JP5080713B2 - 多孔性膜処理によるウイルスの除去された血漿蛋白組成物の製造方法、ウイルスの除去された血漿蛋白組成物およびウイルス除去方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、血漿蛋白組成物中のウイルス、特に感染性ウイルスが除去された血漿蛋白組成物の製造法、当該方法により得られるウイルス、特に感染性ウイルスを実質的に含まない血漿蛋白組成物、非エンベロープウイルスとりわけ、パルボウイルスおよび／またはＡ型肝炎ウイルスを実質的に含まないフィブリノゲン組成物および血漿蛋白組成物中のウイルスを除去する方法に関する。
背景技術
蛋白製剤、特にヒト血漿を原料とする血漿分画製剤には、ヒトに感染し得る病原因子が混入しているおそれがあり、特にウイルス感染に対する問題は重要である。これまで輸血後にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などのウイルスの感染事故が発生している。
このような事故は過去のものではなく、数々の技術の導入によって事故の発生率は指数的な数値をもって劇的に少なくなっているものの、現在もその発生を完全に否定することはできない。
これらのウイルス伝播を防ぐために、夾雑の可能性のあるウイルスを不活化または除去する方法が種々知られている。例えば、蛋白含有組成物を液状で加熱する方法（特開昭５５−１４５６１５号公報、特開昭５６−１３９４２２号公報、特開昭５６−１０６５９４号公報など）、乾燥状態で加熱する方法（特表昭５８−５００５４８号公報、特開昭５８−２１３７２１号公報など）、トリアルキルホスフェートおよび／または界面活性剤などと接触させる方法（特開昭６０−５１１１６号公報など）、紫外線照射による方法（特開平７−１９６５３１号公報など）、ウイルス除去膜による方法（特開平９−１００２３９号公報など）が知られている。
しかし、加熱処理では熱に強いウイルスが残存し、界面活性剤処理では非エンベロープウイルスが残存し、紫外線照射の単独処理では蛋白が失活する可能性があるなど、ウイルスを不活化又は除去する方法において単一の処理では、蛋白の活性を失うことなく、かつ、完全に夾雑ウイルスを不活化又は除去することは困難であった。
そこで、現在、夾雑ウイルスを不活化又は除去する上記方法を適当に組み合わせて使用しているのが現状である。
一方、フィブリノゲンはアルコール血漿分画製造過程において最初に沈殿してくる分画から得られる蛋白質であるために、万一血漿にウイルスが混入した場合にその汚染の影響を受けやすい蛋白質である。特に現在話題の多いウイルスとしてパルボウイルスＢ１９（以下、Ｂ１９という）があるが、このウイルスはエンベロープが無く、熱に強く、その単粒子径は１８〜２５ｎｍ程度と非常に小さいために、血漿分画製剤の分野で特に、その不活化／除去対策に注力され研究が進められているものである。
ウイルス除去膜による方法では、当然に、孔径に比しより大きな分子径のウイルスを濾過により除去することができるが、孔径より小さなウイルスを除去することはできず、また、あまり孔径の小さな除去膜を使用するとサンプルが目詰まりするなど濾過自体が困難であったり、また、サンプル量に比例して膜処理時の流速が低下し、サンプル処理量の制限及び処理時間の増大といった多くの問題を有していた。
特に、フィブリノゲンの精製工程においてその分子量等の関係から、現在市販されている多孔性膜の膜孔径が３５ｎｍ未満のものを使用した場合には、上記の目詰まり、サンプル処理量の制限及び処理時間の増大といった問題が実際に生じており、膜孔径が３５ｎｍ以上の多孔径膜の使用しかできないという問題があった。しかし、パルボウイルス（Ｂ１９）の単粒子径は上述の通り１８〜２５ｎｍ程度であるので、現在市販されている膜孔径３５ｎｍや７５ｎｍのプラノバ３５Ｎ、プラノバ７５Ｎ（いずれも商品名、旭化成社製）単独、さらにはこれらのウイルス除去膜を多段に用いる方法においても除去できないという問題があった。
したがって、今日、簡便な処理方法により少しでもウイルス感染性の少ない、安全な蛋白製剤を提供する方法が望まれていた。
発明の開示
本発明者らは、これらの課題を解決するために鋭意研究した結果、多孔性膜処理により、蛋白の活性を殆ど失うことなく、効率よく夾雑ウイルスを除去することができることを見出して本発明を完成するに至った。また、本発明者らは多孔性膜処理により非エンベロープウイルス、とりわけパルボウイルスおよび／またはＡ型肝炎ウイルスを実質的に含まないフィブリノゲン組成物を得ることができることを見出して本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は下記の通りのものである。
（１） 血漿蛋白組成物をウイルス単粒子径より孔径の大きな多孔性膜処理に付す工程を有することを特徴とするウイルスの除去された血漿蛋白組成物の製造法。
（２） 多孔性膜が多孔性中空糸膜である前記１記載の製造法。
（３） 多孔性膜処理前に血漿蛋白組成物を沈殿法分画処理に付すことを特徴とする前記１または２記載の製造法。
（４） 多孔性膜処理に付す前に、血漿蛋白組成物を沈殿法分画処理に付し、得られた沈殿を水抽出する工程を有することを特徴とする前記１〜３のいずれかに記載の製造法。
（５） 血漿蛋白組成物がフィブロネクチン、フィブリノゲン、凝固Ｖ因子、凝固ＶＩＩＩ因子、フォンビルブランド因子、凝固ＸＩＩＩ因子、レチノール結合蛋白質、αグロブリン、βグロブリンおよびγグロブリンから選ばれる少なくとも一種の蛋白質を含有するものである前記１〜４のいずれかに記載の製造法。
（６） 血漿蛋白組成物が少なくともフィブリノゲンを含有するものである前記５に記載の製造法。
（７） ウイルスが非エンベロープウイルスである前記１〜６のいずれかに記載の製造法。
（８） 非エンベロープウイルスがパルボウイルスおよび／またはＡ型肝炎ウイルスである前記７記載の製造法。
（９） ウイルス単粒子径より孔径の大きな多孔性膜処理に付すことにより当該ウイルスが実質的に除去された血漿蛋白組成物。
（１０） 多孔性膜が多孔性中空糸膜である前記９記載の血漿蛋白組成物。
（１１） 多孔性膜処理前に血漿蛋白組成物を沈殿法分画処理に付することを特徴とする前記９または１０に記載の血漿蛋白組成物。
（１２） 多孔性膜処理前に血漿蛋白組成物を沈殿法にて分画処理し、得られた沈殿を水抽出することを特徴とする前記９〜１１のいずれかに記載の血漿蛋白組成物。
（１３） 血漿蛋白組成物がフィブロネクチン、フィブリノゲン、凝固Ｖ因子、凝固ＶＩＩＩ因子、フォンビルブランド因子、凝固ＸＩＩＩ因子、レチノール結合蛋白質、αグロブリン、βグロブリンおよびγグロブリンから選ばれる少なくとも１種の蛋白質を含有するものである前記９〜１２のいずれかに記載の血漿蛋白組成物。
（１４） 血漿蛋白組成物が少なくともフィブリノゲンを含有するものである前記１３に記載の血漿蛋白組成物。
（１５） ウイルスが非エンベロープウイルスである前記９〜１４のいずれかに記載の血漿蛋白組成物。
（１６） 非エンベロープウイルスがパルボウイルスおよび／またはＡ型肝炎ウイルスである前記１５に記載の血漿蛋白組成物。
（１７） パルボウイルスを実質的に含まないフィブリノゲン組成物。
（１８） 血漿蛋白組成物をウイルス単粒子径より孔径の大きな多孔性膜処理に付すことを特徴とする血漿蛋白組成物中のウイルスの除去方法。
（１９） 多孔性膜が多孔性中空糸膜である前記１８記載の方法。
（２０） 多孔性膜処理前に血漿蛋白組成物を沈殿法分画処理に付すことを特徴とする前記１８または１９記載の方法。
（２１） 多孔性膜処理に付す前に、血漿蛋白組成物を沈殿法にて分画処理し、得られた沈殿を水抽出する工程を有することを特徴とする前記１８〜２０のいずれかに記載の方法。
