WO2001045719A1 - Compositions a base de proteines de plasma exemptes de virus traitees a l'aide d'une membrane poreuse et procede de production - Google Patents

Compositions a base de proteines de plasma exemptes de virus traitees a l'aide d'une membrane poreuse et procede de production Download PDF

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WO2001045719A1
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Tsuyoshi Takahashi
Koji Furushima
Masanori Morita
Muneo Tsujikawa
Takeru Urayama
Nobuaki Hamato
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Mitsubishi Pharma Corporation
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a plasma protein composition from which a virus in a plasma protein composition, particularly an infectious virus has been removed, and a plasma protein composition substantially free of a virus obtained by the method, particularly an infectious virus.
  • the present invention relates to a method for removing viruses in a fibrinogen composition and a plasma protein composition which are substantially free of non-enveloped viruses, especially parvovirus and / or hepatitis A virus.
  • Protein preparations may contain pathogenic factors that can infect humans, and the problem of viral infection is particularly important.
  • transfusions of human immunodeficiency virus (HIV), hepatitis A virus (HAV), hepatitis B virus (HBV) and hepatitis C virus (HCV) have occurred after blood transfusion.
  • a single treatment in a method to inactivate or remove the virus, such as a rope virus remaining and the protein may be inactivated by a single treatment with ultraviolet irradiation, without losing the activity of the protein and completely It was difficult to inactivate or remove contaminating viruses.
  • fibrinogen is a protein that is obtained from the fraction that precipitates first in the alcohol plasma fraction production process, and therefore is susceptible to contamination by contaminants if a virus is contaminated in plasma.
  • Parvovirus B19 (hereinafter referred to as B19) is a particularly popular virus. This virus has no envelope, is resistant to heat, and has a single particle size of about 18 to 25 nm. Due to its small size, research has been focused on plasma inhalation products, especially on measures to remove inactivated Z.
  • a virus having a larger molecular diameter than the pore diameter can be removed by filtration, but a virus smaller than the pore diameter cannot be removed.
  • Many problems such as difficulties in filtration itself, such as clogging of the sample when a membrane is used, and a decrease in the flow rate during membrane processing in proportion to the sample volume, limiting the sample throughput and increasing the processing time
  • the above-mentioned clogging occurs.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve these problems, and as a result, have found that contaminant viruses can be efficiently removed by a porous membrane treatment with little loss of protein activity. It was completed.
  • the present inventors have found that a fibrinogen composition substantially free of non-enveloped viruses, especially parvovirus and hepatitis A virus or Z virus, can be obtained by the porous membrane treatment, and completed the present invention. I came to.
  • the present invention is as follows.
  • the plasma protein composition is at least one protein selected from fibronectin, fibrinogen, coagulation factor V, coagulation factor VIII, von Willebrand factor, coagulation XII I, retinol binding protein, a globulin, ⁇ globulin and gamma globulin 5.
  • Non-enveloped virus is parvovirus and hepatitis ⁇ or ⁇ virus 8.
  • Protein composition (13) The plasma protein composition is selected from fibronectin, fibrinogen, coagulation factor V, coagulation factor VIII, von Willebrand factor, coagulation factor XIII, retinol binding protein, ⁇ globulin, / 3 globulin and gamma globulin 13.
  • a method for removing a virus from a plasma protein composition which comprises subjecting the plasma protein composition to a porous membrane treatment having a pore size larger than a single virus particle diameter.
  • the plasma protein in the plasma protein composition is not particularly limited, and includes any protein as long as it is contained in blood.
  • plasma proteins that can achieve the intended effect in particular by the method of the present invention include plasma proteins having a large molecular weight and a high risk of virus contamination, and include, for example, fibrin nectin, fibrinogen, coagulation V Factors, coagulation factor VIII, von Willebrand factor, coagulation factor XIII, retinol binding protein, ⁇ globulin, 3) gamma globulin and the like.
  • fibrinogen is a protein obtained from the fraction that first precipitates in the alcohol plasma fraction production process, it is a protein that is susceptible to contamination by virus if it enters plasma. It is useful to be able to remove non-enveloped viruses by the simple method of the invention.
  • the plasma protein composition to which the method of the present invention is applied is not particularly limited as long as it is in a form that can be subjected to a porous membrane treatment, because there is a concern that a virus, particularly an infectious virus, may be contaminated. It is usually liquid, for example, a solution consisting of fractions obtained by treating plasma or tissue extract by various fractionation methods, a culture obtained from a recombinant host or tissue culture, or a commercially available protein preparation And the like.
  • the degree of purification is not particularly limited, and any degree of purification is applicable.
  • the degree of purification can be determined by a general method such as PEG (polyethylene glycol) fractionation, alcohol fractionation, glycine fractionation, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and hydrophobic chromatography. Included are any purification steps that have been purified by the appropriate selection and use.
  • the precipitation method used in the present invention includes a method used as a protein fractionation method known per se.
  • neutral salts for example, neutral salts (precipitation method using this is a so-called salting-out method, such as sulfate, sulfite, thiosulfate, phosphate, alkali metal salt, ammonia, magnesium, halogen compound, etc.
  • Water-soluble organic solvents eg, ethanol, methanol, ethyl ether, acetone, etc.
  • water-soluble non-ionized polymer compounds eg, polyethylene glycol (PEG), dextran, Polyvinylpyrrolidone (PVP), nourphenol ethoxylate, etc., metal ion (barium sulfate, aluminum hydroxide, etc.), organic cations (rivanol, protamine, other cationic surfactants, etc.), anions ( For example, precipitation methods using low-molecular anions such as picric acid, trichloroacetic acid, sulfosalicylic acid, and perchloric acid, and polyadiones such as polyacrylic acid, polystyrenesulfonic acid, and polyphosphate), and desalination Precipitation method (dialysis method, dilution method, etc.), glycine precipitation method (glycine sodium monochloride precipit
  • the precipitation method used in the present invention can be carried out under the same method and conditions as those used in ordinary protein fractionation treatment. That is, in the present invention, each substance used in the precipitation method can be appropriately selected according to the solubility of the target protein to be separated. For example, the target charge is changed by changing the surface charge or hydrophilicity of the protein molecule. A protein that can be obtained as a precipitate or a protein that can precipitate unnecessary proteins and obtain the target protein in the supernatant may be used. You can select it. Therefore, various factors affecting the precipitation method, such as hydrogen ion concentration or pH, ion intensity, dielectric constant, temperature, protein concentration, and other ions, can be selected according to the target protein. . In addition, their use conditions may be selected according to the protein.
  • the glycine precipitation method is preferable, and more preferably, the glycine sodium monochloride precipitation method.
  • the concentration is 50 g or more for glycine, 10 g / L or more for sodium chloride, preferably 75 g / L or more for glycine, and 3 O gZL or more for sodium chloride.
  • the upper limit is glycine of 250 g / L or less, preferably 225 g / L or less, sodium chloride of 175 g ZL or less, and preferably 150 g / L or less. is there.
  • Each protein separated by the above precipitation method can be obtained as a necessary fraction by subjecting it to a usual centrifugation treatment and various filtration steps.
