JP4222871B2 - ノンエンベロープウイルス凝集条件下での濾過によるノンエンベロープウイルスの除去方法 - Google Patents
ノンエンベロープウイルス凝集条件下での濾過によるノンエンベロープウイルスの除去方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、濾過によるウイルスの除去方法に関するものであり、特に、タンパク質とウイルスとが共存する条件下、例えば、精製分離する前の血漿のようにウイルスが混入しているおそれのある溶液から、そのウイルスを除去するのに好適な濾過によるウイルスの除去方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、人免疫グロブリンや血液凝固第VIII因子のように、タンパク質を分離精製して得られる血漿分画製剤は各種の治療に有効である一方、ウイルスが混入する可能性があることが知られている。そこで、この血漿分画製剤中のウイルスの不活化方法や除去するための様々な技術が提案されており、より効果的な技術が実施されている。
【０００３】
例えば、ウイルスを不活化するには、加熱処理や有機溶媒／界面活性剤による処理によってウイルスを死滅させる方法がある。これらの方法は、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）やＨＣＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ）等のエンベロープウイルスに対して特に有効な不活化処理として知られている。しかし、ヒトパルボウイルスＢ１９やＨＡＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ）等のノンエンベロープウイルスは、上記処理に対して抵抗性を有しており、エンベロープウイルスに対するほどの効果が期待できない。
【０００４】
一方、ウイルスを除去する方法として、濾過膜を用いて濾過することによりウイルスのみを分離する濾過処理方法が知られている。この方法は、ウイルスより小さい孔径を有する濾過膜によってウイルスを分離して除去するものである。従って、タンパク質を変性させることなくウイルスを物理的に除去できるため、血漿分画製剤製造工程では、有効なウイルス除去方法として使用されている。
【０００５】
しかしながら、前記濾過処理方法においては、人免疫グロブリンや血液凝固第VIII因子のように分子量の大きいタンパク質を対象とする場合、そのサイズは小型のウイルスとさほど変わらないため、濾過膜による分離が困難となる。すなわち、大きめの孔径を有する濾過膜で濾過すると、タンパク質と小型のウイルスの双方を透過させてしまうし、小さめの孔径を有する濾過膜で濾過すると、双方とも阻止してしまうので分離が難しい。
【０００６】
このような濾過処理における問題を解決するために、従来より、精製対象とするタンパク質とウイルスとのサイズに差を生じさせるための技術が各種提案されている。例えば、特開２００１−３３５５０９号公報には、タンパク質の一種であるフィブリノーゲンを含有する溶液から、濾過膜を用いてウイルスを除去する方法が記載されている（特許文献１）。この方法によれば、フィブリノーゲンを含有する溶液に塩基性アミノ酸またはその塩類、および塩化ナトリウムを含有させるようになっている。これにより、フィブリノーゲンの溶解度を高めることで溶液中のフィブリノーゲンのサイズを小さくして、ウイルスを濾過膜で除去するとされる。
【０００７】
また、特開平１１−３３３２５９号公報には、血液製剤等の医薬品や食品中に含まれるＤＮＡやＲＮＡを除去する方法が記載されている（特許文献２）。この方法は、原液に塩を０．１５ｍｏｌ／Ｌ以上加えることによりＤＮＡやＲＮＡをミクロの凝集体にして、多孔膜を用いて除去するとされる。
【０００８】
【特許文献１】
特開２００１−３３５５０９号公報
【特許文献２】
特開平１１−３３３２５９号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特開２００１−３３５５０９号公報に記載された発明においては、フィブリノーゲンの溶解度が高くなる条件を開示しているに過ぎず、他の血漿分画製剤に応用することができない。また、この方法では、濾過膜の孔径より小さいウイルスは、捕捉されずに混入してしまうという問題がある。
【００１０】
また、特開平１１−３３３２５９号公報に記載されている発明においては、医薬品や食品からＤＮＡやＲＮＡなどを完全に除去することは不可能であるという前提で、その除去効率を上げるための条件を規定しているに過ぎない。すなわち、除去対象が細胞やウイルスの構成成分であるＤＮＡやＲＮＡであり、感染性を持つウイルスを対象としていない。また、主要な塩として塩化ナトリウムを想定しているが、特許文献１と同様に塩化ナトリウムではウイルスが凝集しないという問題がある。
【００１１】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、タンパク質およびウイルスが共存する溶液において、目的タンパク質の性質および収率に影響を与えることなく、ウイルスだけを凝集させて、濾過膜によって除去することができるウイルス凝集条件下での濾過によるウイルスの除去方法を提供することを目的としている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明に係るウイルス凝集条件下での濾過によるウイルスの除去方法の特徴は、タンパク質およびウイルスが共存する溶液から濾過により前記ウイルスを除去する方法であって、前記溶液のｐＨを４〜８に調整するとともに、前記溶液に対してアミノ酸を加えることにより前記溶液中のウイルスを凝集させ、濾過膜で濾過することで前記ウイルスを除去するようにした点にある。
【００１３】
また、本発明において、前記アミノ酸は、少なくともグリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびプロリンのいずれかであることが好ましい。これにより、グリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびプロリンは効果的にウイルスを凝集させて所定の濾過膜を通過させない。
【００１４】
また、本発明において、前記溶液に加えるグリシンのモル濃度を０．１ｍｏｌ／Ｌ〜２．０ｍｏｌ／Ｌにすることが好ましい。これにより、添加するグリシンを適量に決定し、ウイルスを凝集除去する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係る濾過によるウイルスの除去方法の実施形態の一例を図面を用いて説明する。
【００１６】
本実施形態における濾過によるウイルスの除去方法は、タンパク質およびウイルスが共存する溶液に対し、この溶液のｐＨを４〜８の範囲に調整し、アミノ酸を加えることにより、前記ウイルスだけを凝集させ、濾過膜によって濾過することで前記ウイルスを極めて高い効率で除去する方法である。
【００１７】
