JP2914666B2

JP2914666B2 - 精製方法

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Publication number: JP2914666B2
Application number: JP63225563A
Authority: JP
Inventors: エシュコアリザ; マイラールフランソワ; イー，スタイルズジェラルド
Original assignee: ARESU TOREE DEINGU SA
Current assignee: ARESU TOREE DEINGU SA
Priority date: 1987-09-11
Filing date: 1988-09-10
Publication date: 1999-07-05
Anticipated expiration: 2014-07-05
Also published as: EP0307373B1; JPH02102A; DE3885686T2; AU2140888A; CA1328625C; ATE97419T1; EP0307373A2; EP0307373A3; DE3885686D1; AU605901B2; ES2047043T3

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の背景〕限外濾過による生物流体の精製は、かかる流体のいろ
いろな成分の分子量が近似していることに帰因し種々の
問題をはらんでいた。たとえ濃縮（例えば小さな分子に
対するより大きな分子の割合が高められている流体の単
離）が知られているとはいえ、限外濾過を通じて小さい
分子から大きい分子を除去するかまたは完全に分離する
ための純粋に物理的な手段の使用は、従来の文献に記載
されていなかった。

他方、限外濾過手段によるウイルス類の濃縮は次の文
献に記載されている。

J.D.Gangemi等、「分子濾過によるアレナウイルスの
濃縮」Applied and Environmental Microbiology, vol.
34,No.3（1977年,9月）330〜332頁、 G.P.Shibley等、「エプスタイン・バールウイルスの
大規模増殖と濃縮のための新規な方法」Applied and En
vironmental Microbiology,vol.40,No.6（1980年,12
月）1404〜1048頁、およびL.E.Mathes等、「多量の組織
培養流体からネコ白血病ウイルスの精製」Journal of C
linical Microbiology,vol.5,No.3（1977年,3月）372〜
374頁。

〔発明の概要〕

特殊のタイプの濾過膜を用いる物理的な分離技術を使
用することにより、ウイルスならびに同様なサイズおよ
び／もしくは分子量のその他の汚染物が生物流体、例え
ば尿、脳下垂体、および他の器官等に由来する抽出物か
ら除去または単離し得ることを発明した。

好ましい態様としては、ヒト成長ホルモン（hGH）を
含む脳下垂体抽出物からレトロウイルスおよびスローウ
イルス（すなわち、AIDSおよびCJD等）の汚染物を除去
するために、100,000ダルトン・カットオフの限外濾過
「PTHK」膜〔ミリポア社（Millipore Corp）製〕が使用
される。この方法は、生成物の約90％〜約99％の回収が
可能である。

〔発明の長所〕

本発明の方法は、他の生物流体の精製法を陵駕する多
数の長所を有する。例えば、本発明の方法は化学的およ
び／または熱処理よりも非常に簡便である。従って、通
常の化学的および／または熱処理に一般的に付随するコ
ストやエネルギーの消費が避けられる。

さらに、本発明により処理された流体は、ヒトまたは
他の動物、好ましくは哺乳類に投与するために単独また
は他の適切な剤、例えばリン酸緩衝溶液との組み合わせ
で使用するのに好都合である。

本発明の他の長所および態様は、本発明についての次
の記載から明らかになるであろう。

〔発明の記載〕

本発明は、生物起源の生成物（すなわち、体液／器官
に由来する物質）の精製方法であって、100,000ダルト
ン（dalton）・カットオフを有する濾過膜を用いて溶液
としての不純な生成物を濾過する段階を含んでなる方法
を提供する。

別言すれば、本発明は、一定の特性を有する限外濾過
膜を用いる生物学的な抽出物からのウイルスの除去に関
する。

他に明記しない限り、本明細書に示す全てのパーセン
テージは重量パーセンテージであり、そして合計組成物
重量に基づく。

〔濾過システム〕

本発明の方法に使用される濾過システムは、限外濾過
膜を必要とする。ある態様では、例えばカセット濾過シ
ステムが使用され、またタンジェンシャル・フロー（ta
ngential flow）を伴う。

本発明の実施に適する装置は、ミリポア社（Millipor
e Corporation of Bedford,Massachusetts,U.S.A）から
市販されている。

タンジェンシャル・フロー濾過は、小さな（濾過物）
分子からより大きな（残留物）分子の分離についての公
知技術である。生物学的な加工系では、この方法は、膜
を通過する濾過物を集めるか、または膜を通過しない残
留物を濃縮するかのいずれかに使用されてきた。

生物流体からウイルス分子および／または他の不純物
を濃縮する方法が既知であるからといっても、高純度の
濾液が得られるような（すなわち、90％〜95％またはそ
れ以上の濾過効率を有する）生物流体から不純物を効率
よく除去することは知られていない。

濾過効率とは、流体または抽出物の初期量に対する濾
過物量の割合を示す。

従って、除去技術（濃縮技術に対立するところの）では、濾過
効率は、約40〜約50％と比較的低い。このことは、残留
した濃厚物（すなわち、残留物）が無視できない量の濾
過物を含むからである。従って、かかる濃厚物は、60〜
90（重量）％の残留物および10〜40（重量）％の濾過物
を含む可能性がある。

