JPS60224626A - 基質を含まず、肝炎の心配のない、高純度のヒト及び動物ヘモグロビン溶液の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は基質を含まず、肝炎の心配のない高゛純度のヒ
ト及び動物ヘモグロビン溶液の製造方法に関する。

ヘモグロビン溶液は生体内で赤血球に関係なく酸素を輸
送できる状態にある。しかし、この溶液の適合性を良好
にするために、溶血によってヘモグロビンを放出させる
血液の血漿及び細胞成分（血漿蛋白質、基質等）をでき
るだけ完全に除去することが必要である。

ヘモグロビン溶液の製造には種々な方法が用いられてい
る。

全ての方法の第１段階では、血漿蛋白質を除去するため
に、赤血球の洗浄が行なわれる。

今までに公知の大部分の方法では、例えば西ドイツ特許
明細書第２２４８４７５号によるように、赤血球に等張
性電解質溶液を加え、遠心分離によって赤血球を分解し
ている。

西ドイツ特許出願公開明細書第３１３０７７０号には、
赤血球を洗浄するために沈降を利用する、工業的規模の
製造に適した方法が述べられている。

全ての製造方法に共通した次の段階は、基質成分の分離
を伴う赤血球の溶血であり、基質成分の分離はヘモグロ
ビンのン濾過、遠心分離、再結晶によってまたはこれら
の方法の組合せによって行なわれる［西ドイツ特許出願
公開明細書第３１３０７７０号、デ・ベヌート（Ｄｅ　
Ｖｃ、ｎｕｔｏ）等、「ヘモグロビン溶液の代用血液と
しての承認」、外科、婦人科及び産科、（Ｓｕｒｇｅｒ
ｙ、　Ｇｙｎｅｃｏ　ｌｏｇｙ＆　０ｂｓｔｅｔｒｉｃ
ｓ）　１９７９年９月号、４１７〜４３６頁；エフ・デ
ー・ベヌート（Ｆ、Ｄｅ　Ｖｅｎｕｔｅ　）等、結晶化
によって製造した、基質を含まないヘモグロビン（７）
特性Ｊ　、　Ｊ、Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ、Ｈｅｄ、、　１９
７７年３月号、５０９〜５１６頁；マリオ　フエオラ（
Ｈａｒｉｏ　Ｆｅｏｌａ　）等、「代用血液としての、
基質を含まないウシへモグＯビンン溶液の開発」、外科
、婦人科及び産科、１９８３年１１月号］。

残留基質の脂質は場合によっては血液凝固に影響を与え
、腎障害を惹起しうるので、基質をできるだけ完全に分
離することが特に重要である。

今までヘモグロビン溶液の製造に用いられた方法は全て
、さらに決定的な欠点を有している。

今までに実施された方法による赤血球の洗浄では、まだ
血漿蛋白質を含む製品が得られる。また赤血球の反復洗
浄またはヘモグロビンの再結晶による血漿蛋白質の完全
除去は収量のかなりの低下をもたらすので、大ぎな工業
的規模の場合には不経済である。

この理由から、ヒトの医療に使用しうるようなヘモグロ
ビン溶液を動物血から製造することは従来の方法では不
可能であった。何故ならば、溶液中に残留蛋白質が存在
するとじ１〜にこの溶液を用いた場合に免疫反応が生ず
るおそれがあるからである。

本発明は、血漿蛋白質及び残留基質の脂質を含まず、ヒ
トの治療用に適した高ＩｉＩ！度ヘモグロビン溶液をヒ
ト血からのみでなく動物血からも、臨床用途に必要とさ
れるような大ｍの製造を可能にするような方法を提供す
るという課題に基づくものである。

この課題は本発明に従って次のように解決される。即ち
、 イ）赤血球含有出発物質を孔径０．１〜１．２岬の透過
フィルター・ユニットを通して等張付洗浄溶液と向流で
ポンプによって循環させ、このときに使用済み洗浄溶液
をン濾過として連続的に取り出し、新しい洗浄溶液を補
充し、口）このように洗浄され、濃縮された赤血球をフ
ィルターから回収し、本来公知の方法で溶血し、溶血物
を殆ど一定量で、８０．０＜１０〜１００、ＯＯＯ［）
の透過性を有する透過限外濾過ユニットを通しこれに対
して向流でポンプによって循環させ、 ハ）段階口）で限外ン戸液として生じた稀薄なヘモグロ
ビン溶液を殆ど一定量で、透過性１０．０００〜５０，
０ＯＯＤの透過限外濾過ユニットを通して水と向流でポ
ンプによって循環させ、透析濾過するが、このときに透
析の前及び／または後に同じ限外濾過ユニットを通して
、水と向流させることなく、ヘモグロビンが所。