ここで、タンパク質を分離精製する処理には、クロマトグラフィー分画法や塩の濃度差による溶解度の変化を利用した塩析法等、多くの方法が知られているが、本実施形態では、血漿分画方法として広く使用されているコーン分画法を採用している。そして、このコーン分画法による処理後のタンパク質製剤を製造する工程の中に、濾過膜を使用したウイルス除去工程を導入している。なお、本実施形態では、加えるアミノ酸としてグリシンを使用し、タンパク質として人免疫グロブリンを分離精製するようになっている。
【００１８】
本実施形態の人免疫グロブリン製剤の製造工程では、コーン分画法により原料血漿から人免疫グロブリンを分離精製する分離精製処理と、この分離精製処理によって分離精製した人免疫グロブリンから濾過膜によってウイルスを除去する濾過処理とが順次行われる。
【００１９】
まず、分離精製処理では、原料血漿のｐＨ（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ：水素イオン濃度指数）、イオン濃度、アルコール濃度、反応温度およびタンパク濃度を適切に組み合わせることによって、原料血漿中に含まれているタンパク質の溶解度をコントロールし、特定のタンパクを沈殿させる。そして、沈殿させたタンパクと上澄みを高速遠心分離器で分離した後、必要な沈殿物または上澄みを採取する。そして、その得られた沈殿物または上澄みに対し、前記条件とは異なる条件を適宜設定することで別のタンパクを沈殿させる。以上の工程を繰り返して原料血漿から不純物を順次除去していくことで、目的タンパクである人免疫グロブリンが高純度で得られる。
【００２０】
つぎに、濾過処理では、図１に示すように、分離精製処理において得られたタンパク質である人免疫グロブリン溶液のｐＨを４〜８に合わせた後（Ｓ１）、アミノ酸であるグリシンを添加することでウイルスを凝集させる（Ｓ２）。そして、人免疫グロブリン分子を透過させ得る径を有する濾過膜を用いてデッドエンド方式で濾過を行う（Ｓ３）。濾過膜の孔径は、人免疫グロブリン分子が通過できれば、できるだけ小さい方がより多種のウイルスを除去できるため、本実施形態では、平均孔径が約３５ｎｍの濾過膜を使用した。
【００２１】
つぎに、前述した本実施形態における濾過処理方法の効果を確認するために、以下のような実験を行ってウイルスの捕捉能力を示すＬＲＶ（Ｌｏｇ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｖａｌｕｅ：対数減少率）を求めた。
【００２２】
【実施例１】
「アミノ酸によるウイルスの凝集効果の実験」
本実施例１では、アミノ酸によるウイルスの凝集効果を確認するとともに、ウイルスの凝集に効果的なアミノ酸を検討するため、各種アミノ酸および非アミノ酸溶液中においてウイルスのＬＲＶを求める実験を行った。
【００２３】
また、アミノ酸としては、グリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびプロリンを試料として選択した。これらを試料として選択したのは、いずれも水への溶解度が高くて実用的だからである。そして、アミノ酸によるウイルスの凝集効果を比較するために、非アミノ酸である酢酸アンモニウムおよびリン酸バッファ塩を比較試料とした。
【００２４】
さらに、ウイルスは、ヒトパルボウイルスＢ１９を使用した。ヒトパルボウイルスＢ１９の大きさは約１８〜２４ｎｍであり極めて小さい。このヒトパルボウイルスＢ１９の溶液は、ヒトパルボウイルスＢ１９陽性血漿を使用し、抗体による影響を回避するため、抗ヒトパルボウイルスＢ１９ＩｇＧ陰性の血漿を選択している。また、このヒトパルボウイルスＢ１９溶液中のウイルス含量は１０１２ＰＣＲｕｎｉｔ／ｍＬである。
【００２５】
まず、ｐＨ６．０に調整した０．３ｍｏｌ／Ｌの上記各種アミノ酸溶液および非アミノ酸溶液を５０ｍＬ計量後、ヒトパルボウイルスＢ１９溶液を１／１００量だけ添加した後、室温で２時間インキュベートしたものをサンプル溶液とした。
【００２６】
なお、前記サンプル溶液を濾過させるための濾過膜は、Ｐｌａｎｏｖａ３５Ｎ（旭化成株式会社製）を使用した。このＰｌａｎｏｖａ３５Ｎは平均孔径が約３５ｎｍでセルロース製の濾過膜である。
【００２７】
以上のような各種サンプル溶液および濾過膜を準備した後に、各種サンプル溶液に対して濾過処理を行った。この処理では、各種のサンプル溶液を濾過膜によりデッドエンド方式で濾過させた。濾過処理における圧力は０．８ｋｇｆ／ｃｍ２に保持し、室温で行った。この濾過処理の結果を図２に示す。
【００２８】
図２は、各サンプル溶液を濾過処理した後のヒトパルボウイルスＢ１９のＬＲＶを求めた結果である。ヒトパルボウイルスＢ１９の大きさは約１８〜２４ｎｍであるから、本来であれば、直径３５ｎｍの濾過膜を通過してしまう。図２に示すように、非アミノ酸である酢酸アンモニウムやリン酸バッファ塩溶液では、ＬＲＶは１以下を示しており、ヒトパルボウイルスＢ１９の除去効果は低かった。これに対し、各アミノ酸溶液のＬＲＶは高く、最も低いセリンでもＬＲＶが約４．５を示し、プロリンではＬＲＶが５．５、スレオニンのＬＲＶは約７．０、グリシンおよびアラニンでは、ＬＲＶが約７．５を示し、極めて高いウイルス除去効果が確認できた。
【００２９】
一般に、ＬＲＶは１．０未満は除去効果が低いとされ実用性が認められないが、４．０以上であれば極めて除去効果が高いと認められている。したがって、本実施例１で使用したいずれのアミノ酸もウイルス除去効果が極めて高い。特に、グリシンおよびアラニンは、ＬＲＶが約７．５と特に高い除去率を示しており、ウイルスの凝集に効果的なアミノ酸であることがわかる。
【００３０】
なお、ヒトパルボウイルスＢ１９ＤＮＡの検出に際しては、ＳＭＩｔｅｓｔ ＥＸ Ｒ＆Ｄ（株式会社ゲノムサイエンス研究所）を用いて抽出し、さらにパルボウイルスＢ１９遺伝子定性キット（株式会社ゲノムサイエンス研究所）を用いて増幅を行って検出した。
【００３１】
【実施例２】
「アミノ酸濃度がウイルスの凝集に及ぼす影響を確認する実験」
本実施例２では、アミノ酸の濃度がウイルスの凝集効果に与える影響を調査するため、アミノ酸の濃度を変化させてウイルスのＬＲＶを測定する実験を行った。本実施例２の試料に用いるアミノ酸は、実施例１においてウイルスの除去効果が高かったグリシンを選択した。その他のウイルスや濾過膜は、実施例１と同様のものを使用した。
【００３２】
まず、グリシンのモル濃度をそれぞれ０．０ｍｏｌ／Ｌ、０．０３ｍｏｌ／Ｌ、０．１ｍｏｌ／Ｌ、０．３ｍｏｌ／Ｌ、１．０ｍｏｌ／Ｌ、および２．０ｍｏｌ／Ｌに調整したグリシン溶液（ｐＨ６．０）を５０ｍＬずつ準備し、ヒトパルボウイルスＢ１９溶液を１／１００量だけ添加した後、室温で２時間インキュベートしたものをサンプル溶液とした。
【００３３】
つぎに、上記各濃度のサンプル溶液に対し、Ｐｌａｎｏｖａ３５Ｎを用いてデッドエンド方式により濾過処理を行った。このときの圧力は０．８ｋｇｆ／ｃｍ２に保持し、室温で行った。この処理後のサンプル溶液について、実施例１と同様の検出法によりヒトパルボウイルスＢ１９のＬＲＶを測定した。この結果を図３に示す。
【００３４】
