JP5100956B2 - ヒトパルボウイルスｂ１９核酸の検出のためのアッセイ - Google Patents

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Description

関連出願
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）に基づいて、米国仮出願第６０／３１６，６９１号、２００１年８月３１日出願の優先権を請求する。
発明の分野
本発明は、ヒト感染性病原体を検出するための診断法および組成物に関し、そして具体的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏでパルボウイルスＢ１９の核酸を検出するための方法および組成物に関する。
発明の背景
ヒト・パルボウイルスＢ１９（時にエリスロウイルスとも呼ばれる）は、血液感染性のエンベロープ不含ウイルスであり、約５．５ｋｂの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを有する（Ｓｈａｄｅら， １９８６， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５８（３）：９２１−９３６、Ｂｒｏｗｎら， １９９７， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． ４８：５９−６７）。個々のウイルス粒子は、およそ同数に相当する、ゲノムのプラス鎖またはマイナス鎖いずれかを１コピー含有する。ｓｓＤＮＡゲノムは逆方向末端反復を有し、この反復配列が、ウイルス複製に必須の、約３５０ｎｔの５’ヘアピンおよび３’ヘアピンを形成する。該ゲノムは、構造タンパク質（ＶＰ１およびＶＰ２）および非構造タンパク質（ＮＳ１）をコードする、プラス鎖上の２つのオープンリーディングフレームを含む。
パルボウイルスＢ１９での感染は、呼吸器感染を介して、あるいは感染血液または血液製剤を通じて起こりうる。ウイルス血症は、接種後、約１週間で高レベル（例えば血液１ｍｌあたり１０11まで）に達しうるが、一般的に、感染後、約２週間以内で一掃される。感染個体は症状をまったく示さない可能性があるし、または穏やかなインフルエンザ様症状、発疹、および／または一時的な関節炎様の関節疼痛（関節症）を含む、伝染性紅斑症状を有する。小児は成人より発疹（「第五病」と呼ばれる）を発症しやすく、一方、関節症は成人で一般的な症状である。溶血性貧血患者における再生不良性発症、並びに免疫抑制患者における持続性のパルボウイルス感染および他の血液学的変化を含め、より深刻な問題が感受性患者で生じる。女性において、パルボウイルスＢ１９感染は、胎児死亡による初期妊娠の約１０％の喪失に関連付けられている。
パルボウイルスＢ１９は、例えば、血液、血清または血漿における感染性粒子を破壊するのに用いられる、化学薬品処理法または熱処理法によるウイルス不活性化に、比較的耐性である。また、試料中のウイルスが高濃度であると、試料からウイルス汚染を除去するのに用いられるウイルス枯渇法が圧倒される可能性がある。汚染された輸血または血液製剤を投与された、さらなる個体が、血液、血漿または血漿由来製剤中のパルボウイルスＢ１９に感染する可能性がある。しばしば、献血された血液のプール（例えば個々の献血された血液の数千のプール）から、血漿製剤が作成され、献血された単一の汚染血液がプールおよびそれに由来する製剤を汚染させうるリスクが生じる。したがって、献血された血液または血漿などの生物学的試料において、ヒト・パルボウイルスＢ１９の存在を検出して、さらなる感染を予防する必要がある。また、感染初期に、または希釈試料もしくはプール試料において起こる可能性があるように、低力価のウイルスの検出を可能にする感度で、パルボウイルスを検出するアッセイに関する必要性もある。適切なレベルで汚染を検出する、パルボウイルスＢ１９核酸に関するアッセイは、感染した輸血単位を血液供給から除去するか、または使用前のプール血漿の汚染されたロットを除去するのを容易にすることが可能である。
パルボウイルスＢ１９で潜在的に汚染されている血液、血清または血漿を同定するのに、免疫診断法が使用されてきている。多くの方法は、個体の血清または血漿に存在する抗パルボウイルス抗体（ＩｇＭまたはＩｇＧ）を検出する（例えばＷｏｌｆらによるＰＣＴ第ＷＯ ９６／０９３９１号およびＨｅｄｍａｎらによる第ＷＯ ９６／２７７９９号を参照されたい）。しかし、免疫学的方法は、感染性病原体に対する体の反応の検出に頼るため、最近の感染または現在の感染を検出するのには制限がある。感染後には迅速にウイルス血症が発生するため、抗パルボウイルス抗体が検出可能になる前でも、個体の血液が高レベルのパルボウイルスＢ１９を含有する可能性があり、これは偽陰性結果につながる。ウイルス血症は、しばしば、迅速に一掃されるため、感染性粒子が存在していない場合であっても、個体が抗体陽性のままである可能性もあり、これは偽陽性結果につながる。また、約９０％までの成人がパルボウイルスＢ１９に関して血清陽性であり、このため、最近の感染または現在の感染を正確に免疫学的方法で検出するのが困難である。他のアッセイは、精製細胞受容体に結合したウイルスまたは空のウイルスキャプシドを検出することによって、パルボウイルスＢ１９の存在を検出する（Ｙｏｕｎｇらに対する米国特許第５，４４９，６０８号）。
ヒト・パルボウイルスＢ１９を検出するのに、ＤＮＡハイブリダイゼーション法および増幅法が用いられてきた。Ｍｕｒｔａｇｈらに対する米国特許第５，６８８，６６９号は、ＰＣＲを用いることにより、パルボウイルスＢ１９の２８４ｂｐ部分を増幅して、そしてその後、増幅されたｄｓＤＮＡをエキソヌクレアーゼで消化し、ｓｓＤＮＡを作製することによる、パルボウイルスＢ１９の検出を記載する。ｓｓＤＮＡを２つの別個のオリゴヌクレオチドプローブ、捕捉プローブおよび検出プローブにハイブリダイズさせ、そして例えばマイクロタイタープレート中の比色アッセイを用いることによって、固体支持体上でハイブリッドを検出した。Ｗｅｉｍｅｒらに対する米国特許第６，１８３，９９９号は、血漿タンパク質溶液において、高力価のパルボウイルスＢ１９を検出する核酸増幅アッセイを開示する。最適でないアニーリング温度および伸長温度を用いて、ＮＳ１遺伝子中のＤＮＡを増幅することによって、該アッセイを用いて、試料における例外的に大量の病原性ウイルスの存在を示す。ＷｏｌｆらによるＰＣＴ第ＷＯ ９６／０９３９１号は、ＰＣＲ増幅された断片を連結することによる、ＮＳ−１タンパク質をコードする配列のクローニングを記載する。入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲおよび／またはドットブロットアッセイを用いて、患者血清中のパルボウイルスＤＮＡを検出し、そして結果を症状およびＮＳ−１タンパク質に対する体液性免疫反応と相関させた。ＮｇｕｙｅｎらによるＰＣＴ第ＷＯ ９９／２８４３９号は、パルボウイルスＢ１９のゲノム配列、並びに診断剤および免疫原剤として有用な断片を開示する。ＢａｒｒｅｔｔらによるＰＣＴ第ＷＯ ９９／４３３６２号は、ＰＣＲ増幅に基づく定量的試験を開示して、病原体を除去するためのろ過後、血漿タンパク質がヒト・パルボウイルスＢ１９を含まないことを立証した。ＬａｚｏらによるＰＣＴ第ＷＯ ０１／０６０１９号は、ヒトおよびブタ・パルボウイルス配列にハイブリダイズ可能な、ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列を開示する。これらのオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応において、パルボウイルスＤＮＡのＮＳおよびＶＰ領域中の部分を増幅するプライマーとして、そして増幅された配列を検出するプローブとして、働くことが可能である。ヒト・パルボウイルスＢ１９ ＤＮＡと同時精製され、そして同時増幅される内部対照として、ブタ・パルボウイルスが試料中に導入される。ＺｅｒｌａｕｔｈらによるＰＣＴ第ＷＯ ０１／１４５９３号は、あらかじめ決定した、異なる検出感度を有する、２つの核酸増幅プロセスを用いることによって、プールした生物学的試料中の、パルボウイルスＢ１９などの汚染微生物を検出する方法であって、汚染試料を同定しそして除去するのに用いる前記方法を開示する。該アッセイはまず、核酸増幅を用いて、第一の検出限界で、微生物核酸の存在を検出することによって、多数の試料を合わせたアリコットで構成されるスクリーニングプールを試験する。次に、第一の検出限界に比較して、より感受性でない検出限界を有する第二の核酸増幅を用いることによって、陽性スクリーニングプール由来のサブプールを試験する。この方法の一例は、パルボウイルスＢ１９ ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を用い、そして蛍光標識プローブを用いて検出することによって血漿を試験した。
ＴｉｊｓｓｅｎらによるＰＣＴ第ＷＯ ０２／００９２４号は、ウイルス・ホスホリパーゼＡ2タンパク質または関連ポリペプチドをコードする配列を含有する、ヒト・パルボウイルスを含む多様なパルボウイルスに由来する核酸配列を開示する。これらは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含めて、ウイルス・ホスホリパーゼＡ2活性または発現を阻害可能な剤を同定するのに有用であり、または遺伝子療法用に改善された組換えベクターを作製するのに有用である。
ＳｕｇａｍｕｒａらによるＪＰ ０４０８８９８５は、ＰＣＲを用いて、クローニングベクターに組み込まれたＤＮＡ断片を増幅することによってクローニングされた、ヒト・パルボウイルスＢ１９タンパク質ＶＰ−１をコードする、クローニングされた遺伝子を開示する。
発明の概要
本発明の１つの側面は、少なくとも２つの別個の核酸オリゴマーの組み合わせであって、オリゴマーが：配列番号４、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって該配列の５’末端につながれたプロモーター配列を含む前記配列、配列番号６、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって該配列の５’末端につながれたプロモーター配列を含む前記配列、配列番号８、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって該配列の５’末端につながれたプロモーター配列を含む前記配列、配列番号１０、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって該配列の５’末端につながれたプロモーター配列を含む前記配列、配列番号１２、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって該配列の５’末端につながれたプロモーター配列を含む前記配列、配列番号２４、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって該配列の５’末端につながれたプロモーター配列を含む前記配列、配列番号２６、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって該配列の５’末端につながれたプロモーター配列を含む前記配列、配列番号１３、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、配列番号１４、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、配列番号１５、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、配列番号１６、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、配列番号１７、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって該配列につながれた検出可能標識を持つ前記配列、配列番号１８、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって該配列につながれた検出可能標識を持つ前記配列、配列番号２７、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって該配列につながれた検出可能標識を持つ前記配列、配列番号２８、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって該配列につながれた検出可能標識を持つ前記配列、配列番号３０、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって該配列につながれた検出可能標識を持つ前記配列、配列番号３１、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって該配列につながれた検出可能標識を持つ前記配列、配列番号３２、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって該配列につながれた検出可能標識を持つ前記配列、配列番号３４、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって該配列につながれた検出可能標識を持つ前記配列、配列番号３６、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって該配列につながれた検出可能標識を持つ前記配列、配列番号３７、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって該配列につながれた検出可能標識を持つ前記配列、配列番号１、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、および場合によって、パルボウイルス標的配列に非特異的な３’テール部分、配列番号２、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、および場合によって、パルボウイルス標的配列に非特異的な３’テール部分、配列番号２０、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、および場合によって、パルボウイルス標的配列に非特異的な３’テール部分、並びに配列番号２１、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、および場合によって、パルボウイルス標的配列に非特異的な３’テール部分からなる群より選択される、前記組み合わせである。