵに影響を受ける動物の数は
、５８匹のうち５４匹であり、ＣＵについては５２匹の
うち５２匹である。カイ二乗解析によれば、この値の相
違は、有意（ｐ＝０．０２０７）である。２５ｎｌｌ＋
の濾過膜による濾過＋尿素の組み合わせが、１００、０
００力ツトオフ濾過＋６Ｍ尿素よりも低レベルのスクレ
ービー排除を示す理由は、この段階では説明することが
できない。

この試験では、１０（８，８）ｌｏｇ／ｇ＋ｍの感染性
力価を有する高感東部均質物に対して２種の複合的な方
法（１００，ＯＯＯＭＷカットオカットオフ濾過＋６有
する濾液の精製）が適用された。これらの２つの方法は
、まった（前処理または後精製段階の適用がなくとも、
約６　ｌｏｇまで感染性を減退させた。

すでに精製されているｈＧＨに対して本発明の方法が適
用される場合には、ｈＧＨまたはそれらが利用されるも
のの他の調製物の安全率をさらに高める。それ故に、本
発明の２段階が調製物の安全性を有意に高めるので、た
とえ最新の技術が使用されているとしても、さらにこれ
らの２つの手順により調製物が処理されるにちがいない
。従って、前記濾過操作または尿素だけの添加物を伴う
濾過操作および他の精製技術の組み合わせ使用が予期さ
れる。

炭１ この例は、１００．０００ダルトン・カットオフ膜を用
いて尿に由来するヒト閉経期のゴナンドトロビン（ＨＭ
Ｇ）溶液の処理を示す。

ＨＭＧ製造の最終的な沈殿段階前の濃厚溶液から尿のＨ
ＭＧ水溶液１２０−を調製した。それは次のような特性
を有していた。

量＝　１２０１Ｒ１（尿３２８１６から調製）溶液の分
析： タンパク−４，１７■／−０総タンパク＝　５０ｋ。

ＦＳＨ（バイオアッセイ）　＝１２５８０Ｉ／−（尿ｌ
ｌ当たり４６υ＾に対応）。

ｐＨ＝７．３゜ 〔この溶液をＮＨ４，ＨＣＯ３（０，１Ｍ　、　ｐＨ８
）で１ｘに希釈した。〕 この最終溶液を、カセット中の１００，０００ダルトン
・カットオフ・ミリポアＰＴＨＫ膜を使用して、１ｋｇ
／−の圧および６部２℃の温度でタンジェンシャルに濾
過した。この濾過を容量が２００艷になるまで実施し、
その後、毎回ＮＨ４ＨＣＯ３，０，１Ｍ（ｐＨ８）の緩
衝液２００ｍ７を加えながらこの濃縮を１２回繰り返し
た（工程表を参照）。

出発溶液＝５００■タンパク。

１００．０００カットオフ後： 濾　液＝０．０．ｘａＺ＝Ｑ、１２５　ｘ　３４５０　
＝　４３１■残留部＝Ｄ、０．　ｘ　ｃｄ　＝０．４　
　ｘ　　２００　＝８０＋ｗ合計５１１喀 容量　　濾　液＝３４５０ａＺ 残留部＝　２００ｍＺ 前記で得られた濾液は、１０，０００ダルトン・カント
オフの膜を通過されそして次のものが得られた。

含まれる総タンパク−４３１■ タンパクの回収（採集した濃厚物＝０．Ｄ、　Ｘ　ｍ／
＝０．８３Ｘ　４１０ｍＺ＝　３４０■（濾液＝０ ０、Ｄ、＝０．０３１ １０．０００カツトオフによるタンパクの損失＝４３１
−３４０　＝９１■ 例２の工程表を次に示す。

