KR20050095584A - Ｂ형 간염 바이러스의 약물 저항성을 식별하는 방법 - Google Patents

Abstract

HBV 약물 저항성을 간편하게 식별하는 방법을 제공한다.

B형 간염 바이러스 (HBV) 코어 프로모터 영역의 핵산 서열에서 유전자 변이를 확인하는 것으로 구성되는 HBV 약제 저항성을 식별하는 방법.

Description

Ｂ형 간염 바이러스의 약물 저항성을 식별하는 방법{Method of distinguishing drug-resistance of hepatitis B virus}

본 발명은 예컨대 라미부진 등의 B형 만성 간염 치료약에 대한 B형 간염 바이러스(HBV)의 저항성을 HBV 코어 프로모터 영역에서 유전자형을 확인하는 것에 의해 식별하는 방법에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(HBV)의 감염자는 세계에서 약 3억명에 달하는 것으로 추산되고 있다. HBV 감염은 급성 및 만성 간염(B형 간염)을 유발하고 또 간경변, 간암의 원인으로 된다.

B형 간염의 진단에는 간조직 찰영 이외에 ALT, HBsAg, HBsAb, HBcAb, HBeAg, HBeAb, HBV 폴리머라제, HBV-DNA 양 등의 혈청 마커가 사용된다. 이 중에서 항 바이러스제 치료효과의 판정에는 혈중 HBV-DNA양이 중시되고 있다. 즉, HBV-DNA 양이 현저하게 저하 또는 측정 감도 이하로 되고 그 상태가 장기간에 걸쳐 유지되며 그 외 지표도 양호한 경우, 높은 치료효과를 나타내었다고 판정된다.

HBV 유전자는 약 3,200 염기쌍으로 구성된 환상의 불완전 2중쇄 DNA이다. 이 HBV 유전자의 복제에는 역전사 과정이 존재한다. 복제과정은 대별하면 다음 4단계로 구분될 수 있다.

① 세포 핵내에서 내인성 DNA 폴리머라제에 의해 완전 2중쇄 환상 DNA로 되고, 이것이 폐환되어 폐환 2중쇄 DNA(covalently closed circular DNA: cccDNA)로 되는 단계. 이 cccDNA는 초나선 구조를 취하고 있다.

② cccDNA를 주형으로 하여 세포의 RNA 폴리머라제 II에 의해 mRNA가 전사되는 단계. 이 중에서 최장 3.5 kb의 것이 pregenome RNA로서 역전사의 주형으로 된다. 이 RNA의 5' 및 3' 말단 "ε" 시그널(encapsidation signal)이 존재하고, 이 중 5'측의 시그널이 pregenome RNA 및 바이러스 폴리머라제의 코어의 입자내로 팩케이징하는데 중요한 작용을 하는 것으로 추정되고 있다.

③ 코어 입자내에서 RNA 의존성 DNA 폴리머라제에 의해 프라이머로서 올리고뉴클레오티드가 합성되며, pregenome RNA를 주형으로 하여 역전사에 의해 (-)쇄 DNA가 합성되는 단계.

④ pregenome RNA의 5' 말단에 남겨진 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하고 (-)쇄 DNA를 주형으로 하여 (+)쇄 DNA가 합성되는 단계.

이들 과정의 어떤 것을 저해하는 것에 의해 HBV 유전자의 복제는 중지되며, 바이러스의 증식이 억제되는 것으로 생각된다. 특히 HBV의 복제에는 역전사 과정이 있고 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)도 그 증식에 역전사 과정을 갖고 있기 때문에 치료약으로서 RNA 의존성 DNA 폴리머라제 저해제의 스크리닝이 실시되어져 왔다.

라미부진도 인간면역 결핍 바이러스(HIV)의 복제 과정에 있는 역전사를 특이적으로 저해하는 점에서 당초는 HIV 치료제로서 개발되었으나, HBV에 대해서도 증식억제 효과를 나타내는 것을 알게되어 1992년 부터 B형 만성 간염의 치료약으로서 개발이 시작되었다.