１つの態様において、組み合わせは：配列番号１３、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、配列番号２４、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって該配列の５’末端につながれたプロモーター配列を含む前記配列、配列番号２７、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって該配列につながれた検出可能標識を持つ前記配列、および配列番号２８、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって該配列につながれた検出可能標識を持つ前記配列からなる群より選択される。プロモーター配列がオリゴマー配列の５’末端につながれている態様において、好ましいプロモーター配列は配列番号１９である。
本発明の別の側面は、配列番号２９に含有される標的特異的配列、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、および場合によって、パルボウイルス標的配列に非特異的な３’テール部分からなる、核酸オリゴマーである。１つの態様において、該オリゴマーは、配列番号２０の標的特異的配列、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、および場合によって、パルボウイルス標的配列に非特異的な３’テール部分を含有する。別の態様において、該オリゴマーは、配列番号２１の標的特異的配列、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、および場合によって、パルボウイルス標的配列に非特異的な３’テール部分を含有する。さらに別の態様は、配列番号４１の標的特異的配列、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、および場合によって、パルボウイルス標的配列に非特異的な３’テール部分を含有する、オリゴマーである。
本発明の１つの側面は、配列番号１に含有される、少なくとも２５の隣接する塩基の標的特異的配列、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、および場合によって、パルボウイルス標的配列に非特異的な３’テール部分からなる、核酸オリゴマーである。
本発明の別の側面は、配列番号３３に含有される配列、その相補配列、またはＲＮＡ均等物からなる、核酸オリゴマーである。１つの態様において、該オリゴマーは、配列番号４０からなる配列、その相補配列、またはＲＮＡ均等物を含んでなる。別の態様は、配列番号３２または配列番号２８の配列、その相補配列、またはＲＮＡ均等物を含有する、オリゴマーである。１つの態様は、配列番号３９からなる配列、その相補配列、またはＲＮＡ均等物を含んでなる、オリゴマーである。別の態様において、該オリゴマーは、配列番号３０または配列番号３１の配列、その相補配列、またはＲＮＡ均等物を含有する。いくつかの態様において、該オリゴマーは、少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシ連結を含む主鎖を有する。
本発明の別の側面は、配列番号３５に含有される配列、その相補配列、またはＲＮＡ均等物からなる、核酸オリゴマーである。態様には、配列番号１７、配列番号２７、もしくは配列番号３４の配列、またはその相補配列、またはＲＮＡ均等物を含有するオリゴマーが含まれる。さらなる態様において、該オリゴマーは、少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシ連結を含む主鎖を有する。
本発明の別の側面は、配列番号３６、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、および配列番号３７、その相補配列、またはＲＮＡ均等物からなる群より選択される、核酸オリゴマーである。いくつかの態様において、該オリゴマーは、少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシ連結を含む主鎖を有する。
本発明の１つの側面は、生物学的試料において、ヒト・パルボウイルスＢ１９核酸を検出する方法であって、パルボウイルスＢ１９核酸を含有する生物学的試料を提供し；少なくとも１つの核酸ポリメラーゼ活性、並びに配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号２４、または配列番号２６の第一の増幅オリゴマーであって、場合によって、各々、該配列の５’末端につながれたプロモーター配列を含む、前記の第一の増幅オリゴマー、および配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６の第二の増幅オリゴマーからなる群より選択される、少なくとも１つの第一の増幅オリゴマーおよび１つの第二の増幅オリゴマーを用いることによって、パルボウイルスＢ１９核酸の部分をｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅し；そしてパルボウイルスＢ１９核酸の増幅された産物に特異的にハイブリダイズする、標識された検出プローブを用いることによって、増幅された該産物を検出し、それによって生物学的試料におけるパルボウイルスＢ１９核酸の存在を示す工程を含んでなる、前記方法である。いくつかの態様において、増幅工程は、オリゴマー対の以下の群：５’末端につながれたプロモーター配列を含む配列番号４と、配列番号１３、５’末端につながれたプロモーター配列を含む配列番号６と、配列番号１３、５’末端につながれたプロモーター配列を含む配列番号２４と、配列番号１３、および５’末端につながれたプロモーター配列を含む配列番号２６と、配列番号１３より選択される、少なくとも２つのオリゴマーを用いる。態様には、実質的に等温の増幅反応を用いる、増幅工程が含まれる。いくつかの態様において、検出工程は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、および配列番号３７からなる群より選択される、標識された検出プローブを用いる。他の態様において、標識された検出プローブは、配列番号１７、配列番号２７、および配列番号２８からなる群より選択される。いくつかの態様は、少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシ連結を含む主鎖を持つ、標識された検出プローブを用いる。検出工程の態様は、均質（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）反応において検出される標識を含む、標識された検出プローブを用いることが可能である。いくつかの態様において、標識された検出プローブには、リンカー化合物を介してオリゴマーに付着した化学発光標識が含まれる。本発明の方法の１つの態様には、パルボウイルスＢ１９標的配列にハイブリダイズする標的特異的配列を含んでなる、少なくとも１つの捕捉オリゴマーと、生物学的試料を接触させ、こうして、捕捉オリゴマーおよびパルボウイルスＢ１９核酸を含んでなる複合体を形成し；そして増幅工程前に、生物学的試料から該複合体を分離する工程がさらに含まれる。いくつかの態様において、該方法は、配列番号１、配列番号２、配列番号２０、もしくは配列番号２１に含有される標的特異的配列の、少なくとも２５の隣接する塩基、またはそのＲＮＡ均等物を含んでなる、捕捉オリゴマーを用いる。いくつかの態様において、捕捉オリゴマーの主鎖には、少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシ連結が含まれる。
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は、例示のみであり、そして本発明を限定しないことを理解すべきである。詳細な説明および実施例は、本発明の多様な態様を例示し、そして本発明の原理を説明する。
発明の詳細な説明
本出願は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅に含まれるアッセイを用いて、生物学的試料に存在するパルボウイルスＢ１９核酸配列を増幅するためのプライマーおよび該配列を検出するためのプローブとして用いる、オリゴヌクレオチド配列を開示する。該方法の好ましい態様は、転写仲介核酸増幅（Ｋａｃｉａｎらに対する米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号に先に詳細に開示されるようなもの）を用いる。増幅された核酸を検出するのに好ましい方法には、増幅された配列の部分に特異的にハイブリダイズする配列特異的プローブを用いることが含まれる。好ましくは、該方法は、混合物において、増幅された核酸に結合する標識プローブを検出する、既知の均質検出工程いずれかを用いる（例えば、Ａｒｎｏｌｄら， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３５：１５８８−１５９４（１９８９）；Ｎｅｌｓｏｎらに対する米国特許第５，６５８，７３７号、並びにＬｉｚａｒｄｉらに対する米国特許第５，１１８，８０１号および第５，３１２，７２８号に開示されるようなもの）。本出願はまた、核酸ハイブリダイゼーション技術を用いることによって、パルボウイルスＢ１９標的ＤＮＡを捕捉するのに有用なオリゴヌクレオチド配列も開示する。捕捉工程の１つの態様は、捕捉された標的を分離するのに磁気粒子を用いる（Ｗｅｉｓｂｕｒｇらに対する米国特許第６，１１０，６７８号を参照されたい）。
「生物学的試料」によって、パルボウイルス核酸を含有する可能性がある、生存しているヒトまたは死亡したヒト由来の組織または材料いずれかを意味し、これには、例えば、痰、末梢血、血漿、血清、リンパ節を含む生検組織、呼吸組織または滲出物、あるいは他の体液、組織または材料が含まれる。試料を処理して、物理的、化学的および／または機械的に組織または細胞構造を破壊し、こうして、細胞内構成要素を遊離させる。試料調製には、解析用試料を調製するのに用いる、緩衝剤、塩、界面活性剤等を含有する溶液を用いることが可能である。