これらに対比し、本発明の精製または除去技術は、残
留物に非常に少量の濾過物を残すに留まる。すなわち、
ウイルスまたは他の汚染物が濾過膜中または濾過膜上に
捕捉される場合には、生物流体の約1ppm以下が損なわれ
る。これらの汚染物、すなわち洗浄操作後の残留物は、
その後廃棄される。

本発明で用いられる濾過膜は、生物物質および医薬の
処理において使用するためにディスクおよびカセットシ
ステムで市販されている限外濾過膜である。

膜自体は、ミリポア社により「PTHK」と表示されてお
り、そして20％のグリセリンを用いるポリプロピレン目
止剤上でキャストされたポリスルホン膜である。またそ
れは、ホルムアルデヒドにより保護されている。

好ましい膜の１つは、ミリポア（Millipore）PTHK限
外濾過膜である。その規格は次のとおりである：保持：ブルーデキストラン 99％ IgG 95％通過：アルブミン 60％保持マーカーは、１〜100psiの平均膜処理圧において
一定であり、通過の挙動は圧と溶質とに依存する。

〔保全性〕

十分に湿潤させた膜について、5psiの空気圧で試験し
た場合、ft²当たりの空気拡散量は2.00ml/分以下であ
る。

〔化学的な適合性〕

膜は、水および20％までのアルコール水と適合性であ
る。その使用できるpH範囲は１〜14である。1.0Mまでの
NaOHにより再生可能である。その温度限界は50℃であ
り、そしてNaOHまたはNaOClにより発熱物質を除去する
ことができる。

この好ましい膜は、ミリポア社の種々の報告類で検討
されている、AD841,OM141、およびUF009である。

この膜は、ディスクかまたはカセットのいずれかでシ
ステムに設置することができる。しかしながら、カセッ
トシステムを利用するのが好ましい。製造者（ミリポ
ア）は、そのカセットシステムを「ペリコン（Pellico
n）」カセットシステム（大容量用）または「ミニタン
（Minitan）」システム（小容量用）と称している。デ
ィスク膜は、減圧下に攪拌容器システムで使用される。

他の有用な濾過システムは、サルトリウスおよびフィ
ルトロン（Sartorius and Filtron）のSM1627等を含
む。

〔濾過パラメーター〕

処理される生物流体は、約300〜約500ml/分またはそ
れ以上の速度で濾過システムを介してポンプ輸送され
る。

使用される膜は、一般に各カセット単たり0.46m²の表
面を有すると記載されている。勿論、１以上のカセット
を利用することができ、この場合はシステムを通過する
流速を適宜に高めなければならない。ミニタンシステム
では、約120〜約600cm²の表面積が普通である。ペリコ
ンシステムでは、約465〜約46,500cm²が普通である。こ
れらの範囲は、使用されるカセット数に対応する。

使用される圧は、約0.2〜約1.5バール、好ましくは0.
3〜1.0バールの範囲内で変動し得るが、より高圧でも使
用することができる。

温度は臨界的でない。しかしながら、濾過方法は約２
〜10℃の温度で実施するのが一般に好ましい。

残留物の流速と濾過物の流速との比率は、使用される
背圧の関数である。それは約30〜約60％との間で変動す
ることができるが、約50％の比率が好ましい。

〔生物流体〕

本発明により処理される生物流体、すなわち、そのも
のからウイルスおよび／または他の汚染物が除去される
ものは、ヒトまたは動物に由来する多様な液体および半
流動体、すなわち体部に由来する組織または流体を包含
する。かかる組織についての好ましい供給源または器官
は、ヒトおよび他の哺乳類である。しかしながら、非哺
乳類源に由来する組織および他の液体も使用することが
できる。

処理される抽出物または他の生物流体は、宿主器官の
正常な代謝を経て産生される組織および体液の物理的処
理から得られるものが好ましい。従って、血液および尿
等も処理することができる。

さらに、組換え技術を使用して誘導される調製物、例
えばrec−hGHのようなホルモンの含有物も本発明の方法
を用いて精製することができる。従って、細胞培養物、
例えば遺伝子工学を施した哺乳類および／またはウイル
ス性細胞の含有物を本発明に従って処理することができ
る。ホルモン等、例えばFSH,LH,HCG,hGH,EGF,インター
フェロン等を含有する調製物が、本発明により処理され
る好ましい物質である。

流体または抽出物が誘導される組織の種類は臨界的で
ない。しかしながら、組織は、身体の構成員、例えば通
常の抽出技術により哺乳類の器官また腺に由来するもの
が好ましい。従って、すべての哺乳類の脳、肝臓、心臓
等に由来する抽出物が好ましい。ヒト、ハムスター、マ
ウスおよびラット等の脳の存在物、特に、脳下垂体に由
来する抽出物が好ましい。成長ホルモンを含有する抽出
物がより好ましい。抽出物類の混合物も使用することが
できる。