  • the target protein is obtained as a precipitate, it must be extracted and dissolved with an appropriate solvent for subsequent purification, but the solvent is not particularly limited, and the protein purification process is not particularly limited. Solvents, buffers, etc. that are commonly used for extraction are used, but when the protein is fibrinogen, citrate buffer or water is usually used for extraction and dissolution, especially after extraction with water and ordinary centrifugation or clear filtration. Through the steps, the effects of the present invention can be enhanced.
  • the treatment with a porous membrane means that plasma proteins, which are likely to be contaminated with a virus, are filtered through a porous membrane.
  • the material of the porous membrane used in the present invention is not particularly limited, and synthetic polymer compounds such as regenerated cellulose, cellulose acetate, polyvinylidene fluoride, polyether sulfone, polyacrylonitrile, polysulfone, and polymethyl methacrylate are used. However, it is preferably regenerated cellulose.
  • the shape may be a hollow fiber shape, a sheet shape, or the like, but is preferably a hollow fiber shape.
  • the porous hollow fiber membrane of the regenerated cellulose is prepared from a cellulose copper ammonia solution by a microphase separation method [Am. Chem. Soc., 9, 197-228 (1985)].
  • the pore size depends on the type of protein and the type of virus to be removed. To 100 nm, preferably 100 to 100 nm. Particularly, when filtering parvovirus, HAV, etc. from proteins having a large molecular weight, such as fibrinogen, 35 to 100 nm, The pore size is preferably 35 to 75 nm.
  • porous membrane When the porous membrane is in the form of a hollow fiber, it is preferably used in the form of a module.
  • a porous hollow fiber membrane may be bundled in parallel, filled into a cartridge, and integrated using an adhesive.
  • Planova series (trade name, manufactured by Asahi Kasei Corporation) having a multilayer structure of 100 or more layers
  • the Piersolve series (trade name, manufactured by Millipore Corporation) known as a virus removal membrane.
  • Omega VR series (trade name, manufactured by Pall)
  • Ultipore series (trade name, manufactured by Pall) and the like can be used.
  • Planova series is particularly preferred.
  • the temperature at which the plasma protein composition is treated with a porous membrane, that is, filtered, is 4 to 50 ° C. And preferably 4 to 37 ° C.
  • the filtration pressure is between 10 and 100 kPa, preferably between 10 and 90 kPa.
  • a filtration method there are a cross-flow filtration method (circulation type) in which the solution is filtered while giving a strain rate, and a dead-end filtration method (non-circulation type) in which the solution is filtered without giving a strain rate.
  • it is performed by a dead end filtration method using pressurized air or the like.
  • the present invention is characterized in that by adding chaotropic ions or amino acids to a sample at the time of filtration through a porous membrane, the contaminant virus can be efficiently removed by the porous membrane treatment with little loss of protein activity. The effect can be further exhibited.
  • the kind of the chaotropic ion or amino acid is not particularly limited, and those usually used in the process of protein purification can be used, but chloride ion and arginine are particularly preferable.
  • Such a filtration treatment can be performed once or plural times. By performing the treatment several times, a more excellent virus removing effect by filtration can be obtained.
  • the present invention can remove a virus having a single particle size smaller than the pore size of the porous membrane by treating the plasma protein composition using a porous membrane having a larger pore size than the virus single particle size,
  • the thus obtained plasma protein composition can be substantially free of the virus.
  • porous membrane having a larger pore diameter than the single virus particle diameter means a porous membrane that can pass through the porous membrane when the virus is a single particle.
  • contaminating viruses can be efficiently removed with little loss of protein activity, and a plasma protein composition as a safer raw material for a plasma protein preparation can be obtained.
  • virus removed by the method of the present invention include vaccinia virus, mumps virus, herpes simplex inores, echovirus, parvovirus, HIV, HAV, HBV, HCV, TTV and the like.
  • non-enveloped viruses that may be contaminated include parvovirus and HAV.
  • the plasma protein composition thus obtained can be used as it is or by a more general protein purification method such as PEG (polyethylene glycol) fraction, alcohol fraction, glycine fraction, gel filtration, ion exchange chromatography, A plasma protein preparation can be obtained by purification by a method such as affinity chromatography or hydrophobic chromatography.
  • Plasma protein preparations are made into liquid preparations or dry preparations by conventional methods, and are usually pharmacologically acceptable additives such as preservatives, bactericides, chelating agents, thickeners, isotonic agents. Or a pharmaceutically necessary component may be appropriately blended.
  • the production method of the present invention produces a plasma protein composition substantially free of virus, and the plasma protein composition is used before and after the method of the present invention to inactivate or remove commonly used viruses.
  • the plasma protein composition is used before and after the method of the present invention to inactivate or remove commonly used viruses.
  • substantially free of virus means that the amount is below the detection limit in a known method for measuring the amount of virus.
  • Parvovirus as a monitor virus sample after the surfactant treatment was added 1 0 2 1.7 copy one Z ml.
  • the sample was subjected to precipitation fractionation with 15% daricin-1M sodium chloride, and fibrinogen was collected by sedimentation by centrifugation (4,000 rpm, 20 minutes). .
  • the recovered fibrinogen was dissolved in l.OL citrate buffer to prepare a 1.0% solution. Using this solution as a sample before filtration, the amount of virus was measured.
  • This solution was subjected to a dead-end filtration method using Branova 75N (average pore size: 72 ⁇ 4 nm) at a temperature of 23 ° C. and a filtration pressure of 10 kPa to remove viruses.
  • the filtrate was used as a sample after filtration to measure the amount of virus.
  • this sample was subjected to precipitation fractionation treatment with 15% glycine-1M sodium chloride, and fibrinogen was collected by sedimentation by centrifugation (4,000 rpm, 20 minutes). Next, the recovered fibrinogen was dissolved in 1.0 L of citrate buffer to prepare a 1.0% solution.
  • parvovirus as a monitor virus was added 10 5.7 Kopino ml.
  • this sample was subjected to 15% glycine-1M sodium chloride fractionation, and fibrinogen was collected by sedimentation by centrifugation (4,000 rpm, 20 minutes). Next, the recovered fibrinogen was dissolved in 1.0 L of a taeic acid buffer to prepare a 1.0% solution. Using this solution as a sample before filtration, the amount of virus was measured.
  • the resulting solution was subjected to a dead-end filtration method using Planopa 75N (average pore diameter 72 ⁇ 4 nm) at a temperature of 23 ° C. and a filtration pressure of 10 kpa to remove viruses.
  • the filtrate was used as a sample after filtration, and the amount of virus was measured.
  • Parvovirus was added as a monitor virus to the sample after the surfactant treatment. Thereafter, the sample was subjected to precipitation fractionation treatment with 15% glycine-1M sodium chloride, and fibrinogen was collected by sedimentation by centrifugation (4,000 rpm, 20 minutes). Next, the recovered fibrinogen was dissolved in 1.0 L of citrate buffer to prepare a 1.0% solution. Using this solution as a sample before filtration, the amount of virus was measured. At the same time, the absorbance at 280 ⁇ m was measured using this solution as a sample before filtration to measure the protein content.
  • This solution was subjected to a dead end filtration method using Planova 75 N (average pore size: 72 ⁇ 4 nm) at a temperature of 23 ° C. and a filtration pressure of 10 kPa to remove viruses.