「核酸」によって、窒素性複素環塩基、または塩基類似体（ａｎａｌｏｇ）を有し、核酸主鎖連結（例えばホスホジエステル結合）によってともに連結されて、ポリヌクレオチドを形成する、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含んでなる多量体化合物を意味する。用語「核酸」には、慣用的なＲＮＡおよびＤＮＡが含まれ、その類似体も含まれる。核酸の主鎖には、多様な連結、例えば、１以上の糖−ホスホジエステル連結、ペプチド−核酸結合（Ｈｙｄｉｇ−ＨｉｅｌｓｅｎらによるＰＣＴ第ＷＯ ９５／３２３０５号を参照されたい）、ホスホロチオエート連結またはメチルホスホネート連結、あるいは単一オリゴヌクレオチドにおける、こうした連結の混合物が含まれることが可能である。核酸の糖部分は、リボースまたはデオキシリボースいずれか、あるいは既知の置換、例えば２’メトキシ置換および２’ハロゲン化物置換を持つ類似の化合物（例えば２’−Ｆ）であることが可能である。慣用的な窒素性塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、既知の塩基類似体（例えばイノシン；Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５−３６， Ａｄａｍｓら監修， 第１１版， １９９２を参照されたい）、プリンまたはピリミジン塩基類の誘導体（例えば、Ｎ4−メチルデオキシグアノシン、デアザ−プリン類またはアザ−プリン類およびデアザ−ピリミジン類またはアザ−ピリミジン類、５位または６位に置換基を有するピリミジン類、２位、６位または８位に置換基を有するプリン塩基類、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ6−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン類、４−アミノ−ピリミジン類、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン類、およびＯ4−アルキル−ピリミジン類（ＣｏｏｋによるＰＣＴ第ＷＯ ９３／１３１２１号）および「無塩基性（ａｂａｓｉｃ）」残基（すなわち、１以上の主鎖位に関して、窒素性塩基が含まれない）（Ａｒｎｏｌｄらに対する米国特許第５，５８５，４８１号）が用語、核酸に含まれる。すなわち、核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡに見られる慣用的な糖、塩基および連結のみを含んでなることが可能であるし、あるいは慣用的な構成要素および置換両方（例えばメトキシ主鎖を介して連結される慣用的塩基および類似体、あるいはＲＮＡ主鎖またはＤＮＡ主鎖を介して連結される慣用的塩基および１以上の塩基類似体）を含むことが可能である。
オリゴマーの主鎖は、ハイブリダイゼーション複合体（例えば、捕捉オリゴマーとその標的核酸の間に形成されるもの）の安定性に影響を与える可能性がある。こうした態様には、ペプチド連結、２’−Ｏ−メトキシ連結および糖−ホスホジエステル型連結が含まれる。ペプチド核酸は、ＲＮＡとハイブリダイゼーション複合体を形成するのに好適である。２’−メトキシ置換ＲＮＡ基または２’−フルオロ置換ＲＮＡを有するオリゴマーは、標準的ＤＮＡまたはＲＮＡに比較して増進したハイブリダイゼーション複合体安定性を有する可能性があり、そして相補的２’−ＯＨ ＲＮＡとハイブリダイゼーション複合体を形成するのに好ましい。２つの糖基をつなぐ連結は、総電荷または電荷密度に影響を与えることによって、あるいは静電相互作用に影響を与えることによって、ハイブリダイゼーション複合体安定性に影響を与える可能性がある（例えば大きな連結は、ハイブリダイゼーション複合体安定性を減少させる可能性がある）。複合体安定性に影響を与える、好ましい連結には、中性基（例えばメチルホスホネート類）または荷電基（例えばホスホロチオエート類）が含まれる。
「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」によって、一般的に１，０００残基未満を有する核酸を意味し、約５ヌクレオチド残基の下限および約５００ヌクレオチド残基の上限を有するサイズ範囲にあるポリマーが含まれる。本発明のいくつかの態様のオリゴマーは、約５〜約１５残基の下限および約５０〜１００残基の上限を有するサイズ範囲にある。オリゴマーの好ましい態様は、約１０〜約２５残基の下限および約２５〜約６０残基の上限を有するサイズ範囲にある。オリゴマーは、天然存在供給源から精製可能であるが、一般的には、周知の酵素的方法または化学的方法いずれかを用いることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成する。一般的に、２’−Ｏ−メトキシ主鎖を持つ本発明のオリゴマーをｉｎ ｖｉｔｒｏで合成する際には、糖−ホスホジエステル連結で合成されたオリゴマーにおいて、同一配列中、３’Ｔが標準的デオキシヌクレオチドであることを除き、チミン（Ｔ）塩基に占められる位で、ウラシル（Ｕ）塩基を用いる。すなわち、メトキシオリゴヌクレオチドは、リボース部分の２’位にメトキシ基を有し、そしてＴがオリゴマーの３’端に存在する場合を除いて、標準的ＤＮＡオリゴヌクレオチドにおけるＴ残基の塩基位にＵを有する。オリゴマーが「ＯＭｅＴ」残基を含有すると明記される場合、塩基位はＴ残基に占められ、そして主鎖は２’−Ｏ−メトキシ連結を含んでなる。オリゴマー塩基配列は、頻繁に、ＤＮＡ配列と称される（すなわちＴ残基を含有する）が、当業者は、対応するＲＮＡ配列（すなわち、同一塩基配列であるが、Ｔの代わりにＵを含有する配列）、あるいは相補ＤＮＡまたは相補ＲＮＡ配列が、明記されるＤＮＡ配列の実質的に均等の態様であることを認識するであろう。実際、上述のように、２’−Ｏ−メトキシ主鎖を持つオリゴマーは、同一オリゴマー中にＵ塩基およびＴ塩基の混合物を含有することが可能である。
「増幅オリゴヌクレオチド」または「増幅オリゴマー」によって、標的核酸またはその相補鎖にハイブリダイズし、そして核酸増幅に関与するオリゴヌクレオチドを意味する。例には、プライマーおよびプロモーター・プライマーが含まれる。好ましくは、増幅オリゴヌクレオチドは、標準的ハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸配列（またはその相補鎖）のある領域に特異的にハイブリダイズする、少なくとも１０の隣接塩基、そしてより好ましくは少なくとも約１２の隣接塩基であるが、約６５塩基未満である隣接塩基を含有する。標的配列にハイブリダイズする隣接塩基は、増幅オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列に、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは約１００％相補的である。増幅オリゴヌクレオチドは、好ましくは、長さ約２０〜約６０ｎｔ（例えば２１〜５６ｎｔ）であり、そして場合によって、修飾ヌクレオチドを含むことが可能である。
増幅オリゴマーは、「プライマー」または「プロモーター・プライマー」と称することが可能である。「プライマー」は、テンプレート核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指し、そして既知の重合反応において、伸長可能な３’端を有する。プライマーの５’領域は、標的核酸に非相補的であることが可能であり、例えば５’非相補的領域は、プロモーター配列を含むことが可能であり、そして該オリゴマーは「プロモーター・プライマー」と称される。当業者は、プライマーとして機能可能なオリゴマー（すなわち、標的配列に特異的にハイブリダイズし、そしてポリメラーゼによって伸長可能な３’端を有する増幅オリゴヌクレオチド）がいずれも、５’プロモーター配列を含み、そしてしたがってプロモーター・プライマーとして機能するよう修飾可能であると認識するであろう。同様に、いかなるプロモーター・プライマーも、プロモーター配列を除去するか、またはプロモーター配列なしで合成することによって修飾して、そしてプライマーとして機能させることが可能である。
「増幅」は、多コピーの標的核酸配列あるいはその相補体または断片を得るための既知の方法いずれかを指し、そして好ましい態様は、配列特異的な方法を用いることによって、標的を特異的に増幅する。既知の増幅法には、例えば、転写仲介増幅、レプリカーゼ仲介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）増幅および鎖置換増幅（ＳＤＡ）が含まれる。レプリカーゼ仲介増幅は、自己複製ＲＮＡ分子、およびＱＢ−レプリカーゼなどのレプリカーゼを用いる（例えば、Ｋｒａｍｅｒらに対する米国特許第４，７８６，６００号、およびＰＣＴ第ＷＯ９０／１４４３９号を参照されたい）。ＰＣＲ増幅は周知であり、そしてＤＮＡポリメラーゼ、配列特異的プライマー、および熱サイクリングを用いて、多コピーの２つの相補ＤＮＡ鎖またはｃＤＮＡ鎖を合成する（例えば、Ｍｕｌｌｉｓらに対する米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号、並びにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９８７， Ｖｏｌ．１５５：３３５−３５０）。ＬＣＲ増幅は、少なくとも４つの別個のオリゴヌクレオチドを用いて、ハイブリダイゼーション、連結、および変性の多数の周期を用いることにより、標的およびその相補鎖を増幅する（ＥＰ特許第０ ３２０ ３０８号）。ＳＤＡは、標的配列が含まれる半修飾ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖にニックを形成する制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプライマーを用い、その後、一連のプライマー伸長および鎖置換工程における増幅を続けることによって増幅する（Ｗａｌｋｅｒらに対する米国特許第５，４２２，２５２号）。以下に例示するように、好ましい態様では、転写仲介増幅を用いる。当業者は、本発明の方法工程および増幅オリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ活性によるプライマー伸長に基づく、多様な核酸増幅法に容易に適応可能であることを理解するであろう。
標的配列の「断片」または「部分」の増幅は、全標的領域核酸配列またはその相補体より短い配列を含有する、増幅された核酸の産生を指す。標的配列の部分を増幅することによって、例えば標的配列の内部位にハイブリダイズし、そして内部位から重合を開始する、増幅オリゴヌクレオチドを用いることによって、こうした断片を産生することが可能である。
「転写仲介増幅」（ＴＭＡ）または「転写関連増幅」によって、ＲＮＡポリメラーゼを用いて、核酸テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を産生する、核酸増幅を意味する。転写仲介増幅は、一般的に、ＲＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡポリメラーゼ活性、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、並びにプロモーター・プライマーを使用し、そして場合によって、「ヘルパー」オリゴマーを含む１以上の他の増幅オリゴヌクレオチドを含むことが可能である。転写関連増幅の変型が当該技術分野に周知であり、そして別の箇所に詳細に記載される（Ｋａｃｉａｎらに対する米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号、Ｂｕｒｇらに対する米国特許第５，４３７，９９０号、Ｍａｌｅｋらに対する米国特許第５，１３０，２３８号、Ｕｒｄｅａらに対する米国特許第４，８６８，１０５号および第５，１２４，２４６号、ＫａｃｉａｎらによるＰＣＴ第ＷＯ ９３／２２４６１号、ＧｉｎｇｅｒａｓらによるＰＣＴ第ＷＯ ８８／０１３０２号および第ＷＯ ８８／１０３１５号、ＭｃＤｏｎｏｕｇｈらによるＰＣＴ第ＷＯ ９４／０３４７２号、並びにＲｙｄｅｒらによるＰＣＴ第ＷＯ ９５／０３４３０号を参照されたい）。米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号の方法が、好ましい増幅態様である。
「プローブ」によって、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、核酸において、好ましくは増幅された核酸において、標的配列に特異的にハイブリダイズし、それによって、標的または増幅された核酸の検出を可能にする、核酸オリゴマーを意味する。検出は、直接（すなわち配列に直接ハイブリダイズしているプローブから生じる）であっても、または間接的（すなわちプローブを標的に連結する中間分子構造にハイブリダイズしているプローブから生じる）であってもいずれでもよい。プローブの「標的」は、一般的に、標準的水素結合形成（すなわち塩基対形成）によって、プローブオリゴマーの少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする、増幅された核酸配列内の配列または該核酸配列のサブセットを指す。プローブは、標的特異的配列、およびプローブの三次元コンホメーションに寄与する他の配列を含んでなることが可能である（例えばＬｉｚａｒｄｉらに対する米国特許第５，１１８，８０１号および第５，３１２，７２８号、並びにＢｅｃｋｅｒらに対する第６，３６１，９４５ Ｂ１号）。適切なハイブリダイゼーション条件下で、プローブの標的特異的配列に完全には相補的でない標的配列に、プローブオリゴマーが安定にハイブリダイゼーション可能である場合、配列は、「十分に相補的」である。