組織、本発明の他の細胞性物質または体液から処理さ
れる対象となる流体を取り出すために使用される抽出技
術は、限定されるものでない。しかしながら、流体は、
溶媒もしくは塩沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、
およびサイズ排除クロマトグラフィー等のような手段を
経て得られるものが一般に好ましい。処理される流体
は、粒子が除去された、例えば0.45μｍのフィルターま
たは他の適当な濾過装置により浄化されたものでなけれ
ばならない。

尿素、NaOH,NH₄HCO₃およびリン酸緩衝剤の如き溶質お
よび／またはpH安定剤が、処理される生物流体中に一般
に存在せめられる。混合物も実施可能である。多様な溶
質を使用することができる。しかしながら、膜の有効性
を変更するような前記溶質は、避けるべきである。

尿素および／または他の脱汚染剤の適当量は、処理後
の流体中に残存するいずれかの汚染物を失活せしめるた
めにも使用することができる。スクレーピー（Scrapi
e）およびCJDの感染力の減退についての尿素の作用は、
過去に研究されている。殆どの研究者（Hunter等,1986,
KimberlinおよびWalker,1985,March等,1984,Prusiner,1
982,ならびにMould,未公表データ,1969）は、実際には
彼等の実験方法は異なるにもかかわらず感染力の２〜３
ログ（logs）の減退を見出している。本発明者等も前記
と同様に、スクレーピー感染ハムスターまたはCJD感染
モルモットの脳均質物に20％までの尿素を添加したもの
に由来する効果は、明瞭には観察されなかったとするブ
ラウン（Brown）等の観察と異なる結果を得ている。

過去においては、感染力の失活のためにNaOHを使用す
ることが勧められていた。しかしながら、約２〜約8M濃
度の尿素、好ましくは6Mの尿素溶液にさらした場合に
は、何んらの観察し得る変性を生じないにもかかわら
ず、NaOHは、hGHの部分的な失活および変性を惹起す
る。

限外濾過の後の尿素または他の適当な薬剤が使用され
る。これは分離した化学的な失活段階であり、残存する
ウイルスの感染性を除去するためのものである。処理
後、尿素は10,000ダルトン・カットオフのカセットを備
える限外濾過により除去される。

〔汚染物〕

本発明の精製方法を用いて生物流体から除去される汚
染物質は、所期の濾過を通じて分子量100,000ダルトン
の濾過膜により、それらが残されるに必要なサイズを有
するすべての物体である。従って、本発明により除去さ
れそして処分されるウイルスまたはその他の汚染物は、
適当なサイズのヒトおよび／または動物のウイルスであ
る。

γ−グロブリンおよびブルーデキストランが使用され
る濾過膜に対する保持マーカーであることから、その膜
上に残存される汚染物の分子量は、100,000よりわずか
に大きいもの、すなわち11,000以上であるといえる。

本発明の方法および濾過システムを用いて除去するこ
とができるウイルス性汚染物は、いわゆる「スロー」ウ
イルス、例えばスクレーピーウイルスおよびクロィツフ
ェルド・ヤコブ（Creutzfeld Jakob）症候群のウイルス
（CJD）等を包含する。

本発明の濾過システムを用いて生物流体および生物学
的抽出物から除去することができる他の汚染物は、一般
的なウイルス、例えばAIDS（HIV）、SV40、肝炎ウイル
スならびにウイルス様粒子、例えばプリオン等を包含す
る。かかる不純物の混合物も除去することができる。

精製ホルモンまたは他の流体から汚染物を除去した
後、濾過膜上に保持される汚染物は、それらから洗い流
され、そして適当な方法、例えば焼却、埋葬、オートク
レーブまたは不活性化により廃棄される。

次に、精製した流体は、貯蔵、管理、包装または流体
のその他の加工のために適する手段に供される。かかる
加工としては、凍結乾燥、溶媒沈殿、冷凍、凍結（内容
物だけかまたは溶液として）および尿素処理等を挙げる
ことができる。これらの技術の１以上および／または他
の加工技術を利用することもできる。

以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。

〔実施例〕

例１この例は、セロノのhGH（Serono′s hGH）（「GROR
M」として市販されている）へのスクレーピー作因の導
入および25nM限外濾過膜と100,000限外濾過膜との排除
能の比較ならびにさらに6M尿素による処理効果を示す。

〔方法〕

ウイルス源スクレーピー263K株で感染したハムスターの脳を「ス
ローウイルス」汚染物として使用した。スクレーピー作
因は、CJD作因と同様な生物学的および物理化学的特性
を有することが示されている。ハムスター適応性スクレ
ーピー株は、その短いインキュベーション期間〔ウイル
スの最高量の脳内（IC）接種後55〜60日〕およびその強
いウイルス感染力価（脳のｇ当たり10¹⁰LD₅₀）故に選ば
れた。

KimberlinおよびWalkerにより分離された（1977）ス
クレーピーのハムスター適応性263K株を、リン酸緩衝溶
液（PBS）（pH7.4）中10％のスクレーピー感染の脳均質
物で脳内（IC）接種することによりゴールデン・シリア
ン（golden Syrian）ハムスター中を２度通過させた。
ハムスターの脳を末期症状の動物から無菌的に取り出
し、直ちに−80℃で凍結させた。凍結した脳を溶解し、
そして最終濃度が10％となるように滅菌リン酸緩衝溶液
（pH7.4）中で均質化した。懸濁物を1500gで30分間遠心
し、次いで上澄を5mlの既知小量に分注し、そして−80
℃にて冷凍貯蔵した。