本発明において、血漿蛋白組成物における血漿蛋白は特に限定されるものではなく、血液中に含まれるものであれば如何なるものも含まれる。たとえば、本願発明の方法により特に所期の効果を達成することができる血漿蛋白としては、分子量が大きく、ウイルスの混入のおそれが高い血漿蛋白質であって、たとえば、フィブロネクチン、フィブリノゲン、凝固Ｖ因子、凝固ＶＩＩＩ因子、フォンビルブランド因子、凝固ＸＩＩＩ因子、レチノール結合蛋白質、αグロブリン、βグロブリンおよびγグロブリンなどが挙げられる。特に、フィブリノゲンはアルコール血漿分画製造過程において最初に沈殿してくる分画から得られる蛋白質であるために、万一血漿にウイルスが混入した場合にその汚染の影響を受けやすい蛋白質であり、本発明の簡便な方法により非エンベロープウイルスを除去できることは有用である。
本発明の方法が適応される血漿蛋白組成物は、ウイルス、特に感染性ウイルスの夾雑が危惧され、多孔性膜処理に付することのできる形態のものであれば特に限定されるものではなく、通常は液状であり、例えば、血漿または組織抽出液を各種分画法により処理して得た分画からなる溶液、遺伝子組み換え宿主または組織培養により得られる培養液、市販の蛋白製剤としたものなどが挙げられる。
また、その精製度は特に制限されるものではなく、任意の精製度のものが適応可能である。その精製度は一般的な方法、例えば、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）分画、アルコール分画、グリシン分画、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等の方法を適宜選択し利用することによって精製された如何なる精製段階のものも含まれる。
本発明で使用される沈殿法としては自体既知の蛋白分画法として使用される方法が含まれる。たとえば、中性塩類（これを使用する沈殿法は、いわゆる塩析法と呼ばれるもので、硫酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、リン酸塩、アルカリ金属塩、アンモニア、マグネシウム、ハロゲン化合物等が挙げられる）、水溶性有機溶媒（たとえば、エタノール、メタノール、エチルエーテル、アセトン等）、水溶性非イオン化高分子化合物（たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ノニルフェノールエトキシレート等）、金属イオン（硫酸バリウム、水酸化アルミニウム等）、有機陽イオン（リバノール、プロタミン、その他陽イオン性界面活性剤等）、陰イオン（たとえば、ピクリン酸、三塩化酢酸、スルフォサリチル酸、過塩素酸等の低分子陰イオン、ポリアクリル酸、ポリスチレンスルフォン酸、ポリリン酸塩等のポリアニオン）等を使用する沈殿法、脱塩による沈殿法（透析法、希釈法等）、グリシン沈殿法（グリシン−塩化ナトリウム沈殿法）等が挙げられる。
本発明において使用される沈殿法は通常の蛋白質分画処理時に用いられると同様の方法、条件にて行なうことができる。すなわち、本発明において沈殿法に使用される各物質は分離しようとする目的蛋白質の溶解性に応じて適宜選択することが出来、例えば、当該蛋白質分子の表面電荷や親水性等を変化させ目的の蛋白質を沈殿として得ることができるもの、または不要な蛋白質を沈殿させ目的の蛋白質を上清に得ることが出来るものを使用すればよく、その沈殿処理における条件は、それぞれの蛋白質に応じて選択すればよい。したがって、水素イオン濃度またはｐＨ、イオン強度、誘電率、温度、蛋白濃度およびその他のイオン等、沈殿法に影響を及ぼす種々の因子も目的の蛋白質に応じたものを選択することが出来る。また、それらの使用条件も蛋白質に応じて選択すればよい。
特に、蛋白質がフィブリノゲンである場合、グリシン沈殿法が好ましく、更に好ましくはグリシン−塩化ナトリウム沈殿法である。またその濃度はグリシンが５０ｇ／Ｌ以上、塩化ナトリウムが１０ｇ／Ｌ以上、好ましくはグリシンが７５ｇ／Ｌ以上、塩化ナトリウム３０ｇ／Ｌ以上である。また、その上限は、グリシンが２５０ｇ／Ｌ以下、好ましくは２２５ｇ／Ｌ以下であり、塩化ナトリウムが１７５ｇ／Ｌ以下、好ましくは１５０ｇ／Ｌ以下である。
上記沈殿法により分離された各蛋白質は通常の遠心処理、各種濾過工程に付すことにより必要な画分として得られる。
目的蛋白質が沈殿として得られる場合にはその後の精製のため適当な溶媒で抽出、溶解して溶液とする必要があるが、溶媒には特に限定はなく、蛋白質の精製過程で通常使用される溶媒、緩衝液等が使用されるが、蛋白質がフィブリノゲンである場合、抽出、溶解には通常クエン酸緩衝液や水が使用され、特に水抽出した後通常の遠心または清澄濾過工程を経ることにより本発明の効果を高めることができる。
本発明において、多孔性膜処理とは、ウイルスの夾雑が危惧される血漿蛋白を多孔性膜によって濾過することを意味する。
本発明に使用される多孔性膜の素材は特に制限されず、再生セルロース、酢酸セルロース、ポリフッ化ビニリデン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリスルホン、ポリメチルメタクリレート等の合成高分子化合物が使用されるが、好ましくは再生セルロースである。
また、その形状は中空糸状、シート状等が挙げられるが、好ましくは中空糸状である。たとえば、該再生セルロースの多孔性中空糸膜はセルロース銅アンモニア溶液からミクロ相分離法［Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９，１９７−２２８（１９８５）］によって調製される。
使用する多孔性膜の平均孔径は蛋白質の種類、除去しようとするウイルスの種類により異なるが、一般に１〜１００ｎｍ、好ましくは１０〜１００ｎｍであり、特に、フィブリノゲン等の分子量の大きな蛋白質においてパルボウイルス、ＨＡＶ等を濾過除去する場合には３５〜１００ｎｍ、好ましくは３５〜７５ｎｍの孔径である。
多孔性膜が中空糸状である場合には、好ましくはモジュールの態様で使用される。たとえば、多孔性中空糸膜を多数平行に束ねてカートリッジに充填し、接着剤を用いて一本化したものが挙げられる。
市販のものとしては、膜となる周壁が１００層以上の多重層構造であるプラノバシリーズ（商品名、旭化成社製）、ウイルス除去膜として知られているバイアソルブシリーズ（商品名、ミリポア社製）、オメガＶＲシリーズ（商品名、ポール社製）、ウルチポアシリーズ（商品名、ポール社製）等を使用することができる。特に好ましくは、プラノバシリーズである。
血漿蛋白組成物を多孔性膜にて処理、即ち濾過する際の温度は、４〜５０℃であり、好ましくは４〜３７℃である。
濾過圧力は１０〜１００ｋｐａ、好ましくは１０〜９０ｋｐａである。濾過の方法としては、溶液にひずみ速度を与えながら濾過するクロスフロー濾過法（循環式）と溶液にひずみ速度を与えずに濾過するデットエンド濾過法（非循環式）がある。好ましくは、加圧空気等によるデットエンド濾過法によって行われる。
また、多孔性膜にて濾過する際に、試料にカオトロピックイオンまたはアミノ酸を添加することによって、多孔性膜処理により、蛋白の活性を殆ど失うことなく、効率よく夾雑ウイルスを除去するという本発明の効果をより一層発揮させることができる。
この場合のカオトロピックイオンまたはアミノ酸の種類は特に限定されず、通常蛋白質の精製過程で使用されるものを使用することができるが、特に、塩素イオン、アルギニンなどが好ましい。
また、このような濾過処理は単回又は複数回行うこともできる。複数回行なうことにより、濾過による更に優れたウイルス除去効果を得ることができる。