「十分に相補的」によって、一連の相補塩基間の水素結合形成により、別の塩基配列とハイブリダイズ可能な、隣接核酸塩基配列を意味する。相補塩基配列は、標準的塩基対形成（例えばＧ：Ｃ、Ａ：ＴまたはＡ：Ｕ）を用いることによって、オリゴマー配列中の各位で相補的であることが可能であるし、または相補的でない１以上の残基（無塩基性の位が含まれる）を含有することが可能であるが、この場合、適切なハイブリダイゼーション条件下で、相補塩基配列全体が別の塩基配列と特異的にハイブリダイズ可能である。隣接塩基は、オリゴマーがハイブリダイズすることが意図される配列に、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは１００％相補的である。当業者は、適切なハイブリダイゼーション条件を容易に選択可能であり、該条件は、塩基配列組成に基づいて予測可能であるか、または日常的な試験を用いることによって決定可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， １９８９）§§１．９０−１．９１、７．３７−７．５７、９．４７−９．５１および１１．４７−１１．５７、特に§§９．５０−９．５１、１１．１２−１１．１３、１１．４５−１１．４７および１１．５５−１１．５７を参照されたい）。
「捕捉オリゴヌクレオチド」または「捕捉オリゴマー」または「捕捉プローブ」によって、捕捉しようとする標的核酸に特異的にハイブリダイズし、そして標的を他の試料構成要素から単離しそして／または濃縮する手段を提供する、核酸オリゴマーを意味する。捕捉オリゴマーの態様には、２つの結合性領域：標的結合性領域および固定プローブ結合性領域が含まれ、これによって、捕捉オリゴマーはハイブリダイゼーション複合体を形成し、この複合体において、該捕捉オリゴマーの標的結合性領域が標的配列に結合し、そして固定プローブ結合性領域が固体支持体上に固定されたオリゴマーに結合する（Ｗｅｉｓｂｕｒｇらに対する米国特許第６，１１０，６７８号および第６，２８０，９５２号を参照されたい）。標的結合性領域および固定プローブ結合性領域は、通常、同一捕捉オリゴマー上にあるが、２つの機能領域は、１以上のリンカーによってともにつながれた２つの異なるオリゴマー上に存在することが可能である。例えば、固定プローブ結合性領域が第一のオリゴマー上に存在し、標的結合性領域が第二のオリゴマー上に存在することが可能であり、そして２つのオリゴマーは、第一のオリゴマーおよび第二のオリゴマーの配列に特異的にハイブリダイズするリンカーである第三のオリゴマーと水素結合することによってつながれる。また、捕捉プローブの標的結合性領域を捕捉プローブの標的特異的部分と称することも可能であり、そして固定プローブ結合性領域をテール部分と称することも可能である。テール部分の態様には、ホモポリマー（例えばポリｄＴまたはポリｄＡ）または非ホモポリマー（例えばＴ1-3Ａ30）が含まれ、これらは好ましくは、オリゴマーの標的特異的部分の３’端に付着している。
「固定プローブ」または「固定オリゴマー」によって、固定した支持体に捕捉オリゴマーを直接または間接的につなぐ核酸オリゴマーを意味する。固体支持体につながれた固定プローブは、結合した標的配列を試料中の未結合成分から分離するのを容易にする。溶液中のマトリックスおよび粒子、例えばニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレンおよび金属粒子、好ましくは磁気誘引可能粒子など、いかなる既知の固体支持体も使用可能である。好ましい支持体は、固定プローブが直接（例えば直接共有結合、キレート化、またはイオン性相互作用を介して）、または間接的に（例えば１以上のリンカーを介して）つながれ、連結または相互作用が核酸ハイブリダイゼーション条件中、安定である、単分散常磁性球体（例えば、±５％でサイズが均一）である。
「分離」または「精製」によって、生物学的試料の１以上の構成要素を、少なくとも１つの他の試料構成要素から取り除くことを意味する。試料構成要素は、一般的に、核酸、塩、タンパク質、炭水化物、および脂質の水性溶液を含む。核酸を分離する工程または核酸を精製する工程は、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約９０％、そしてより好ましくは少なくとも約９５％の他の試料構成要素を取り除く。
「標識」によって、検出可能であるか、または検出可能シグナルを導くことが可能な分子部分または化合物を意味する。標識は、直接または間接的に、核酸プローブにつながれている。直接標識は、標識をプローブに連結する結合または相互作用を用い、これらには、水素結合、疎水性相互作用およびイオン性相互作用などの、共有結合または非共有相互作用が含まれ、あるいはキレートまたは配位複合体の形成を通じて直接標識する。間接標識は、標識およびプローブを連結する、架橋部分または「リンカー」（例えばオリゴヌクレオチドまたは抗体）を用いる。リンカーを用いて、検出可能シグナルを増幅することが可能である。標識は、既知の検出可能部分いずれか、例えば放射性核種、リガンド（例えばビオチン、アビジン）、酵素または酵素基質、反応性基、または発色団、例えば色素または検出可能粒子（例えばラテックスビーズまたは金属粒子）、発光化合物（例えば生物発光、燐光または化学発光標識）および蛍光化合物である。好ましくは、標識プローブ上の標識は、均質反応において検出可能である（すなわち、混合物において、結合した標識プローブが、未結合標識プローブに比較して、検出可能な変化、例えば安定性または異なる分解を示す）。均質アッセイに使用する標識の１つの態様は、化学発光化合物（例えばＷｏｏｄｈｅａｄらに対する米国特許第５，６５６，２０７号、Ｎｅｌｓｏｎらに対する米国特許第５，６５８，７３７号、およびＡｒｎｏｌｄ， Ｊｒ．らに対する米国特許第５，６３９，６０４号に詳細に記載されるもの）である。好ましい化学発光標識はアクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物、例えば標準的ＡＥまたはその誘導体（例えば、ナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−または３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、および２−メチル−ＡＥ）である。合成、および核酸に標識を付着させ、そして標識を検出する方法は、当該技術分野に周知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， １９８９）， 第１０章；Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙらに対する米国特許第４，５８１，３３３号、Ｎｅｌｓｏｎらに対する米国特許第５，６５８，７３７号、Ｗｏｏｄｈｅａｄらに対する米国特許第５，６５６，２０７号、Ｈｏｇａｎらに対する米国特許第５，５４７，８４２号、Ａｒｎｏｌｄ， Ｊｒ．らに対する米国特許第５，２８３，１７４号；およびＢｅｃｋｅｒらによるＥＰ特許公報第０７４７７０６号を参照されたい）。均質アッセイに使用する標識の別の態様は、プローブが標的にハイブリダイズしていない場合、蛍光標識に機能的に近接する消光剤化合物とともに、プローブに付着している蛍光化合物である（例えばＬｉｚａｒｄｉらに対する米国特許第５，１１８，８０１号および第５，３１２，７２８号、並びにＢｅｃｋｅｒらに対する米国特許第６，３６１，９４５ Ｂ１号）。
「均質検出可能標識」は、標識プローブが標的配列にハイブリダイズしているかどうかに基づいて、均質な方式で、その存在を検出可能な（すなわち、標識または標識プローブの非ハイブリダイズ型を物理的に取り除かなくても検出可能である）標識を指す。均質検出可能標識およびその検出法の態様が記載されている（Ａｒｎｏｌｄらに対する米国特許第５，２８３，１７４号、Ｗｏｏｄｈｅａｄらに対する米国特許第５，６５６，２０７号、Ｎｅｌｓｏｎらに対する米国特許第５，６５８，７３７号、Ｌｉｚａｒｄｉらに対する米国特許第５，１１８，８０１号および第５，３１２，７２８号、並びにＢｅｃｋｅｒらに対する米国特許第６，３６１，９４５Ｂ１号）。
「本質的にからなる」によって、本発明の基本的なそして新規の特性を実質的に変化させない、さらなる構成要素（単数または複数）、および方法工程（単数または複数）が含まれていてもよいことを意味する。こうした特性には、本明細書に記載し、請求する構成要素または方法工程であって、出発材料中、約１００〜５００コピーのパルボウイルスＢ１９ ＤＮＡを検出する感度で、パルボウイルスＢ１９ ＤＮＡ由来の核酸増幅産物を含むパルボウイルスＢ１９核酸配列を検出する、前記構成要素または方法工程に、実質的な影響を持たない、塩、緩衝剤、核酸オリゴマーおよび類似の生化学的試薬が含まれる。同様に、アッセイの基本的な性質に実質的な影響を持たない、さらなる方法工程を含むことが可能である。
本発明のアッセイは、生物学的試料（例えば血液、血清、血漿、痰、気管支洗浄液）に存在するヒト・パルボウイルスを検出する。１つの態様において、アッセイは、プールまたは個々のドナー由来いずれかの血漿試料における、パルボウイルスＢ１９ ＤＮＡを検出した。血漿標本を調製するため、標準法を用いて、全血試料を遠心分離し、そして試験する前に血漿を４℃または−２０℃に保管した。標本中のウイルス粒子を溶解するため、界面活性剤を含有する溶解試薬を標本と混合して、ウイルス粒子からパルボウイルスＢ１９ ＤＮＡを遊離させた。標本プロセシングは、溶解試薬中に捕捉オリゴマーおよび固定オリゴマーを含むことによって、ウイルス溶解とウイルス標的ＤＮＡの精製を組み合わせることが可能である。その後、該方法には、パルボウイルスＢ１９ ＤＮＡを捕捉オリゴマーに特異的にハイブリダイズさせ、捕捉オリゴマーをその後、固定オリゴマーにハイブリダイズさせ、そして結合した複合体（すなわち固定オリゴマー、捕捉オリゴマー、およびウイルス標的ＤＮＡ）を他の試料構成要素から実質的に分離する、標的捕捉工程が含まれる。結合したパルボウイルス含有複合体を含む固体支持体を洗浄することによって、残った試料構成要素を洗い流す。こうして、結合したパルボウイルスＢ１９核酸を固体支持体から遊離させることなく、ウイルス標的ＤＮＡを他の試料構成要素から分離し、そして結合した複合体中で濃縮する。
典型的な試料プロセシングは以下の工程を伴った（米国特許第６，１１０，６７８号に詳細に記載されるとおり）。体液（例えば血漿０．５ｍｌ）中のウイルス粒子を、標的捕捉試薬（７９０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、６８０ｍＭ ＬｉＯＨ、１０％ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、２３０ｍＭスクシネート、７ｐｍ／ｍｌの少なくとも１つの捕捉プローブ、および磁気粒子（ＳＥＲＡＤＹＮTM、インディアナ州インディアナポリス）に結合させたポリｄＴ14 １００μｇ／ｍｌ）と６０℃で接触させて溶解した。捕捉オリゴマーは、パルボウイルスＢ１９ゲノム配列の一部である標的配列に相補的であり、そして該標的配列に特異的にハイブリダイズする５’標的特異的配列（例えば配列番号１、２、２０および２１）、および固体支持体に付着した相補オリゴマー（例えばオリゴｄＴ）にハイブリダイズする３’テール配列（例えばオリゴｄＡ）で構成された。捕捉プローブの他の好ましい態様は、配列番号４１を含む２７〜３３ヌクレオチドの標的相補配列を含有するオリゴマー、並びに配列番号２２および配列番号２９に示す標的配列に特異的に結合するオリゴマーである。混合物を第一の温度（６０℃）でインキュベーションして、捕捉オリゴマーがパルボウイルスＢ１９ ＤＮＡ中の相補標的配列に特異的に結合するのを可能にすることによって、この反応混合物において、標的捕捉ハイブリダイゼーションが起こる。その後、混合物を４０℃以下（例えば室温）に冷却して、捕捉オリゴマーの３’テールが粒子上の相補オリゴマーにハイブリダイズするのを可能にした。第二のハイブリダイゼーション後、例えば重力分離、遠心分離、または磁気分離を用いることによって、混合物を処理して、他の試料構成要素から、結合した核酸結合複合体を含む固体支持体を分離する。一般的に、分離には、結合した核酸複合体を含む磁気粒子を試験管側面に引き寄せる磁石を含有するラックを使用した。その後、磁気粒子を洗浄緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、６．５ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）無水エタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）メチルパラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）プロピルパラベン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ｐＨ７．５）に懸濁し、試験管側面に粒子を分離し、そして上清を除去することによって、上清を除去し、そして粒子上の結合した複合体を１ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄した。