  • the filtrate was used as a sample after filtration to measure the amount of virus.
  • the protein content of the filtrate was measured as the absorbance at 280 nm.
  • the filtrate was further subjected to a dead-end filtration method using a Planova 35N (average pore size: 35 ⁇ 2 nm) at a temperature of 23 ° C. and a filtration pressure of 10 kPa to remove viruses.
  • a Planova 35N average pore size: 35 ⁇ 2 nm
  • the amount of virus was measured.
  • the protein content of this filtrate was measured as the absorbance at 280 nm.
  • Fr.I fraction of corn derived from normal human plasma 100 g was dissolved in 1.5 L of physiological saline, and tree (n-butyl) phosphate (TNBP) was added to 0.3 wZv% and Tween 80 in 1 part. w / V%, and treated with a surfactant at 30 ° C for 6 hours.
  • TNBP tree (n-butyl) phosphate
  • the parvovirus was added 1 0 10 ⁇ 1 copy / ml as a sample on the monitor virus after detergent treatment.
  • the sample was subjected to precipitation fractionation with 8% glycine-1M sodium chloride, and fibrinogen was collected by precipitation by centrifugation (4,000 rpm, 20 minutes). .
  • the recovered fibrinogen was dissolved in 1.5 L of water for injection to prepare a fibrinogen solution. After removing the insoluble matter in this solution by centrifugation, 0.9 g / L sodium chloride was added to obtain a sample before filtration.
  • This solution was subjected to a dead-end filtration method using Planova 35N (average pore size: 35 ⁇ 2 nm) at a temperature of 23 ° C. and a filtration pressure of 10 kPa. This filtrate was used as a sample after filtration, and the amount of virus was measured.
  • Planova 35N average pore size: 35 ⁇ 2 nm
  • glycine - sodium chloride fraction, water extraction precipitation showed a 1 0 6 copies one Zm 1 or more virus removal effect before and after the treatment that combines a centrifugal removal Contact Yopi plug Nova 3 5 N.
  • Fr.I fraction of corn derived from normal human plasma 100 g was dissolved in 1.5 L of physiological saline, and tree (n-butyl) phosphate (TNBP) was added to 0.3 wZv% and Tween 80 to 1 w. / v%, and treated with a surfactant at 30 ° C for 6 hours.
  • TNBP tree (n-butyl) phosphate
  • the recovered fibrinogen was dissolved in 1.5 L of water for injection to prepare a fiprinogen solution. After removing the insolubles in this solution by centrifugation, 0.9 gZL of sodium chloride was added to obtain a sample before filtration.
  • This solution was subjected to a dead-end filtration method using Planova 35N (average pore size: 35 ⁇ 2 nm) at a temperature of 23 ° C. and a filtration pressure of 10 kPa. This filtrate was used as a sample after filtration, and the amount of virus was measured.
  • Planova 35N average pore size: 35 ⁇ 2 nm
  • Fr.I fraction of corn derived from normal human plasma 100 g was dissolved in 1.5 L of physiological saline, and TNBP was added to 0.3 V% and Tween 80 to 1 wZv%.
  • a surfactant treatment was performed at 30 ° C. for 6 hours.
  • Fibrinogen was precipitated and recovered by precipitation fractionation treatment with / 0 glycine-1M sodium chloride. Next, the recovered fibrinogen was dissolved in 1.0 L of citrate buffer to prepare a 1.0% solution.
  • the solution was Parvovirus 10 10 - 7 copies Zm 1 was added as a monitor virus.
  • This solution was used as a sample before filtration, and the amount of virus was measured.
  • This solution was subjected to a dead-end filtration method using Planova 75N (average pore size: 72 ⁇ 4 nm) at a temperature of 23 ° C. and a filtration pressure of 10 kPa to remove viruses.
  • the filtrate was used as a sample after filtration to measure the amount of virus.
  • the sample was subjected to precipitation fractionation treatment with 15% glycine-1M sodium chloride to precipitate and recover fibrinogen.
  • the recovered fibrinogen was dissolved in 1.0 L of citrate buffer to prepare a 1.0% solution.
  • This solution was subjected to a dead-end filtration method using Planopa 75N (average pore size: 72 ⁇ 4 nm) at a temperature of 23 ° C. and a filtration pressure of 10 kPa to remove viruses.
  • the filtrate was used as a sample after filtration to measure the amount of virus.
  • the filtrate was further subjected to a dead-end filtration method using a Planova 35N (average pore size: 35 ⁇ 2 nm) at a temperature of 23 ° C. and a filtration pressure of 10 kPa to remove viruses. Using this filtrate as a sample after filtration, the amount of virus was measured.
  • the amount of virus of parvovirus was measured for each sample by measuring the residual amount of viral nucleic acid by polymerase chain reaction (PCR) (Transfusion Vol.32, p.824-828 (1992)).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the nucleic acid of parvovirus becomes undetectable at 1 0 2 copies Z m 1.
  • EMC virus encephalomyocarditis virus: lunar myocarditis virus
  • the infectivity titer of EMC virus to Vero cells is 10 L5 TCID 5 . At / m1, it is below the detection limit.
  • Table 1 shows the results of Examples 1-2 and 4-5 and Reference Examples 1-3.
  • the present invention can provide a plasma protein having no fear of viral infectivity.
  • the treatment with the porous membrane of the present invention can provide a fibrinogen composition substantially free of non-enveloped viruses, especially parvovirus and hepatitis A or Z virus.