、ニー」し−人 （限外濾過カットオフ１００，０００）全一」［−液 （１００，０００カツトオフに由来する）３４５０ｄ。

本発明の方法を用いて生産バッチの１部を濾過して得ら
れた収量を通常に処理された生産バッチの他の部分のも
のとの比較において次の表に示す。

出発段階におけるＦＳＨ含量は、尿１１当たり４６１、
ＩＪであった。

ホルモン ＦＳＨ の な 生産収量に対する限外濾過法カットオフ１００．０００
＋カットオフｉｏ、ｏｏｏの総数率： ■↓ 例Ｉで実施されたのと同様の方法を使用して、ＳＶ４０
ウィルスをヒトの尿から除去することができた。動物試
験の結果は、１００，０００ダルトン・カットオフ膜が
使用された場合には予期したように感染性の減退を示し
た。希釈および／または尿素の添加は、感染性の低下傾
向を促進した６±圭 例１で実施されたのと同様の方法を使用して、ＡＩＤＳ
ウィルスを尿および他のヒトの生物流体から除去するこ
とができた。動物試験の結果は、本発明の膜を用いる濾
過が感染性を減退することを示した。さらに、希釈およ
び／または尿素の使用は、精製した物質におけるすべて
の残存ウィルスの活性の低下を助長した。

肛 Ｐ　Ｔ　ＩＩ　Ｋ膜端製方法によりヒト成長ホルモンか
らシミアン・ウィルス（Ｓｉｍｉａｎ　Ｖｉｒｕｓ）　
４０　　（ＳＶ４０）の研究のために開発されたプロト
コールに従って次の試験を行った。

〔目　的〕

濾過後に透過物中に出現するＳ　Ｖ　４０を用いて、Ｐ
ＴＨＫ膜のウィルス保持特性を測定することを目的とす
る。

最初の試験は、ミニタン装置に装着されたミリボアＰＴ
）ＩＫ膜を使用して、モデルとした一般的なウィルス（
ＳＶ４０）の除却と、同時にヒト成長ホルモンの通過に
対する臨界的な実施変数の影響を評価できる。第１の目
的は、０．５バールの膜透過圧下で操作した場合の膜表
面積に対するバッチ容量の比率の影響を評価することで
ある。この操作条件は、正確に１／１０のスケールにお
ける製造操作に一致する。第２の目的は、残留物の流量
に対する透過物の流量の割合、表面積に対して通過させ
得る量の限定される割合のような操作条件の影響を評価
することである。この方法で２つの操作条件を評価する
ことができる。本試験は、他の処理操作のすべて（すな
わち尿素処理、洗浄段階の回数、等）を現行の製造の実
施方法に模して設定した。

量　　および壮 供給源ニアレス・七ロノ（Ａｒｅｓ−３ｅｒｏｎｏ）名
　称：ミニタン形状のＰＴＨＫ（ＰＴＨＫ　ｉｎ　ｍ１
ｎｉｔａｎｃｏｎｆ　ｉｇｕｒａｔｉｏｎ） 供給源二ミリポア（門１１目ρｏｒｅ）１且且皿 シミリアン・ウィルス４０　（ＳＶ４０）（供給源：Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ　Ｄｅｐａｒｔｎ＋ｅｎｔ、　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉ−ａｔｅｓ、　
Ｉｎｃ、） 跋腹之ス孟左 試験システム：ビオテクノロジー・サービス・デパート
メント・ラボラトリ−（ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＳ
ｅｒｖｉｃｅｓ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ）に保管されているＳＶ４０ウィルスアッセイ
用のフェロ細胞（Ｖｅｒ。

ｃｅｌｌ）。

サンプル中に存在するＳＶ４０の量の変化をモニターす
る方法は、標準的なウィルスの定量方法を利用した。

蕾Ｕ頁および Ａ、被試験溶液は、ＳＶ４０により汚染されており、そ
して種々の操作条件下での濾過を含む濾過系を通して調
製した。サンプルは、下記に具体化されるような濾過工
程を通じて数段階で採集し、そしてプラークについてア
ッセイするまで一７０℃にて貯蔵した。