試料調製に続いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素仲介核酸合成によって増幅される領域の５’端および３’端を定義する増幅オリゴマー対を用いることによって、パルボウイルスＢ１９ ＤＮＡ標的の増幅を達成した。１つの態様は、実質的に米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号に記載されるとおりであり、検出可能な多数の増幅産物（ＲＮＡ転写物）を産生する、実質的な等温系である、転写仲介増幅（ＴＭＡ）法を用いる。該方法の態様は、少なくとも１つのプロモーター・プライマーが配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号２３、および配列番号２５からなる群より選択され、このプロモーター・プライマーを、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーと組み合わせた、増幅オリゴマーの混合物を用いた。他の態様は、少なくとも１つのプロモーター・プライマーが配列番号３、配列番号５、および配列番号９からなる群より選択され、このプロモーター・プライマーを、配列番号１３および配列番号１６からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーと組み合わせた、増幅オリゴマーの混合物を用いた。いくつかの態様は、少なくとも１つのプロモーター・プライマーが配列番号３、配列番号２３、および配列番号２５からなる群より選択され、このプロモーター・プライマーを、配列番号１３からなるプライマーと組み合わせた、増幅オリゴマーの混合物を用いた。当業者は、プロモーター・プライマーの標的特異的部分からなるオリゴマーが、標的配列にハイブリダイズ可能であり、そしてそのプロモーター配列（配列番号１９）と独立に、酵素仲介核酸増幅のプライマーとして機能する３’端を提供可能であることを認識するであろう。こうしたオリゴマーには、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号２４、および配列番号２６の配列が含まれる。
転写仲介増幅によって標的核酸を増幅すると、単一コピーの標的核酸から多くの核酸鎖が生じ、したがって、増幅された配列にハイブリダイズするプローブを検出することによって、標的を検出することが可能である。一般的に、反応混合物は、溶液中に、標的核酸、および少なくとも１つのプロモーター・プライマーを含む２つのプライマー、逆転写酵素活性およびＲＮＡポリメラーゼ活性、核酸合成基質（デオキシリボヌクレオシド三リン酸およびリボヌクレオチド三リン酸）、並びに適切な塩および緩衝剤を含み、核酸テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を産生する。簡潔には、第一のプロモーター・プライマーが、標的配列部分に特異的にハイブリダイズし、そしてＲＮアーゼＨ活性を含む逆転写酵素が、プロモーター・プライマーの３’伸長によって、第一鎖ｃＤＮＡを生成する。第一のプロモーター・プライマーより下流で、ｃＤＮＡを第二のプライマーとハイブリダイズさせ、そして逆転写酵素を用いて第二のプライマーの３’端から新規ＤＮＡ鎖を合成して、一端に、機能するプロモーター配列を有するｄｓＤＮＡを生成する。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーター配列位でｄｓＤＮＡに結合し、そして多数の転写物または「単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ）」を転写する。これらの単位複製配列を、増幅プロセスにおいてさらに新規複製周期のテンプレートとして利用して、最終的に、最初の標的配列から、多量の一本鎖増幅核酸を生成する（例えば単一テンプレートから１００〜３，０００コピーのＲＮＡが合成される）。該プロセスは、実質的に一定の反応条件を用いる（すなわち実質的に等温である）。典型的には、１００μｌ増幅反応は、７５μｌの増幅試薬混合物（１１．６ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、１５．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２２．７ｍＭ ＭｇＣｌ2、２３．３ｍＭ ＫＣｌ、３．３３％グリセロール、０．０５ｍＭ酢酸亜鉛（二水和物）、各０．６６５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、各５．３２ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰ、ｐＨ７）および２５μｌの酵素試薬混合物（７００ＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、１４００Ｕのモロニーネズミ白血病ウイルス由来の逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）、１６ｍＭ ＨＥＰＥＳ（遊離酸、二水和物）、７０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、５０ｍＭ ＫＣｌ、２０％（ｖ／ｖ）無水グリセロール、１０％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１０２、および１５０ｍＭトレハロース（二水和物）、ｐＨ７）を用い、好ましくは、固体粒子上に保持される、捕捉された標的核酸とこれらを混合する。酵素活性に関しては、１ＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７プロモーターを含有するＤＮＡテンプレートを用いると、３７℃、１時間で、１ｎｍｏｌのＡＴＰをＲＮＡに取り込み、そして１ＵのＭＭＬＶ−ＲＴは、テンプレートとしてオリゴｄＴにプライミングされるポリ（Ａ）２００〜４００μｍｏｌを用いると、３７℃、１０分間で、１ｎｍｏｌのｄＴＴＰをＤＮＡに取り込む。
増幅後、好ましくは、増幅された配列の一部に特異的にハイブリダイズする、少なくとも１つの標識核酸プローブとのハイブリダイゼーションによって、パルボウイルスＢ１９標的ＤＮＡから生成した増幅配列を検出する。プローブ態様には、約８０℃〜８５℃の範囲のＴmを有するものが含まれる。いくつかのプローブ態様には、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、および配列番号３７の配列を有するオリゴマーが含まれる。他の態様は、配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０に含有される配列を含む２０〜２２ヌクレオチドのオリゴマーである。他のプローブ態様には、配列番号３３に含有される少なくとも２１の隣接ヌクレオチドのオリゴマー、および配列番号３５に含有される２０〜２５の隣接ヌクレオチドのオリゴマーが含まれる。好ましくは、均質反応において検出可能な標識を検出することによって、標識プローブの検出を達成する。したがって、いくつかの態様には、均質検出を可能にする周知の方法を用いて、アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物で標識したプローブが含まれる（例えば標識および検出法は、Ａｒｎｏｌｄ， Ｊｒ．らに対する米国特許第５，２８３，１７４号、Ｗｏｏｄｈｅａｄらに対する米国特許第５，６５６，２０７号、およびＮｅｌｓｏｎらに対する米国特許第５，６５８，７３７号に詳細に記載される）。リンカー化合物を介して、化学発光ＡＥ化合物をプローブ配列に付着させる（実質的にＡｒｎｏｌｄ， Ｊｒ．らに対する米国特許第５，５８５，４８１号および第５，６３９，６０４号に記載されるとおり、例えば第１０欄第６行から第１１欄第３行、および実施例８を参照されたい）。いくつかの態様において、ＡＥ化合物標識を、配列番号１７の７位および８位の間、または１１位および１２位の間に、そして配列番号１８の１１位および１２位の間に連結した。標識プローブのさらなる態様を、実施例９に記載する。１つの態様において、標識プローブオリゴマーは、核酸主鎖中に少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシ連結を有する（例えば２’−Ｏ−メトキシ主鎖を含んで合成した配列番号１８）。典型的な検出工程において、プローブ試薬は、１００ｍＭスクシネート、２％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ、２３０ｍＭ ＬｉＯＨ（一水和物）、１５ｍＭ ２，２’−ジチオジピリジン（ＡＬＤＲＩＴＨＩＯＬ−２）、１．２Ｍ ＬｉＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＥＧＴＡ、３％（ｖ／ｖ）無水エタノールを含み、これをＬｉＯＨで約ｐＨ４．７にし、そして未結合プローブ上の標識を加水分解するのに用いる選択試薬は、６００ｍＭホウ酸、１８２ｍＭ ＮａＯＨ、１％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を含んだ。照度計（例えばＬＥＡＤＥＲTM４５０ＨＣ＋、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ社、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、相対光単位（ＲＬＵ）としてシグナルを検出した。
捕捉オリゴマー、増幅オリゴマーおよび検出プローブとして使用するのに適したＤＮＡ配列を選択するため、同一配列または類似配列の領域をマッチングさせ、そして周知の分子生物学技術を用いて比較することによって、部分配列または相補配列を含む、公的にアクセス可能なデータベース（例えばＧｅｎＢａｎｋ）から入手可能な、既知のパルボウイルスＢ１９ ＤＮＡ配列を並列させた。アルゴリズムの使用によって、配列比較を容易にすることが可能であるが、当業者は、手で、そして視覚的に、容易にこうした比較を行うことが可能である。一般的に、本発明に使用するための合成オリゴマーを設計する基礎として、比較配列間で、相対的に少数の変動を含有する配列部分を選択した。オリゴマーを設計する際の他の検討材料には、周知の方法を用いることによって決定されるような、相対的ＧＣ含量（Ｔmに影響を与える）および配列内の予測される二次構造（分子内ハイブリッドを形成する可能性がある）の相対的欠如が含まれた。
１つの態様において、体液（例えば血漿）試料０．５〜１ｍｌを用いて、単一試験管中でアッセイを行い、反応あたりの約１００〜５００コピー／ｍｌの標的ＤＮＡを検出する感度で、標的パルボウイルスＢ１９ ＤＮＡを検出する。他の態様において、該アッセイは、個々の試料をプールした試料であることが可能な試料において、より多数の標的パルボウイルスＢ１９ ＤＮＡを検出した。
別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての科学的および技術的用語は、相当する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書で用いる用語の多くの一般的な定義は、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第２版（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら， １９９４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ニューヨーク州ニューヨーク）、Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ， １９９１， Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ， ニューヨーク州ニューヨーク）、およびＴａｂｅｒ’ｓ Ｃｙｃｌｏｐｅｄｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ， 第１７版（Ｆ．Ａ． Ｄａｖｉｓ Ｃｏ．， ペンシルバニア州フィラデルフィア， １９９３）に提供される。別に言及しない限り、本明細書で使用するかまたは意図する技術は、一般の当業者に周知の標準的方法論である。以下の実施例は、本発明の好ましい態様をいくつか例示し、そして例示の目的のみで提供される。
実施例１：パルボウイルスＢ１９ ＤＮＡの標的捕捉