特に、本発明は、血漿蛋白組成物をウイルス単粒子径より孔径の大きな多孔性膜を使用して処理することによって、多孔性膜の孔径より小さな単粒子径のウイルスを除去することができ、このようにして得られた血漿蛋白組成物は、実質的に当該ウイルスを含まないものとすることが可能となる。
「ウイルス単粒子径より孔径の大きな多孔性膜」とは、当該ウイルスが単粒子である場合には、当該多孔性膜を通過しうる多孔性膜を意味する。
したがって、本発明によれば、蛋白の活性を殆ど失うことなく、効率よく夾雑ウイルスを除去することができ、より安全な血漿蛋白製剤の原料としての血漿蛋白組成物を得ることができる。
本発明の方法により除去されるウイルスの具体例として、ワクシニアウイルス、ムンプスウイルス、単純庖疹ウイルス、エコーウイルス、パルボウイルス、ＨＩＶ、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＴＴＶなどが挙げられる。特に、夾雑が危惧される非エンベロープウイルスとしてパルボウイルス、ＨＡＶ等が挙げられる。
このようにして得られた血漿蛋白組成物はそのまま、またはさらに一般的な蛋白質の精製方法、たとえばＰＥＧ（ポリエチレングリコール）分画、アルコール分画、グリシン分画、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等の方法により精製することによって、血漿蛋白製剤とすることができる。
血漿蛋白製剤は、慣用の方法により液状製剤または乾燥製剤とされ、通常医薬として薬理的に許容される添加剤、たとえば、防腐剤、殺菌剤、キレート剤、粘稠剤、等張化剤など、または製薬上必要な成分が適宜配合されてもよい。本発明の製造法によって、実質的にウイルスの除去された血漿蛋白組成物が製造されるが、血漿蛋白組成物は本発明の方法の前後において、一般的に使用されるウイルス不活化または除去方法、たとえば、乾燥加熱、液状加熱、界面活性剤処理、紫外線照射処理、ウイルス除去膜処理などを適宜組み合わせることによって、ウイルスの不活化または除去をより完全なものとすることができる。
本発明において「実質的にウイルスの除去された」とは既知のウイルス量の測定方法において検出限界以下であることを意味する。
実施例
以下、実験例、参考例等により本発明を説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
実施例１
正常ヒト血漿由来のコーンのＦｒ．Ｉ画分１００ｇを１．５Ｌのクエン酸緩衝液で溶解し、トリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を０．３ｗ／ｖ％及びＴｗｅｅｎ８０を１ｗ／ｖ％になるように添加し、３０℃にて６時間の界面活性剤処理を行なった。
界面活性剤処理後の試料にモニターウイルスとしてパルボウイルスを１０２．７コピー／ｍｌ添加した。
その後、この試料を１５％グリシン−１Ｍ塩化ナトリウムによる沈殿分画処理にて、フィブリノゲンを遠心（４，０００ｒｐｍ、２０分間）により沈殿させて回収した。次いで回収されたフィブリノゲンを１．０Ｌのクエン酸緩衝液に溶解し、１．０％溶液を調製した。この溶液を濾過前のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。
この溶液をプラノバ７５Ｎ（平均孔径７２±４ｎｍ）を用いた温度２３℃、濾過圧１０ｋｐａ、デットエンド濾過法に供しウイルス除去を行なった。この濾液を濾過後のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。
実施例２
正常ヒト血漿由来のコーンのＦｒ．Ｉ画分１００ｇを１．５Ｌのクエン酸緩衝液で溶解し、トリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を０．３ｗ／ｖ％及びＴｗｅｅｎ８０を１ｗ／ｖ％になるように添加し、３０℃にて６時間の界面活性剤処理を行なった。
その後、この試料を１５％グリシン−１Ｍ塩化ナトリウムによる沈殿分画処理に供し、フィブリノゲンを遠心（４，０００ｒｐｍ、２０分間）により沈殿させて回収した。次いで回収されたフィブリノゲンを１．０Ｌのクエン酸緩衝液に溶解し、１．０％溶液を調製した。
この溶液にモニターウイルスとしてパルボウイルスを１０５．７コピー／ｍｌ添加した。
その後、この試料を１５％グリシン−１Ｍ塩化ナトリウム分画に供し、フィブリノゲンを遠心（４，０００ｒｐｍ、２０分間）により沈殿させて回収した。次いで回収されたフィブリノゲンを１．０Ｌのクエン酸緩衝液に溶解し、１．０％溶液を調製した。この溶液を濾過前のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。
得られた溶液をプラノバ７５Ｎ（平均孔径７２±４ｎｍ）を用いた温度２３℃、濾過圧１０ｋｐａ、デットエンド濾過法に供しウイルス除去を行なった。この濾液を濾過後のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。
実施例３
正常ヒト血漿由来のコーンのＦｒ．Ｉ画分１００ｇを１．５Ｌの生理食塩水で溶解し、トリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を０．３ｗ／ｖ％及びＴｗｅｅｎ８０を１ｗ／ｖ％になるように添加し、３０℃にて６時間の界面活性剤処理を行なった。
界面活性剤処理後の試料にモニターウイルスとしてパルボウイルスを添加した。
その後、この試料を１５％グリシン−１Ｍ塩化ナトリウムによる沈殿分画処理にて、フィブリノゲンを遠心（４，０００ｒｐｍ、２０分間）により沈殿させて回収した。次いで回収されたフィブリノゲンを１．０Ｌのクエン酸緩衝液に溶解し、１．０％溶液を調製した。この溶液を濾過前のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。また、同時にこの溶液を濾過前のサンプルとしてその蛋白質量を測定するため２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。
この溶液をプラノバ７５Ｎ（平均孔径７２±４ｎｍ）を用いた温度２３℃、濾過圧１０ｋｐａ、デットエンド濾過法に供しウイルス除去を行なった。この濾液を濾過後のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。また、同時にこの濾液の蛋白質量を２８０ｎｍにおける吸光度として測定した。
次に、この濾液を更にプラノバ３５Ｎ（平均孔径３５±２ｎｍ）を用いた温度２３℃、濾過圧１０ｋｐａ、デットエンド濾過法に供しウイルス除去を行なった。この濾液を濾過後のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。また、同時にこの濾液の蛋白質量を２８０ｎｍにおける吸光度として測定した。
この場合、プラノバ７５Ｎとプラノバ３５Ｎを組み合わせた濾過によりその前後で１０６コピー／ｍｌ以上のウイルス除去効果を示した。
実施例４
正常ヒト血漿由来のコーンのＦｒ．Ｉ画分１００ｇを１．５Ｌの生理食塩水で溶解し、トリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を０．３ｗ／ｖ％及びＴｗｅｅｎ８０を１ｗ／ｖ％になるように添加し、３０℃にて６時間の界面活性剤処理を行なった。
界面活性剤処理後の試料にモニターウイルスとしてパルボウイルスを１０１０．１コピー／ｍｌ添加した。
その後、この試料を８％グリシン−１Ｍ塩化ナトリウムによる沈殿分画処理にて、フィブリノゲンを遠心（４，０００ｒｐｍ、２０分間）により沈殿させて回収した。次いで回収されたフィブリノゲンを１．５Ｌの注射用水で溶解し、フィブリノゲン溶液を調製した。この溶液中の不溶物を遠心処理にて除去した後、０．９ｇ／Ｌの塩化ナトリウムを添加して濾過前のサンプルとした。