라미부진의 HBV에 대한 작용기전은 확실히 알려져 있지는 않지만 다음과 같이 생각되어 지고 있다. 라미부진은 뉴클레오시드(시티딘) 유도체의 항 바이러스제이고 세포내에서 삼인산 유도체에 의해 인산화되어 활성형으로 된다. 이 약제의 HBV에 대한 증식억제 기구의 하나는 RNA 의존성 DNA 폴리머라제(역전사효소) 저해에 의해 프리게놈 RNA의 역전사를 저해하는 것이다.

또 다른 하나의 기구로서, 바이러스 DNA 쇄에 들어가서 그의 신장을 중지시키는 것도 고려되고 있다. 또한 면역계에 대한 간접적인 영향으로서 라미부진 투여에 의해 바이러스의 감소가 생기면, 혈류중의 바이러스 단백질이 감소되며 HBV 항원에 대한 T 세포의 낮은 반응성이 회복되는 것도 보고되어 있다(Boni C et al. Journal of Clinical Investigation, 102, 968-975, 1998).

이와 같은 작용 기구에 의해, HBV 감염증의 치료약으로서 라미부진은 널리 사용되어 왔으나, 혈중 바이러스양이 감소되기 어려운 증례도 존재하고, 그 후의 내성주 출현 및 간염재발이 문제되는 수가 많다. 라미부진이 보다 효과적인 증례를 선택하기 위한 바이러스 측의 유전자 변화와 치료효과의 관계를 논한 연구로서 주로 라미부진의 타겟인 DNA 폴리머라제의 B 및 C 도메인에 대한 것은 다수 알려져 있지만(Ono-Nita SK et al. Hepatology, 29, 939-945, 1999)(Allen MI et al. Hepatology, 27, 1670-1677, 1998), 그 이외의 영역에 관해서 검토된 보고는 적다.

또한 HBV의 유전자형의 연구로서, HBs 영역의 서열을 비교하여 Genotype A.D의 유전자형을 결정한 예가 보고되어 있다(Journal of Medical Virology, 2002, 68, 522-528). 이 보고는 이 유전자형의 상이함에 의해, HBV에 대한 인터페론의 치료효과가 상이한 것을 나타내고 있다. 또한 코어 프로모터 영역의 유전자에서 HBV-DNA의 1896번째의 염기 G가 A로, 1899번째의 염기 G가 A로 변이되어 있는 것도 보고되어 있다. 그러나, 이들 유전자의 변화는 바이러스의 유전자형이 아니라 감염후의 변이로 생각되고 있고, 또 HBV 치료와의 관계는 명확하게 되어 있지 않다(가라사와 타츠노부, 일본임상 증간호, 분자 간염 바이러스병학 기초.임상.예방 하권 A,B,D,E형 간염 바이러스, 1995년, 52-57). 이와 같이 코어 프로모터 영역의 유전자 변이는 보고되어 있지만, 이 영역의 변이가 HBV의 유전자형이라는 개념은 보고되어 있지 않다.

비특허문헌 1

Ono-Nitta 등, Hepatology, 29, 939-945, 1999

비특허문헌 2

Allen MI 등, Hepatology, 27, 1670-1677, 1998

비특허문헌 3

Yuh 등, Journal of Virology, 66, 4073-4084, 1992

비특허문헌 4

Honigwachs 등, Journal of Virology, 63, 919-924, 1989

비특허문헌 5

Lopez-Cabrera 등, Proceedings of the national Academy of Science of the United States of America, 87, 5069-5073, 1990

비특허문헌 6

카와사와 타츠노부 등, 일본임상 증간호, 분자 간염 바이러스병학 기초.임상.예방 하권 A,B,D,E형 간염 바이러스, 1995년, 52-57)

도 1-1은 라미부진 치료를 실시한 환자의 HBV 코어 프로모터 영역의 핵산서열을 비교한 것을 나타낸다. 최상단이 원래 서열, 상단 31검체가 라미부진 치료효과가 있는 검체, 하단 12검체가 치료효과가 없었던 검체를 나타낸다.

도 1-2는 라미부진 치료를 실시한 환자의 HBV 코어 프로모터 영역의 핵산서열을 비교한 것을 나타낸다. 최상단이 원래 서열, 상단 31검체가 라미부진 치료효과가 있는 검체, 하단 12검체가 치료효과가 없었던 검체를 나타낸다.