標準的ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ合成反応を用いて、どちらも３’ ｄＡ30テールを有する、配列番号１の配列を有する捕捉プローブおよび配列番号２の配列を有する捕捉プローブを合成した。上述の標的捕捉法を用いて、各々、既知のコピー数の生存パルボウイルスＢ１９（２，０００、１，０００、５００または陰性対照の０）を加えておいた（ｓｐｉｋｅｄ）、未感染ドナーから得たヒト血漿試料と、捕捉オリゴマーを混合した。血漿試料（一般的に０．５ｍｌ）を、各々別個に捕捉プローブ（反応あたり３．５ｐｍ）を含有する、等量の標的捕捉試薬と混合することによって、ウイルス粒子を溶解した。約６０℃で約２０分間、そしてその後、１８〜２５℃で約１０〜２０分間ハイブリダイゼーションさせることによって捕捉した後、上述のように、付着したハイブリダイゼーション複合体とともに、磁気粒子を２回洗浄した。粒子上に保持される複合体中のパルボウイルス標的配列を、実質的に実施例２に記載するように行うＴＭＡ反応中で増幅し、そしてＡＥ標識プローブ（配列番号１７）とハイブリダイゼーションさせることによって、増幅した標的配列を検出した。結果（結合した検出プローブから検出されたＲＬＵ）を表１に示す。これらの結果（約１．５ｘ１０6のＲＬＵ）は、どちらの捕捉プローブも、陰性対照（ＲＬＵ約２ｘ１０4）に比較して、パルボウイルスＢ１９ ＤＮＡに特異的に結合し、そして該ＤＮＡを試料から有効に捕捉することを示す。
表１：標的捕捉後、パルボウイルスＢ１９ ＤＮＡに結合している標識プローブの検出（ＲＬＵ）
Figure 0005100956
実施例２：パルボウイルスＢ１９ ＤＮＡの増幅および単位複製配列の検出
配列番号３のプロモーター・プライマーおよび配列番号１３のプライマー（各々７．５ｐｍｏｌ）を含有する、上述のような試薬（反応あたり７５μｌ）を用い、そして２００μｌの不活性シリコン油で覆って蒸発を防いだＴＭＡ反応において、既知の量のパルボウイルスＢ１９標的核酸（反応試験管あたり、１０００、５００、２５０、１００、５０および０コピーの変性ｓｓＤＮＡ）を増幅した。混合物を６０℃で１０分間、その後、４２℃で１０分間インキュベーションし、そしてその後、２５μｌの酵素試薬を添加して、そして試験管を手で混合し、そしてその後、４２℃で６０分間インキュベーションした。増幅後、６０℃で試料をインキュベーションし、そして配列番号１７のプローブを含有する１００μｌのプローブ試薬を添加した。混合物を６０℃で２０分間インキュベーションし、そしてその後、３００μｌの選択試薬を添加し、混合し、そして上述のようにシグナル（ＲＬＵ）を検出する前に、６０℃で１０分間、そして室温で１０分間インキュベーションした。
こうした増幅工程および検出工程後、各条件に関して５つの複製試料から検出したシグナルの平均は以下のとおりであった：すべて、１．６４ｘ１０4ＲＬＵを生じた陰性対照（０コピー）と比較して、１，０００コピーは６．７８ｘ１０6ＲＬＵを生じ、５００コピーは５．５６ｘ１０6ＲＬＵを生じ、２５０コピーは４．４２ｘ１０6ＲＬＵを生じ、１００コピーは１．０６ｘ１０6ＲＬＵを生じ、そして５０コピーは２．０３ｘ１０4ＲＬＵを生じた。これらの結果は、増幅および検出アッセイの感度が、少なくとも標的１００コピーであることを示す。
実施例３：標的捕捉を用いる増幅アッセイにおける、パルボウイルスＢ１９の検出
本実施例では、実質的に実施例１に記載するように行った標的捕捉アッセイを、実質的に実施例２に記載するように行った増幅工程および検出工程と組み合わせた。試験した各試料に関して、ウイルス粒子のコピー数が既知であった（５００、２５０、１００および陰性対照の０）。捕捉プローブは、実施例１におけるとおりであり、そして増幅オリゴマーの組み合わせは、配列番号３と配列番号１３、および配列番号５と配列番号１３であった。検出プローブは配列番号１７であった。表２に示す結果は、試験した条件各々に関して５つの試料の平均である。これらの結果は、アッセイの感度が、試料中、約２５０コピーの標的パルボウイルスＤＮＡを検出可能であるか、またはそれより優れている（すなわち試料あたり１００コピーを検出可能である）ことを示す。配列番号３と配列番号１３のプライマーセットは、血漿からの捕捉において、ウイルス２５０コピーより優れた感度を有するとともに、実施例２に記載するような増幅および検出アッセイにおいて、１００コピーの感度で、安定で、再現可能なシグナルを有する。
表２：標的捕捉に増幅アッセイを加えて、検出されたシグナル（ＲＬＵ）
Figure 0005100956
実施例４：臨床的標本の試験
正常血液ドナー集団におけるアッセイ特異性およびパルボウイルスＢ１９ ＤＮＡの出現率（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）を決定するため、臨床的血漿試料および商業的に入手可能な血漿試料に対して、実質的に実施例３に記載するように、ＴＭＡに基づくアッセイを行った（配列番号３および配列番号１３の増幅オリゴマーを用いる）。ＨＩＶおよびＨＣＶの存在に関して陰性である４６８の無作為血液ドナー標本（大カンザスシティー地域血液センター、ミズーリ州カンザスシティーから得た）に対してアッセイを行った。４６８のうち３つの標本（０．６％）がパルボウイルスＢ１９に関して陽性であった（すなわち陽性対照に比較した際、少なくとも１００コピーの標的に関して検出されるものと均等のシグナルを提供した）。ＴＭＡに基づく同アッセイを用いて再試験した際、およびパルボウイルスＢ１９の異なる標的配列を増幅するＰＣＲに基づくアッセイを用いて試験した際、３つの陽性試料はすべて、陽性結果を提供した。
このＴＭＡに基づくアッセイの感度を、標準化されたパルボウイルスＢ１９ ＤＮＡ標本（米国赤十字から得られ、そして米国遺伝学研究所によって定量化されたもの）に基づいて評価した。アッセイにおいて、パルボウイルスＢ１９標準を５００コピー／ｍｌおよび２００コピー／ｍｌ含有する陽性試料の検出は、それぞれ、１００％（１０試験中１０）および８０％（１０試験中８）であった。１，０００ゲノム均等物／ｍｌを含有する別の標準（米国生物学的標準および対照研究所、またはＮＩＢＳＣから得た）もまた、このアッセイでの試験結果は陽性であった。これらの結果は、このアッセイが、血液スクリーニング環境において、ヒト・パルボウイルスＢ１９を検出するのに必要な感度および特異性を有することを示す。
このＴＭＡに基づくアッセイを用いて、パルボウイルスＢ１９に関して抗体陽性であるいくつかの標本もまた試験した。抗パルボウイルスＩｇＭに関して陽性である４つの血漿試料（ＬＭ００ＰＰ７５１、０５２５６−５２０、０５２５４−５２０、および０５２５９−５２０、ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア州オーシャンサイド）は、ＴＭＡに基づくアッセイを用いて試験した際、陽性対照としてのＮＩＢＳＣ標準に比較して、パルボウイルスＢ１９ ＤＮＡに関して、すべて陽性の結果を生じた。抗パルボウイルス抗体およびパルボウイルスＢ１９ ＤＮＡ（ＰＣＲに基づく試験に基づく）に関して陽性である６つの標本（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州エメリービルから得た）を、陰性ヒト血漿中、１対１０に希釈した。ＴＭＡに基づくアッセイを用いて、希釈した試料をアッセイし、そして６つの標本すべてがパルボウイルスＢ１９に関して陽性の試験結果であったことから、アッセイ感度が高レベルであることが示された。抗パルボウイルスＢ１９ ＩｇＭに関して陽性の試験結果であった６つの血漿標本（ＢｉｏＣｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ， Ｉｎｃ．、米国メリーランド州フランクリン）もまた、ＴＭＡに基づくアッセイを用いて試験した。６つの血漿すべてがパルボウイルスＢ１９核酸に関して陰性の試験結果であり、これらの血漿に、パルボウイルスＢ１９に対する抗体が残存していたものの、ウイルスがドナーから一掃されていたことが示された。
実施例５：多様な標的捕捉オリゴマーを用いた試料調製
本実施例は、アッセイの最初の工程において、すなわち捕捉オリゴマーへのハイブリダイゼーションを用いることによる、試料からのパルボウイルスＢ１９ ＤＮＡの捕捉において、多様なオリゴマーを単独で、または組み合わせて用いることが可能であることを示す。これらの実験において、配列番号１、配列番号２０および配列番号２１のオリゴマーを３’ポリ（Ａ）テール部分を含むように合成し、そして実質的に先に記載されるような方法（米国特許第６，１１０，６７８号）を用いて、試料からパルボウイルスＢ１９ ＤＮＡを捕捉するのに使用した。簡潔には、パルボウイルスＢ１９を含有する血漿試料を、溶解試薬、および１以上の捕捉オリゴマーを含有する捕捉試薬と混合し、そして混合物をインキュベーションして（６０℃、２０分間）、捕捉オリゴマーがパルボウイルス標的ＤＮＡにハイブリダイズするのを可能にした。該混合物はまた、捕捉オリゴマーの３’テール部分に相補的であり、そして磁気粒子に付着しているホモポリマー・オリゴマーも含有した。これらのホモポリマー相補配列を、第二のハイブリダイゼーション反応（２５℃、１４〜２０分間）においてハイブリダイズさせ、そして磁気粒子に付着したハイブリダイゼーション複合体を残りの試料から分離し、そして増幅に進む前に洗浄した（例えばハイブリダイゼーション複合体を粒子上に保持する緩衝液１ｍｌで２回）。これらの実験において、反応あたり３．５ｐｍｏｌの各捕捉オリゴマーを以下のように試験した：反応は、配列番号１、２０および２１を各々、個々に、そして多様なありうる組み合わせで（配列番号１および２０、配列番号１および２１、配列番号２０および２１、並びに配列番号１、２０および２１）含んだ。試料を捕捉試薬で処理した後、反応あたり各１５ｐｍｏｌの配列番号２３のプロモーター・プライマーおよび配列番号１３のプライマー、並びに１時間のＴＭＡ反応に適切な塩、ヌクレオチドおよび酵素（実質的に、米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号に先に詳細に記載されるようなもの）を含有する増幅混合物中、付着したハイブリダイゼーション複合体を含む磁気粒子をインキュベーションした。ｎｔ７およびｎｔ８の間で２−メチル−ＡＥ標識した配列番号１７の検出プローブを添加し（反応あたり０．１ｐｍｏｌ）、そして増幅産物とインキュベーションして（６０℃、２０分間）ハイブリダイゼーションを可能にし、そして先に詳細に記載されるように（米国特許第５，２８３，１７４号、第５，６５６，２０７号、および第５，６５８，７３７号）、化学発光シグナルを検出した（ＲＬＵ）。
実験の最初の一組において、試験したヒト血漿試料は、パルボウイルスＢ１９をまったく含有しない（陰性試料）か、または反応あたり１，０００コピーのパルボウイルスＢ１９を含有し（陽性試料）、この試料は、標準化試料（ＮＩＢＳＣ由来）との比較によって力価測定した（ｔｉｔｒａｔｅｄ）、感染血漿のストック試料（米国赤十字由来）から希釈することによって調製された。条件各々に関して、１０の複製試料を試験した。検出した結果（ＲＬＵ平均±標準偏差）を以下の表に示す。
表３：異なる捕捉オリゴマーを用いて行ったアッセイの結果
Figure 0005100956
実験の第二の組において、血漿試料は、パルボウイルスＢ１９をまったく含有しない（陰性試料）か、または多様な量のパルボウイルスＢ１９（反応あたり、１，０００、５００、２５０、１００および５０コピー）を含有し、この試料は、上述のストック試料からの希釈によって調製された。各条件に関して、パルボウイルスＢ１９を１，０００および０コピー含有するものに関しては、５つの複製試料を試験し、そして他のすべてに関しては、１０の複製試料を試験した。検出した結果（ＲＬＵ平均±標準偏差）を以下に示す。陰性対照（反応あたり０コピー）のすべてに関して、検出されたバックグラウンドは、２，２７７±２１５〜４，７２４±３，８８９ＲＬＵの範囲であった。
表４：異なる捕捉オリゴマーを用いて行ったアッセイの感度
Figure 0005100956
これらの実験結果は、３つの捕捉オリゴマーいずれかを単独でまたは混合物中で用いてアッセイを行った場合、各形式が、パルボウイルスＢ１９の存在を検出したことを示す。該アッセイによって、２５０〜１，０００コピー／ｍｌを含有するすべての試料で陽性シグナルが生じ、１００コピー／ｍｌを含有する試料の８０〜９０％で陽性シグナルが生じ、そして５０コピー／ｍｌを含有する試料の５０〜７０％で陽性シグナルが生じた。
実施例６：異なる増幅オリゴマーを用いた、パルボウイルスＢ１９配列の増幅
本実施例は、プライマーとして働く増幅オリゴマーの異なる組み合わせが、パルボウイルスＢ１９ ＤＮＡ中の標的配列を効率的に増幅可能であることを示す。配列番号２４（ＡＧＴＡＣＣＧＧＧＴＡＧＴＴＧＴＡＣＧＣＴＡＡＣＴ）または配列番号２６（ＣＴＡＧＧＴＴＣＴＧＣＡＴＧＡＣＴＧＣＴＡＣＴＧＧＡ）および配列番号１３（ＣＣＣＣＴＡＧＡＡＡＡＣＣＣＡＴＣＣＴＣＴ）のパルボウイルス特異的部分を有するプライマーの組み合わせを用いることによって、標的配列を増幅した。