この溶液をプラノバ３５Ｎ（平均孔径３５±２ｎｍ）を用いた温度２３℃、濾過圧１０ｋｐａ、デットエンド濾過法に供した。この濾液を濾過後のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。
この場合、グリシン−塩化ナトリウム分画、沈殿の水抽出、遠心除去およびプラノバ３５Ｎを組み合わせた処理によりその前後で１０６コピー／ｍｌ以上のウイルス除去効果を示した。
実施例５
正常ヒト血漿由来のコーンのＦｒ．Ｉ画分１００ｇを１．５Ｌの生理食塩水で溶解し、トリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を０．３ｗ／ｖ％及びＴｗｅｅｎ８０を１ｗ／ｖ％になるように添加し、３０℃にて６時間の界面活性剤処理を行なった。
界面活性剤処理後の試料にモニターウイルスとしてＥＭＣを１０８．４ＴＣＩＤ５０／ｍｌ添加した。
その後、この試料を８％グリシン−１Ｍ塩化ナトリウムによる沈殿分画処理にて、フィブリノゲンを遠心（４，０００ｒｐｍ、２０分間）により沈殿させて回収した。次いで回収されたフィブリノゲンを１．５Ｌの注射用水で溶解し、フィブリノゲン溶液を調製した。この溶液中の不溶物を遠心処理にて除去した後、０．９ｇ／Ｌの塩化ナトリウムを添加して濾過前のサンプルとした。
この溶液をプラノバ３５Ｎ（平均孔径３５±２ｎｍ）を用いた温度２３℃、濾過圧１０ｋｐａ、デットエンド濾過法に供した。この濾液を濾過後のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。
この場合、グリシン−塩化ナトリウムによる沈殿分画処理、沈殿の水抽出、遠心除去およびプラノバ３５Ｎを組み合わせた処理によりその前後で１０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上のウイルス除去効果を示した。
参考例１
正常ヒト血漿由来のコーンのＦｒ．Ｉ画分１００ｇを１．５Ｌの生理食塩水で溶解し、ＴＮＢＰを０．３ｗ／ｖ％及びＴｗｅｅｎ８０を１ｗ／ｖ％になるように添加し、３０℃にて６時間の界面活性剤処理を行なった。
その後、この試料を１５％グリシン−１Ｍ塩化ナトリウムによる沈殿分画処理にて、フィブリノゲンを沈殿させて回収した。次いで回収されたフィブリノゲンを１．０Ｌのクエン酸緩衝液に溶解し、１．０％溶液を調製した。
この溶液にモニターウイルスとしてパルボウイルスを１０１０．７コピー／ｍｌ添加した。
また、この溶液を濾過前のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。
この溶液をプラノバ７５Ｎ（平均孔径７２±４ｎｍ）を用いた温度２３℃、濾過圧１０ｋｐａ、デットエンド濾過法に供しウイルス除去を行なった。この濾液を濾過後のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。
参考例２
参考例１の方法中、モニターウイルスとしてパルボウイルスを１０１１．７コピー／ｍｌ添加し、その後この溶液をプラノバ３５Ｎ（平均孔径３５±２ｎｍ）を用いた温度２３℃、濾過圧１０ｋｐａ、デットエンド濾過法に供した以外、参考例１と同様に処理を行ない各試料のウイルス量を測定した。
参考例３
正常ヒト血漿由来のコーンのＦｒ．Ｉ画分１００ｇを１．５Ｌの生理食塩水で溶解し、トリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を０．３ｗ／ｖ％及びＴｗｅｅｎ８０を１ｗ／ｖ％になるように添加し、３０℃にて６時間の界面活性剤処理を行なった。
その後、この試料を１５％グリシン−１Ｍ塩化ナトリウムによる沈殿分画処理にて、フィブリノゲンを沈殿させて回収した。次いで回収されたフィブリノゲンを１．０Ｌのクエン酸緩衝液に溶解し、１．０％溶液を調製した。
この溶液にモニターウイルスとしてパルボウイルスを１０５．７コピー／ｍｌ添加した。
この溶液をプラノバ７５Ｎ（平均孔径７２±４ｎｍ）を用いた温度２３℃、濾過圧１０ｋｐａ、デットエンド濾過法に供しウイルス除去を行なった。この濾液を濾過後のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。
次に、この濾液を更にプラノバ３５Ｎ（平均孔径３５±２ｎｍ）を用いた温度２３℃、濾過圧１０ｋｐａ、デットエンド濾過法に供しウイルス除去を行なった。この濾液を濾過後のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。
ウイルス量の測定方法：
（１）パルボウイルスのウイルス量の測定は各試料についてウイルス核酸の残存量をポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）測定法（Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｖｏｌ．３２，ｐ．８２４−８２８（１９９２））によって測定した。パルボウイルスの核酸量は１０２コピー／ｍｌで検出限界以下となる。
（２）ＥＭＣウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ：脳心筋炎ウイルス）はＶｅｒｏ細胞を使用した感染価（ＴＣＩＤ５０）を測定することにより評価した。
ＥＭＣウイルスのＶｅｒｏ細胞に対する感染価は、１０１．５ＴＣＩＤ５０／ｍｌで検出限界以下となる。
上記の実施例１〜２、４〜５および参考例１〜３の結果を表１に示す。
蛋白質量の測定方法
各試料を生理食塩液で適当に希釈し、２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。上記の実施例３の結果を表２に示す。
産業上の利用分野
本発明により血漿蛋白組成物を多孔性膜処理することによって、蛋白の活性を殆ど失うことなく、効率よく血漿蛋白中の夾雑ウイルスを除去することができる。従って、本発明によってウイルス感染性の危惧のない血漿蛋白を提供することができる。特に、本発明の多孔性膜処理により非エンベロープウイルス、とりわけパルボウイルスおよび／またはＡ型肝炎ウイルスを実質的に含まないフィブリノゲン組成物を提供することができる。
本出願は、日本で出願された平成１１年特許願第３６０９５０号を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
本発明は、血漿蛋白組成物中のウイルス、特に感染性ウイルスが除去された血漿蛋白組成物の製造法、当該方法により得られるウイルス、特に感染性ウイルスを実質的に含まない血漿蛋白組成物、非エンベロープウイルスとりわけ、パルボウイルスおよび／またはＡ型肝炎ウイルスを実質的に含まないフィブリノゲン組成物および血漿蛋白組成物中のウイルスを除去する方法に関する。
背景技術
蛋白製剤、特にヒト血漿を原料とする血漿分画製剤には、ヒトに感染し得る病原因子が混入しているおそれがあり、特にウイルス感染に対する問題は重要である。これまで輸血後にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などのウイルスの感染事故が発生している。
このような事故は過去のものではなく、数々の技術の導入によって事故の発生率は指数的な数値をもって劇的に少なくなっているものの、現在もその発生を完全に否定することはできない。