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Description

明細書
多孔性膜処理によるウィルスの除去された血漿蛋白組成物の製造方法、 ウィルス の除去された血漿蛋白組成物およびウイルス除去方法
技術分野
本発明は、 血漿蛋白組成物中のウィルス、 特に感染性ウィルスが除去された血漿 蛋白組成物の製造法、 当該方法により得られるウィルス、 特に感染性ウィルスを実 質的に含まない血漿蛋白組成物、 非エンベロープウィルスとりわけ、 パルボウイル スおよび/または A型肝炎ゥィルスを実質的に含まないフイブリノゲン組成物および 血漿蛋白組成物中のウィルスを除去する方法に関する。
背景技術
蛋白製剤、 特にヒ ト血漿を原料とする血漿分画製剤には、 ヒ トに感染し得る病原 因子が混入しているおそれがあり、 特にウィルス感染に対する問題は重要である。 これまで輸血後にヒ ト免疫不全ウィルス （H I V) 、 A型肝炎ウィルス （HAV) 、 B型肝炎ウィルス （HBV) 、 C型肝炎ウィルス （HCV) などのウィルスの感染 事故が発生している。
このような事故は過去のものではなく、 数々の技術の導入によって事故の発生率 は指数的な数値をもって劇的に少なくなつているものの、 現在もその発生を完全に 否定することはできない。
これらのウィルス伝播を防ぐために、 夾雑の可能性のあるウィルスを不活化また は除去する方法が種々知られている。 例えば、 蛋白含有組成物を液状で加熱する方 法 （特開昭 55— 1456 1 5号公報、 特開昭 56— 1 39422号公報、 特開昭 56-106594号公報など） 、 乾燥状態で加熱する方法 （特表昭 58— 500 548号公報、 特開昭 58 - 21 3721号公報など） 、 トリアルキルホスフエ一 トおよび Zまたは界面活性剤などと接触させる方法 （特開昭 60— 5 1 1 1 6号公 報など） 、 紫外線照射による方法 （特開平 7— 1 96531号公報など） 、 ウィル ス除去膜による方法 （特開平 9一 100239号公報など） が知られている。 しかし、 加熱処理では熱に強いウィルスが残存し、 界面活性剤処理では非ェンべ ロープウィルスが残存し、 紫外線照射の単独処理では蛋白が失活する可能性がある など、 ウィルスを不活化又は除去する方法において単一の処理では、 蛋白の活性を 失うことなく、 かつ、 完全に夾雑ウィルスを不活化又は除去することは困難であつ た。
そこで、 現在、 夾雑ウィルスを不活化又は除去する上記方法を適当に組み合わせ て使用しているのが現状である。
一方、 フイブリノゲンはアルコール血漿分画製造過程において最初に沈殿してく る分画から得られる蛋白質であるために、 万一血漿にウィルスが混入した場合にそ の汚染の影響を受けやすい蛋白質である。 特に現在話題の多いウィルスとしてパル ボウイルス B 1 9 (以下、 B 1 9という） があるが、 このウィルスはエンベロープ が無く、 熱に強く、 その単粒子径は 1 8〜2 5 n m程度と非常に小さいために、 血 漿分画製剤の分野で特に、 その不活化 Z除去対策に注力され研究が進められている ものである。
ウィルス除去膜による方法では、 当然に、 孔径に比しより大きな分子径のウィル スを濾過により除去することができるが、 孔径より小さなウィルスを除去すること はできず、 また、 あまり孔径の小さな除去膜を使用するとサンプルが目詰まりする など濾過自体が困難であったり、 また、 サンプル量に比例して膜処理時の流速が低 下し、 サンプル処理量の制限及び処理時間の増大といった多くの問題を有していた 特に、 フイブリノゲンの精製工程においてその分子量等の関係から、 現在市販さ れている多孔性膜の膜孔径が 3 5 n m未満のものを使用した場合には、 上記の目詰 まり、 サンプル処理量の制限及び処理時間の増大といった問題が実際に生じており 、 膜孔径が 3 5 n m以上の多孔径膜の使用しかできないという問題があった。 しか し、 パルボウイルス （B 1 9 ) の単粒子径は上述の通り 1 8〜2 5 n m程度である ので、 現在市販されている膜孔径 3 5 n mや 7 5 n mのプラノバ 3 5 N、 プラノバ 7 5 N (いずれも商品名、 旭化成社製） 単独、 さらにはこれらのウィルス除去膜を 多段に用いる方法においても除去できないという問題があった。 したがって、 今日、 簡便な処理方法により少しでもウィルス感染性の少ない、 安 全な蛋白製剤を提供する方法が望まれていた。
発明の開示
本発明者らは、 これらの課題を解決するために鋭意研究した結果、 多孔性膜処理 により、 蛋白の活性を殆ど失うことなく、 効率よく夾雑ウィルスを除去することが できることを見出して本発明を完成するに至った。 また、 本発明者らは多孔性膜処 理により非エンベロープウィルス、 とりわけパルボウイルスおよび Zまたは A型肝炎 ウィルスを実質的に含まないフィブリノゲン組成物を得ることができることを見出 して本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は下記の通りのものである。
( 1 ) 血漿蛋白組成物をウィルス単粒子径より孔径の大きな多孔性膜処理に付す 工程を有することを特徴とするウィルスの除去された血漿蛋白組成物の製造法。
( 2 ) 多孔性膜が多孔性中空糸膜である前記 1記載の製造法。
( 3 ) 多孔性膜処理前に血漿蛋白組成物を沈殿法分画処理に付すことを特徴とす る前記 1または 2記載の製造法。
( 4 ) 多孔性膜処理に付す前に、 血漿蛋白組成物を沈殿法分画処理に付し、 得ら れた沈殿を水抽出する工程を有することを特徴とする前記 1〜 3のいずれかに記載 の製造法。
( 5 ) 血漿蛋白組成物がフイブロネクチン、 フイブリノゲン、 凝固 V因子、 凝固 V I I I因子、 フォンビルブランド因子、 凝固 XII I因子、 レチノール結合蛋白質、 aグロブリン、 βグロプリンおよび γグロプリンから選ばれる少なくとも一種の蛋 白質を含有するものである前記 1〜4のいずれかに記載の製造法。
( 6 ) 血漿蛋白組成物が少なくともフイブリノゲンを含有するものである前記 5 に記載の製造法。
( 7 ) ウィルスが非エンベロープウィルスである前記 1〜 6のいずれかに記載の 製造法。
( 8 ) 非エンベロープウィルスがパルボウィルスおよび Ζまたは Α型肝炎ゥィルス である前記 7記載の製造法。
(9) ウィルス単粒子径より孔径の大きな多孔性膜処理に付すことにより当該ゥ ィルスが実質的に除去された血漿蛋白組成物。
(1 0) 多孔性膜が多孔性中空糸膜である前記 9記載の血漿蛋白組成物。
(1 1) 多孔性膜処理前に血漿蛋白組成物を沈殿法分画処理に付することを特徴 とする前記 9または 10に記載の血漿蛋白組成物。