スクレーピー汚染hGHの精製凍結乾燥hGH（90％純度の単量体ヒト成長ホルモンタ
ンパク）を0.01MのNH₄HCO₃（pH8.0）10.8mlに溶解して
おき、スクレーピー263K株感染ハムスターの脳の10％の
浄化懸濁液1.2mlを超音波処理（３×５秒）し、次いで
前記hGH溶液に添加して最終容量を12mlとした。サンプ
ル2mlを抜き取り感染力価を測定した。

サンプルを10^-10まで10倍ずつくり返し希釈した。未
希釈から10^-10までの各段階の希釈物の既知小量0.05ml
を各12匹のハムスターに脳内接種した（動物の数:12×1
1＝132）。

ここで添加される希釈剤も次のアッセイで添加される
希釈剤も0.01モルNH₄HCO₃緩衝液（pH8.0）であった。

残りの10mlを２個の等しい既知小量の5mlに分配し
た。5mlの既知小量（第２番目のアッセイ力価）を0.01M
のNH₄HCO₃で100mlまで希釈し、100,000カットオフ限外
濾過膜を通過させた。この濾液を限外濾過により濃縮し
次いで凍結乾燥し、そして最終容量を5mlに調整した。2
mlのサンプルを抜き取り第２番目のアッセイ力価に供し
た。

第２番目のアッセイ前記サンプルを連続的に10倍ずつ10^-5まで希釈し、未
希釈のサンプルおよび各希釈サンプルの既知小量の0.05
mlを各12匹のハムスターに脳内接種した（動物の数:12
×６＝72）。

残りの濾過物3mlを次のように6M尿素で処理した。

（１）この3mlの既知小量に1.40gの尿素（分子量60.0
2、比容積0.756）を添加して6Mの最終濃度とした。４℃
で一夜処理した後、溶液をNH₄HCO₃緩衝液に対して限外
濾過により透析して尿素を除去した。次に、この溶液を
凍結乾燥した後、0.01MのNH₄HCO₃（pH8.0）3mlに再懸濁
した。

第３番目のアッセイ前記の全量を未希釈のままハムスターの脳内に注入し
た（動物の数:60）。

（２）第２の5mlの既知小量を220nM、40nMおよび25nMか
ら成る一連の濾過膜を通過させた。濾液を限外濾過によ
り濃縮し次いで凍結乾燥し、そして最終容量を10mMの炭
酸アンモニウムで5mlに調整した。2mlのサンプルを抜き
取り第５番目のアッセイ力価の測定に供した。

第５番目のアッセイサンプルを、100単位/mlのペニシリンおよび0.1mg/ml
のストレプトマイシンを含有するリン酸緩衝溶液（PB
S）で10^-5まで連続的に10倍ずつ希釈した。未希釈およ
び各希釈サンプルの既知小量の0.05mlを各12匹のハムス
ターに脳内接種した（動物数:12×６＝72）。

残りの3mlの濾液を次のように処理した。

（３）この3mlの既知小量に1.40gの尿素（分子量60.0
2、比容量0.756）を添加して6Mの最終濃度とした。４℃
で一夜処理した後、溶液をNH₄HCO₃緩衝液に対して限外
濾過により透析した尿素を除去した。次に、この溶液を
凍結乾燥した後、0.01MのNH₄HCO₃（pH8.0）3mlに再懸濁
した。

第６番目のアッセイ前記の全量を未希釈のままハムスターの脳内に注入し
た（動物の数:60）。

100,000MWにおける限外濾過操作は、８パケットの膜
を装備したミニタンシステム（Millipore）におけるタ
ンジェンシャル（tangential）濾過を用い、約0.5バー
ルの圧の下に４℃で実施した。25nmの濾過は、0.47mmの
スウィンネックス・フィルター・ホルダー・ミリポア
（Swinnex Filter Holder Millipore）を装備したミリ
ポア600ml装填用ユニットにおいて実施した。

結果前述の測定法および濾過調製物を用いる実験室汚染の
残留に対する効果を次の表に示す。

リード（Reed）およびムュンヒ（Muench）の方法に従
って計算した感染性力価は、10^5.5/0.05ml（脳の1g当た
り10^8.8）のLD₅₀値を示した。

リードおよびムュンヒの方法に従って計算した感染性
力価は、10^3.1/0.05ml（脳の1g当たり10^6.4）のLD₅₀値
を示した。

100,000濾過後は、2.4log.の感染力価の減退が存在す
る。

第３表：第３番目のアッセイ（100,000MW濾過＋6M尿
素）第３番目のアッセイ用サンプルの全量を58匹の乳離し
たハムスターに脳内接種した。１匹の動物は、接種処置
後直ちに死んでしまった。46匹のハムスターは、接種後
126.0±13.9日でスクレーピー症状の徴候を示した。残
りの11匹の動物は、接種後180日目でも生存し、そして
スクレーピー症状の徴候を全く示さなかった。死亡率は
80.7％で、かつインキュベーション期間により計算した
感染性力価は、脳の1g当たり10^2.9±1.3のLD₅₀値を示し
た。