Ｂ、濾過手段の構成および実施は、発明者が独自に設定
したものである。サンプルを汚染するために用いたＳＶ
４０は、発明者等の研究施設から入手し、そしてサンプ
ルは次のプラークアッセイのための特別な精製段階から
入手した。汚染ウィルスの目標濃度は、試験材料で希釈
後、約１０’ｐｆｕ／＋ｄである。

プラークアッセイは、下記に特定されるような残余の塩
溶液において正確な力価を与えるように適当な希釈下（
サンプル当たり最高３度）で実施され得る。

１．０　　凍結乾燥したｈ−ＧＨを０．０１Ｍの炭酸水
素アンモニウム緩衝液２８５　ｌｎ１で２ｍｇ／−に再
調製した。３個の１ｄサンプルをＳＶ　−４０およびｈ
−ＧＨアフセイ用に取って置き、−７０℃にて保管した
（ＡＩ）。

２．０　　貯蔵のｈ−ＧＯ溶液２８５−を約２　Ｘ１０
’ｐｆｕ／ＩＩｄの貯蔵ＳＶ４０溶液１５−とインキュ
ベーション（１／２０希釈）して最終力価１０’ｐｆｕ
／−とした。この接種した溶液の１−サンプル３個をＳ
Ｖ　−４０およびｈ−ＧＨアッセイ用に取って置き、−
７０℃で保管した（Ａ２）。

この接種した供給試料をプロトコールＡｌ。

Ａ２およびＡ３の濾過装置への導入用として各１００−
の３つの等しい既知小量に分別した。

Ａ、１．プロトコールＡ１ １．０　　接種した供給試料１００ｄを０．５バールの
膜透過圧下でＰＴＨＫミニタン（８層）を通して濾過し
た。９度一連の洗浄を行い、ｈ−ＧＨの全量を回収した
。各洗浄段階は、出発容量が１５〜２０−に減少するま
で溶液１００−を濾過することから成る。この残りの容
量を次の洗浄段階の前に０．ＯＩＭの炭酸水素アンモニ
ウム溶液で１００−まで再希釈した。最初の濾過および
９度の洗浄の後、最終容量が８００〜８５０ｄの濾過調
製物が生じた。

２．０　　前記の濾過生成物１−サンプルの３個を取っ
て置き、ＳＶ　−４０およびｈ−Ｇｌｌの双方のアッセ
イ用（Ａ３）として−７０℃で保管した。

３．０　　前記の濾過調製物１００−を、ＰＴＧＣミニ
タンＳシステムを用いて約１０ＩＲ１まで濃縮した。こ
の１０ｓｄを取って置き（Ａ４）、ＳＶ　−４０および
ｈ−ＧＨアッセイ用として一７０℃で保管した。

４．０　　残っているＰＴＩＩＫ濾過ｈ−ＧＨ７００〜
７５０−に尿素を添加して６Ｍ尿素濃度とした。この溶
液を４℃で一夜（１６時間）維持した。

５、０　　処理後に、ＰＴＧＣミニタンを用いて７度の
連続的な０．０１Ｍ炭酸水素アンモニウム洗浄を行い尿
素を除去した。初発の１５０ｙｎｌ容積を１００　ｙｎ
ｌまで減少させた。次に、０．０１Ｍの炭酸水素アンモ
ニウム１１を加えた。この溶液の容量を再びｘｏｏ＊ｘ
まで減少させた。この洗浄工程を７度繰り返して尿素を
除去した。洗浄後、このシステムを０．０１Ｍ炭酸水素
アンモニウム３０〇−に洗い込みすべてのｈ−ＧＨを再
回収した。