(1 2) 多孔性膜処理前に血漿蛋白組成物を沈殿法にて分画処理し、 得られた沈 殿を水抽出することを特徴とする前記 9〜1 1のいずれかに記載の血漿蛋白組成物 (1 3) 血漿蛋白組成物がフイブロネクチン、 フイブリノゲン、 凝固 V因子、 凝 固 V I I I因子、 フォンビルブランド因子、 凝固 XIII因子、 レチノール結合蛋白質 、 αグロブリン、 /3グロブリンおよび γグロブリンから選ばれる少なくとも 1種の 蛋白質を含有するものである前記 9〜 1 2のいずれかに記載の血漿蛋白組成物。
(14) 血漿蛋白組成物が少なくともフイブリノゲンを含有するものである前記 1 3に記載の血漿蛋白組成物。
(1 5) ウィルスが非エンベロープウィルスである前記 9〜 14のいずれかに記 載の血漿蛋白組成物。
(1 6) 非エンベロープウィルスがパルボウイルスおよび/または Α型肝炎ウィル スである前記 1 5に記載の血漿蛋白組成物。
(1 7) パルボウイルスを実質的に含まないフイブリノゲン組成物。
(1 8) 血漿蛋白組成物をウィルス単粒子径より孔径の大きな多孔性膜処理に付 すことを特徴とする血漿蛋白組成物中のウィルスの除去方法。
(1 9) 多孔性膜が多孔性中空糸膜である前記 1 8記載の方法。
(20) 多孔性膜処理前に血漿蛋白組成物を沈殿法分画処理に付すことを特徴と する前記 1 8または 1 9記載の方法。
(2 1) 多孔性膜処理に付す前に、 血漿蛋白組成物を沈殿法にて分画処理し、 得 られた沈殿を水抽出する工程を有することを特徴とする前記 1 8〜20のいずれか に記載の方法。
本発明において、 血漿蛋白組成物における血漿蛋白は特に限定されるものではな く、 血液中に含まれるものであれば如何なるものも含まれる。 たとえば、 本願発明 の方法により特に所期の効果を達成することができる血漿蛋白としては、 分子量が 大きく、 ウィルスの混入のおそれが高い血漿蛋白質であって、 たとえば、 フイブ口 ネクチン、 フイブリノゲン、 凝固 V因子、 凝固 V I I I因子、 フォンビルブランド 因子、 凝固 XIII因子、 レチノール結合蛋白質、 αグロブリン、 ）3グロブリンおよび γグロブリンなどが挙げられる。 特に、 フイブリノゲンはアルコール血漿分画製造 過程において最初に沈殿してくる分画から得られる蛋白質であるために、 万一血漿 にウィルスが混入した場合にその汚染の影響を受けやすい蛋白質であり、 本発明の 簡便な方法により非エンベロープウィルスを除去できることは有用である。
本発明の方法が適応される血漿蛋白組成物は、 ウィルス、 特に感染性ウィルスの 夾雑が危惧され、 多孔性膜処理に付することのできる形態のものであれば特に限定 されるものではなく、 通常は液状であり、 例えば、 血漿または組織抽出液を各種分 画法により処理して得た分画からなる溶液、 遺伝子組み換え宿主または組織培養に より得られる培養液、 市販の蛋白製剤としたものなどが挙げられる。
また、 その精製度は特に制限されるものではなく、 任意の精製度のものが適応可 能である。 その精製度は一般的な方法、 例えば、 P E G (ポリエチレングリコール ) 分画、 アルコール分画、 グリシン分画、 ゲル濾過、 イオン交換クロマトグラフィ 一、 ァフィ二ティークロマトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィー等の方法を適 宜選択し利用することによって精製された如何なる精製段階のものも含まれる。 本発明で使用される沈殿法としては自体既知の蛋白分画法として使用される方法 が含まれる。 たとえば、 中性塩類 （これを使用する沈殿法は、 いわゆる塩析法と呼 ばれるもので、 硫酸塩、 亜硫酸塩、 チォ硫酸塩、 リン酸塩、 アルカリ金属塩、 アン モニァ、 マグネシウム、 ハロゲン化合物等が挙げられる） 、 水溶性有機溶媒 （たと えば、 エタノール、 メタノール、 ェチルエーテル、 アセトン等） 、 水溶性非イオン 化高分子化合物 （たとえば、 ポリエチレングリコール （P E G ) 、 デキストラン、 ポリビニルピロリ ドン （P V P ) 、 ノユルフェノールエトキシレート等） 、 金属ィ オン （硫酸バリウム、 水酸化アルミニウム等） 、 有機陽イオン （リバノール、 プロ タミン、 その他陽イオン性界面活性剤等） 、 陰イオン （たとえば、 ピクリン酸、 三 塩化酢酸、 スルフォサリチル酸、 過塩素酸等の低分子陰イオン、 ポリアクリル酸、 ポリスチレンスルフォン酸、 ポリリン酸塩等のポリア二オン） 等を使用する沈殿法 、 脱塩による沈殿法 （透析法、 希釈法等） 、 グリシン沈殿法 （グリシン一塩化ナト リウム沈殿法） 等が挙げられる。
本発明において使用される沈殿法は通常の蛋白質分画処理時に用いられると同様 の方法、 条件にて行なうことができる。 すなわち、 本発明において沈殿法に使用さ れる各物質は分離しようとする目的蛋白質の溶解性に応じて適宜選択することが出 来、 例えば、 当該蛋白質分子の表面電荷や親水性等を変化させ目的の蛋白質を沈殿 として得ることができるもの、 または不要な蛋白質を沈殿させ目的の蛋白質を上清 に得ることが出来るものを使用すればよく、 その沈殿処理における条件は、 それぞ れの蛋白質に応じて選択すればよい。 したがって、 水素イオン濃度または p H、 ィォ ン強度、 誘電率、 温度、 蛋白濃度およびその他のイオン等、 沈殿法に影響を及ぼす 種々の因子も目的の蛋白質に応じたものを選択することが出来る。 また、 それらの 使用条件も蛋白質に応じて選択すればよい。
特に、 蛋白質がフイブリノゲンである場合、 グリシン沈殿法が好ましく、 更に好 ましくはグリシン一塩化ナトリゥム沈殿法である。 またその濃度はグリシンが 5 0 g 以上、 塩化ナトリウムが 1 0 g/L以上、 好ましくはグリシンが 7 5 g/L以上、 塩 化ナトリウム 3 O gZL以上である。 また、 その上限は、 グリシンが 2 5 0 g / L以 下、 好ましくは 2 2 5 g / L以下であり、 塩化ナトリゥムが 1 7 5 g Z L以下、 好 ましくは 1 5 0 g Z L以下である。
上記沈殿法により分離された各蛋白質は通常の遠心処理、 各種濾過工程に付すこ とにより必要な画分として得られる。
目的蛋白質が沈殿として得られる場合にはその後の精製のため適当な溶媒で抽出 、 溶解して溶液とする必要があるが、 溶媒には特に限定はなく、 蛋白質の精製過程 で通常使用される溶媒、 緩衝液等が使用されるが、 蛋白質がフイブリノゲンである 場合、 抽出、 溶解には通常クェン酸緩衝液や水が使用され、 特に水抽出した後通常 の遠心または清澄濾過工程を経ることにより本発明の効果を高めることができる。 本発明において、 多孔性膜処理とは、 ウィルスの夾雑が危惧される血漿蛋白を多 孔性膜によって濾過することを意味する。
本発明に使用される多孔性膜の素材は特に制限されず、 再生セルロース、 酢酸セ ルロース、 ポリフッ化ビニリデン、 ポリエーテルスルホン、 ポリアクリロニトリル 、 ポリスルホン、 ポリメチルメタクリレート等の合成高分子化合物が使用されるが 、 好ましくは再生セルロースである。