パルボウイルスを含有しないヒト血漿（陰性対照）とパルボウイルスＢ１９のアリコットを混合して、１ｍｌあたり１０，０００、５，０００、１，０００、５００、２５０、１００、５０、および２５コピーのパルボウイルスＢ１９を含有する試料を産生することによって、試料を調製した。陽性対照として、１ｍｌあたり１，０００コピーのパルボウイルスＢ１９を含有する標準試料もまたアッセイした。実質的に先に記載されるように（米国特許第６，１１０，６７８号）、試料をオリゴマー（配列番号１）と混合し、これをパルボウイルスＢ１９ ＤＮＡとハイブリダイズさせ、そしてその後、パルボウイルスＢ１９ ＤＮＡを含有するハイブリダイゼーション複合体を、磁気ビーズに付着したオリゴマーとハイブリダイズさせることによって、試料から分離した。
各１５ｐｍｏｌの配列番号２３のプロモーター・プライマーおよび配列番号１３、または配列番号２５のプロモーター・プライマーおよび配列番号１３を用いて、実質的に上述のように、ＴＭＡ系を用いて、増幅アッセイを行った。１時間の増幅反応後、ｎｔ７およびｎｔ８の間で化学発光化合物標識した配列番号１７の検出プローブと混合物をハイブリダイズさせ（反応あたり５．５ｘ１０9ＲＬＵを用いる）、そして上述のように相対光単位（ＲＬＵ）シグナルを検出した。陽性対照および陰性対照に関しては、５つの複製試料を試験した。実験試料に関しては、各条件あたり１０の複製を試験した。これらのアッセイの結果（ＲＬＵ平均±標準偏差）を以下の表に示す。
表５：異なる増幅オリゴマーを用いて得たアッセイ結果
Figure 0005100956
結果は、プライマーとして用いたオリゴマーのどちらの組み合わせも、パルボウイルスＢ１９配列を増幅するアッセイにおいて、実質的に同等に働いたことを示す。どちらのアッセイ形式でも、２５０コピー以上のパルボウイルスＢ１９を含有する試料すべてに関して、陽性シグナルが検出され、そして１００コピーを含有する試料の７０〜８０％に関して、陽性シグナルが検出された。
同様の実験において、プライマーの他の組み合わせ：配列番号３のプロモーター・プライマーおよび配列番号１３、または配列番号２３のプロモーター・プライマーおよび配列番号１３を用いてアッセイを行った。これらのプロモーター・プライマーのパルボウイルスＢ１９特異的部分は、それぞれ、配列番号４（ＣＴＡＧＧＴＴＣＴＧＣＡＴＧＡＣＴＧＣＴＡＣＴＧＧＡ）および配列番号２４（上記を参照されたい）である。試験した試料は、パルボウイルスＢ１９をまったく含有しない（陰性試料）か、または反応あたり１，０００コピーのパルボウイルスＢ１９を含有するか、いずれかであった。各条件に関して、１０の複製試料を試験した。配列番号３および配列番号１３のプライマーの組み合わせに関して、該アッセイは、陽性試料に関して、２，６７８，７０９±５０７，２０９の平均ＲＬＵシグナルを、そして陰性対照に関して、１，８４１±１２８の平均ＲＬＵシグナルを生じた。配列番号２３および配列番号１３のプライマーの組み合わせに関して、該アッセイは、陽性試料に関して、４，０７４，９８９±１２３，４２０の平均ＲＬＵシグナルを、そして陰性対照に関して、３，４６２±２，９３６の平均ＲＬＵシグナルを生じた。したがって、増幅オリゴマーのさらなる組み合わせを用いて、試料において、パルボウイルスＢ１９ ＤＮＡの存在を検出するアッセイを行うことが可能である。
実施例７：異なる検出プローブを用いて行う、パルボウイルスＢ１９検出アッセイ
本実施例において、実質的に実施例５に記載する方法を用いることによって、パルボウイルスＢ１９をアッセイした。簡潔には、パルボウイルスをまったく含有しないヒト血漿（陰性対照）に、既知の量のパルボウイルスＢ１９（１ｍｌあたり１０，０００、５，０００、１，０００、５００、２５０、１００、５０、および２５コピーの最終濃度を達成する量）を添加して用い、試料を調製した。これらに加え、試験中に、陽性対照として、１ｍｌあたり１，０００コピーのパルボウイルスＢ１９を含有する、先に試験した既知の試料を含んだ。実質的に先に記載されるような方法を用いて（米国特許第６，１１０，６７８号）、まず、相補オリゴマー（配列番号１）へのハイブリダイゼーションによって、１ｍｌ試料からパルボウイルスＢ１９ ＤＮＡを捕捉し、これをその後、３’ポリ（Ａ）テールを介して、磁気ビーズに付着させた相補ポリ（Ｔ）オリゴマーにハイブリダイズさせることによって試料をアッセイした。その後、配列番号２３のプロモーター・プライマー（配列番号２４の標的特異的配列および配列番号１９のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んでなる）および配列番号１３のプライマーを含む、１時間のＴＭＡ反応において、パルボウイルスＢ１９ゲノム配列の標的位を増幅した。先に詳細に記載されるように（米国特許第５，５８５，４８１号および第５，６３９，６０４号）、反応中、２−メチル−ＡＥで標識した検出プローブを用いて、相対光単位（ＲＬＵ）を検出することによって、増幅産物を検出した。標準的な化学的方法を用いて、２’−Ｏ−メトキシ主鎖を持ち、そして配列番号１７（ｎｔ７および８の間で標識）、配列番号２７（ｎｔ５および６の間で標識）、および配列番号２８（ｎｔ９および１０の間で標識）のヌクレオチド配列を有するオリゴマーを産生することによって、検出プローブを合成した。２つの別個の組のアッセイ、配列番号１７および２７を用いることによって検出結果を得る一方のアッセイ、および配列番号１７および２８を用いることによって検出結果を得るもう１つのアッセイを行った（どちらの組のアッセイでも、反応あたり１ｘ１０6ＲＬＵを用いた）。各実験条件に関して、１０の複製試料をアッセイし、そして陽性（１，０００コピー）対照および陰性（０コピー）対照、並びにＮＩＢＳＣ標準（１，０００ゲノム均等物／ｍｌ）に関しては、５つの複製試料をアッセイした。これらの試験の結果（検出したＲＬＵ平均±標準偏差）を以下の表に示す。
表６：異なる検出プローブを用いた、増幅されたパルボウイルスＢ１９標的配列の検出
Figure 0005100956
結果は、異なる検出プローブを用いた３つのアッセイ形式が、反応性および感度において、実質的に均等であることを示した。すなわち、検出したＲＬＵが３０，０００以上である場合が陽性シグナルであることを踏まえて、３つの形式はすべて、試料１ｍｌあたり、１００コピー以上のパルボウイルスＢ１９を検出し、そしてより少ないコピー数のパルボウイルスＢ１９（２５および／または５０コピー／ｍｌ）を頻繁に検出した。
実施例８：異なる検出プローブを用いた、増幅されたパルボウイルスＢ１９配列の検出
本実施例は、個々の検出プローブまたは２つの異なる検出プローブの混合物を用いて、アッセイの感度を試験した。検出プローブの混合物は、等量の配列番号２７および配列番号２８のプローブを含有した。アッセイは、検出プローブ混合物を、いずれかの検出プローブ単独の使用に比較した。実質的に実施例５に記載するように、しかしパルボウイルスＢ１９をまったく含有しないヒト血漿（陰性対照）、あるいは１ｍｌあたり５００、２５０、１００、５０、または２５コピーのパルボウイルスＢ１９を含有する血漿試料を用いて、アッセイを行った；陽性対照は、１，０００コピー／ｍｌを含有した。上述のように、まず、３’ポリＡテールとともに配列番号１を有するオリゴマーを用いることにより、磁気粒子上のハイブリダイゼーション複合体中の、パルボウイルスＢ１９ ＤＮＡを捕捉することによって、試料（１ｍｌ）をアッセイした。その後、配列番号２３のプロモーター・プライマーおよび配列番号１３のプライマーを含む、１時間のＴＭＡ反応を用いることによって、パルボウイルスＢ１９標的配列を増幅した。配列番号２７または配列番号２８いずれかの検出プローブを個々に、あるいは配列番号２７および配列番号２８のプローブ混合物を用いることによって、増幅産物を検出した。プローブを２−メチル−ＡＥで標識し（配列番号２７のｎｔ５および６の間、並びに配列番号２８のｎｔ９／１０）、そして各プローブに関して、反応あたり１ｘ１０6ＲＬＵの活性で用いた。陽性対照および陰性対照に関して、５つの複製試料を試験し、一方、他の実験条件各々に関して、２０の複製試料を試験した。結果（ＲＬＵ平均±標準偏差）を以下に示す。
表７：標識プローブを単独で用いた、または標識プローブ混合物を用いた、検出結果
Figure 0005100956
結果は、単独のプローブおよび混合物中のプローブが、どちらも、行ったすべてのアッセイにおいて、５００コピー／ｍｌのパルボウイルスＢ１９を検出したことを示す。より少ないコピー数のパルボウイルスＢ１９を含有する試料もまた検出された（２５０コピー／ｍｌに関しては９０〜１００％、１００コピー／ｍｌに関しては７５〜８５％、そして５０コピー／ｍｌに関しては３０〜５０％）。３つのアッセイ形式の感度は、実質的に均等であった。
実施例９：異なる検出プローブを用いた、パルボウイルスＢ１９検出
本実施例において、実質的に実施例８に記載するような方法を用いて産生した、増幅された産物を、多様な検出プローブオリゴマーを用いて検出した。検出プローブオリゴマーは、ヌクレオチド配列が互いに異なるか、または同一ヌクレオチド配列を持つプローブオリゴマーに関しては、オリゴマーに付着する標識の位置が異なる。標準的な化学的方法を用い、すべてのプローブをｉｎ ｖｉｔｒｏで合成して、２’−Ｏ−メトキシ主鎖を持つ、明記した配列のオリゴマーを産生した。先に記載されるように（米国特許第５，５８５，４８１号および第５，６３９，６０４号）、標識化合物をオリゴマーに付着させるリンカー化合物を用いて、２−メチル−ＡＥでオリゴマーを標識し、そして反応あたり１ｘ１０6ＲＬＵの活性で用いた。オリゴマー上の標識位は、隣接するヌクレオチド位によって言及され、例えば「１２／１３」は、リンカーおよび付着した標識が、オリゴマーのｎｔ１２およびｎｔ１３の間に位置することを意味する。これらの実験で試験した検出プローブオリゴマーを以下に要約する。
表８：標識プローブ
Figure 0005100956
検出された平均ＲＬＵとして報告される、これらの検出プローブを用いたアッセイの結果を以下に示す。パルボウイルスＢ１９ ＤＮＡをまったく含有しないヒト血漿試料（陰性試料）、および１，０００コピー／ｍｌのパルボウイルスＢ１９を含有する血漿（陽性試料）の５つの複製アッセイにおいて、各プローブを試験した。各プローブに関して、平均ＲＬＵ結果を用い、陰性試料中で検出されるＲＬＵに対する、陽性試料中で検出されるＲＬＵの比（検出比）を決定した。
表９：異なる標識プローブを用いることによって得た結果
Figure 0005100956
Figure 0005100956
試験したプローブすべてが、陰性対照の少なくとも４倍多いシグナルを生じたため、結果によって、多様な異なる検出プローブを用いて、増幅産物中のパルボウイルスＢ１９配列を検出可能であることが示された。好ましい態様は、一般的に、１０以上の検出比を有する。より好ましくは、検出比は１００以上であり、そして最も好ましくは、３００〜９５０の範囲である。これらの結果によってまた、同一ヌクレオチド配列に関して、オリゴマー上の標識の位が、産生される検出シグナルに影響を与える可能性があることも示された。
本発明を、特定の実施例および好ましい態様の背景で記載してきた。当業者は、請求項に定義される他の態様が本発明に含まれることを認識するであろう。

Claims (25)

  1. 少なくとも２の別個の核酸増幅オリゴマーを含むヒト・パルボウイルスＢ１９核酸を検出するための組成物であって、前記オリゴマーは、
    （a）配列番号２４、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、該配列の５’末端につながれたプロモーター配列を含む前記配列と、配列番号１３、その相補配列、またはＲＮＡ均等物；
    （b）配列番号４、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、該配列の５’末端につながれたプロモーター配列を含む前記配列と、配列番号１３、その相補配列、またはＲＮＡ均等物；ならびに
    （c）配列番号６、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、該配列の５’末端につながれたプロモーター配列を含む前記配列と、配列番号１３、その相補配列、またはＲＮＡ均等物；
    からなるオリゴマー対群から選択される、前記組成物。
  2. 前記配列の５’末端につながれたプロモーター配列が、配列番号１９からなるプロモーター配列である、請求項１記載の組成物。
  3. 前記少なくとも２のオリゴマーに少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシ連結を含むオリゴマー主鎖がある、請求項１又は２記載の組成物。
  4. 請求項１又は２記載の組成物であって、ここで該組成物は（a）のオリゴマー対を含み、そしてここで該組成物がさらに以下：
    配列番号１７、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、該配列につながれた検出可能標識を有する前記配列；
    配列番号２７、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、該配列につながれた検出可能標識を有する前記配列；および