望の値に濃縮されるまで、ポンプによって循環させる。

本発明により、濾過と孔径の小さいフィルター膜との組
合わせによって、赤血球から血漿蛋白質を除去し、細胞
溶解後に赤血球外被を完全に除去し、ヘモグロビンをこ
のましからざる随伴物質から浄化することが可能となる
。

添附図面に従って更に詳細に説明する。

第１図中において、等強性電解質溶液１０は、管１８を
通過して、容器１２から赤血球１６を収容する容器１４
へと通される。ポンプ２０は溶液を、管２２を介して容
器１４から回収し、それを膜フイルタ−２４へと送給す
る。溶解蛋白質を含む洗浄液は該フィルター２４から開
口２６で回収され、一方、赤血球を含む洗浄液は管２８
を介して容器１４に戻される。容器１４とフィルター２
４とを介するこの等張性溶液の循環は所定の蛋白質除去
レベルに達するまで所望の限り続けられる。

この場合に、例えばラッカー顔料の回収に通常用いられ
るような工業用ポンプ及び工業用濾過モジュールを用い
ることができる。

周知のように、赤血球はごく軽度の溶面を受けるため、
当業者は赤血球をできるだけきれいに洗浄し、溶血を避
けることに常に努力している。蓄積された古い赤血球濃
縮液は特に溶血に対して敏感である。

従って、当業者にとって精製処理法として特別なものに
思われない、工業用フィルターモジュールを通す工業用
ポンプを用いた循環ポンプにおいて溶血が殆ど行なわれ
ないことは全く画期的なことであり、特に例えば献血か
ら２週間たったような蓄積された赤血球濃縮液の使用に
とっては驚くべきことである。

このように、本発明による方法は動物及びヒトからの新
鮮な全血に対してのみでなく、蓄積されたヒト赤血球濃
縮液に対しても、取るに足るほどの溶血を起すことなく
用いられるものである。

この第１工程によって、短時間に多量の洗浄溶液を赤血
球と接触させ、再び循環から取出す゛ことによって、強
度の洗浄を行なうことが可能になる。

洗浄溶液としては、如何なる等強性電解質溶液ならびに
穂または糖アルコールの等張性溶液も適しているが、特
に好ましい洗浄溶液は等優性ＮａＣｌ溶液である。

フィルター面積を拡大することによって、任意の赤血球
量を洗浄することができるため、この方法はヘモグロビ
ン溶液の工業的規模の製造に適している。

使用するフィルターは平坦な繊維膜および中空繊維膜の
いずれでも良いが、中空繊維、Ｉ！は平坦な繊維膜より
も大きな面積を小容積で有するので、中空繊維膜が好ま
しい。

膜の平均孔径は０．１〜１．２ＩＩＲの範囲であり、こ
の下限未満では血漿蛋白質が赤血球と共に保持され、上
限を超えると溶血速渡が大きく上昇する。平均孔径０．
４〜ｏ、　８ｆｉの膜を使用するのが特に好ましい。

濾過圧力は５０〜７００ｍｂａｒの範囲であることが好
ましい。

この循環洗浄は血漿蛋白質がもはや検出されなくなるま
で行なう。

上述のように赤血球を洗浄した後に、濃縮した赤血球を
２〜３倍量の水中に導入することによって、溶血を行な
う。

第２図に示した第２及び第３工程はヘモグロビンからの
基質の分離を説明するものであり、溶血の直後に第２か
過段階において赤血球から遊離したヘモグロビンが赤血
球基質から分離される。溶血物３０を水３１に対して強
度に透析濾過するが、この際には８０．０００〜１００
，０ＯＯＤの透過性を荷重る限外濾過ユニット３２を用
いる（平坦膜または中空繊維膜、特に中空ｍ雑膜製のも
の）このことは、溶血物３０が殆ど一定量で限外か過ユ
ニット３２を通してポンプ３３によって循環させられ、
６４．５００の分子量を有するヘモグロビンが８０，０
００〜１００，０ＯＯＤ以下の分子量を有する全ての随
伴物質とともに限外濾過中に現われることを意味する。