도 1-3은 라미부진 치료를 실시한 환자의 HBV 코어 프로모터 영역의 핵산서열을 비교한 것을 나타낸다. 최상단이 원래 서열, 상단 31검체가 라미부진 치료효과가 있는 검체, 하단 12검체가 치료효과가 없었던 검체를 나타낸다.

발명이 해결하고자하는 과제

HBV 감염을 약물적으로 치료함에 있어서 당해 약물의 효과를 HBV와 관련하여 객관적으로 아는 것은 치료방침 및 약물의 선택에 대하여 유익한 정보로 된다. 본 발명은 HBV 간염에 대한 치료방침과 약물의 선택에 대한 유익한 정보를 유전자공학적 견지로 부터 입수하는 방법을 제공하는 것이다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은 HBV 간염 치료를 약물적으로 실시할 때의 효과가 바이러스측의 요인에 의해 영향을 받는 것을 가정하고, 바이러스의 증식과정에 관계가 있는 유전형의 상이함, 특히 HBV의 코어 프로모터 영역에서 염기 서열의 다양성이 HBV에 대한 약물 효과의 상이함에 관여하고 있는 것을 새로이 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉 본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV) 코어 프로모터 영역의 핵산 서열에서 유전자 변이를 확인하는 것으로 구성되는 HBV의 약제저항성을 식별하는 방법이다.

또한 본 발명은 혈중의 HBV-DNA를 단리 정제하고, PCR에 의해 HBV 코어 프로모터 영역을 증폭시키며, 염기 서열을 결정하는 것에 의해 약제 치료 효과를 좌우하는 코어 프로모터 유전자의 변이를 확인하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 라미부진으로 대표되는 RNA 의존성 DNA 폴리머라제 저해 효과를 갖는 약제에 의한 B형 간염 바이러스(HBV) 감염의 치료 효과를 예측하는데 도움이 되는 것으로, HBV 코어 프로모터 핵산 서열의 변화(변이)를 확인(검출)하는 방법에 관한 것이다. 특히 HBV 코어 프로모터 핵산 서열의 변이를 적어도 1개 확인(검출)하는 것에 의해 약물 투여후의 혈중 HBV양의 저하를 예측하는데 도움이 된다.

또한 본 발명은 HBV 코어 프로모터 핵산 서열의 특정 부분 서열(예컨대 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7에 기재된 서열)의 적어도 1개의 변이를 확인(검출)하는 것, 바람직하게는 서열번호 1에 기재된 7번째의 핵산 C, 28번째의 핵산 T, 33번째의 핵산 A, 57번째의 핵산 A, 73번째의 핵산 T, 106번째의 핵산 A, 107번째의 핵산 T, 200번째의 핵산 A, 250번째의 핵산 G, 또는 253번째의 핵산 G 중 어느 하나 또는 그 이상의 핵산이 변화되어 있는 것을 확인(검출)하는 것에 관한 것이다.

본 발명은 또한 바람직하게는 서열번호 1에 기재된 7번째의 핵산 C가 T, 또는 28번째의 핵산 T가 C, 또는 33번째의 핵산 A가 G, 또는 57번째의 핵산 A가 G 또는 C, 또는 73번째의 핵산 T가 G, 또는 106번째의 핵산 A가 T 또는 C 또는 G, 또는 107번째의 핵산 T가 C 또는 G, 200번째의 핵산 A가 T 또는 C, 250번째 핵산 G가 A, 253번째의 핵산 G가 A로 되어 있는 어느 하나 또는 그 이상의 변이를 확인(검출)하는 것에 관한 것이다. HBV 약제 저항성 또는 감수성의 상이함은 HBV의 유전자형에 의한 종류의 상이함에 기인하는 것으로 생각된다. 이 때문에 본 발명은 HBV의 코어 프로모터에 상술한 변이 중의 어느 하나를 갖는 HBV의 유전자형을 제공한다. 이 유전자형을 이용하는 약제저항성의 예측 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 HBV의 유전자형을 확인하는 방법도 제공한다.