100,000MW濾過＋6M尿素処理後は、5.9±1.3logの感染
性力価の減退が存在する。

リードおよびムュンヒの方法に従って計算した感染力
価は、10^3.4/0.05ml（脳の1g当たり10^6.7）のLD₅₀値を
示した。

25nm濾過後は、2.1ogの感染性力価の減退が存在す
る。

第５表：第６番目のアッセイ（25nm濾過＋6M尿素）第６番目のアッセイ用サンプルの総量を53匹の乳離し
たハムスターに脳内接種した。１匹の動物は、接種処置
後直ちに死んでしまった。50匹のハムスターは、接種後
111.7＋10.6日でスクレーピー症状の徴候を示した。残
りの２匹の動物は、接種後180日目でも生存し、そして
スクレーピー症状の徴候を全く示さなかった。死亡率は
96.2％で、かつインキューベーション期間により計算し
た感染性力価は、脳の1g当たり10^4.2±1のLD₅₀値を示し
た。

25nm濾過＋6M尿素処理後は、4.6±1.0logの感染性力
価の減退が存在する。

本発明に従って処理したサンプル（すなわち、100,00
0MWカットオフ膜を用いて限外濾過し、そして尿素と接
触せしめる段階を有しないか、または有すもの）は、よ
り低い比率の感染性を示した。一般に、感染性は99.6％
減退した（すなわち、サンプルを2nm濾過システムを使
用して濾過した場合に比較して）。

感染性に対する濾過の効果を第６表に示した。

（ａ）感染力価は、滴定の終点〔Am.J.Hyg.27:493〜97
（1938）参照〕またはインキュベーション時間〔J.Com
p.Pathol.79:15〜22（1969）参照〕による（ｂ）の測定
により、脳の1g当たりの−log₁₀LD₅₀i.c.単位で表し
た。

6Mの尿素にさらした100,000MWカットオフ濾液は、25n
m濾液（CU）に対して処理した場合よりも強い不活化効
果を示した。感染から症状の徴候の発現までの平均日数
は、BUについては136.5＋／−4.0日（平均＋SEM）であ
り、CUについては114.2＋／−2.3日であった。この相違
は、ｐ＜0.0001のレベルでＴ−試験およびウイルコキソ
ン（Wilcoxon）試験に携わる研究者にとって統計上有意
である。BUに影響を受ける動物の数は、58匹のうち54匹
であり、CUについては52匹のうち52匹である。カイ二乗
解析によれば、この値の相違は、有意（ｐ＝0.0207）で
ある。25nmの濾過膜による濾過＋尿素の組み合わせが、
100,000カットオフ濾過＋6M尿素よりも低いレベルのス
クレーピー排除を示す理由は、この段階では説明するこ
とができない。

この試験では、10（8.8）log/gmの感染性力価を有す
る高感染脳均質物に対して２種の複合的な方法（100,00
0MWカットオフ濾過＋6M尿素を有する濾液の精製）が適
用された。これらの２つの方法は、まったく前処理また
は後精製段階の適用がなくとも、約6logまで感染性を減
退させた。

すでに精製されているhGHに対して本発明の方法が適
用される場合には、hGHまたはそれらが利用されるもの
の他の調製物の安全率をさらに高める。それ故に、本発
明の２段階が調製物の安全性を有意に高めるので、たと
え最新の技術が使用されているとしても、さらにこれら
の２つの手順により調製物が処理されるにちがいない。
従って、前記濾過操作または尿素だけの添加物を伴う濾
過操作および他の精製技術の組み合わせ使用が予期され
る。

例２この例は、100,000ダルトン・カットオフ膜を用いて
尿に由来するヒト閉経期のゴナンドトロピン（HMG）溶
液の処理を示す。

HMG製造の最終的な沈殿段階前の濃厚溶液から尿のHMG
水溶液120mlを調製した。それは次のような特性を有し
ていた。

量＝120ml（尿3281から調製）溶液の分析：タンパク＝4.17mg/ml。総タンパク＝500mg。

FSH（バイオアッセイ）＝1258UI/ml（尿１当たり46UA
に対応）。

pH＝7.3。

〔この溶液をNH₄HCO₃（0.1M,pH8）で１に希釈し
た。〕この最終溶液を、カセット中の100,000ダルトン・カ
ットオフ・ミリポアPTHK膜を使用して、1kg/cm²の圧お
よび６±２℃の温度でタンジェンシャルに濾過した。こ
の濾過を容量が200mlになるまで実施し、その後、毎回H
N₄HCO₃,0.1M（pH8）の緩衝液200mlを加えながらこの濃
縮を12回繰り返した（工程表を参照）。