また、 その形状は中空糸状、 シート状等が挙げられるが、 好ましくは中空糸状で ある。 たとえば、 該再生セルロースの多孔性中空糸膜はセルロース銅アンモニア溶 液からミクロ相分離法 [Am. Chem. Soc.， 9, 197-228 (1985) ] によって調製される 使用する多孔性膜の平均孔径は蛋白質の種類、 除去しようとするウィルスの種類 により異なるが、 一般に：！〜 1 0 0 n m、 好ましくは 1 0〜： 1 0 0 n mであり、 特 に、 フイブリノゲン等の分子量の大きな蛋白質においてパルボウイルス、 H A V等 を濾過除去する場合には 3 5〜 1 0 0 n m、 好ましくは 3 5〜 7 5 n mの孔径であ る。
多孔性膜が中空糸状である場合には、 好ましくはモジュールの態様で使用される 。 たとえば、 多孔性中空糸膜を多数平行に束ねてカートリッジに充填し、 接着剤を 用いて一本化したものが挙げられる。
市販のものとしては、 膜となる周壁が 1 0 0層以上の多重層構造であるプラノバ シリーズ （商品名、 旭化成社製） 、 ウィルス除去膜として知られているパイァソル ブシリーズ （商品名、 ミリポア社製） 、 オメガ V Rシリーズ （商品名、 ポール社製 ) 、 ウルチポアシリーズ （商品名、 ポール社製） 等を使用することができる。 特に 好ましくは、 プラノバシリーズである。
血漿蛋白組成物を多孔性膜にて処理、 即ち濾過する際の温度は、 4〜5 0 °Cであ り、 好ましくは 4〜37°Cである。
濾過圧力は 10〜100 k p a、 好ましくは 10〜90 k p aである。 濾過の方 法としては、 溶液にひずみ速度を与えながら濾過するクロスフロー濾過法 （循環式 ) と溶液にひずみ速度を与えずに濾過するデットエンド濾過法 （非循環式） がある 。 好ましくは、 加圧空気等によるデットエンド濾過法によって行われる。
また、 多孔性膜にて濾過する際に、 試料にカオトロピックイオンまたはアミノ酸 を添加することによって、 多孔性膜処理により、 蛋白の活性を殆ど失うことなく、 効率よく夾雑ウィルスを除去するという本発明の効果をより一層発揮させることが できる。
この場合のカオトロピックイオンまたはアミノ酸の種類は特に限定されず、 通常 蛋白質の精製過程で使用されるものを使用することができるが、 特に、 塩素イオン 、 アルギニンなどが好ましい。
また、 このような濾過処理は単回又は複数回行うこともできる。 複数回行なうこ とにより、 濾過による更に優れたウィルス除去効果を得ることができる。
特に、 本発明は、 血漿蛋白組成物をウィルス単粒子径より孔径の大きな多孔性膜 を使用して処理することによって、 多孔性膜の孔径より小さな単粒子径のウィルス を除去することができ、 このようにして得られた血漿蛋白組成物は、 実質的に当該 ウィルスを含まないものとすることが可能となる。
「ウィルス単粒子径より孔径の大きな多孔性膜」 とは、 当該ウィルスが単粒子で ある場合には、 当該多孔性膜を通過しうる多孔性膜を意味する。
したがって、 本発明によれば、 蛋白の活性を殆ど失うことなく、 効率よく夾雑ゥ ィルスを除去することができ、 より安全な血漿蛋白製剤の原料としての血漿蛋白組 成物を得ることができる。
本発明の方法により除去されるウィルスの具体例として、 ワクシニアウィルス、 ムンプスウィルス、 単純疱疹ゥイノレス、 エコーウィルス、 パルボウイルス、 H I V 、 HAV、 HBV、 HCV、 TTVなどが挙げられる。 特に、 夾雑が危惧される非 エンベロープウィルスとしてパルボウイルス、 HAV等が挙げられる。 このようにして得られた血漿蛋白組成物はそのまま、 またはさらに一般的な蛋白 質の精製方法、 たとえば P E G (ポリエチレングリコール） 分画、 アルコール分画 、 グリシン分画、 ゲル濾過、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティ一クロ マトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィ一等の方法により精製することによって 、 血漿蛋白製剤とすることができる。
血漿蛋白製剤は、 慣用の方法により液状製剤または乾燥製剤とされ、 通常医薬と して薬理的に許容される添加剤、 たとえば、 防腐剤、 殺菌剤、 キレート剤、 粘稠剤 、 等張化剤など、 または製薬上必要な成分が適宜配合されてもよい。
本発明の製造法によって、 実質的にウィルスの除去された血漿蛋白組成物が製造さ れるが、 血漿蛋白組成物は本発明の方法の前後において、 一般的に使用されるウイ ルス不活化または除去方法、 たとえば、 乾燥加熱、 液状加熱、 界面活性剤処理、 紫 外線照射処理、 ウィルス除去膜処理などを適宜組み合わせることによって、 ウィル スの不活化または除去をより完全なものとすることができる。
本発明において 「実質的にウィルスの除去された」 とは既知のウィルス量の測定 方法において検出限界以下であることを意味する。
実施例
以下、 実験例、 参考例等により本発明を説明するが、 本発明はこれらにより何ら 限定されるものではない。
実施例 1
正常ヒ ト血漿由来のコーンの F r . I画分 100 gを 1. 5 Lのクェン酸緩衝液で溶解 し、 トリ一 （n—ブチル） ホスフェート （T N B P ) を 0 . 3 w/ v %及び T w e e n 8 0を 1 wZ v %になるように添加し、 3 0 °Cにて 6時間の界面活性剤処理を 行なった。
界面活性剤処理後の試料にモニターウィルスとしてパルボウイルスを 1 0 2· 7コピ 一 Z m l添加した。
その後、 この試料を 15%ダリシン一 1M塩化ナトリゥムによる沈殿分画処理にて、 フイブリノゲンを遠心 （4， 0 0 0 r p m、 2 0分間） により沈殿させて回収した 。 次いで回収されたフイブリノゲンを l.OLのクェン酸緩衝液に溶解し、 1.0%溶液 を調製した。 この溶液を濾過前のサンプルとしてそのウィルス量を測定した。
この溶液をブラノバ 75 N (平均孔径 72 ±4 nm) を用いた温度 23°C、 濾過 圧 10 k p a、 デットェンド濾過法に供しウィルス除去を行なった。 この濾液を濾 過後のサンプルとしてそのウィルス量を測定した。
実施例 2
正常ヒ ト血漿由来のコーンの F r . I画分 100gを 1.5Lのクェン酸緩衝液で溶解 し、 トリ一 （n—プチル） ホスフェート （TNBP) を 0. 3wZv%及び Twe e n 80を 1 wZv%になるように添カ卩し、 30 °Cにて 6時間の界面活性剤処理を 行なった。
その後、 この試料を 1 5%グリシン一 1M塩化ナトリウムによる沈殿分画処理に 供し、 フイブリノゲンを遠心 （4， 000 r pm, 20分間） により沈殿させて回 収した。 次いで回収されたフイブリノゲンを 1.0Lのクェン酸緩衝液に溶解し、 1.0 %溶液を調製した。
この溶液にモニターウィルスとしてパルボウイルスを 105· 7コピーノ ml添加し た。
その後、 この試料を 15%グリシン一 1M塩化ナトリウム分画に供し、 フイブリノゲ ンを遠心 （4, 000 r pm、 20分間） により沈殿させて回収した。 次いで回収 されたフイブリノゲンを 1.0Lのタエン酸緩衝液に溶解し、 1.0%溶液を調製した。 この溶液を濾過前のサンプルとしてそのウィルス量を測定した。