これらのウイルス伝播を防ぐために、夾雑の可能性のあるウイルスを不活化または除去する方法が種々知られている。例えば、蛋白含有組成物を液状で加熱する方法（特開昭５５−１４５６１５号公報、特開昭５６−１３９４２２号公報、特開昭５６−１０６５９４号公報など）、乾燥状態で加熱する方法（特表昭５８−５００５４８号公報、特開昭５８−２１３７２１号公報など）、トリアルキルホスフェートおよび／または界面活性剤などと接触させる方法（特開昭６０−５１１１６号公報など）、紫外線照射による方法（特開平７−１９６５３１号公報など）、ウイルス除去膜による方法（特開平９−１００２３９号公報など）が知られている。
しかし、加熱処理では熱に強いウイルスが残存し、界面活性剤処理では非エンベロープウイルスが残存し、紫外線照射の単独処理では蛋白が失活する可能性があるなど、ウイルスを不活化又は除去する方法において単一の処理では、蛋白の活性を失うことなく、かつ、完全に夾雑ウイルスを不活化又は除去することは困難であった。
そこで、現在、夾雑ウイルスを不活化又は除去する上記方法を適当に組み合わせて使用しているのが現状である。
一方、フィブリノゲンはアルコール血漿分画製造過程において最初に沈殿してくる分画から得られる蛋白質であるために、万一血漿にウイルスが混入した場合にその汚染の影響を受けやすい蛋白質である。特に現在話題の多いウイルスとしてパルボウイルスＢ１９（以下、Ｂ１９という）があるが、このウイルスはエンベロープが無く、熱に強く、その単粒子径は１８〜２５ｎｍ程度と非常に小さいために、血漿分画製剤の分野で特に、その不活化／除去対策に注力され研究が進められているものである。
ウイルス除去膜による方法では、当然に、孔径に比しより大きな分子径のウイルスを濾過により除去することができるが、孔径より小さなウイルスを除去することはできず、また、あまり孔径の小さな除去膜を使用するとサンプルが目詰まりするなど濾過自体が困難であったり、また、サンプル量に比例して膜処理時の流速が低下し、サンプル処理量の制限及び処理時間の増大といった多くの問題を有していた。
特に、フィブリノゲンの精製工程においてその分子量等の関係から、現在市販されている多孔性膜の膜孔径が３５ｎｍ未満のものを使用した場合には、上記の目詰まり、サンプル処理量の制限及び処理時間の増大といった問題が実際に生じており、膜孔径が３５ｎｍ以上の多孔径膜の使用しかできないという問題があった。しかし、パルボウイルス（Ｂ１９）の単粒子径は上述の通り１８〜２５ｎｍ程度であるので、現在市販されている膜孔径３５ｎｍや７５ｎｍのプラノバ３５Ｎ、プラノバ７５Ｎ（いずれも商品名、旭化成社製）単独、さらにはこれらのウイルス除去膜を多段に用いる方法においても除去できないという問題があった。
したがって、今日、簡便な処理方法により少しでもウイルス感染性の少ない、安全な蛋白製剤を提供する方法が望まれていた。
発明の開示
本発明者らは、これらの課題を解決するために鋭意研究した結果、多孔性膜処理により、蛋白の活性を殆ど失うことなく、効率よく夾雑ウイルスを除去することができることを見出して本発明を完成するに至った。また、本発明者らは多孔性膜処理により非エンベロープウイルス、とりわけパルボウイルスおよび／またはＡ型肝炎ウイルスを実質的に含まないフィブリノゲン組成物を得ることができることを見出して本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は下記の通りのものである。
（１） 血漿蛋白組成物をウイルス単粒子径より孔径の大きな多孔性膜処理に付す工程を有することを特徴とするウイルスの除去された血漿蛋白組成物の製造法。
（２） 多孔性膜が多孔性中空糸膜である前記１記載の製造法。
（３） 多孔性膜処理前に血漿蛋白組成物を沈殿法分画処理に付すことを特徴とする前記１または２記載の製造法。
（４） 多孔性膜処理に付す前に、血漿蛋白組成物を沈殿法分画処理に付し、得られた沈殿を水抽出する工程を有することを特徴とする前記１〜３のいずれかに記載の製造法。
（５） 血漿蛋白組成物がフィブロネクチン、フィブリノゲン、凝固Ｖ因子、凝固ＶＩＩＩ因子、フォンビルブランド因子、凝固ＸＩＩＩ因子、レチノール結合蛋白質、αグロブリン、βグロブリンおよびγグロブリンから選ばれる少なくとも一種の蛋白質を含有するものである前記１〜４のいずれかに記載の製造法。
（６） 血漿蛋白組成物が少なくともフィブリノゲンを含有するものである前記５に記載の製造法。
（７） ウイルスが非エンベロープウイルスである前記１〜６のいずれかに記載の製造法。
（８） 非エンベロープウイルスがパルボウイルスおよび／またはＡ型肝炎ウイルスである前記７記載の製造法。
（９） ウイルス単粒子径より孔径の大きな多孔性膜処理に付すことにより当該ウイルスが実質的に除去された血漿蛋白組成物。
（１０） 多孔性膜が多孔性中空糸膜である前記９記載の血漿蛋白組成物。
（１１） 多孔性膜処理前に血漿蛋白組成物を沈殿法分画処理に付することを特徴とする前記９または１０に記載の血漿蛋白組成物。
（１２） 多孔性膜処理前に血漿蛋白組成物を沈殿法にて分画処理し、得られた沈殿を水抽出することを特徴とする前記９〜１１のいずれかに記載の血漿蛋白組成物。
（１３） 血漿蛋白組成物がフィブロネクチン、フィブリノゲン、凝固Ｖ因子、凝固ＶＩＩＩ因子、フォンビルブランド因子、凝固ＸＩＩＩ因子、レチノール結合蛋白質、αグロブリン、βグロブリンおよびγグロブリンから選ばれる少なくとも１種の蛋白質を含有するものである前記９〜１２のいずれかに記載の血漿蛋白組成物。
（１４） 血漿蛋白組成物が少なくともフィブリノゲンを含有するものである前記１３に記載の血漿蛋白組成物。
（１５） ウイルスが非エンベロープウイルスである前記９〜１４のいずれかに記載の血漿蛋白組成物。
（１６） 非エンベロープウイルスがパルボウイルスおよび／またはＡ型肝炎ウイルスである前記１５に記載の血漿蛋白組成物。
（１７） パルボウイルスを実質的に含まないフィブリノゲン組成物。
（１８） 血漿蛋白組成物をウイルス単粒子径より孔径の大きな多孔性膜処理に付すことを特徴とする血漿蛋白組成物中のウイルスの除去方法。
（１９） 多孔性膜が多孔性中空糸膜である前記１８記載の方法。
（２０） 多孔性膜処理前に血漿蛋白組成物を沈殿法分画処理に付すことを特徴とする前記１８または１９記載の方法。
（２１） 多孔性膜処理に付す前に、血漿蛋白組成物を沈殿法にて分画処理し、得られた沈殿を水抽出する工程を有することを特徴とする前記１８〜２０のいずれかに記載の方法。
本発明において、血漿蛋白組成物における血漿蛋白は特に限定されるものではなく、血液中に含まれるものであれば如何なるものも含まれる。たとえば、本願発明の方法により特に所期の効果を達成することができる血漿蛋白としては、分子量が大きく、ウイルスの混入のおそれが高い血漿蛋白質であって、たとえば、フィブロネクチン、フィブリノゲン、凝固Ｖ因子、凝固ＶＩＩＩ因子、フォンビルブランド因子、凝固ＸＩＩＩ因子、レチノール結合蛋白質、αグロブリン、βグロブリンおよびγグロブリンなどが挙げられる。特に、フィブリノゲンはアルコール血漿分画製造過程において最初に沈殿してくる分画から得られる蛋白質であるために、万一血漿にウイルスが混入した場合にその汚染の影響を受けやすい蛋白質であり、本発明の簡便な方法により非エンベロープウイルスを除去できることは有用である。
本発明の方法が適応される血漿蛋白組成物は、ウイルス、特に感染性ウイルスの夾雑が危惧され、多孔性膜処理に付することのできる形態のものであれば特に限定されるものではなく、通常は液状であり、例えば、血漿または組織抽出液を各種分画法により処理して得た分画からなる溶液、遺伝子組み換え宿主または組織培養により得られる培養液、市販の蛋白製剤としたものなどが挙げられる。