본 발명은 유전자의 변이를 확인(검출) 검출하는 방법이 핵산의 서열을 결정하는 방법인 것을 포함한다. 또한 프로브 또는 프라이머로서는 핵산을 사용한 핵산 끼리의 2중쇄 형성(하이브리다이제이션)을 이용한 방법인 것을 포함한다.

또한 본 발명은 상기 HBV의 코어 프로모터 영역의 유전자 변이를 검출하기 위한 진단약, 진단 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 HBV의 코어 프로모터의 서열번호 1 또는 그의 일부의 유전자 서열을 갖는 핵산을 사용한 새로운 HBV 치료약에 관한 것이다. 이러한 핵산은 (데코이) 핵산으로서 HBV 코어 프로모터의 야생주의 유전자 서열을 타겟으로 하는 단백질에 특이적으로 결합하여 본래의 타겟인 HBV 자신의 코어 프로모터으로의 상기 단백질의 결합을 길항적으로 방지하는 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명의 데코이 핵산을 생체에 투여하는 것에 의해 HBV 코어 프로모터로부터의 전사를 억제하고 HBV의 증식을 저해하는 것이 가능하게 된다.

HBV의 코어 프로모터 영역은 보고에 따라 다소의 차는 있지만, 기본적으로는 전사 개시부위의 상류 약 200 bp 까지가 코어 프로모터 영역으로서 확인되어 있다( Yuh CH et al, Journal of Virology, 66, 4073-4084, 1992; Honigwachs J et al, Journal of Virology, 63, 919-924, 1989; Lopez-Cabrera M et al, Proceedings of the national Academy of Science of the United States of America, 87, 5069-5073, 1990).

본 발명에서는 설명의 편의상 염기서열의 번호를 HBV의 2중쇄 DNA의 제한효소 EcoRI 부위 GAATTC의 최초의 T를 핵산번호 1로서 표기한다. 이 편의적인 번호를 사용한 경우에, 본 발명에서 말하는 HBV의 코어 프로모터 영역은 핵산번호 1631부터 코어 단백질의 개시 아미노산 까지의 핵산번호 1900으로 규정된다.

이 영역에는 증식에 중요한 엔헨서 II 영역(Enh II) 및 프리게놈 RNA의 코어 입자에 포함되는데 필요한 엔캡시데이션 시그널(ε) 영역이 존재하고, HBV의 DNA 폴리머라제나 간세포 특이적인 핵내인자의 결합부위로 되어 있기 때문에 한번 변이가 생기면 바이러스의 증식, 복제에 중요한 변화가 생기게 되는 것으로 생각된다. 이 ε영역은 HBV의 DNA 폴리머라제의 프라이밍 및 역전사 활성에 필요하다(Urban M., et al. Journal of General Virology (1998), 79, 1121-2231). 또한 엔헨서 II 영역(EnhII)에는 footprinting 또는 methylation interference에 의해 확인되는 footprintII 또는 Boxα, footprintI, Boxβ의 조절 엘리먼트가 존재하고 있다.

본 발명은 폴리머라제 등이 결합되는 영역 및 바이러스 유전자 복제 조절에 중요한 역할을 하고 있는 엔헨서 영역에 착안하여, B형 간염의 치료약, 특히 라미부진의 치료효과에 영향을 주는 코어 프로모터의 유전자 변이를 확인하는 것이다.

본 발명에 의해 B형 만성 간염환자의 치료전 진단에 유용한 HBV 코어 프로모터 유전자 변이를 검출하는 것에 의해 약제내성주나 간염재발이 적은 테일러메드(맞춤)의료에 공헌할 수 있고, 또 새로운 진단약을 개발할 수 있다. 또한 라미부진 등의 역전사 저해제로 치료효과를 높이기 어려운 바이러스가 확인될 수 있기 때문에 이와 같은 변이 바이러스의 서열을 사용하는 것에 의해 이러한 바이러스에도 효과가 높은 신규 항 HBV 약의 개발에 유익할 수 있다.