前記で得られた濾液は、10,000ダルトン・カットオフ
の膜を通過されそして次のものが得られた。

含まれる総タンパク＝431mg タンパクの回収｛採集した濃厚物＝O.D.×ml＝0.83×41
0ml＝340mg ｛濾液＝０10,000 カットオフによるタンパクの損失＝431−340＝91
mg 例２の工程表を次に示す。

例３本発明の方法を用いて生産バッチの１部を濾過して得
られた収量を通常に処理された生産バッチの他の部分の
ものとの比較において次の表に示す。

出発段階におけるFSH含量は、尿１当たり46I.Uであ
った。

生産収量に対する限外濾過法カットオフ100,000＋カ
ットオフ10,000の総収率：例４例１で実施されたのと同様の方法を使用して、SV40ウ
イルスをヒトの尿から除去することができた。動物試験
の結果は、100,000ダルトン・カットオフ膜が使用され
た場合には予期したように感染性の減退を示した。希釈
および／または尿素の添加は、感染性の低下傾向を促進
した。

例５例１で実施されたのと同様の方法を使用して、AIDSウ
イルスを尿および他のヒトの生物流体から除去すること
ができた。動物試験の結果は、本発明の膜を用いる濾過
が感染性を減退することを示した。さらに、希釈および
／または尿素の使用は、精製した物質におけるすべての
残存ウイルスの活性の低下を助長した。

例６ PTHK膜精製方法によりヒト成長ホルモンからシミアン
・ウイルス（Simian Virus）40（SV40）の研究のために
開発されたプロトコールに従って次の試験を行った。

〔目的〕

濾過後に透過物中に出現するSV40を用いて、PTHK膜の
ウイルス保持特性を測定することを目的とする。

最初の試験は、ミニタン装置に装着されたミリポアPT
HK膜を使用して、モデルとした一般的なウイルス（SV4
0）の除却と、同時にヒト成長ホルモンの通過に対する
臨界的な実施変数の影響を評価できる。第１の目的は、
0.5バールの膜透過圧下で操作した場合の膜表面積に対
するバッチ容量の比率の影響を評価することである。こ
の操作条件は、正確に1/10のスケールにおける製造操作
に一致する。第２の目的は、残留物の流量に対する透過
物の流量の割合、表面積に対して通過させ得る量の限定
される割合のような操作条件の影響を評価することであ
る。この方法で２つの操作条件を評価することができ
る。本試験は、他の処理操作のすべて（すなわち尿素処
理、洗浄段階の回数、等）を現行の製造の実施方法に模
して設定した。

被試験物および装置供給源：アレス・セロノ（Ares−Serono）名称：ミニタン形状のPTHK（PTHK in minitan configur
ation）供給源：ミリポア（Millipore）陽性対照シミリアン・ウイルス40（SV40）（供給源:Virology
Department,Microbiological Associates,Inc.）試験システム試験システム：ビオテクノロジー・サービス・デパー
トメント・ラボラトリー（Biotechnology Services Dep
artment Laboratory）に保管されているSV40ウイルスア
ッセイ用のフェロ細胞（Vero cell）。

サンプル中に存在するSV40の量の変化をモニターする
方法は、標準的なウイルスの定量方法を利用した。

試験計画および手段 A.被試験溶液は、SV40により汚染されており、そして種
々の操作条件下での濾過を含む濾過系を通して調製し
た。サンプルは、下記に具体化されるような濾過工程を
通じて数段階で採集し、そしてプラークについてアッセ
イするまで−70℃にて貯蔵した。

B.濾過手段の構成および実施は、発明者が独自に設定し
たものである。サンプルを汚染するために用いたSV40
は、発明者等の研究施設から入手し、そしてサンプルは
次のプラークアッセイのための特別な精製段階から入手
した。汚染ウイルスの目標濃度は、試験材料で希釈後、
約10⁶pfu/mlである。

プラークアッセイは、下記に特性されるような残余の
塩溶液において正確な力価を与えるように適当な希釈下
（サンプル当たり最高３度）で実施され得る。

方法 A.プロトコールＡ 1.0 凍結乾燥したｈ−GHを0.01Mの炭酸水素アンモニウ
ム緩衝液285mlで2mg/mlに再調製した。３個の1mlサンプ
ルをSV−40およびｈ−GHアッセイ用に取って置き、−70
℃にて保管した（A1）。

2.0 貯蔵のｈ−GH溶液285mlを約２×10⁷pfu/mlの貯蔵S
V40溶液15mlとインキュベーション（1/20希釈）して最
終力価10⁶pfu/mlとした。この接種した溶液の1mlサンプ
ル３個をSV−40およびｈ−GHアッセイ用に取って置き、
−70℃で保管した（A2）。この接種した供給試料をプロ
トコールA1,A2およびA3の濾過装置への導入用として各1
00mlの３つの等しい既知小量に分別した。

A.1.プロトコールA1 1.0 接種した供給試料100mlを0.5バールの膜透過圧下
でPTHKミニタン（８層）を通して濾過した。９度一連の
洗浄を行い、ｈ−GHの全量を回収した。各洗浄段階は、
出発容量が15〜20mlに減少するまで溶液100mlを濾過す
ることから成る。この残りの容量を次の洗浄段階の前に
0.01Mの炭酸水素アンモニウム溶液で100mlまで再希釈し
た。最初の濾過および９度の洗浄の後、最終容量が800
〜850mlの濾過調製物が生じた。