図３に示すように、グリシンが低濃度の領域では、グリシン濃度が高くなるに従ってＬＲＶは高くなり、ウイルスの除去効果が向上している。グリシン濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌのときに、ＬＲＶが６．０を超えて、グリシン濃度が０．３ｍｏｌ／Ｌのときに、ＬＲＶが約７．５と最大値を示した。０．３ｍｏｌ／Ｌよりも高い濃度の領域では、グリシン濃度が１．０ｍｏｌ／Ｌの場合、ＬＲＶは約６．０となり、グリシン濃度が２．０ｍｏｌ／Ｌの場合、ＬＲＶは約５．５になった。実施例２の結果によれば、グリシンの濃度はウイルスのＬＲＶに影響を与えると考えられ、少なくともグリシン濃度が０．１〜２．０ｍｏｌ／Ｌの範囲では、ＬＲＶが５．５以上を示し、グリシン濃度が０．３ｍｏｌ／Ｌの場合に７．５以上を示して高い凝集効果が認められる。
【００３５】
【実施例３】
「溶液のｐＨがウイルスの凝集に及ぼす影響を確認する実験」
本実施例３では、サンプル溶液のｐＨがウイルスの凝集効果に与える影響を調査するため、サンプル溶液のｐＨを変化させてウイルスのＬＲＶを測定する実験を行った。本実施例３で用いるアミノ酸溶液は、実施例１でウイルスの除去効果が高かったグリシンを選択し、その濃度は０．３ｍｏｌ／Ｌに設定した。そして、ｐＨを３．０、４．０、６．０、７．０、８．０および９．０に調整したサンプル溶液をそれぞれ用意した。その他、サンプル溶液の作成方法および濾過膜による濾過処理方法は、実施例１と同様の条件で行った。図４に実施例３の結果を示す。
【００３６】
図４は、サンプル溶液のｐＨ値に対するヒトパルボウイルスＢ１９のＬＲＶを示すグラフである。図４に示すように、サンプル溶液のｐＨが６．０のときにＬＲＶは最大値約７．５を示し、それより酸性側の領域およびアルカリ側の領域ではＬＲＶは減少する傾向を示した。つまり、サンプル溶液がｐＨ４．０ではＬＲＶが約２．５となり、ｐＨ３．０ではＬＲＶが約１．０にまで減少した。また、アルカリ側の領域でもアルカリ性が強くなるほどＬＲＶが減少し、ｐＨ７．０ではＬＲＶが約６．０であり、ｐＨ８．０ではＬＲＶが約４．５を保持してウイルスの除去効果が認められた。ｐＨ９．０ではＬＲＶが１．０以下となりウイルスの除去効果はほとんど認められなかった。本実施例３の結果により、ウイルスの凝集除去の効果は、グリシン溶液のｐＨに依存することがわかる。本実施例３の場合、ｐＨが４〜８が好ましく、ｐＨ６．０近傍がより好ましい。
【００３７】
ここで、サンプル溶液のｐＨが６．０近傍の場合に、ヒトパルボウイルスＢ１９の除去効果が特に高い理由について検討する。ヒトパルボウイルスＢ１９は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＮＳといったタンパクによりカプシドが形成されている。これらタンパクの推定される等電点は、ＶＰ１が６．０９であり、ＶＰ２が６．４０であり、ＮＳが５．７５であり、６．０近傍に集中している。これらのことからヒトパルボウイルスＢ１９の凝集は、等電点沈殿効果によるものと考えられる。すなわち、ヒトパルボウイルスＢ１９の等電点にサンプル溶液のｐＨを合わせると、ウイルス全体の電荷が中和されて凝集しやすくなり、この条件下でグリシン等のアミノ酸を添加することにより、ヒトパルボウイルスＢ１９の凝集が促進されると考えられる。
【００３８】
【実施例４】
「濾過膜の孔径がウイルス除去効果に及ぼす影響を確認する実験」
本実施例４では、濾過膜の材質、平均孔径および吸着性の違いがウイルスの除去効果へ与える影響を調査するための実験を行った。本実施例４で用いる濾過膜は、平均孔径３５ｎｍのＰｌａｎｏｖａ３５Ｎ（旭化成株式会社製）、平均孔径５０ｎｍのｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ＮＦＲ（日本ミリポア株式会社）、平均孔径７５ｎｍのＰｌａｎｏｖａ７５Ｎ（旭化成株式会社製）および平均孔径２２０ｎｍのＭｉｌｌｅｘ−ＧＳ（日本ミリポア株式会社）をそれぞれ用意した。また、Ｐｌａｎｏｖａ３５ＮおよびＰｌａｎｏｖａ７５Ｎはセルロース製であり、ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ＮＦＲおよびＭｉｌｌｅｘ−ＧＳはＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ：ポリビニリデンフルオライド）製である。その他、サンプル溶液の作成方法および濾過膜による濾過処理方法は、実施例１と同様の条件で行った。図５に本実施例４の結果を示す。
【００３９】
図５は、濾過膜の孔径に対するヒトパルボウイルスＢ１９のＬＲＶを示している。図５に示すように、濾過膜の孔径が大きくなるに従ってＬＲＶは減少する傾向を示した。ただ、直線的に減少するのではなく、指数関数的に減少した。具体的には、ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ＮＦＲは、平均孔径が５０ｎｍであり、ヒトパルボウイルスＢ１９のサイズの２倍以上大きな孔径を有しているが、ＬＲＶが約６．５と極めて高い除去率を示した。さらに、平均孔径がヒトパルボウイルスＢ１９のサイズの４倍近い大きさである７５ｎｍのＰｌａｎｏｖａ７５Ｎであっても、ＬＲＶが約４．０と高い除去率が得られ、平均孔径がヒトパルボウイルスＢ１９のサイズの１０倍ほども大きいＭｉｌｌｅｘ−ＧＳ（２２０ｎｍ）であっても、ＬＲＶは１程度を示した。ウイルスの除去率は凝集体のサイズと濾過膜の平均孔径に依存することが報告されているが、本実施例４によるウイルス凝集体の大きさを推定すると、Ｐｌａｎｏｖａ３５ＮおよびＰｌａｎｏｖａ７５Ｎのデータより、ウイルス凝集体の大きさはそれぞれ平均６４ｎｍ、７７ｎｍと考えられる。ウイルスの除去率と濾過膜の平均孔径が直線的な比例関係にないのは、それらの凝集体のサイズ分布が広いためと考えられる。このように濾過膜の孔径は小さいほど除去効果があるのはもとより、ヒトパルボウイルスＢ１９が相当に大きな凝集体を形成していることが確認できた。
【００４０】
また、ヒトパルボウイルスＢ１９の濾過膜への吸着性を調べるため、Ｐｌａｎｏｖａ３５Ｎを用いて吸着実験を行った。この吸着実験は、ヒトパルボウイルスＢ１９溶液内にＰｌａｎｏｖａ３５Ｎを入れて撹拌した後にＰｌａｎｏｖａ３５Ｎを取り除き、その撹拌前後におけるヒトパルボウイルスＢ１９の量を測定した。その結果、吸着処理前と吸着処理後とを比較すると、ヒトパルボウイルスＢ１９のＬＲＶが０．５しか変化しておらず、濾過膜に吸着された状況は認められなかった。これによりウイルスが濾過膜に吸着されて除去されているのではないことが認められた。
【００４１】
【実施例５】
「タンパク質が存在する場合のウイルスの凝集効果の確認実験」
本実施例５では、実際にタンパク質が存在する場合におけるウイルスの凝集効果を確認する実験を行った。本実施例５で用いるタンパク質は、人免疫グロブリンおよびアルブミンを使用し、これらを０．３ｍｏｌ／Ｌのグリシン溶液に溶解させて、５％グロブリン溶液および５％アルブミン溶液を作成した。そして、これらの溶液を５０ｍＬずつ準備し、ヒトパルボウイルスＢ１９溶液を１／１００量だけ添加した後、室温で２時間インキュベートしたものをサンプル溶液とした。前記各実施例と同様に、これらのサンプル溶液をＰｌａｎｏｖａ３５Ｎを用いてデッドエンド方式で濾過処理を行った。この実験によるウイルスのＬＲＶの結果を図６に示す。なお、比較のため、タンパク質を含まない０．３ｍｏｌ／Ｌ濃度のグリシン溶液のＬＲＶも示す。