６．０　　この最終工程のｈ−ＧＨ調製物の４−のサン
プル３個を取って置き、ＳＶ４０およびｈ−ＧＨアッセ
イ（Ａ５）用として一７０℃で保管した。

Ａ、２．プロトコールＡ２ １．０　　接種した供給試料１００−を、ＰＴＩ（Ｋミ
ニタン（１層）を通して、濾液対透過流量部が１：１に
なるように濾過した。これらの条件下でプロトコールＡ
、１．１と同様にｈ　−Ｇ　Ｉ＋溶液を洗浄した。

２．０　　濾過調製物の１１ｎ１サンプル３個を取って
置き（Ａ　６　）　、５Ｖ−４０およびｈ−ＧＨ７’　
ｙ　セイ用に一７０℃で保管した。

Ａ、３．プロトコールＡ３ １．０　　接種した供給試料１００−を、ＰＴＨＫミニ
タン（１層）を通して、濾液対透過流量部が５：１にな
るように濾過した。これらの条件下でプロトコールＡ、
１．１と同様にｈ−ＧＨ溶液を洗浄した。

２．０　　濾過調製物の１−サンプル３個を取って置き
くＡ　７　）、５Ｖ−４０およびｈ−ＧＨ７ツセイ用に
一７０℃で保管した。

旦一対一皿 Ｃ，１、遠猪二娃五対皿拭験 （目　的）プロトコールＡと同様な濃厚物におけるＳＶ
４０を一７０℃で凍結し、そして融解した場合に回収し
得るウィルスの力価を測定するにある。

１、０　１０’ｐｆｕ／−の貯蔵ＳＶ４０溶液を、０．
ＯＩＭの炭酸水素アンモニウムで１０，１０２、および
１０’ｐｆｕ／Ｔｎｌまで順次希釈した。

２．０　　各濃厚物のサンプル１−を、プロトコールＡ
のそれと同じ時間（約４時間）室温に静置し、それ以上
の処理をすることなく直ちにＳＶ　−４０についてアッ
セイした（Ｃ１）。

３．０　　すべての３つの濃厚物の既知小量を、プロト
コールＡＩに用いた貯蔵時間と同じ時間−７０℃で凍結
した。

４．０３つの濃厚物のすべてを室温で融解し、次いでＳ
Ｖ　−４０についてアッセイした（Ｃ２）。

Ｃ０２，１黴ｆｌ（炭酸水素アンモニウムおよびｈ−Ｇ
１１） （目的）Ｓｖ４０プラークア・ノセイに対する０、０１
Ｍの炭酸水素アンモニウム緩衝液およびｈ−ＧＨ双方の
毒性を測定するにある。

１．０　０．０１Ｍの炭酸水素アンモニウム溶液を貯蔵
ＳＶ　−４０で１０’ｐｆｕ／−に汚染させた。このサ
ンプルをＳＶ　−４０についてアッセイしくＣ８）、そ
の力価をＳＶ　−４０の標準曲線と比較した。

２．０　０．ＯＩＭの炭酸水素アンモニウム溶液を、組
織培養物で順次１０Ｘ（サンプルＣ９）および１００Ｘ
　（サンプルＣｌ０）希釈した。

これらのサンプルの各々を１０’ｐｆｕ／ｍｌの濃度ま
で貯蔵ＳＶ　−４０で接種し、そしてアッセイした。

３、０　１０’ｐｆｕ／−の貯蔵ＳＶ４０を０．０１Ｍ
炭酸水素アンモニウムにおける貯蔵ｈ−Ｇｌ（中に１／
２０希釈し、最終（７）　Ｓ　Ｖ　４０　？Ｈｒ度を約
１０’ｐｆｕ／　ｍｌにした。この溶液をＳＶ　−４０
力価についてアッセイした（サンプルＣ７）。

Ｃ・３・玉」ｊじＬ辻肌 （目　的）　ＳＶ４０ウィルスの尿素処理によるウィル
ス不活化能の測定。

１．０　　貯蔵ＳＶ４０溶液５　ｍｌを使用して、０．
０１Ｍの炭酸水素アンモニウム中１−当たり２■のｈ−
ＧＨ貯藏溶液９５−を接種し、ＳＶ４０の最終濃度を１
０’ｐｆｕ／ｍｊ！とじた。