    配列番号２８、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、該配列につながれた検出可能標識を有する前記配列
    からなる群から選択される少なくとも１つのプローブオリゴマーを含む、組成物。
  5. 請求項４記載の組成物であって、ここで該組成物がさらに以下：
    配列番号１、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、および場合によって、パルボウイルス標的配列に非特異的な３’テール部分；
    配列番号２０、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、および場合によって、パルボウイルス標的配列に非特異的な３’テール部分；ならびに
    配列番号２１、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、および場合によって、パルボウイルス標的配列に非特異的な３’テール部分
    からなる群から選択される少なくとも１つの捕捉オリゴマーを含む、組成物。
  6. 請求項１又は２記載の組成物であって、ここで該組成物は（a）のオリゴマー対を含み、そしてここで該組成物がさらに以下：
    配列番号２７、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、該配列につながれた検出可能標識を有する前記配列；
    配列番号２８、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、該配列につながれた検出可能標識を有する前記配列；
    配列番号３０、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、該配列につながれた検出可能標識を有する前記配列；
    配列番号３１、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、該配列につながれた検出可能標識を有する前記配列；
    配列番号３２、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、該配列につながれた検出可能標識を有する前記配列；
    配列番号３４、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、該配列につながれた検出可能標識を有する前記配列；および
    配列番号３６、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、該配列につながれた検出可能標識を有する前記配列
    からなる群から選択される少なくとも１つのプローブオリゴマーを含む、組成物。
  7. 請求項６記載の組成物であって、ここで該組成物がさらに配列番号１、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、および場合によって、パルボウイルス標的配列に非特異的な３’テール部分のオリゴマー配列を有する捕捉オリゴマーを含む、組成物。
  8. 請求項１又は２記載の組成物であって、ここで該組成物が（b）又は（c）のオリゴマー対を含み、そしてここで該組成物がさらに配列番号１７、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、該配列につながれた検出可能標識を有するオリゴマー配列を有するプローブオリゴマーを含む、組成物。
  9. 請求項８記載の組成物であって、ここで該組成物がさらに以下：
    配列番号１、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、および場合によって、パルボウイルス標的配列に非特異的な３’テール部分；および
    配列番号２、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、および場合によって、パルボウイルス標的配列に非特異的な３’テール部分
    からなる群から選択される少なくとも１つの捕捉オリゴマーを含む、組成物。
  10. 生物学的試料において、ヒト・パルボウイルスＢ１９核酸を検出する方法であって：
    パルボウイルスＢ１９核酸を含有する生物学的試料を提供し；
    少なくとも１つの核酸ポリメラーゼ活性、並びに１つの第一の増幅オリゴマーおよび１つの第二の増幅オリゴマーを含む少なくとも２の別個の核酸オリゴマーを用いて、パルボウイルスＢ１９核酸の部分をｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅し、ここで、該増幅工程は実質的に等温の増幅反応を用いるものであり、そしてここで、
    第一の増幅オリゴマーが、配列番号２４からなる配列、その相補配列、またはＲＮＡ均等物からなるオリゴマー配列であり、該配列の５’末端につながれたプロモーター配列を含み、および
    第二の増幅オリゴマーが、配列番号１３からなる配列、その相補配列、またはＲＮＡ均等物からなるオリゴマー配列であり；そして
    パルボウイルスＢ１９核酸の増幅された産物に特異的にハイブリダイズして、それによって生物学的試料におけるパルボウイルスB１９核酸の存在を示す標識された検出プローブを用いることによって、増幅された該産物を検出し、ここで該検出プローブは以下：
    配列番号１７からなるオリゴマー配列、その相補配列、もしくはＲＮＡ均等物；
    配列番号２７からなるオリゴマー配列、その相補配列、もしくはＲＮＡ均等物；または
    配列番号２８からなるオリゴマー配列、その相補配列、もしくはＲＮＡ均等物からなるものである
    工程を含んでなる、前記方法。
  11. 前記検出工程が、少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシ連結を含むオリゴマー主鎖を含んでなる、標識された検出プローブを用いる、請求項１０記載の方法。
  12. 前記検出工程が、均質（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）反応において検出される標識を含む、標識された検出プローブを用いる、請求項１０または１１記載の方法。
  13. 前記検出工程が、リンカー化合物を介してオリゴマーに付着した化学発光標識を含む、標識された検出プローブを用いる、請求項１０〜１２のいずれか１項記載の方法。
  14. パルボウイルスＢ１９標的配列にハイブリダイズする標的特異的配列を含んでなる、少なくとも１つの捕捉オリゴマーと生物学的試料とを接触させ、こうして、捕捉オリゴマーおよびパルボウイルスＢ１９核酸を含んでなる複合体を形成し；そして
    増幅工程前に、生物学的試料から該複合体を分離する
    工程をさらに含んでなる、請求項１０〜１２のいずれか１項の方法。
  15. 前記捕捉オリゴマーが、配列番号１、配列番号２０、もしくは配列番号２１、またはそのＲＮＡ均等物に含有される標的特異的配列の、少なくとも２５の隣接する塩基を含んでなる、請求項１４の方法。
  16. 前記捕捉オリゴマーが、少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシ連結を含む主鎖を含んでなる、請求項１４又は１５の方法。
  17. 生物学的試料において、ヒト・パルボウイルスＢ１９核酸を検出する方法であって：
    パルボウイルスＢ１９核酸を含有する生物学的試料を提供し；
    少なくとも１つの核酸ポリメラーゼ活性、並びに１つの第一の増幅オリゴマーおよび１つの第二の増幅オリゴマーを含む請求項１記載の少なくとも２の別個の核酸オリゴマーを用いて、パルボウイルスＢ１９核酸の部分をｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅する工程であって、ここで、該増幅工程は実質的に等温の増幅反応を用いる工程；および
    パルボウイルスＢ１９核酸の増幅された産物に特異的にハイブリダイズする、標識された検出プローブを用いることによって、増幅された該産物を検出し、それによって生物学的試料におけるパルボウイルスＢ１９核酸の存在を示す工程を含んでなる、前記方法。
  18. 請求項１７に記載の方法であって、ここで前記増幅工程で使用される前記少なくとも２の別個の核酸オリゴマーが配列番号１９からなるプロモーター配列を含む、方法。
  19. 請求項１７又は１８に記載の方法であって、ここで前記増幅工程で使用される前記少なくとも２の別個の核酸オリゴマーに少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシ連結を含むオリゴマー主鎖がある、方法。
  20. 請求項１７又は１８に記載の方法であって、ここで前記標識された検出プローブが以下：
    配列番号１７、その相補配列、またはＲＮＡ均等物；
    配列番号２７、その相補配列、またはＲＮＡ均等物；および
    配列番号２８、その相補配列、またはＲＮＡ均等物
    からなる群より選択される少なくとも１つのオリゴマーを含む、方法。
  21. 請求項２０に記載の方法であって、パルボウイルスＢ１９核酸を少なくとも１つの捕捉オリゴマーに特異的にハイブリダイズさせるための標的捕捉工程をさらに含み、ここで前記少なくとも１つの捕捉オリゴマーは以下：
    配列番号１、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、および場合によって、パルボウイルス標的配列に非特異的な３’テール部分；
    配列番号２０、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、および場合によって、パルボウイルス標的配列に非特異的な３’テール部分；ならびに
    配列番号２１、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、および場合によって、パルボウイルス標的配列に非特異的な３’テール部分
    からなる群より選択される、方法。
  22. 請求項１７又は１８に記載の方法であって、ここで前記増幅工程が、配列番号２４、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、該配列の５’末端につながれたプロモーター配列を含む前記配列と、配列番号１３、その相補配列、またはＲＮＡ均等物を用いて行われ；そしてここで前記標識された検出プローブは以下：
    配列番号２７、その相補配列、またはＲＮＡ均等物；
    配列番号２８、その相補配列、またはＲＮＡ均等物；
    配列番号３０、その相補配列、またはＲＮＡ均等物；
    配列番号３１、その相補配列、またはＲＮＡ均等物；
    配列番号３２、その相補配列、またはＲＮＡ均等物；
    配列番号３４、その相補配列、またはＲＮＡ均等物；および
    配列番号３６、その相補配列、またはＲＮＡ均等物
    からなる群より選択される、方法。
  23. 請求項２２に記載の方法であって、パルボウイルスＢ１９核酸を１つの捕捉オリゴマーに特異的にハイブリダイズさせるための標的捕捉工程をさらに含み、ここで前記捕捉オリゴマーは配列番号１、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって、パルボウイルス標的配列に非特異的な３’テール部分を含むものである、方法。
  24. 請求項１７又は１８に記載の方法であって、ここで前記増幅工程が（ｂ）配列番号４、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、該配列の５’末端につながれたプロモーター配列を含む前記配列と、配列番号１３、その相補配列、またはＲＮＡ均等物を用いて行われるか；または（ｃ）配列番号６、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、該配列の５’末端につながれたプロモーター配列を含む前記配列と、配列番号１３、その相補配列、またはＲＮＡ均等物を用いて行われ；そしてここで前記標識された検出プローブオリゴマーは、配列番号１７、その相補配列、またはＲＮＡ均等物のオリゴマー配列を有し、該配列につながれた検出可能標識を有するプローブオリゴマーである、方法。
  25. 請求項２４に記載の方法であって、パルボウイルスＢ１９核酸を１つの捕捉オリゴマーに特異的にハイブリダイズさせるための標的捕捉工程をさらに含み、ここで前記捕捉オリゴマーは以下：
    配列番号１、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって、パルボウイルス標的配列に非特異的な３’テール部分を含むもの；および
    配列番号２、その相補配列、またはＲＮＡ均等物であって、場合によって、パルボウイルス標的配列に非特異的な３’テール部分を含むもの
    からなる群より選択される、方法。
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