본 발명은 구체적으로는 코어 프로모터 영역의 핵산 서열을 확인하여 HBV의 유전자 변이를 확인하는 것을 포함하는 방법이다. 이 영역은 바이러스의 증식에 중요한 부위이고, 유전자 서열의 상이에 의해 HBV의 치료에 시용될 수 있는 약제에 대한 감수성이 상이해지는 관계를 갖는 것이 본 발명자들의 연구에 의해 연역적으로 증명되었다. 이 연구 과정에서 코어 프로모터 영역 중에서도 6개의 짧은 영역, 또한 그 중에서도 어떤 특정 핵산 서열의 변화를 확인하는 것에 의해 HBV의 약물 저항성의 상이함을 간편하게 식별할 수 있는 것을 밝혀내었다.

이하 대표적인 HBV 치료약인 라미부진을 예로 하여 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 라미부진의 치료에만 한정되는 것은 아니다.

HBV의 대표적인 치료약인 라미부진에 의한 치료는 혈중 바이러스양을 나타내는 HBV-DNA양 및 간세포내의 바이러스양을 반영하는 마커인 HBe 항원양의 고역가 증례에서 바이러스양이 감소하기 어려운 예가 다수 존재하고, 그 후 내성주 출현이나 간염재발이 문제가 되는 경우가 많다.

그러나, HBV-DNA양 및 HBe 항원양의 고역가 증례에서도 라미부진이 주효하고 혈중의 HBV-DNA양을 신속하게 감소시켜 간염을 진정화시키는 증례가 존재한다.

본 발명자들은 라미부진 치료를 받은 B형 만성 간염 환자의 치료전 혈청과 치료 개시 6개월후의 혈청을 사용하여 TMA법에 의해 혈중 HBV-DNA양을 측정하고, 치료 6개월 후의 HBV-DNA양이 검출감도 미만(5000 copies/ml 미만)으로 저하된 경우, 바이러스 음성군으로 판정하고, 그 이상인 경우를 바이러스 양성군으로 하여, 유의차 검정에 의해 예후인자를 검색하였다.

이어 로쿠하라 등(Journal of Medical Virology, 62, 471-478, 2000)의 방법에 의해, 수집한 치료전의 혈청 검체로 부터 시판되는 핵산 추출 키트를 사용하여 HBV-DNA를 추출하고, PCR법을 이용하여 HBV 코어 프로모터 영역을 증폭시키며 3% 아가로오스 겔에 의해 전기영동시킨 후, 겔로 부터 양성 밴드를 잘라내고, 핵산을 정제시키고, 직접 시퀀싱법에 의해 염기서열을 결정하였다. 또한 치료전의 코어 프로모터 영역의 염기서열과 야생주를 비교하는 것에 의해 유전자 변이를 유발하고 있는 부위를 선별하고, 치료 6개월 후의 바이러스 양성군과 음성군을 지표로 유의차 검정을 실시하여 라미부진 치료 효과를 예측할 수 있는 유전자 변이부위를 해석하였다.

그 결과, 종래 보고되어 있는 HBe 항원양성, HBV-DNA 양이 유의한 예후 마커로서 추출되어 왔지만, 연령, 성별, 병력, 병 유형, 혈소판치, 알부민치, ALT치,빌리루빈치에 유의차는 보이지 않았다. 그러나, 코어 프로모터 영역의 유전자 변이를 해석하면, 3개소에서 유의한 라미부진 치료효과와 관련되는 유전자 변이가 검출되었다.

또한 그의 HBV 코어 프로모터 영역에서 유전자 변이가 적어도 1개라도 있는 경우에서는 6개월후의 바이러스 양성군과 음성군 사이에 유의차(P<0.0001)가 확인될 수 있어, 이 변이를 확인하는 것으로 라미부진의 치료효과를 예측할 수 있는 것이 증명되었다. 이 유전자 변이를 갖는 HBV와 갖지 않는 HBV는 상이한 유전자형의 HBV로 생각된다. 이 유전자형의 상이함은 HBV의 증식능 등의 생물학적 기능과도 상관되어 있는 가능성이 있다.