また、その精製度は特に制限されるものではなく、任意の精製度のものが適応可能である。その精製度は一般的な方法、例えば、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）分画、アルコール分画、グリシン分画、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等の方法を適宜選択し利用することによって精製された如何なる精製段階のものも含まれる。
本発明で使用される沈殿法としては自体既知の蛋白分画法として使用される方法が含まれる。たとえば、中性塩類（これを使用する沈殿法は、いわゆる塩析法と呼ばれるもので、硫酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、リン酸塩、アルカリ金属塩、アンモニア、マグネシウム、ハロゲン化合物等が挙げられる）、水溶性有機溶媒（たとえば、エタノール、メタノール、エチルエーテル、アセトン等）、水溶性非イオン化高分子化合物（たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ノニルフェノールエトキシレート等）、金属イオン（硫酸バリウム、水酸化アルミニウム等）、有機陽イオン（リバノール、プロタミン、その他陽イオン性界面活性剤等）、陰イオン（たとえば、ピクリン酸、三塩化酢酸、スルフォサリチル酸、過塩素酸等の低分子陰イオン、ポリアクリル酸、ポリスチレンスルフォン酸、ポリリン酸塩等のポリアニオン）等を使用する沈殿法、脱塩による沈殿法（透析法、希釈法等）、グリシン沈殿法（グリシン−塩化ナトリウム沈殿法）等が挙げられる。
本発明において使用される沈殿法は通常の蛋白質分画処理時に用いられると同様の方法、条件にて行なうことができる。すなわち、本発明において沈殿法に使用される各物質は分離しようとする目的蛋白質の溶解性に応じて適宜選択することが出来、例えば、当該蛋白質分子の表面電荷や親水性等を変化させ目的の蛋白質を沈殿として得ることができるもの、または不要な蛋白質を沈殿させ目的の蛋白質を上清に得ることが出来るものを使用すればよく、その沈殿処理における条件は、それぞれの蛋白質に応じて選択すればよい。したがって、水素イオン濃度またはｐＨ、イオン強度、誘電率、温度、蛋白濃度およびその他のイオン等、沈殿法に影響を及ぼす種々の因子も目的の蛋白質に応じたものを選択することが出来る。また、それらの使用条件も蛋白質に応じて選択すればよい。
特に、蛋白質がフィブリノゲンである場合、グリシン沈殿法が好ましく、更に好ましくはグリシン−塩化ナトリウム沈殿法である。またその濃度はグリシンが５０ｇ／Ｌ以上、塩化ナトリウムが１０ｇ／Ｌ以上、好ましくはグリシンが７５ｇ／Ｌ以上、塩化ナトリウム３０ｇ／Ｌ以上である。また、その上限は、グリシンが２５０ｇ／Ｌ以下、好ましくは２２５ｇ／Ｌ以下であり、塩化ナトリウムが１７５ｇ／Ｌ以下、好ましくは１５０ｇ／Ｌ以下である。
上記沈殿法により分離された各蛋白質は通常の遠心処理、各種濾過工程に付すことにより必要な画分として得られる。
目的蛋白質が沈殿として得られる場合にはその後の精製のため適当な溶媒で抽出、溶解して溶液とする必要があるが、溶媒には特に限定はなく、蛋白質の精製過程で通常使用される溶媒、緩衝液等が使用されるが、蛋白質がフィブリノゲンである場合、抽出、溶解には通常クエン酸緩衝液や水が使用され、特に水抽出した後通常の遠心または清澄濾過工程を経ることにより本発明の効果を高めることができる。
本発明において、多孔性膜処理とは、ウイルスの夾雑が危惧される血漿蛋白を多孔性膜によって濾過することを意味する。
本発明に使用される多孔性膜の素材は特に制限されず、再生セルロース、酢酸セルロース、ポリフッ化ビニリデン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリスルホン、ポリメチルメタクリレート等の合成高分子化合物が使用されるが、好ましくは再生セルロースである。
また、その形状は中空糸状、シート状等が挙げられるが、好ましくは中空糸状である。たとえば、該再生セルロースの多孔性中空糸膜はセルロース銅アンモニア溶液からミクロ相分離法［Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９，１９７−２２８（１９８５）］によって調製される。
使用する多孔性膜の平均孔径は蛋白質の種類、除去しようとするウイルスの種類により異なるが、一般に１〜１００ｎｍ、好ましくは１０〜１００ｎｍであり、特に、フィブリノゲン等の分子量の大きな蛋白質においてパルボウイルス、ＨＡＶ等を濾過除去する場合には３５〜１００ｎｍ、好ましくは３５〜７５ｎｍの孔径である。
多孔性膜が中空糸状である場合には、好ましくはモジュールの態様で使用される。たとえば、多孔性中空糸膜を多数平行に束ねてカートリッジに充填し、接着剤を用いて一本化したものが挙げられる。
市販のものとしては、膜となる周壁が１００層以上の多重層構造であるプラノバシリーズ（商品名、旭化成社製）、ウイルス除去膜として知られているバイアソルブシリーズ（商品名、ミリポア社製）、オメガＶＲシリーズ（商品名、ポール社製）、ウルチポアシリーズ（商品名、ポール社製）等を使用することができる。特に好ましくは、プラノバシリーズである。
血漿蛋白組成物を多孔性膜にて処理、即ち濾過する際の温度は、４〜５０℃であり、好ましくは４〜３７℃である。
濾過圧力は１０〜１００ｋｐａ、好ましくは１０〜９０ｋｐａである。濾過の方法としては、溶液にひずみ速度を与えながら濾過するクロスフロー濾過法（循環式）と溶液にひずみ速度を与えずに濾過するデットエンド濾過法（非循環式）がある。好ましくは、加圧空気等によるデットエンド濾過法によって行われる。
また、多孔性膜にて濾過する際に、試料にカオトロピックイオンまたはアミノ酸を添加することによって、多孔性膜処理により、蛋白の活性を殆ど失うことなく、効率よく夾雑ウイルスを除去するという本発明の効果をより一層発揮させることができる。
この場合のカオトロピックイオンまたはアミノ酸の種類は特に限定されず、通常蛋白質の精製過程で使用されるものを使用することができるが、特に、塩素イオン、アルギニンなどが好ましい。
また、このような濾過処理は単回又は複数回行うこともできる。複数回行なうことにより、濾過による更に優れたウイルス除去効果を得ることができる。
特に、本発明は、血漿蛋白組成物をウイルス単粒子径より孔径の大きな多孔性膜を使用して処理することによって、多孔性膜の孔径より小さな単粒子径のウイルスを除去することができ、このようにして得られた血漿蛋白組成物は、実質的に当該ウイルスを含まないものとすることが可能となる。
「ウイルス単粒子径より孔径の大きな多孔性膜」とは、当該ウイルスが単粒子である場合には、当該多孔性膜を通過しうる多孔性膜を意味する。
したがって、本発明によれば、蛋白の活性を殆ど失うことなく、効率よく夾雑ウイルスを除去することができ、より安全な血漿蛋白製剤の原料としての血漿蛋白組成物を得ることができる。
本発明の方法により除去されるウイルスの具体例として、ワクシニアウイルス、ムンプスウイルス、単純庖疹ウイルス、エコーウイルス、パルボウイルス、ＨＩＶ、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＴＴＶなどが挙げられる。特に、夾雑が危惧される非エンベロープウイルスとしてパルボウイルス、ＨＡＶ等が挙げられる。
このようにして得られた血漿蛋白組成物はそのまま、またはさらに一般的な蛋白質の精製方法、たとえばＰＥＧ（ポリエチレングリコール）分画、アルコール分画、グリシン分画、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等の方法により精製することによって、血漿蛋白製剤とすることができる。