【００４２】
図６に示すように、タンパク質を含まないグリシン溶液（コントロール）のＬＲＶは約７．５であるが、５％グロブリンが存在すると、ＬＲＶは約５．０になり、５％アルブミン存在下では、ＬＲＶは約２．０になる。これにより、血漿タンパクであるグロブリン、アルブミンに関しては共存させるタンパク質濃度をできるだけ低濃度にする方が高いウイルスの除去効果を期待できる。ところで本実施例５で使用したタンパク質濃度は５％であり、かなり高い濃度にしている。従って、実際の処理においては、さらにタンパク質濃度が低くなると考えられ、除去効果が向上すると予想される。
【００４３】
なお、本実施例５では、人免疫グロブリンおよびアルブミンの添加により溶液のタンパク質濃度が高くなっている。このため、ヒトパルボウイルスＢ１９ＤＮＡの検出には、タンパク質分解酵素であるｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ＫとＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ：ドデシル硫酸ナトリウム）によりタンパク質を分解し、ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍで抽出したＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ：デオキシリボ核酸）をＮＳ（ＮｏｎＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：非構造タンパク）領域に対するｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法で分析した。
【００４４】
【実施例６】
「他のウイルスに対する凝集効果の確認実験」
本実施例６では、ヒトパルボウイルスＢ１９以外のウイルスに対するアミノ酸の凝集効果を確認する実験を行った。他のウイルス溶液としては、ＥＭＣ（ＥｎｃｅｐｈａｌｏＭｙｏＣａｒｄｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）溶液およびＰＰＶ（ＰｏｒｃｉｎｅＰａｒｖｏ Ｖｉｒｕｓ）溶液を用意し、さらにこれらにヒト血漿を含有した溶液を用意した。なお、ＥＭＣおよびＰＰＶは、培養液を凍結融解により細胞を破壊してウイルス溶液とした。各ウイルス溶液中のウイルス含量は、それぞれ１０８．３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、１０８．４ＴＣＩＤ５０／ｍＬである。
【００４５】
本実施例６では、０．３ｍｏｌ／Ｌのグリシン溶液（ｐＨ６．０）を５０ｍＬずつ準備し、上記４種類のウイルス溶液をそれぞれ１／１００量だけ添加した後、室温で２時間インキュベートしたものをサンプル溶液とした。そして、これらのサンプル溶液をＰｌａｎｏｖａ３５Ｎによりデッドエンド方式で濾過処理を行った。この処理後のＥＭＣおよびＰＰＶのＬＲＶを図７に示す。
【００４６】
図７に示すように、ＥＭＣのＬＲＶは３．２以上、ＰＰＶのＬＲＶは４．０以上であり、ヒト血漿を含む場合もＥＭＣではＬＲＶが３．７以上、ＰＰＶのＬＲＶは３．１以上となり、いずれのウイルスも検出限界以下まで減少した。ＥＭＣのサイズは、２８〜３０ｎｍであり、ＰＰＶのサイズは１８〜２５ｎｍであり、いずれも濾過膜の平均孔径３５ｎｍより小さいが、確実に除去されていることが認められる。従って、ヒトパルボウイルスＢ１９以外のウイルスに関しても本実施形態における濾過処理により凝集除去できることが認められる。
【００４７】
なお、ＥＭＣおよびＰＰＶの検出に際しては、９６穴プレートにて培養した４×１０５ｃｅｌｌ／０．０５ｍＬのＶｅｒｏ Ｃ１００８細胞およびＣＰＫ細胞に、ＭＥＭ培地で５倍段階希釈した検体を０．１ｍＬ接種し、６〜１０日後に顕微鏡下でＣＰＥの確認を行い、Ｋａｒｂｅｒ法により５０％ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｏｓｅ（ＴＣＩＤ５０）を算出した。
【００４８】
以上より、本実施形態によれば、人免疫グロブリンとウイルスとが共存する溶液において、人免疫グロブリンに影響を与えることなく、ウイルスだけを凝集させて、濾過膜によって除去することができる。
【００４９】
また、前記溶液に加えるアミノ酸として、グリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびプロリンのいずれかを選択することにより、実用的であって、かつ、効果的にウイルスを凝集させて除去することができる。
【００５０】
さらに、前記溶液に加えるグリシンのモル濃度を０．１ｍｏｌ／Ｌ〜２．０ｍｏｌ／Ｌにすることにより、ウイルスを凝集除去することができる。
【００５１】
また、本実施形態におけるウイルス除去方法は、中性付近のｐＨにおいてアミノ酸共存下でウイルスが凝集することを利用していることから、人免疫グロブリン製剤に限らず、他の血漿分画製剤にも適用可能である。
【００５２】
なお、本実施形態の各構成は前述したものに限るものではなく、適宜変更することができる。
【００５３】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、タンパク質およびウイルスが共存する溶液において、目的タンパク質の性質および収率に影響を与えることなく、ウイルスだけを凝集させて、濾過膜によって除去することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明に係る濾過によるウイルスの除去方法を示すフローチャート図である。
【図２】 本実施形態において、溶液に加えるアミノ酸の種類に対するヒトパルボウイルスＢ１９の対数減少率ＬＲＶの関係を示すグラフである。
【図３】 本実施形態において、グリシンのモル濃度に対するヒトパルボウイルスＢ１９の対数減少率ＬＲＶの関係を示すグラフである。
【図４】 本実施形態において、溶液のｐＨに対するヒトパルボウイルスＢ１９の対数減少率ＬＲＶの関係を示すグラフである。
【図５】 本実施形態において、濾過膜の平均孔径に対するヒトパルボウイルスＢ１９の対数減少率ＬＲＶの関係を示すグラフである。
【図６】 本実施形態において、タンパク質存在下におけるヒトパルボウイルスＢ１９の対数減少率ＬＲＶを示すグラフである。
【図７】 本実施形態において、ウイルスがＥＭＣおよびＰＰＶの場合の濾過処理による対数減少率ＬＲＶを示す表である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、濾過によるウイルスの除去方法に関するものであり、特に、タンパク質とウイルスとが共存する条件下、例えば、精製分離する前の血漿のようにウイルスが混入しているおそれのある溶液から、そのウイルスを除去するのに好適な濾過によるウイルスの除去方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、人免疫グロブリンや血液凝固第VIII因子のように、タンパク質を分離精製して得られる血漿分画製剤は各種の治療に有効である一方、ウイルスが混入する可能性があることが知られている。そこで、この血漿分画製剤中のウイルスの不活化方法や除去するための様々な技術が提案されており、より効果的な技術が実施されている。