이와 같이 본 발명의 HBV 코어 프로모터 영역의 변이는 HBV의 DNA 폴리머라제나 간세포 특이적인 핵내인자에 관계되는 HBV의 증식. 복제의 저해효과에 관련되는 것이 명확하게 되어, 이 변이를 확인하는 것에 의해 라미부진 치료의 주효율의 향상을 촉진할 수 있다. 따라서, HBV의 코어 프로모터 영역의 유전자 변이가 라미부진 치료 효과의 예측 마커로서 이용될 가능성이 있다.

발명의 실시형태

본 발명의 유전자 변이를 확인 검출하는 방법은 예컨대 HBV의 코어 프로모터 영역의 핵산 서열을 결정하는 것에 의해 실시하는 것이 가능하다. 핵산 서열 결정 방법은 기본적으로는 Maxam & Gilbert법 또는 디데옥시법의 개량법이 사용되고 있다. 이들의 상세한 해설은 「Molecular cloning: A LABORATORY MANUAL, THIRD EDITION (COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, Cold Spring Harbor, New York)」에 상술되어 있다. 또한 각종 키트가 다수의 메이커로 부터 발매되고 있고, 이들도 이용가능하다.

핵산서열을 결정하기 위한 DNA는 PCR로 본 발명의 코어 프로모터 영역을 증폭시키고, 그대로 다이렉트 시퀀싱법으로 핵산의 서열을 선택하여도 좋다. 또한 한번 PCR 산물을 벡터에 클로닝하여 핵산의 결정을 실시하여도 상관없다. 또는 점 돌연변이를 붙이는 시퀀싱법을 이용하여도 좋다.

본 발명의 핵산서열의 변이를 검출하는 방법은 유전자 서열을 결정하는 이외에도 1 염기로 부터 수 염기의 상이함을 검출하는 방법이면 어떤 방법이라도 사용할 수 있다. 예컨대 SSCP, DGGE, CFLP, RFLP 와 같은 유전자 변이의 검출법이 이용가능하다. 또한 1 염기 변이의 SNP의 검출에 이용되고 있는 임베더법도 이용가능하다. 또한 상보적인 핵산이 이중쇄를 형성하는 하이브리다이제이션의 원리를 이용한 변이 검출법도 전부 이용가능하다. 이들 유전자, 핵산 변이의 검출법은 프로브 또는 프라이머를 사용한 방법 또는 이들을 조합한 방법이 있다. 이들의 프로브 또는 프라이머는 핵산에 한정되지 않고 표적하는 핵산과 하이브리다이제이션으로 결합가능한 것이 포함될 수 있다.

이하의 실시예는 본 발명을 증명하는 것이지만, 이들에 의해 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 라미부진 치료와 바이러스 음성화에 관여하는 예후인자의 검색

만성 B형 간염 감염환자 53명(남성 40명, 여성 13명, 평균 연령 49.8±9.4세, 만성 간염 38명, 간경변 15명)에 라미부진을 100 mg/day 경구투여에 의해 매일 투여하고 투여전의 데이터 및 투여후의 데이터를 해석하였다. 라미부진 투여 6개월의 시점에서 HBV-DNA량이 TMA법에 의해 감도 미만(3.7 LGE/mL 미만)으로 저하된 때, 바이러스 음성화로 판정하였다.

바이러스가 음성화된 사람과 양성인 채로 있는 사람에 관하여 연령, 성별, HBeAg 양성률, 치료전의 HBV DNA 양, 병력, 병 유형, 혈소판치, 알부민, ALT, 빌리루빈치 등에 관하여 치료효과의 예측인자로 될 수 있는지에 관하여 Fisher의 직접법, Mann-Whitney U 검정에 의해 유의차를 검정하였다.

표 1로 부터, 종래 보고되어 있는 HBe항원양성, HBV-DNA양이 유의한 예후 마커로서 추출되어 왔지만, 연령, 성별, 병력, 병 유형, 혈소판치, 알부민치, ALT치, 빌리루빈치에 유의차는 보이지 않았다.

<실시예 2> HBV 코어 프로모터 영역의 염기서열의 결정

실시예 1에서 라미부진 치료를 실시한 53명 중, 43명의 치료 전 환자 혈청 50 ㎕로 부터 바이러스 DNA를 추출 키트(스마이테스트, (주식회사) 게놈사이언스 연구소 제조)를 이용하여 매뉴얼에 따라서 추출하였다.