血漿蛋白製剤は、慣用の方法により液状製剤または乾燥製剤とされ、通常医薬として薬理的に許容される添加剤、たとえば、防腐剤、殺菌剤、キレート剤、粘稠剤、等張化剤など、または製薬上必要な成分が適宜配合されてもよい。本発明の製造法によって、実質的にウイルスの除去された血漿蛋白組成物が製造されるが、血漿蛋白組成物は本発明の方法の前後において、一般的に使用されるウイルス不活化または除去方法、たとえば、乾燥加熱、液状加熱、界面活性剤処理、紫外線照射処理、ウイルス除去膜処理などを適宜組み合わせることによって、ウイルスの不活化または除去をより完全なものとすることができる。
本発明において「実質的にウイルスの除去された」とは既知のウイルス量の測定方法において検出限界以下であることを意味する。
実施例
以下、実験例、参考例等により本発明を説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
実施例１
正常ヒト血漿由来のコーンのＦｒ．Ｉ画分１００ｇを１．５Ｌのクエン酸緩衝液で溶解し、トリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を０．３ｗ／ｖ％及びＴｗｅｅｎ８０を１ｗ／ｖ％になるように添加し、３０℃にて６時間の界面活性剤処理を行なった。
界面活性剤処理後の試料にモニターウイルスとしてパルボウイルスを１０２．７コピー／ｍｌ添加した。
その後、この試料を１５％グリシン−１Ｍ塩化ナトリウムによる沈殿分画処理にて、フィブリノゲンを遠心（４，０００ｒｐｍ、２０分間）により沈殿させて回収した。次いで回収されたフィブリノゲンを１．０Ｌのクエン酸緩衝液に溶解し、１．０％溶液を調製した。この溶液を濾過前のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。
この溶液をプラノバ７５Ｎ（平均孔径７２±４ｎｍ）を用いた温度２３℃、濾過圧１０ｋｐａ、デットエンド濾過法に供しウイルス除去を行なった。この濾液を濾過後のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。
実施例２
正常ヒト血漿由来のコーンのＦｒ．Ｉ画分１００ｇを１．５Ｌのクエン酸緩衝液で溶解し、トリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を０．３ｗ／ｖ％及びＴｗｅｅｎ８０を１ｗ／ｖ％になるように添加し、３０℃にて６時間の界面活性剤処理を行なった。
その後、この試料を１５％グリシン−１Ｍ塩化ナトリウムによる沈殿分画処理に供し、フィブリノゲンを遠心（４，０００ｒｐｍ、２０分間）により沈殿させて回収した。次いで回収されたフィブリノゲンを１．０Ｌのクエン酸緩衝液に溶解し、１．０％溶液を調製した。
この溶液にモニターウイルスとしてパルボウイルスを１０５．７コピー／ｍｌ添加した。
その後、この試料を１５％グリシン−１Ｍ塩化ナトリウム分画に供し、フィブリノゲンを遠心（４，０００ｒｐｍ、２０分間）により沈殿させて回収した。次いで回収されたフィブリノゲンを１．０Ｌのクエン酸緩衝液に溶解し、１．０％溶液を調製した。この溶液を濾過前のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。
得られた溶液をプラノバ７５Ｎ（平均孔径７２±４ｎｍ）を用いた温度２３℃、濾過圧１０ｋｐａ、デットエンド濾過法に供しウイルス除去を行なった。この濾液を濾過後のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。
実施例３
正常ヒト血漿由来のコーンのＦｒ．Ｉ画分１００ｇを１．５Ｌの生理食塩水で溶解し、トリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を０．３ｗ／ｖ％及びＴｗｅｅｎ８０を１ｗ／ｖ％になるように添加し、３０℃にて６時間の界面活性剤処理を行なった。
界面活性剤処理後の試料にモニターウイルスとしてパルボウイルスを添加した。
その後、この試料を１５％グリシン−１Ｍ塩化ナトリウムによる沈殿分画処理にて、フィブリノゲンを遠心（４，０００ｒｐｍ、２０分間）により沈殿させて回収した。次いで回収されたフィブリノゲンを１．０Ｌのクエン酸緩衝液に溶解し、１．０％溶液を調製した。この溶液を濾過前のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。また、同時にこの溶液を濾過前のサンプルとしてその蛋白質量を測定するため２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。
この溶液をプラノバ７５Ｎ（平均孔径７２±４ｎｍ）を用いた温度２３℃、濾過圧１０ｋｐａ、デットエンド濾過法に供しウイルス除去を行なった。この濾液を濾過後のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。また、同時にこの濾液の蛋白質量を２８０ｎｍにおける吸光度として測定した。
次に、この濾液を更にプラノバ３５Ｎ（平均孔径３５±２ｎｍ）を用いた温度２３℃、濾過圧１０ｋｐａ、デットエンド濾過法に供しウイルス除去を行なった。この濾液を濾過後のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。また、同時にこの濾液の蛋白質量を２８０ｎｍにおける吸光度として測定した。
この場合、プラノバ７５Ｎとプラノバ３５Ｎを組み合わせた濾過によりその前後で１０６コピー／ｍｌ以上のウイルス除去効果を示した。
実施例４
正常ヒト血漿由来のコーンのＦｒ．Ｉ画分１００ｇを１．５Ｌの生理食塩水で溶解し、トリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を０．３ｗ／ｖ％及びＴｗｅｅｎ８０を１ｗ／ｖ％になるように添加し、３０℃にて６時間の界面活性剤処理を行なった。
界面活性剤処理後の試料にモニターウイルスとしてパルボウイルスを１０１０．１コピー／ｍｌ添加した。
その後、この試料を８％グリシン−１Ｍ塩化ナトリウムによる沈殿分画処理にて、フィブリノゲンを遠心（４，０００ｒｐｍ、２０分間）により沈殿させて回収した。次いで回収されたフィブリノゲンを１．５Ｌの注射用水で溶解し、フィブリノゲン溶液を調製した。この溶液中の不溶物を遠心処理にて除去した後、０．９ｇ／Ｌの塩化ナトリウムを添加して濾過前のサンプルとした。
この溶液をプラノバ３５Ｎ（平均孔径３５±２ｎｍ）を用いた温度２３℃、濾過圧１０ｋｐａ、デットエンド濾過法に供した。この濾液を濾過後のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。
この場合、グリシン−塩化ナトリウム分画、沈殿の水抽出、遠心除去およびプラノバ３５Ｎを組み合わせた処理によりその前後で１０６コピー／ｍｌ以上のウイルス除去効果を示した。
実施例５
正常ヒト血漿由来のコーンのＦｒ．Ｉ画分１００ｇを１．５Ｌの生理食塩水で溶解し、トリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を０．３ｗ／ｖ％及びＴｗｅｅｎ８０を１ｗ／ｖ％になるように添加し、３０℃にて６時間の界面活性剤処理を行なった。
界面活性剤処理後の試料にモニターウイルスとしてＥＭＣを１０８．４ＴＣＩＤ５０／ｍｌ添加した。
その後、この試料を８％グリシン−１Ｍ塩化ナトリウムによる沈殿分画処理にて、フィブリノゲンを遠心（４，０００ｒｐｍ、２０分間）により沈殿させて回収した。次いで回収されたフィブリノゲンを１．５Ｌの注射用水で溶解し、フィブリノゲン溶液を調製した。この溶液中の不溶物を遠心処理にて除去した後、０．９ｇ／Ｌの塩化ナトリウムを添加して濾過前のサンプルとした。