【０００３】
例えば、ウイルスを不活化するには、加熱処理や有機溶媒／界面活性剤による処理によってウイルスを死滅させる方法がある。これらの方法は、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）やＨＣＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ）等のエンベロープウイルスに対して特に有効な不活化処理として知られている。しかし、ヒトパルボウイルスＢ１９やＨＡＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ）等のノンエンベロープウイルスは、上記処理に対して抵抗性を有しており、エンベロープウイルスに対するほどの効果が期待できない。
【０００４】
一方、ウイルスを除去する方法として、濾過膜を用いて濾過することによりウイルスのみを分離する濾過処理方法が知られている。この方法は、ウイルスより小さい孔径を有する濾過膜によってウイルスを分離して除去するものである。従って、タンパク質を変性させることなくウイルスを物理的に除去できるため、血漿分画製剤製造工程では、有効なウイルス除去方法として使用されている。
【０００５】
しかしながら、前記濾過処理方法においては、人免疫グロブリンや血液凝固第VIII因子のように分子量の大きいタンパク質を対象とする場合、そのサイズは小型のウイルスとさほど変わらないため、濾過膜による分離が困難となる。すなわち、大きめの孔径を有する濾過膜で濾過すると、タンパク質と小型のウイルスの双方を透過させてしまうし、小さめの孔径を有する濾過膜で濾過すると、双方とも阻止してしまうので分離が難しい。
【０００６】
このような濾過処理における問題を解決するために、従来より、精製対象とするタンパク質とウイルスとのサイズに差を生じさせるための技術が各種提案されている。例えば、特開２００１−３３５５０９号公報には、タンパク質の一種であるフィブリノーゲンを含有する溶液から、濾過膜を用いてウイルスを除去する方法が記載されている（特許文献１）。この方法によれば、フィブリノーゲンを含有する溶液に塩基性アミノ酸またはその塩類、および塩化ナトリウムを含有させるようになっている。これにより、フィブリノーゲンの溶解度を高めることで溶液中のフィブリノーゲンのサイズを小さくして、ウイルスを濾過膜で除去するとされる。
【０００７】
また、特開平１１−３３３２５９号公報には、血液製剤等の医薬品や食品中に含まれるＤＮＡやＲＮＡを除去する方法が記載されている（特許文献２）。この方法は、原液に塩を０．１５ｍｏｌ／Ｌ以上加えることによりＤＮＡやＲＮＡをミクロの凝集体にして、多孔膜を用いて除去するとされる。
【０００８】
【特許文献１】
特開２００１−３３５５０９号公報
【特許文献２】
特開平１１−３３３２５９号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特開２００１−３３５５０９号公報に記載された発明においては、フィブリノーゲンの溶解度が高くなる条件を開示しているに過ぎず、他の血漿分画製剤に応用することができない。また、この方法では、濾過膜の孔径より小さいウイルスは、捕捉されずに混入してしまうという問題がある。
【００１０】
また、特開平１１−３３３２５９号公報に記載されている発明においては、医薬品や食品からＤＮＡやＲＮＡなどを完全に除去することは不可能であるという前提で、その除去効率を上げるための条件を規定しているに過ぎない。すなわち、除去対象が細胞やウイルスの構成成分であるＤＮＡやＲＮＡであり、感染性を持つウイルスを対象としていない。また、主要な塩として塩化ナトリウムを想定しているが、特許文献１と同様に塩化ナトリウムではウイルスが凝集しないという問題がある。
【００１１】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、タンパク質およびウイルスが共存する溶液において、目的タンパク質の性質および収率に影響を与えることなく、ウイルスだけを凝集させて、濾過膜によって除去することができるウイルス凝集条件下での濾過によるウイルスの除去方法を提供することを目的としている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明に係るウイルス凝集条件下での濾過によるウイルスの除去方法の特徴は、タンパク質およびウイルスが共存する溶液から濾過により前記ウイルスを除去する方法であって、前記溶液のｐＨを４〜８に調整するとともに、前記溶液に対してアミノ酸を加えることにより前記溶液中のウイルスを凝集させ、濾過膜で濾過することで前記ウイルスを除去するようにした点にある。
【００１３】
また、本発明において、前記アミノ酸は、少なくともグリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびプロリンのいずれかであることが好ましい。これにより、グリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびプロリンは効果的にウイルスを凝集させて所定の濾過膜を通過させない。
【００１４】
また、本発明において、前記溶液に加えるグリシンのモル濃度を０．１ｍｏｌ／Ｌ〜２．０ｍｏｌ／Ｌにすることが好ましい。これにより、添加するグリシンを適量に決定し、ウイルスを凝集除去する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係る濾過によるウイルスの除去方法の実施形態の一例を図面を用いて説明する。
【００１６】
本実施形態における濾過によるウイルスの除去方法は、タンパク質およびウイルスが共存する溶液に対し、この溶液のｐＨを４〜８の範囲に調整し、アミノ酸を加えることにより、前記ウイルスだけを凝集させ、濾過膜によって濾過することで前記ウイルスを極めて高い効率で除去する方法である。
【００１７】
ここで、タンパク質を分離精製する処理には、クロマトグラフィー分画法や塩の濃度差による溶解度の変化を利用した塩析法等、多くの方法が知られているが、本実施形態では、血漿分画方法として広く使用されているコーン分画法を採用している。そして、このコーン分画法による処理後のタンパク質製剤を製造する工程の中に、濾過膜を使用したウイルス除去工程を導入している。なお、本実施形態では、加えるアミノ酸としてグリシンを使用し、タンパク質として人免疫グロブリンを分離精製するようになっている。
【００１８】
本実施形態の人免疫グロブリン製剤の製造工程では、コーン分画法により原料血漿から人免疫グロブリンを分離精製する分離精製処理と、この分離精製処理によって分離精製した人免疫グロブリンから濾過膜によってウイルスを除去する濾過処理とが順次行われる。