추출 DNA 2㎕, 0.5U의 AmpliTaq Gold (PE applied Biosystems)를 반응액(200μM dNTP, 50 mM KCL, 10 mM Tris-HCL [pH 8.3], 2.0 mM MgCl2, 0.001% gelatin) 25㎕에 가하고, is2:5'-GAG ACC ACC GTG AAC GCC CA (1611-1630) 및 CB4: 5'-AAA AGA GAG TAA CTC CAC AG (1954-1935)의 각 프라이머 0.25 mM으로 증폭시켰다.

PCR protocol은 예열한 후 94℃, 30초, 55℃, 1분의 사이클을 43 사이클 반복하였다. 서멀 사이클러는 DNA Engine (MJ Research Corp. Watertown, MA)을 이용하였다. PCR 음성 검체는 outer primer set에 의해 1st PCR 을 실시한 후, 2nd PCR은 30 사이클로 하였다. 이 PCR에 의해 음성이었던 검체는 outer primers set로서 es2:5'-ACG TCG CAT GGA GAC CAC CG (1601-1620), CB2:5'-GGA AAG AAG TCA GAA GGC AA (1974-1955)를 이용하고, 1st PCR을 실시한 후에 is2와 CB4의 프라이머에 의해 30 사이클의 2nd PCR을 실시하였다.

이 PCR 산물을 3% 아가로오스 겔에서 전기영동한 후, 겔로 부터 밴드를 절취하고, GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotec Inc)에 의해 정제하였다. 시퀀스는 디데옥시법인, Taq Dye Deoxy Terminator cycle sequencing kit에 의해 반응시키고, fluroescent DNA seqeuncer (Applied Biosystems)에 의해 해석하였다. 서열을 결정한 43명의 환자의 코어 프로모터 영역 서열을 도 1-1 내지 도 1-3에 나타낸다.

H5부터 262 까지의 31 검체가 라미부진 치료에 의해 6개월 후에 혈중의 DNA 양이 검출 한계 이하로 감소된 환자의 서열이다. A17 부터 A5 까지의 11 검체가 DNA가 검출 한계 이하까지 감소되지 않고 라미부진 치료효과가 적었던 환자의 서열이다.

각 도의 가장 위의 예는 원래 서열(야생형)의 서열을 나타내고 있다. 각 도의 상단 31 검체와 하단 12검체에서는 서열에 상이함이 있는 것을 알 수 있다. 또한 그 상이함은 일정한 영역에 집중되어 있는 것이 확실하다. 라미부진의 효과가 있는 군(효과군)에서는 염기번호에서 1671~1682번째의 영역(서열번호 2)에 원래 서열과 상이한 서열을 가진 검체가 많다. 특히 1674번째(서열번호 1의 28번째)의 핵산 T가 C로, 1679번째(서열번호 1의 33번째)의 A가 G로 변화되어 있지만, 라미부진의 효과가 없는 군(비효과군)에서는 그와 같은 변화는 보이지 않았다.

또한 라미부진의 치료 효과를 나타낸 군에서는 염기번호에서 1701~1721번째의 영역(서열번호 3)에 원래 서열과 상이한 서열을 가진 검체가 많다. 특히 1703번째(서열번호 1의 57번째)의 핵산 A가 C 또는 G로, 1719번째(서열번호 1의 73번째)의 T가 G로 변화되어 있지만, 라미부진의 치료효과를 나타내지 않았던 비효과군에서는 그와 같은 변화는 보이지 않았다.

마찬가지로, 효과군에서는 염기번호에서 1736~1761번째의 영역(염기번호 4)에 원래 서열과 상이한 서열을 가진 검체가 많다. 특히 1752번째(서열번호 1의 106번째)의 핵산 A가 T 또는 C 또는 G로, 1753번째 (서열번호 1의 107번째)의 T가 G 또는 C로 변화되어 있지만, 비효과군에서는 그와 같은 변화는 보이지 않았다.