この方法の利点は、ヘモグロビンの大部分が赤血球基質
と共に廃棄されていた今までの公知の方法とは対照的に
、存在する溶血物から殆ど全てのヘモグロビンを回収す
ることができることである。

この第２濾過段階で限外か液として生ずる稀薄なヘモグ
ロビン溶液３４を第２か過段階において、第２ｉ濾過と
並行してポンプ３５を介して濃縮する。１０．０００〜
５０．ＯＯＯ［）の透過性を有する限外か過ユニット３
６を再び用いるならば、ヘモグロビンが留保されること
によって、ヘモグロビンが濃縮されるとともに、使用し
た膜の前記の透過能以下の分子層を有する随伴物質の一
部が１でに除去される。ヘモグロビンが所望の濃度にま
で濃縮されるや否や、完全に濃縮するために、低分子の
随伴物質を水３１に対して新たに透析濾過する。

しかし、実際には第３か過段階の如何なる箇所において
も透析か過を行なうことができる。

例えば、最初に透析濾過し、次に濃縮するか、またはこ
の逆を行なうことができる。しかし、透析ｉ濾過のため
にはヘモグロビン溶液量が多すぎてもまた溶液がｍ厚す
ぎてもいけないので、透析濾過は第３段階のほぼ中央で
行なうのが好ましい。すなわちヘモグロビン溶液を最初
に成る濃度にまで濃縮し、次に透析濾過し、その後に望
ましい最終濃度に調節する。

第２及び第３７濾過段階のか過圧力は、その都度の対応
フィルターモジュールに対して許容される最大圧力によ
って、制限を受ける。この最大圧力は製造者によってモ
ジュールに記載される。

例えば西ドイツ特許明細書第２４４９２５２号、第２６
１７８２２号及び第２７１４２５２号に述べられている
ように、通常の方法によって改質ヘモグロビン溶液に加
工することのできる、望ましい濃度の高純度ヘモグロビ
ン溶液が得られるが、前述の文献は改質のみに関するも
のであり、浄化に関するものではない。

３段階の全てにおける濾過は云わゆる接線力゛向の透過
濾過である。通常のか過では、清適すべき物質が非常に
迅速に孔を閉塞してしまうことになる。

水としては脱イオン水または蒸溜水を用いることが好ま
しい。

すでに前述した刊行物の中でマリオ・フＪオラ（Ｈａｒ
ｉｏ　Ｆｅｏｌａ　）等が述べているヘモグロビン溶液
の製造法も確かに２段階を含むものであり、溶血物を次
々に、１００，０００［）及び３０，０ＯＯＤの透過性
を有するフィルターに通している。しかし、彼らの方法
では先行の赤血球洗浄を電解質溶液による通常の方法で
行なっているため、血漿蛋白質の完全な分離が行なわれ
ていない。

さらに、最後の３０．ＯＯＯ［）濾過からの限外か液を
電解質に対して透析しているため、得られたヘモグロビ
ン溶液が高い電解質含量を有する結果になり、このこと
は例えば心臓切開手＃ｌ（心臓麻痺）における冠血管の
Ｗｌ流のような特定の用途に対しては不利である。

これに反して、第２及び第３工程で水に対して透析濾過
する本発明の方法によると、実際に電解質を含まない製
品が得られる。Ｒ後に、全ての粗粒の細胞成分をまだ含
りする溶血物を１００．０ＯＯＤフイルターで直接濾過
すると、このフィルターが非常に迅速に閉塞することが
専門家に当然考えられるので、溶血を行なった後の２つ
の限外か過に０．５声の孔径を有するフィルターによる
か過を前置させる。しかし、本発明によって溶血物を１
００，０ＯＯＤフイルターに通して水と向流でポンプに
よって循環させるならば、フィルター閉塞が生ぜず、孔
径のより大きいフィルターによる溶血物の前＠ン濾過段
階を省略できることが意外にも見出された。