２．０３個のサンプル１−を取って置き（Ｃ３）、ＳＶ
　−４０およびｈ−ＧＨアッセイ用に一７０℃で保管し
た。

３．０　　尿素を最終濃度６Ｍの尿素まで添加し、４℃
に１６時間静置した。

４．０　　前記プロトコールＡ、１．５のようにＰＴＧ
Ｃミニタンを用いて濾過することにより尿素を除去した
。

５．０　　この濾液の３つのサンプル４−をＳＶ　−４
０およびｈ−ＧＨアッセイ用に取って置き（Ｃ４）、−
７０℃で保管した。

Ｃ，４，１０に゛ルトンＵＦの、■ （目　的）　ＰＴＧＣミニタンの有効性の確認備　考：
この試験に由来するサンプルは貯蔵し、そして必要があ
れば簡単に分析した（すなわち、サンプル４Ａは、ＳＶ
４０の明瞭な喪失を示す）。

１．０　　貯蔵ＳＶ４０溶液５ｄを、０．ＯＩＭ（７）
炭酸水素アンモニウム中２■／−のｈ−Ｇ旧容液と混合
し、ＳＶ４０の最終濃度を１０’ｐｆｕ／ｍｊ！とじた
。

２．０３つの１艷のサンプルを取って置き（Ｃ５）、５
−４０アツセイ用に一７０℃で保管した。

３．０　　前記接種した溶液をＰＴＧＣミニタンを使用
して約ＩＱｍｌの最終容量まで濃縮した。

４．０　１Ｑｍ１容量中のｌ　ｍｌのサンプル３つを取
って置き、−７０℃で保管した（Ｃ６）。

Ｍニ二１ １．０ ２．０ ３．０ ４．０ ５．０ ６．０ ２　Ｘ１０’ｐｆｕ／−の貯蔵ＳＶ４０゜凍結乾燥ｈ−
ＧＨ：　１．５　ｇ。

炭酸水素アンモニウム。

尿素。

滅菌水。

濾過ユニット。

プロトコールＡ　：　ｌ０ＰＴＩＩＫミニタンバケツト
４　ＰＴＧＣミニタンバケット ４ミニタンユニツト ８２種の膜は、ＰＬＭＫ　、　ＰＫＭＫおよびＰＺＨＫ
から選んだ。

選択は、ｈ−ＧＨの通過性に 基づいて行った。　ｈ−ＧＨの 通過性は、出願人からミ リボア社に送ったｈ−Ｇｌ（を 使用してミリポア社が決 定した。

膜 ９７ｒ野ケ（社）肛定 供給試料および透過溶液におけるタンパクの測定は、プ
ランフォード（Ｂｒａｎｆｏｒｄ）の染料−バインディ
ング法〔＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、　７２．２４
８（１９７６））により実施した。

バイオ・ランド（Ｂｉｏ　Ｒａｄ）タンパクアッセイ染
料剤（５００−００６）を使用した。標準は、−２０℃
またはそれ以下で貯蔵されている下垂体ｈＧＨ（１ｍｇ
　／　ａｄ　）を精製した。