2.0 前記の濾過生成物1mlサンプルの３個を取って置
き、SV−40およびｈ−GHの双方のアッセイ用（A3）とし
て−70℃で保管した。

3.0 前記の濾過調製物100mlを、PTGCミニタンＳシステ
ムを用いて約10mlまで濃縮した。この10mlを取って置き
（A4）、SV−40およびｈ−GHアッセイ用として−70℃で
保管した。

4.0 残っているPTHK濾過ｈ−GH700〜750mlに尿素を添
加して6M尿素濃度とした。この溶液を４℃で一夜（16時
間）維持した。

5.0 処理後に、PTGCミニタンを用いて７度の連続的な
0.01M炭酸水素アンモニウム洗浄を行い尿素を除去し
た。初発の750ml容積を100mlまで減少させた。次に、0.
01Mの炭酸水素アンモニウム１を加えた。この溶液の
容量を再び100mlまで減少させた。この洗浄工程を７度
繰り返して尿素を除去した。洗浄後、このシステムを0.
01M炭酸水素アンモニウム300mlに洗い込みすべてのｈ−
GHを再回収した。

6.0 この最終工程のｈ−GH調製物の4mlのサンプル３個
を取って置き、SV40およびｈ−GHアッセイ（A5）用とし
て−70℃で保管した。

A.2.プロトコールA2 1.0 接種した供給試料100mlを、PTHKミニタン（１層）
を通して、濾液対透過流量部が1:1になるように濾過し
た。これらの条件下でプロトコールA.1.1.と同様にｈ−
GH溶液を洗浄した。

2.0 濾過調製物の1mlサンプル３個を取って置き（A
6）、SV−40およびｈ−GHアッセイ用に−70℃で保管し
た。

A.3.プロトコールA3 1.0 接種した供給試料100mlを、PTHKミニタン（１層）
を通して、濾液対透過流量部が5:1になるように濾過し
た。これらの条件下でプロトコールA.1.1と同様にｈ−G
H溶液を洗浄した。

2.0 濾過調製物の1mlサンプル３個を取って置き（A
7）、SV−40およびｈ−GHアッセイ用に−70℃で保管し
た。

C.対照 C.1.凍結−融解対照試験（目的）プロトコールＡと同様な濃厚物におけるSV40を
−70℃で凍結し、そして融解した場合に回収し得るウイ
ルスの力価を測定するにある。

1.0 10⁷pfu/mlの貯蔵SV40溶液を、0.01Mの炭酸水素ア
ンモニウムで10,10²、および10³pfu/mlまで順次希釈し
た。

2.0 各濃厚物のサンプル1mlを、プロトコールＡのそれ
と同じ時間（約４時間）室温に静置し、それ以上の処理
をすることなく直ちにSV−40についてアッセイした（C
1）。

3.0 すべての３つの濃厚物の既知小量を、プロトコー
ルA1に用いた貯蔵時間と同じ時間−70℃で凍結した。

4.0 ３つの濃厚物のすべてを室温で融解し、次いでSV
−40についてアッセイした（C2）。

C.2.緩衝液の毒性（炭酸水素アンモニウムおよびｈ−G
H）（目的）SV40プラークアッセイに対する0.01Mの炭酸水
素アンモニウム緩衝液おびｈ−GH双方の毒性を測定する
にある。

1.0 0.01Mの炭酸水素アンモニウム溶液を貯蔵SV−40で
10⁴pfu/mlに汚染させた。このサンプルをSV−40につい
てアッセイし（C8）、その力価をSV−40の標準曲線と比
較した。

2.0 0.01Mの炭酸水素アンモニウム溶液を、組織培養物
で順次10X（サンプルC9）および100X（サンプルC10）希
釈した。これらのサンプルの各々を10⁴pfu/mlの濃度ま
で貯蔵SV−40で接種し、そしてアッセイした。

3.0 10⁷pfu/mlの貯蔵SV40を0.01M炭酸水素アンモニウ
ムにおける貯蔵ｈ−GH中に1/20希釈し、最終のSV40濃度
を約10⁶pfu/mlにした。この溶液をSV−40力価について
アッセイした（サンプルC7）。

C.3.6M尿素対照（目的）SV40ウイルスの尿素処理によるウイルス不活化
能の測定。

1.0 貯蔵SV40溶液5mlを使用して、0.01Mの炭酸水素ア
ンモニウム中1ml当たり2mgのｈ−GH貯蔵溶液95mlを接種
し、SV40の最終濃度を10⁶pfu/mlとした。

2.0 ３個のサンプル1mlを取って置き（C3）、SV−40お
よびｈ−GHアッセイ用に−70℃で保管した。

3.0 尿素を最終濃度6Mの尿素まで添加し、４℃に16時
間静置した。

4.0 前記プロトコールA.1.5.のようにPTGCミニタンを
用いて濾過することにより尿素を除去した。

5.0 この濾液の３つのサンプル4mlをSV−40およびｈ−
GHアッセイ用に取って置き（C4）、−70℃で保管した。

C.4.10KダルトンUFの対照（目的）PTGCミニタンの有効性の確認備考：この試験に由来するサンプルは貯蔵し、そして必
要があれば簡単に分析した（すなわち、サンプル4Aは、
SV40の明瞭な喪失を示す）。