本発明による複合方法の利点は１つには技術的に簡単に
実施できることであり、これに伴ってこれまでの方法に
比べてかなりの時間の節約及びヘモグロビン収率の上昇
が得られる。他の利点としては、このようにして得られ
たヘモグロビンの純度が高いためにヒトの治療用の改質
ヘモグロビン溶液の製造に動物血を用いること゛がおそ
らく可能になることが考えられる。さらに、本発明によ
る製品は実際に電解質を含んでいす、また本発明の方法
は出発物質中に場合によっては存在する細菌またはウィ
ルスを明らかに減少させるため、従来の方法から公知の
、例えばβ−プロピオラクトンによる殺菌（例、えば、
西ドイツ特許明細書第２２４８４７５号、西ドイツ特許
出願公開明細書第３１３０７７０号）を省略することが
可能である。しかし、特別な場合には１本発明による方
法においても事情に応じて、赤白球洗浄中にβ−プロピ
オラクトン処理を実施する。

以下の実施例は本発明をさらに詳細に説明するものであ
る。

実施例１ 安定化した新鮮なウシ血液５１を血液フィルターを通し
て濾過して、５１入容器に収容した。

この血液を孔径０．４声及び総面積１Ｔｄの２個の中空
繊維ン濾過カートリッジを通してｒｋｉ液ポンプによっ
て循環させた。この循環からか去されたＭの代りに、絶
えず０．９％ＮａＣ１溶液を補充した。

血漿蛋白質をほぼ完全に除去するために、ＮａＣｌ溶液
５０１（出発ｍの１０倍）を用いて洗浄した。平均か過
圧力は２６６１ｂａｒであった。洗浄は３時間で終了し
た。つぎに赤血球を２．５Ｑに濃縮した。この赤血球潮
縮物を蒸溜水５ｆｉ中で攪拌し、このときい溶血を惹起
させた。基質を除去するために、この溶血物を透過性１
０００．０００Ｄ（７）２個ノ中空ｒｊＡＮカートリッ
ジ（１，８Ｔｄ）ヲ通してポンプによって循環させた。

ヘモグロビン（分子ｆｆｉ　６４５００）はこの膜を通
過するが、基質成分及びｈ分子ｍ物質は留保された。蒸
溜水を絶えず添加することによって、循環量を一定に保
持した。３０ｆｔの限外炉液中に全ヘモグロビンの約９
５％が含有されていた。限外炉液５１が得られるや否や
、量を一定に保ちながらヘモグロビンを、透過性１０，
０ＯＯＤ　（１，８ｍ　）の２個の中空ｌ！雑カートリ
ッジが存在する他の循環系で濃縮した。基質分離が終了
し、５１量中に全ヘモグロビンの９５％が存在するよう
になるや否や、低分子量成分を除去するために、１０，
０ＯＯＤの透過性を有する同じ限外か過ユニットを通し
て蒸溜水２５１に対して透析濾過した。最後の段階では
、同じ循環でヘモグロビンを２２％までに濃縮した。次
にこの溶液を０．２虜フイルターを通して無菌化した。

収率は８０％であった。

実施例２ ヘモグロビン溶液から血漿蛋白質が完全に除去されてい
ることは、免疫電気泳動に基いて及び動物実験において
示された。これに加えて、フロインドアジュバント（ｒ
ｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｎＶａｎｔ）を用い、実施例１
で製造されたヘモグ［１ビン溶液によって、モルモット
を免疫化した。この動物の血漿中には、ヒト血漿蛋白質
及び動物の血漿蛋白質に対する抗体が検出されなかった
。

実施例３ 出発血液中に存在する病原菌が本発明の方法によって明
らかに減少することは、実験によっても示された。ヘモ
グロビン溶液の製造に用いた血液に約２５厘の直径を有
するΦｘ１７４ファージまたは２００ａｍの直径を有す
るにファージを１０’／ｄの濃度で加え１＝場合に、第
１濾過段階における１０倍ｍの洗浄溶液による赤血球の
洗浄によって、１０３〜１０４個のファージの減少が生
ずることが示された。