【００１９】
まず、分離精製処理では、原料血漿のｐＨ（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ：水素イオン濃度指数）、イオン濃度、アルコール濃度、反応温度およびタンパク濃度を適切に組み合わせることによって、原料血漿中に含まれているタンパク質の溶解度をコントロールし、特定のタンパクを沈殿させる。そして、沈殿させたタンパクと上澄みを高速遠心分離器で分離した後、必要な沈殿物または上澄みを採取する。そして、その得られた沈殿物または上澄みに対し、前記条件とは異なる条件を適宜設定することで別のタンパクを沈殿させる。以上の工程を繰り返して原料血漿から不純物を順次除去していくことで、目的タンパクである人免疫グロブリンが高純度で得られる。
【００２０】
つぎに、濾過処理では、図１に示すように、分離精製処理において得られたタンパク質である人免疫グロブリン溶液のｐＨを４〜８に合わせた後（Ｓ１）、アミノ酸であるグリシンを添加することでウイルスを凝集させる（Ｓ２）。そして、人免疫グロブリン分子を透過させ得る径を有する濾過膜を用いてデッドエンド方式で濾過を行う（Ｓ３）。濾過膜の孔径は、人免疫グロブリン分子が通過できれば、できるだけ小さい方がより多種のウイルスを除去できるため、本実施形態では、平均孔径が約３５ｎｍの濾過膜を使用した。
【００２１】
つぎに、前述した本実施形態における濾過処理方法の効果を確認するために、以下のような実験を行ってウイルスの捕捉能力を示すＬＲＶ（Ｌｏｇ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｖａｌｕｅ：対数減少率）を求めた。
【００２２】
【実施例１】
「アミノ酸によるウイルスの凝集効果の実験」
本実施例１では、アミノ酸によるウイルスの凝集効果を確認するとともに、ウイルスの凝集に効果的なアミノ酸を検討するため、各種アミノ酸および非アミノ酸溶液中においてウイルスのＬＲＶを求める実験を行った。
【００２３】
また、アミノ酸としては、グリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびプロリンを試料として選択した。これらを試料として選択したのは、いずれも水への溶解度が高くて実用的だからである。そして、アミノ酸によるウイルスの凝集効果を比較するために、非アミノ酸である酢酸アンモニウムおよびリン酸バッファ塩を比較試料とした。
【００２４】
さらに、ウイルスは、ヒトパルボウイルスＢ１９を使用した。ヒトパルボウイルスＢ１９の大きさは約１８〜２４ｎｍであり極めて小さい。このヒトパルボウイルスＢ１９の溶液は、ヒトパルボウイルスＢ１９陽性血漿を使用し、抗体による影響を回避するため、抗ヒトパルボウイルスＢ１９ＩｇＧ陰性の血漿を選択している。また、このヒトパルボウイルスＢ１９溶液中のウイルス含量は１０１２ＰＣＲｕｎｉｔ／ｍＬである。
【００２５】
まず、ｐＨ６．０に調整した０．３ｍｏｌ／Ｌの上記各種アミノ酸溶液および非アミノ酸溶液を５０ｍＬ計量後、ヒトパルボウイルスＢ１９溶液を１／１００量だけ添加した後、室温で２時間インキュベートしたものをサンプル溶液とした。
【００２６】
なお、前記サンプル溶液を濾過させるための濾過膜は、Ｐｌａｎｏｖａ３５Ｎ（旭化成株式会社製）を使用した。このＰｌａｎｏｖａ３５Ｎは平均孔径が約３５ｎｍでセルロース製の濾過膜である。
【００２７】
以上のような各種サンプル溶液および濾過膜を準備した後に、各種サンプル溶液に対して濾過処理を行った。この処理では、各種のサンプル溶液を濾過膜によりデッドエンド方式で濾過させた。濾過処理における圧力は０．８ｋｇｆ／ｃｍ２に保持し、室温で行った。この濾過処理の結果を図２に示す。
【００２８】
図２は、各サンプル溶液を濾過処理した後のヒトパルボウイルスＢ１９のＬＲＶを求めた結果である。ヒトパルボウイルスＢ１９の大きさは約１８〜２４ｎｍであるから、本来であれば、直径３５ｎｍの濾過膜を通過してしまう。図２に示すように、非アミノ酸である酢酸アンモニウムやリン酸バッファ塩溶液では、ＬＲＶは１以下を示しており、ヒトパルボウイルスＢ１９の除去効果は低かった。これに対し、各アミノ酸溶液のＬＲＶは高く、最も低いセリンでもＬＲＶが約４．５を示し、プロリンではＬＲＶが５．５、スレオニンのＬＲＶは約７．０、グリシンおよびアラニンでは、ＬＲＶが約７．５を示し、極めて高いウイルス除去効果が確認できた。
【００２９】
一般に、ＬＲＶは１．０未満は除去効果が低いとされ実用性が認められないが、４．０以上であれば極めて除去効果が高いと認められている。したがって、本実施例１で使用したいずれのアミノ酸もウイルス除去効果が極めて高い。特に、グリシンおよびアラニンは、ＬＲＶが約７．５と特に高い除去率を示しており、ウイルスの凝集に効果的なアミノ酸であることがわかる。
【００３０】
なお、ヒトパルボウイルスＢ１９ＤＮＡの検出に際しては、ＳＭＩｔｅｓｔ ＥＸ Ｒ＆Ｄ（株式会社ゲノムサイエンス研究所）を用いて抽出し、さらにパルボウイルスＢ１９遺伝子定性キット（株式会社ゲノムサイエンス研究所）を用いて増幅を行って検出した。
【００３１】
【実施例２】
「アミノ酸濃度がウイルスの凝集に及ぼす影響を確認する実験」
本実施例２では、アミノ酸の濃度がウイルスの凝集効果に与える影響を調査するため、アミノ酸の濃度を変化させてウイルスのＬＲＶを測定する実験を行った。本実施例２の試料に用いるアミノ酸は、実施例１においてウイルスの除去効果が高かったグリシンを選択した。その他のウイルスや濾過膜は、実施例１と同様のものを使用した。
【００３２】
まず、グリシンのモル濃度をそれぞれ０．０ｍｏｌ／Ｌ、０．０３ｍｏｌ／Ｌ、０．１ｍｏｌ／Ｌ、０．３ｍｏｌ／Ｌ、１．０ｍｏｌ／Ｌ、および２．０ｍｏｌ／Ｌに調整したグリシン溶液（ｐＨ６．０）を５０ｍＬずつ準備し、ヒトパルボウイルスＢ１９溶液を１／１００量だけ添加した後、室温で２時間インキュベートしたものをサンプル溶液とした。
【００３３】
つぎに、上記各濃度のサンプル溶液に対し、Ｐｌａｎｏｖａ３５Ｎを用いてデッドエンド方式により濾過処理を行った。このときの圧力は０．８ｋｇｆ／ｃｍ２に保持し、室温で行った。この処理後のサンプル溶液について、実施例１と同様の検出法によりヒトパルボウイルスＢ１９のＬＲＶを測定した。この結果を図３に示す。
【００３４】
図３に示すように、グリシンが低濃度の領域では、グリシン濃度が高くなるに従ってＬＲＶは高くなり、ウイルスの除去効果が向上している。グリシン濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌのときに、ＬＲＶが６．０を超えて、グリシン濃度が０．３ｍｏｌ／Ｌのときに、ＬＲＶが約７．５と最大値を示した。０．３ｍｏｌ／Ｌよりも高い濃度の領域では、グリシン濃度が１．０ｍｏｌ／Ｌの場合、ＬＲＶは約６．０となり、グリシン濃度が２．０ｍｏｌ／Ｌの場合、ＬＲＶは約５．５になった。実施例２の結果によれば、グリシンの濃度はウイルスのＬＲＶに影響を与えると考えられ、少なくともグリシン濃度が０．１〜２．０ｍｏｌ／Ｌの範囲では、ＬＲＶが５．５以上を示し、グリシン濃度が０．３ｍｏｌ／Ｌの場合に７．５以上を示して高い凝集効果が認められる。