１、　アッセイ方法は次の通りである。

ａ、標準曲線 標準曲線は、染料濃厚物の各所しい壜について測定した
。

蒸留水　８００７５０７００６５０６００染料濃厚物　
　２００　２００　２００　２００　２００☆各欄は、
バの容量を表す。

☆アッセイは、ブランク溶液を除き３重に反復して実施
した。

☆１５分のインキュベーション後、試薬ブランクに対す
る標準サンプルのＯＤ　（５９５ｎｍ）を記録した。

☆標準曲線は、標準サンプル濃度に対するＯ　Ｄ　（５
９５ｎｎ＋）をプロットすることにより得た。

貞次に、標準曲線の勾配を計算した。

ｂ、ｈＧＨサンプルの調製 ☆ｈＧＨ溶液を蒸留水で希釈して、約１〜２■タンパク
／−溶液を得た。

☆５〜２０躍を含有する希釈サンプルの適当量を試験管
に入れた。その総量を水で８００にした。

☆次に、染料濃厚物の２００μｌを添加しそして混合し
た。

☆ＯＤ　（５９５ｎｍ）は、試薬ブランクニ対シテ、１
５分インキュベーション後に記録した。

２、ｈＧＨ濃度の定量 支！１ンリ（社）１定 ＾ｌ 貯蔵再構成ｈ−ＧＨ 悲り２ρとｑ刺一定 Ｃ１ 凍結／融解 対照 ２ａ ２ｂ ２ｃ 融解対照 １０’ｐｆｕ／ｄ １０２ｐｆｕ／ｍｇ １０ｐｆｕ／ｌｎｌ。

上記例によれば、ヒトまたは他の哺乳動物起源の精製ホ
ルモンの抽出物から得られる精製抽出物を、カセットシ
ステムの１００，０００ダルトン・カットオフ濾過膜を
使用する濾過は、それらからウィルス性の汚染物を効率
よく除去することが示される。従って、本発明者は、生
物流体が商業的規模で精製し得る工業的に適用可能な方
法を提供する。

さらに、本明細書に記載した脱汚染物としての尿素およ
びその他の技術、例えば希釈技術の使用は、本発明によ
って処理される生物流体を使用する者に対し、ウィルス
感染が蔓延する可能性を実質的に減少する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生物流体から不純物を除去するための １００，０００ダルトン（ｄａｌｔｏｎ）・カットオフ
   を有する濾過膜を用いて不純な生物流体を濾過する段階
   （１）を含んでなる生物流体またはそれらに由来する生
   成物の精製方法。 ２、前記不純な生物流体が、未処理の生物抽出物である
   請求項１記載の方法。 ３、前記不純物が、ウィルスまたはウィルス様粒子を含
   むものである請求項２記載の方法。 ４、前記不純な生物流体が、均質化した脳下垂体組織に
   由来する浄化抽出物である請求項３記載の方法。 ５、前記不純な生物流体が、ヒト成長ホルモンを含むも
   のである請求項４記載の方法。 ６、尿素を用いて濾過物を精製する段階（２）をさらに
   含んでなる請求項５記載の方法。７、ウィルス含有不純
   物を廃棄する段階（３）、および精製した成長ホルモン
   を回収する段階（４）をさらに含んでなる請求項６記載
   の方法。 ８、生物抽出物におけるウィルスの感染性の減少方法で
   あって、 （ａ）人体部または動物体部に由来する組織の採集物か
   ら抽出物を調製する段階、 （ｂ）１００，０００ダルトン・カットオフ膜を用いて
   抽出物を濾過する段階、 （ｃ）膜上に維持される不純物を廃棄する段階および （ｄ）濾過物としての精製抽出物を回収する段階を含ん
   でなる方法。 ９、前記抽出物が、ヒト成長ホルモン調製物である請求
   項８記載の方法。 １０、除去されるウィルスが、スローウイルスである請
   求項９記載の方法。 １１、濾液を少なくとも１０＾−＾４希釈度まで希釈す
   る段階をさらに含んでなる請求項９記載の方法。 １２、前記調製物がヒト成長ホルモンを含むものである
   請求項１０記載の方法。 １３、前記段階（ｂ）の後に濾過物を尿素と接触せしめ
   、そして即座に限外濾過する請求項１２記載の方法。 １４、前記段階（ｂ）の後に濾過物を尿素と接触せしめ
   、そして即座に限外濾過をする請求項９記載の方法。