放出されたヘモグロビンが１００，０ＯＯＤの透過性を
有する限外ン濾過膜によってか遇される次のか過段階で
は、さらに１０３個／ｌｌ１１のファージがその直径に
基づいて膜を通過できないために、躾によって留保され
た。従って、添加したファージは約１０６個／＃１１！
減少した。すなわら１０個／ｄまでに低下した。通常の
血液銀行基準によって検査される輸血川面液は依然とし
て肝炎を伝染させうるので、この無菌化効果は特に重要
である。すでに前記で詳論したように、従来の方法では
化学的な殺菌処理が必要であった。

ここに述べたか過方法によると、このような化学的な殺
菌を省略することが可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、赤血球をフィルターユニットを通して等偏性
洗浄溶液と向流でポンプによって循環させる。本発明の
方法の第１工程の赤血球洗浄法の説明線図、第２図は、
本発明の方法の第２及び第３行程におけるヘモグロビン
からの基質の分離の説明線図である。 １０・・・等偏性洗浄溶液 １６・・・赤血球 ２４・・・孔径０．１〜１．２声の透過フィルターユニ
ット ３０・・・溶血物 ３１・・・水 ３２・・・ａｏ、　ｏｏｏ〜１００．ＯＯＯ［）の透過
性を有する透過限外濾過ユニット ３３・・・ポンプ ３４・・・稀薄なヘモグロビン溶液 ３５・・・ポンプ ３６・・・ｉｏ、ｏｏｏ〜ｓｏ、ｏｏｏ□の透過性を有
する透過限外濾過ユニット ３７・・・水 特許出願人　ビオテスト　ファルマ　ゲゼルシャフト　
ミツト　ベシュレンクタ ー　ハフラング 、Ｊｌ−゛ 代　理　人　北　村　欣　−他２名１・゛、イー２−／

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、基質を含まず、肝炎の心配のない、高純度のヒト及
   び動物ヘモグロビン溶液の製造方法において、 イ）赤血球を含有する出発物質を孔径０，１〜１．２声
   の透過フィルターユニットを通して、等張性洗浄溶液と
   向流で循環させ、使用済み洗浄溶液をか液として連続的
   に取り出し、新しい洗浄溶液を補充し、 ０）このように洗浄され、濃縮された赤血球をフィルタ
   ーから取り出し、本来公知の方法で溶血し、溶血物を殆
   ど一定量で、 ａｏ、ｏｏｏ〜１００．ＯＯＯ［）の透過性を有する透
   過限外濾過ユニットを通して水と向流でポンプによって
   循環させ、 ハ）段階口）で限外か液として生じた稀薄なヘモグロビ
   ン溶液を殆ど一定量で、１０，０００〜５０，０００［
   ）の透過性を有する透過限外濾過ユニットを通して水と
   向流でポンプによって循環させて透析濾過するが、この
   場合に透析か過の前及び／または後に同じ限外濾過ユニ
   ットを通して、水と向流でなく、ヘモグロビンが望まし
   い濃度に濃縮されるまで、ポンプによって循環させるこ
   とを特徴とする基質を含まず、肝炎の心配のない、高純
   度のヒト及び動物ヘモグロビン溶液の製造方法。 ２、段階ハ）において、ヘモグロビンが望ましい濃度に
   濃縮されるまで、最初にポンプによって循環させ、次に
   同じ限外濾過ユニットを通して水と向流で循環させて透
   析濾過し、次にヘモグロビンを望ましい最終濃度に調節
   することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の製
   造方法。 ３、段階イ）において、５０〜７００１ｂａｒの濾過圧
   力で操作することを特徴とする特許請求の範間第１項ま
   たは第２項に記載の製造方法。 ４１段階イ）の洗浄溶液として等偏性ＮａＣｌ溶液を用
   いることを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項
   のいずれか１項に記載の製造方法。 ５、段階イ）において０．４〜０．６声の孔径を有する
   ン濾過ユニットを用いることを特徴とする特許請求の範
   囲第１項乃至第４項のいずれが１項に記載の製造方法。 ６．３段階の全てにおいて、ン濾過ユニットまたは限外
   濾過ユニットとして中空ｍ線膜を用いることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項乃至第５項のいずれか１項に記
   載の製造方法。