得られた溶液をプラノパ 75N (平均孔径 72 ±4 nm) を用いた温度 23°C、 濾過圧 10 k p a、 デットェンド濾過法に供しウィルス除去を行なった。 この濾液 を濾過後のサンプルとしてそのウィルス量を測定した。
実施例 3
正常ヒ ト血漿由来のコーンの F r · I画分 100 gを 1.5Lの生理食塩水で溶解し、 トリー （n—プチル） ホスフェート （TNBP) を 0. 3wノv%及ぴTwe e n 80を 1 wZv%になるように添加し、 30°Cにて 6時間の界面活性剤処理を行な つた。
界面活性剤処理後の試料にモニタ一ウィルスとしてパルボウイルスを添加した。 その後、 この試料を 15%グリシン一 1M塩化ナトリゥムによる沈殿分画処理にて、 フイブリノゲンを遠心 （4， 000 r pm、 20分間） により沈殿させて回収した 。 次いで回収されたフイブリノゲンを 1.0Lのクェン酸緩衝液に溶解し、 1.0%溶液 を調製した。 この溶液を濾過前のサンプルとしてそのウィルス量を測定した。 また 、 同時にこの溶液を濾過前のサンプルとしてその蛋白質量を測定するため 2 80 η mにおける吸光度を測定した。
この溶液をプラノバ 7 5 N (平均孔径 7 2 ±4 nm) を用いた温度 2 3°C、 濾過 圧 l O k p a、 デットェンド濾過法に供しウィルス除去を行なった。 この濾液を濾 過後のサンプルとしてそのウィルス量を測定した。 また、 同時にこの濾液の蛋白質 量を 2 80 nmにおける吸光度として測定した。
次に、 この濾液を更にプラノバ 3 5 N (平均孔径 3 5 ± 2 nm) を用いた温度 2 3°C、 濾過圧 1 0 k p a、 デットエンド濾過法に供しウィルス除去を行なった。 こ の濾液を濾過後のサンプルとしてそのウィルス量を測定した。 また、 同時にこの濾 液の蛋白質量を 2 8 0 nmにおける吸光度として測定した。
この場合、 プラノノ 7 5 Nとプラノバ 3 5 Nを組み合わせた濾過によりその前後 で 1 06コピー Zm 1以上のウィルス除去効果を示した。
実施例 4
正常ヒ ト血漿由来のコーンの F r . I画分 100 gを 1.5 Lの生理食塩水で溶解し、 トリー （n—ブチル） ホスフェート （TNB P) を 0. 3wZv%及び Tw e e n 8 0を 1 w/ V %になるように添加し、 3 0°Cにて 6時間の界面活性剤処理を行な つた。
界面活性剤処理後の試料にモニターウィルスとしてパルボウイルスを 1 010· 1コ ピー/ m l添加した。
その後、 この試料を 8%グリシン一 1M塩化ナトリゥムによる沈殿分画処理にて、 フイブリノゲンを遠心 （4， 00 0 r pm、 20分間） により沈殿させて回収した 。 次いで回収されたフイブリノゲンを 1. 5Lの注射用水で溶解し、 フイブリノゲン 溶液を調製した。 この溶液中の不溶物を遠心処理にて除去した後、 0. 9 g/Lの 塩化ナトリゥムを添加して濾過前のサンプルとした。
この溶液をプラノバ 3 5 N (平均孔径 3 5 ± 2 nm) を用いた温度 2 3°C、 濾過 圧 1 0 k p a、 デットエンド濾過法に供した。 この濾液を濾過後のサンプルとして そのウィルス量を測定した。
この場合、 グリシン—塩化ナトリウム分画、 沈殿の水抽出、 遠心除去およぴプラ ノバ 3 5 Nを組み合わせた処理によりその前後で 1 06コピ一 Zm 1以上のウィルス 除去効果を示した。
実施例 5
正常ヒ ト血漿由来のコーンの F r . I画分 100 gを 1.5 Lの生理食塩水で溶解し、 トリー （n—ブチル） ホスフェート （TNB P) を 0. 3wZv%及び Tw e e n 80を 1 w/v%になるように添加し、 30°Cにて 6時間の界面活性剤処理を行な つた。
界面活性剤処理後の試料にモニターウィルスとして EMCを 1 08· 4TC I D5。 /m 1添加した。
その後、 この試料を 8%グリシン一 1M塩化ナトリゥムによる沈殿分画処理にて、 フイブリノゲンを遠心 （4， 000 r pm、 2 0分間） により沈殿させて回収した
。 次いで回収されたフイブリノゲンを 1. 5 Lの注射用水で溶解し、 フィプリノゲ ン溶液を調製した。 この溶液中の不溶物を遠心処理にて除去した後、 0. 9 gZL の塩化ナトリゥムを添加して濾過前のサンプルとした。
この溶液をプラノバ 3 5 N (平均孔径 3 5 ± 2 nm) を用いた温度 2 3°C、 濾過 圧 1 0 k p a、 デットェンド濾過法に供した。 この濾液を濾過後のサンプルとして そのウィルス量を測定した。
この場合、 グリシン—塩化ナトリウムによる沈殿分画処理、 沈殿の水抽出、 遠心 除去およびプラノバ 3 5 Nを組み合わせた処理によりその前後で 1 04TC I D5。Z m 1以上のウィルス除去効果を示した。 参考例 1
正常ヒ ト血漿由来のコーンの F r . I画分 100 gを 1.5 Lの生理食塩水で溶解し、 TNB Pを 0. 3 V %及び Tw e e n 80を 1 wZ v %になるように添加し、 30°Cにて 6時間の界面活性剤処理を行なった。
その後、 この試料を 15。/0グリシン一 1M塩化ナトリウムによる沈殿分画処理にて、 フイブリノゲンを沈殿させて回収した。 次いで回収されたフイブリノゲンを 1.0Lの クェン酸緩衝液に溶解し、 1.0%溶液を調製した。
この溶液にモニターウィルスとしてパルボウイルスを 1010· 7コピー Zm 1添加 した。
また、 この溶液を濾過前のサンプルとしてそのウィルス量を測定した。
この溶液をプラノバ 75 N (平均孔径 72 ±4 nm) を用いた温度 23°C、 濾過 圧 1 0 k p a、 デットェンド濾過法に供しウィルス除去を行なった。 この濾液を濾 過後のサンプルとしてそのウィルス量を測定した。
参考例 2
参考例 1の方法中、 モニターウィルスとしてパルボウイルスを 1 01 7コピー Z m】添加し、 その後この溶液をブラノバ 35 N (平均孔径 35± 2 nm) を用いた 温度 23°C、 濾過圧 10 k p a、 デットェンド濾過法に供した以外、 参考例 1と同 様に処理を行ない各試料のウィルス量を測定した。
参考例 3
正常ヒ ト血漿由来のコーンの F r . I画分 100 gを 1.5 Lの生理食塩水で溶解し、 トリ一 （n—プチル） ホスフェート （TNB P) を 0. 3w/v%及びTwe e n 80を 1 wZv%になるように添カ卩し、 30°Cにて 6時間の界面活性剤処理を行な つた。
その後、 この試料を 15%グリシン一 1M塩化ナトリゥムによる沈殿分画処理にて、 フイブリノゲンを沈殿させて回収した。 次いで回収されたフイブリノゲンを 1.0Lの クェン酸緩衝液に溶解し、 1.0%溶液を調製した。
この溶液にモニターウィルスとしてパルボウイルスを 105· 7コピー Zm 1添加し た。