【００３５】
【実施例３】
「溶液のｐＨがウイルスの凝集に及ぼす影響を確認する実験」
本実施例３では、サンプル溶液のｐＨがウイルスの凝集効果に与える影響を調査するため、サンプル溶液のｐＨを変化させてウイルスのＬＲＶを測定する実験を行った。本実施例３で用いるアミノ酸溶液は、実施例１でウイルスの除去効果が高かったグリシンを選択し、その濃度は０．３ｍｏｌ／Ｌに設定した。そして、ｐＨを３．０、４．０、６．０、７．０、８．０および９．０に調整したサンプル溶液をそれぞれ用意した。その他、サンプル溶液の作成方法および濾過膜による濾過処理方法は、実施例１と同様の条件で行った。図４に実施例３の結果を示す。
【００３６】
図４は、サンプル溶液のｐＨ値に対するヒトパルボウイルスＢ１９のＬＲＶを示すグラフである。図４に示すように、サンプル溶液のｐＨが６．０のときにＬＲＶは最大値約７．５を示し、それより酸性側の領域およびアルカリ側の領域ではＬＲＶは減少する傾向を示した。つまり、サンプル溶液がｐＨ４．０ではＬＲＶが約２．５となり、ｐＨ３．０ではＬＲＶが約１．０にまで減少した。また、アルカリ側の領域でもアルカリ性が強くなるほどＬＲＶが減少し、ｐＨ７．０ではＬＲＶが約６．０であり、ｐＨ８．０ではＬＲＶが約４．５を保持してウイルスの除去効果が認められた。ｐＨ９．０ではＬＲＶが１．０以下となりウイルスの除去効果はほとんど認められなかった。本実施例３の結果により、ウイルスの凝集除去の効果は、グリシン溶液のｐＨに依存することがわかる。本実施例３の場合、ｐＨが４〜８が好ましく、ｐＨ６．０近傍がより好ましい。
【００３７】
ここで、サンプル溶液のｐＨが６．０近傍の場合に、ヒトパルボウイルスＢ１９の除去効果が特に高い理由について検討する。ヒトパルボウイルスＢ１９は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＮＳといったタンパクによりカプシドが形成されている。これらタンパクの推定される等電点は、ＶＰ１が６．０９であり、ＶＰ２が６．４０であり、ＮＳが５．７５であり、６．０近傍に集中している。これらのことからヒトパルボウイルスＢ１９の凝集は、等電点沈殿効果によるものと考えられる。すなわち、ヒトパルボウイルスＢ１９の等電点にサンプル溶液のｐＨを合わせると、ウイルス全体の電荷が中和されて凝集しやすくなり、この条件下でグリシン等のアミノ酸を添加することにより、ヒトパルボウイルスＢ１９の凝集が促進されると考えられる。
【００３８】
【実施例４】
「濾過膜の孔径がウイルス除去効果に及ぼす影響を確認する実験」
本実施例４では、濾過膜の材質、平均孔径および吸着性の違いがウイルスの除去効果へ与える影響を調査するための実験を行った。本実施例４で用いる濾過膜は、平均孔径３５ｎｍのＰｌａｎｏｖａ３５Ｎ（旭化成株式会社製）、平均孔径５０ｎｍのｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ＮＦＲ（日本ミリポア株式会社）、平均孔径７５ｎｍのＰｌａｎｏｖａ７５Ｎ（旭化成株式会社製）および平均孔径２２０ｎｍのＭｉｌｌｅｘ−ＧＳ（日本ミリポア株式会社）をそれぞれ用意した。また、Ｐｌａｎｏｖａ３５ＮおよびＰｌａｎｏｖａ７５Ｎはセルロース製であり、ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ＮＦＲおよびＭｉｌｌｅｘ−ＧＳはＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ：ポリビニリデンフルオライド）製である。その他、サンプル溶液の作成方法および濾過膜による濾過処理方法は、実施例１と同様の条件で行った。図５に本実施例４の結果を示す。
【００３９】
図５は、濾過膜の孔径に対するヒトパルボウイルスＢ１９のＬＲＶを示している。図５に示すように、濾過膜の孔径が大きくなるに従ってＬＲＶは減少する傾向を示した。ただ、直線的に減少するのではなく、指数関数的に減少した。具体的には、ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ＮＦＲは、平均孔径が５０ｎｍであり、ヒトパルボウイルスＢ１９のサイズの２倍以上大きな孔径を有しているが、ＬＲＶが約６．５と極めて高い除去率を示した。さらに、平均孔径がヒトパルボウイルスＢ１９のサイズの４倍近い大きさである７５ｎｍのＰｌａｎｏｖａ７５Ｎであっても、ＬＲＶが約４．０と高い除去率が得られ、平均孔径がヒトパルボウイルスＢ１９のサイズの１０倍ほども大きいＭｉｌｌｅｘ−ＧＳ（２２０ｎｍ）であっても、ＬＲＶは１程度を示した。ウイルスの除去率は凝集体のサイズと濾過膜の平均孔径に依存することが報告されているが、本実施例４によるウイルス凝集体の大きさを推定すると、Ｐｌａｎｏｖａ３５ＮおよびＰｌａｎｏｖａ７５Ｎのデータより、ウイルス凝集体の大きさはそれぞれ平均６４ｎｍ、７７ｎｍと考えられる。ウイルスの除去率と濾過膜の平均孔径が直線的な比例関係にないのは、それらの凝集体のサイズ分布が広いためと考えられる。このように濾過膜の孔径は小さいほど除去効果があるのはもとより、ヒトパルボウイルスＢ１９が相当に大きな凝集体を形成していることが確認できた。
【００４０】
また、ヒトパルボウイルスＢ１９の濾過膜への吸着性を調べるため、Ｐｌａｎｏｖａ３５Ｎを用いて吸着実験を行った。この吸着実験は、ヒトパルボウイルスＢ１９溶液内にＰｌａｎｏｖａ３５Ｎを入れて撹拌した後にＰｌａｎｏｖａ３５Ｎを取り除き、その撹拌前後におけるヒトパルボウイルスＢ１９の量を測定した。その結果、吸着処理前と吸着処理後とを比較すると、ヒトパルボウイルスＢ１９のＬＲＶが０．５しか変化しておらず、濾過膜に吸着された状況は認められなかった。これによりウイルスが濾過膜に吸着されて除去されているのではないことが認められた。
【００４１】
【実施例５】
「タンパク質が存在する場合のウイルスの凝集効果の確認実験」
本実施例５では、実際にタンパク質が存在する場合におけるウイルスの凝集効果を確認する実験を行った。本実施例５で用いるタンパク質は、人免疫グロブリンおよびアルブミンを使用し、これらを０．３ｍｏｌ／Ｌのグリシン溶液に溶解させて、５％グロブリン溶液および５％アルブミン溶液を作成した。そして、これらの溶液を５０ｍＬずつ準備し、ヒトパルボウイルスＢ１９溶液を１／１００量だけ添加した後、室温で２時間インキュベートしたものをサンプル溶液とした。前記各実施例と同様に、これらのサンプル溶液をＰｌａｎｏｖａ３５Ｎを用いてデッドエンド方式で濾過処理を行った。この実験によるウイルスのＬＲＶの結果を図６に示す。なお、比較のため、タンパク質を含まない０．３ｍｏｌ／Ｌ濃度のグリシン溶液のＬＲＶも示す。
【００４２】
図６に示すように、タンパク質を含まないグリシン溶液（コントロール）のＬＲＶは約７．５であるが、５％グロブリンが存在すると、ＬＲＶは約５．０になり、５％アルブミン存在下では、ＬＲＶは約２．０になる。これにより、血漿タンパクであるグロブリン、アルブミンに関しては共存させるタンパク質濃度をできるだけ低濃度にする方が高いウイルスの除去効果を期待できる。ところで本実施例５で使用したタンパク質濃度は５％であり、かなり高い濃度にしている。従って、実際の処理においては、さらにタンパク質濃度が低くなると考えられ、除去効果が向上すると予想される。