1.0 貯蔵SV40溶液5mlを、0.01Mの炭酸水素アンモニウ
ム中2mg/mlのｈ−GH溶液と混合し、SV40の最終濃度を10
⁴pfu/mlとした。

2.0 ３つの1mlのサンプルを取って置き（C5）、Ｓ−40
アッセイ用に−70℃で保管した。

3.0 前記接種した溶液をPTGCミニタンを使用して約10m
lの最終容量まで濃縮した。

4.0 10ml容量中の1mlのサンプル３つを取って置き、−
70℃で保管した（C6）。

材料 1.0 ２×10⁷pfu/mlの貯蔵SV40。

2.0 凍結乾燥ｈ−GH:1.5g。

3.0 炭酸水素アンモニウム。

4.0 尿素。

5.0 滅菌水。

6.0 濾過ユニット。

プロトコールA:10PTHKミニタンパケット 4PTGCミニタンパケット４ミニタンユニット膜:2種の膜は、PLMK,PKMKおよびPZHKから選んだ。選択
は、ｈ−GHの通過性に基づいて行った。ｈ−GHの通過性
は、出願人からミリポア社に送ったｈ−GHを使用してミ
リポア社が決定した。

タンパクの測定供給試料および透過溶液におけるタンパクの測定は、
ブランフォード（Branford）の染料−バインディング法
〔Anal.Biochem. 72,248（1976）〕により実施した。

バイオ・ラッド（Bio Rad）タンパクアッセイ染料剤
（500−006）を使用した。標準は、−20℃またはそれ以
下で貯蔵されている下垂体hGH（1mg/ml）を精製した。

1.アッセイ方法は次の通りである。

a.標準曲線標準曲線は、染料濃厚物の各新しい壜について測定し
た。

☆各欄は、μｌの容量を表す。

☆アッセイは、ブランク溶液を除き３重に反復して実施
した。

☆15分のインキュベーション後、試薬ブランクに対する
標準サンプルのOD（595nm）を記録した。

☆標準曲線は、標準サンプル濃度に対するOD（595nm）
をプロットすることにより得た。

☆次に、標準曲線の勾配を計算した。

b.hGHサンプルの調製 ☆hGH溶液を蒸留水で希釈して、約１〜2mgタンパク/ml
溶液を得た。

☆５〜20μｇを含有する希釈サンプルの適当量を試験管
に入れた。その総量を水で800にした。

☆次に、染料濃厚物の200μｌを添加しそして混合し
た。

☆OD（595nm）は、試薬ブランクに対して、15分インキ
ュベーション後に記録した。

2.hGH濃度の定量上記例によれば、ヒトまたは他の哺乳動物起源の精製
ホルモンの抽出物から得られる精製抽出物を、カセット
システムの100,000ダルトン・カットオフ濾過膜を使用
する濾過は、それらからウイルス性の汚染物を効率よく
除去することが示される。従って、本発明者は、生物流
体が商業的規模で精製し得る工業的に適用可能な方法を
提供する。さらに、本明細書に記載した脱汚染物として
の尿素およびその他の技術、例えば希釈技術の使用は、
本発明によって処理される生物流体を使用する者に対
し、ウイルス感染が蔓延する可能性を実質的に減少す
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＢ０１Ｄ 69/02 Ａ６１Ｋ 37/36 (72)発明者ジェラルドイー，スタイルズアメリカ合衆国，マサチューセッツ 02332，ダックスベリー，プライアーファームロード 66 (56)参考文献特開昭59−196794（ＪＰ，Ａ) 欧州公開219295（ＥＰ，Ａ１) 生化学辞典（東京化学同人、1984年発行）1430〜1433頁 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 9/08 A61K 35/12 A61K 37/36 A61M 1/36 B01D 61/14 B01D 69/02

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】有意な損失を伴うことなく成長ホルモン及
びインターフェロンより成る群から選ばれる生物学的生
成物のウィルス感染能を実質的に低める又はそれからウ
ィルス夾雑物を除去するための方法であって、前記生物
学的生成物を含む流体の100,000ダルトンのカットオフ
値を有する限外濾過膜を介するタンジェンシャル・フロ
ー濾過、それに次ぐその濾液からの前記生物学的生成物
の回収を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項２】前記膜が下記の規格を有する、請求項１記
載の方法。保持：ブルーデキストラン ≧99％ IgG ≧95％通過：アルブミン ≧60％
【請求項３】前記濾過した生物学的生成物を尿素に接触
させる、請求項１また２記載の方法。
【請求項４】前記生物学的生成物がヒト成長ホルモンで
ある、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】前記限外濾過膜がウィルス感染能を99.6％
以上低め、しかも90％以上で前記生成物回収せしめるも
のである。請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。