この溶液をプラノパ 7 5 N (平均孔径 7 2 ± 4 n m) を用いた温度 2 3°C、 濾過 圧 1 0 k p a、 デットェンド濾過法に供しウィルス除去を行なった。 この濾液を濾 過後のサンプルとしてそのウィルス量を測定した。
次に、 この濾液を更にプラノバ 3 5 N (平均孔径 3 5 ± 2 nm) を用いた温度 2 3°C、 濾過圧 1 0 k p a、 デットエンド濾過法に供しウィルス除去を行なった。 こ の濾液を濾過後のサンプルとしてそのウィルス量を測定した。
ウィルス量の測定方法：
(1) パルボウイルスのウィルス量の測定は各試料についてウィルス核酸の残存量 をポリメラ一ゼチェーンリアクション （P CR) 測定法 （Transfusion Vol.32, p.824-828 (1992) ) によって測定した。 パルボウイルスの核酸量は 1 02コピー Z m 1で検出限界以下となる。
(2) EMCウィルス （encephalomyocarditis virus：月 心筋炎ウィルス） は V e r o細胞を使用した感染価 （TC I D50) を測定することにより評価した。
EMCウィルスの V e r o細胞に対する感染価は、 1 0 L5T C I D 5。/m 1で検 出限界以下となる。
上記の実施例 1〜 2、 4〜 5および参考例 1〜 3の結果を表 1に示す。
蛋白質量の測定方法
各試料を生理食塩液で適当に希釈し、 2 8 0 nmにおける吸光度を測定した。 上 記の実施例 3の結果を表 2に示す。
前処理 多孔性膜 ウィルス量
フィルタ 7 5 n m 3 5 n m
濾過前 濾過後 濾過前 濾過後
(孔径） (添加時） （添加時） 実施例 1 グリシン一 ί m 1 027 検出限界 一 一
塩化ナトリ 以下
ゥム (パルボ B 1 9 ： コピ一 Zm 1 ) 実施例 2 グリシン一 5 n m 1 057 検出限界 一 一
塩化ナトリ 以下
ゥム (パルボ B 1 9 ： コピ一 1 ) 実施例 4 グリシン一 ύ o n m 一 - 1 0101 検出限界 塩化ナトリ 以下 ゥム (パルボ B 1 9 ： コピー Zm 1 )
+水抽出
実施例 5 グリシン一 ^ o n m 一 一 1 084 検出限界 塩化ナトリ 以下 ヮム (EMC ： T C I D 5。Zm 1 )
+水抽出
参考例 1 なし 7 5 n m 1 0八 11Π7 1 0 n 7 ― 一
(パルボ B 1 9 ： コピー Zm 1 ) 参考例 2 なし 3 5 n m 一 ― 1 0117 1 0117
(パルボ B 1 9 ： コピー Zm 1 ) 参考例 3 なし 75 n m 1 057 1 057 1 057 1 057
+ 35 n m (パルボ B 1 9 ： コピー 1 ) 表 2
Figure imgf000018_0001
産業上の利用分野
本発明により血漿蛋白組成物を多孔性膜処理することによって、 蛋白の活性を殆 ど失うことなく、 効率よく血漿蛋白中の夾雑ウィルスを除去することができる。 従 つて、 本発明によってウィルス感染性の危惧のない血漿蛋白を提供することができ る。 特に、 本発明の多孔性膜処理により非エンベロープウィルス、 とりわけパルボ ウィルスおよび Zまたは A型肝炎ウィルスを実質的に含まないフイブリノゲン組成 物を提供することができる。
本出願は、 日本で出願された平成 1 1年特許願第 3 6 0 9 5 0号を基礎としてお り、 それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲
I . 血漿蛋白組成物をウィルス単粒子径より孔径の大きな多孔性膜処理に付すェ 程を有することを特徴とするウィルスの除去された血漿蛋白組成物の製造法。
2 . 多孔性膜が多孔性中空糸膜である請求の範囲 1記載の製造法。
3 . 多孔性膜処理前に血漿蛋白組成物を沈殿法分画処理に付すことを特徴とする 請求の範囲 1または 2記載の製造法。
4 . 多孔性膜処理に付す前に、 血漿蛋白組成物を沈殿法分画処理に付し、 得られ た沈殿を水抽出する工程を有することを特徴とする請求の範囲 1〜 3のいずれかに 記載の製造法。
5 . 血漿蛋白組成物がフイブロネクチン、 フイブリノゲン、 凝固 V因子、 凝固 V I I I因子、 フォンビルブランド因子、 凝固 XIII因子、 レチノ一ル結合蛋白質、 ひ グロブリン、 βグロプリンおよび γグロブリンから選ばれる少なくとも一種の蛋白 質を含有するものである請求の範囲 1〜4のいずれかに記載の製造法。
6 . 血漿蛋白組成物が少なくともフイブリノゲンを含有するものである請求の範 囲 5に記載の製造法。
7 . ウィルスが非エンベロープウィルスである請求の範囲 1〜 6のいずれかに記 載の製造法。
8 . 非ェンベロ一プウイルスがパルボウィルスおよび/または Α型肝炎ゥィルスで ある請求の範囲 7記載の製造法。
9 . ウィルス単粒子径より孔径の大きな多孔性膜処理に付すことにより当該ウイ ルスが実質的に除去された血漿蛋白組成物。
1 0 . 多孔性膜が多孔性中空糸膜である請求の範囲 9記載の血漿蛋白組成物。
I I . 多孔性膜処理前に血漿蛋白組成物を沈殿法分画処理に付することを特徴と する請求の範囲 9または 1 0に記載の血漿蛋白組成物。
1 2 . 多孔性膜処理前に血漿蛋白組成物を沈殿法にて分画処理し、 得られた沈殿 を水抽出することを特徴とする請求の範囲 9〜 1 1のいずれかに記載の血漿蛋白組 成物。
1 3 . 血漿蛋白組成物がフイブロネクチン、 フイブリノゲン、 凝固 V因子、 凝固 V I I I因子、 フォンビルブランド因子、 凝固 XIII因子、 レチノール結合蛋白質、 αグロプリン、 βグロブリンおよび γグロブリンから選ばれる少なくとも 1種の蛋 白質を含有するものである請求の範囲 9〜1 2のいずれかに記載の血漿蛋白組成物
1 4 . 血漿蛋白組成物が少なくともフィプリノゲンを含有するものである請求の 範囲 1 3に記載の血漿蛋白組成物。
1 5 . ウィルスが非エンベロープウィルスである請求の範囲 9〜 1 4のいずれか に記載の血漿蛋白組成物。
1 6 . 非エンベロープウィルスがパルボウイルスおよびノまたは Α型肝炎ウィルス である請求の範囲 1 5に記載の血漿蛋白組成物。
1 7 . パルボウイルスを実質的に含まないフイブリノゲン組成物。
1 8 . 血漿蛋白組成物をウィルス単粒子径より孔径の大きな多孔性膜処理に付す ことを特徴とする血漿蛋白組成物中のウィルスの除去方法。
1 9 . 多孔性膜が多孔性中空糸膜である請求の範囲 1 8記載の方法。
2 0 . 多孔性膜処理前に血漿蛋白組成物を沈殿法分画処理に付すことを特徴とす る請求の範囲 1 8または 1 9記載の方法。
2 1 . 多孔性膜処理に付す前に、 血漿蛋白組成物を沈殿法にて分画処理し、 得ら れた沈殿を水抽出する工程を有することを特徴とする請求の範囲 1 8〜2 0のいず れかに記載の方法。
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