【００４３】
なお、本実施例５では、人免疫グロブリンおよびアルブミンの添加により溶液のタンパク質濃度が高くなっている。このため、ヒトパルボウイルスＢ１９ＤＮＡの検出には、タンパク質分解酵素であるｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ＫとＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ：ドデシル硫酸ナトリウム）によりタンパク質を分解し、ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍで抽出したＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ：デオキシリボ核酸）をＮＳ（ＮｏｎＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：非構造タンパク）領域に対するｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法で分析した。
【００４４】
【実施例６】
「他のウイルスに対する凝集効果の確認実験」
本実施例６では、ヒトパルボウイルスＢ１９以外のウイルスに対するアミノ酸の凝集効果を確認する実験を行った。他のウイルス溶液としては、ＥＭＣ（ＥｎｃｅｐｈａｌｏＭｙｏＣａｒｄｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）溶液およびＰＰＶ（ＰｏｒｃｉｎｅＰａｒｖｏ Ｖｉｒｕｓ）溶液を用意し、さらにこれらにヒト血漿を含有した溶液を用意した。なお、ＥＭＣおよびＰＰＶは、培養液を凍結融解により細胞を破壊してウイルス溶液とした。各ウイルス溶液中のウイルス含量は、それぞれ１０８．３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、１０８．４ＴＣＩＤ５０／ｍＬである。
【００４５】
本実施例６では、０．３ｍｏｌ／Ｌのグリシン溶液（ｐＨ６．０）を５０ｍＬずつ準備し、上記４種類のウイルス溶液をそれぞれ１／１００量だけ添加した後、室温で２時間インキュベートしたものをサンプル溶液とした。そして、これらのサンプル溶液をＰｌａｎｏｖａ３５Ｎによりデッドエンド方式で濾過処理を行った。この処理後のＥＭＣおよびＰＰＶのＬＲＶを図７に示す。
【００４６】
図７に示すように、ＥＭＣのＬＲＶは３．２以上、ＰＰＶのＬＲＶは４．０以上であり、ヒト血漿を含む場合もＥＭＣではＬＲＶが３．７以上、ＰＰＶのＬＲＶは３．１以上となり、いずれのウイルスも検出限界以下まで減少した。ＥＭＣのサイズは、２８〜３０ｎｍであり、ＰＰＶのサイズは１８〜２５ｎｍであり、いずれも濾過膜の平均孔径３５ｎｍより小さいが、確実に除去されていることが認められる。従って、ヒトパルボウイルスＢ１９以外のウイルスに関しても本実施形態における濾過処理により凝集除去できることが認められる。
【００４７】
なお、ＥＭＣおよびＰＰＶの検出に際しては、９６穴プレートにて培養した４×１０５ｃｅｌｌ／０．０５ｍＬのＶｅｒｏ Ｃ１００８細胞およびＣＰＫ細胞に、ＭＥＭ培地で５倍段階希釈した検体を０．１ｍＬ接種し、６〜１０日後に顕微鏡下でＣＰＥの確認を行い、Ｋａｒｂｅｒ法により５０％ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｏｓｅ（ＴＣＩＤ５０）を算出した。
【００４８】
以上より、本実施形態によれば、人免疫グロブリンとウイルスとが共存する溶液において、人免疫グロブリンに影響を与えることなく、ウイルスだけを凝集させて、濾過膜によって除去することができる。
【００４９】
また、前記溶液に加えるアミノ酸として、グリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびプロリンのいずれかを選択することにより、実用的であって、かつ、効果的にウイルスを凝集させて除去することができる。
【００５０】
さらに、前記溶液に加えるグリシンのモル濃度を０．１ｍｏｌ／Ｌ〜２．０ｍｏｌ／Ｌにすることにより、ウイルスを凝集除去することができる。
【００５１】
また、本実施形態におけるウイルス除去方法は、中性付近のｐＨにおいてアミノ酸共存下でウイルスが凝集することを利用していることから、人免疫グロブリン製剤に限らず、他の血漿分画製剤にも適用可能である。
【００５２】
なお、本実施形態の各構成は前述したものに限るものではなく、適宜変更することができる。
【００５３】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、タンパク質およびウイルスが共存する溶液において、目的タンパク質の性質および収率に影響を与えることなく、ウイルスだけを凝集させて、濾過膜によって除去することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明に係る濾過によるウイルスの除去方法を示すフローチャート図である。
【図２】 本実施形態において、溶液に加えるアミノ酸の種類に対するヒトパルボウイルスＢ１９の対数減少率ＬＲＶの関係を示すグラフである。
【図３】 本実施形態において、グリシンのモル濃度に対するヒトパルボウイルスＢ１９の対数減少率ＬＲＶの関係を示すグラフである。
【図４】 本実施形態において、溶液のｐＨに対するヒトパルボウイルスＢ１９の対数減少率ＬＲＶの関係を示すグラフである。
【図５】 本実施形態において、濾過膜の平均孔径に対するヒトパルボウイルスＢ１９の対数減少率ＬＲＶの関係を示すグラフである。
【図６】 本実施形態において、タンパク質存在下におけるヒトパルボウイルスＢ１９の対数減少率ＬＲＶを示すグラフである。
【図７】 本実施形態において、ウイルスがＥＭＣおよびＰＰＶの場合の濾過処理による対数減少率ＬＲＶを示す表である。
Claims (3)
- タンパク質およびノンエンベロープウイルスが共存する溶液から濾過により前記ノンエンベロープウイルスを除去する方法であって、前記溶液のｐＨを４〜８に調整するとともに、前記溶液に対してアミノ酸を加えることにより前記溶液中のノンエンベロープウイルスを凝集させ、濾過膜で濾過するノンエンベロープウイルス凝集条件下での濾過によるノンエンベロープウイルスの除去方法。
- 請求項１において、前記アミノ酸は、少なくともグリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびプロリンのいずれかであるノンエンベロープウイルス凝集条件下での濾過によるノンエンベロープウイルスの除去方法。
- 請求項２において、前記グリシンのモル濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌ〜２．０ｍｏｌ／Ｌであるノンエンベロープウイルス凝集条件下での濾過によるノンエンベロープウイルスの除去方法。
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