この溶液をプラノバ３５Ｎ（平均孔径３５±２ｎｍ）を用いた温度２３℃、濾過圧１０ｋｐａ、デットエンド濾過法に供した。この濾液を濾過後のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。
この場合、グリシン−塩化ナトリウムによる沈殿分画処理、沈殿の水抽出、遠心除去およびプラノバ３５Ｎを組み合わせた処理によりその前後で１０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上のウイルス除去効果を示した。
参考例１
正常ヒト血漿由来のコーンのＦｒ．Ｉ画分１００ｇを１．５Ｌの生理食塩水で溶解し、ＴＮＢＰを０．３ｗ／ｖ％及びＴｗｅｅｎ８０を１ｗ／ｖ％になるように添加し、３０℃にて６時間の界面活性剤処理を行なった。
その後、この試料を１５％グリシン−１Ｍ塩化ナトリウムによる沈殿分画処理にて、フィブリノゲンを沈殿させて回収した。次いで回収されたフィブリノゲンを１．０Ｌのクエン酸緩衝液に溶解し、１．０％溶液を調製した。
この溶液にモニターウイルスとしてパルボウイルスを１０１０．７コピー／ｍｌ添加した。
また、この溶液を濾過前のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。
この溶液をプラノバ７５Ｎ（平均孔径７２±４ｎｍ）を用いた温度２３℃、濾過圧１０ｋｐａ、デットエンド濾過法に供しウイルス除去を行なった。この濾液を濾過後のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。
参考例２
参考例１の方法中、モニターウイルスとしてパルボウイルスを１０１１．７コピー／ｍｌ添加し、その後この溶液をプラノバ３５Ｎ（平均孔径３５±２ｎｍ）を用いた温度２３℃、濾過圧１０ｋｐａ、デットエンド濾過法に供した以外、参考例１と同様に処理を行ない各試料のウイルス量を測定した。
参考例３
正常ヒト血漿由来のコーンのＦｒ．Ｉ画分１００ｇを１．５Ｌの生理食塩水で溶解し、トリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を０．３ｗ／ｖ％及びＴｗｅｅｎ８０を１ｗ／ｖ％になるように添加し、３０℃にて６時間の界面活性剤処理を行なった。
その後、この試料を１５％グリシン−１Ｍ塩化ナトリウムによる沈殿分画処理にて、フィブリノゲンを沈殿させて回収した。次いで回収されたフィブリノゲンを１．０Ｌのクエン酸緩衝液に溶解し、１．０％溶液を調製した。
この溶液にモニターウイルスとしてパルボウイルスを１０５．７コピー／ｍｌ添加した。
この溶液をプラノバ７５Ｎ（平均孔径７２±４ｎｍ）を用いた温度２３℃、濾過圧１０ｋｐａ、デットエンド濾過法に供しウイルス除去を行なった。この濾液を濾過後のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。
次に、この濾液を更にプラノバ３５Ｎ（平均孔径３５±２ｎｍ）を用いた温度２３℃、濾過圧１０ｋｐａ、デットエンド濾過法に供しウイルス除去を行なった。この濾液を濾過後のサンプルとしてそのウイルス量を測定した。
ウイルス量の測定方法：
（１）パルボウイルスのウイルス量の測定は各試料についてウイルス核酸の残存量をポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）測定法（Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｖｏｌ．３２，ｐ．８２４−８２８（１９９２））によって測定した。パルボウイルスの核酸量は１０２コピー／ｍｌで検出限界以下となる。
（２）ＥＭＣウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ：脳心筋炎ウイルス）はＶｅｒｏ細胞を使用した感染価（ＴＣＩＤ５０）を測定することにより評価した。
ＥＭＣウイルスのＶｅｒｏ細胞に対する感染価は、１０１．５ＴＣＩＤ５０／ｍｌで検出限界以下となる。
上記の実施例１〜２、４〜５および参考例１〜３の結果を表１に示す。
蛋白質量の測定方法
各試料を生理食塩液で適当に希釈し、２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。上記の実施例３の結果を表２に示す。
本発明により血漿蛋白組成物を多孔性膜処理することによって、蛋白の活性を殆ど失うことなく、効率よく血漿蛋白中の夾雑ウイルスを除去することができる。従って、本発明によってウイルス感染性の危惧のない血漿蛋白を提供することができる。特に、本発明の多孔性膜処理により非エンベロープウイルス、とりわけパルボウイルスおよび／またはＡ型肝炎ウイルスを実質的に含まないフィブリノゲン組成物を提供することができる。
本出願は、日本で出願された平成１１年特許願第３６０９５０号を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (13)
- 多孔性膜処理前に血漿蛋白組成物をグリシン沈殿法分画処理に付す工程、次いでグリシン沈殿法分画処理された血漿蛋白組成物を非エンベロープウイルス単粒子径より孔径の大きな、かつ平均孔径１００ｎｍ以下の多孔性膜処理に付す工程を有することを特徴とする非エンベロープウイルスの除去された血漿蛋白組成物の製造法であって、血漿蛋白組成物がフィブロネクチン、フィブリノゲン、凝固Ｖ因子、凝固ＶＩＩＩ因子、フォンビルブランド因子、凝固ＸＩＩＩ因子、レチノール結合蛋白質、αグロブリン、βグロブリンおよびγグロブリンから選ばれる少なくとも一種の蛋白質を含有するものである、製造法。
- 多孔性膜が多孔性中空糸膜である請求項１記載の製造法。
- 多孔性膜処理に付す前に、血漿蛋白組成物をグリシン沈殿法分画処理に付し、得られた沈殿を適当な溶媒で抽出および／または溶解する工程を有することを特徴とする請求項１または２に記載の製造法。
- グリシン沈殿法分画処理がグリシン−塩化ナトリウム沈殿分画処理である請求項１〜３のいずれかに記載の製造法。
- 血漿蛋白組成物が少なくともフィブリノゲンを含有するものである請求項１〜４のいずれかに記載の製造法。
- 非エンベロープウイルスがパルボウイルスおよび／またはＡ型肝炎ウイルスである請求項１〜５のいずれかに記載の製造法。
- 多孔性膜処理前に血漿蛋白組成物をグリシン沈殿法分画処理に付すこと、次いでグリシン沈殿法分画処理された血漿蛋白組成物を非エンベロープウイルス単粒子径より孔径の大きな、かつ平均孔径１００ｎｍ以下の多孔性膜処理に付すことを特徴とする血漿蛋白組成物中の非エンベロープウイルスの除去方法。
- 多孔性膜が多孔性中空糸膜である請求項７記載の方法。
- 多孔性膜処理に付す前に、血漿蛋白組成物をグリシン沈殿法にて分画処理し、得られた沈殿を適当な溶媒で抽出および／または溶解する工程を有することを特徴とする請求項７または８に記載の方法。
- グリシン沈殿法分画処理がグリシン−塩化ナトリウム沈殿分画処理である請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
- 血漿蛋白組成物がフィブロネクチン、フィブリノゲン、凝固Ｖ因子、凝固ＶＩＩＩ因子、フォンビルブランド因子、凝固ＸＩＩＩ因子、レチノール結合蛋白質、αグロブリン、βグロブリンおよびγグロブリンから選ばれる少なくとも一種の蛋白質を含有するものである、請求項７〜１０のいずれかに記載の方法。
- 血漿蛋白組成物が少なくともフィブリノゲンを含有するものである請求項７〜１１のいずれかに記載の方法。
- 非エンベロープウイルスがパルボウイルスおよび／またはＡ型肝炎ウイルスである請求項７〜１２のいずれかに記載の方法。
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