또한 효과군에서는 염기번호에서 1799~1817 영역(서열번호 5)에 원래 서열과 상이한 서열을 가진 검체가 많고, 1802번째, 1803번째, 1809번째, 1810번째, 1811번째, 1812번째, 1814번째에 변화가 보이지만, 비효과군에서는 그와 같은 변화는 보이지 않았다. 또한 효과군에서는 1843-1860번째의 영역(서열번호 6)에 원래 서열과 상이한 서열을 가진 검체가 많다. 특히 1846번째(서열번호 1의 200번째)의 핵산 A가 T 또는 C로 변화되어 있지만, 비효과군에서는 그와 같은 변화는 보이지 않는다. 효과군에서는 1893-1902 번째의 영역(서열번호 7)에 원래 서열과 상이한 서열을 가진 검체가 많다. 특히 1896번째 (서열번호 1의 250번째)의 핵산 G가 A로, 1899번째 (서열번호 1의 253번째)의 G가 A로 변화되어 있지만, 비효과군에서는 그와 같은 변화는 보이지 않는다.

<실시예 3> 코어 프로모터 영역의 유전자 변이에 의한 해석

(A) 유전자 변이 부위에 의한 통계적 해석

효과가 있었던 환자 9명 및 효과가 없었던 환자 2검체의 코어 프로모터 영역을 실시예 1의 방법에 따라서 서열결정화하고 합계 53 검체에 관한 라미부진의 치료효과와 핵산 서열의 변화(변이) 관계를 조사하고, Fisher의 직접법에 의해 유의차를 검정하였다. 표 2에 유의차가 있었던 변이와 양성군에는 보이지 않고 음성화군에 보인 변이를 나타낸다.

표 2의 음성화군(n=40)은 라미부진 치료 효과가 있는 군, 양성군(n=13)은 라미부진 치료 효과가 없는 군이다. 이와 같은 몇개의 포인트에서 유의차가 있는 것이 나타났다.

또한 코어 프로모터 변이(A1762T, G1764A)에 관해서는 음성화군, 양성군에서 각각 82.5%, 84.6%로 보이고, 유의차는 없었다.

(B) 코어 프로모터 영역 전체에서 변이의 통계적 해석

표 2에 나타낸 핵산의 변화가 보이는 검체와 전혀 보이지 않는 검체에서 라미부진의 치료효과를 예측할 수 있는지에 관해서 Fisher 의 직접법에 의해 유의차를 검정하였다.

몇개의 변화가 보인 환자는 53명 중 38명이고 그 중 35명은 라미부진 치료효과가 확인되었다. 또한 1개소도 변화가 보이지 않았던 환자는 15명으로, 그 중 10명은 치료효과가 보이지 않았다. 이것은 이 코어 프로모터 영역의 핵산서열의 변화가 라미부진 치료효과에 현저한 관련이 있는 것을 나타내고 있다. 라미부진은 RNA 의존성 DNA 폴리머라제 저해효과를 갖고 있고, 이것이 HBV의 증식억제에 관여하고 있는 것이라 보여진다.

본 발명에 의하면, 바이러스측의 유전자 변이를 치료전 또는 치료중에 검출하는 것에 의해 라미부진으로 대표되는 HBV 치료 효과를 예측할 수 있고, 치료 성적을 향상시키며, 또는 내성주 또는 간염재발을 억제하는 등의 효과를 기대할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Advanced Life Science Institute, Inc. <120> Method for identifying Drug Resistance of Hepatitis B Virus <130> SAP-705-PCT <150> JP 2002359372 <130> 2002-12-11 <160> 7 <210> 1 <211> 299 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 1 gtcttacata agaggactct tggactctca gcaatgtcaa cgaccgacct tgaggcatac 60 ttcaaagact gtttgtttaa agactgggag gagttggggg aggagattag gttaaaggtc 120 tttgtactag gaggctgtag gcataaattg gtctgttcac cagcaccatg caactttttc 180 acctctgcct aatcatctca tgttcatgtc ctactgttca agcctccaag ctgtgccttg 240 ggtggctttg gggcatggac attgacccgt ataaagaatt tggagcttct gtggagtta 299 <210> 2 <211> 12 <212> Hepatitis B Virus <400> 2 ctctcagcaa tg 12 <210> 3 <211> 21 <212> Hepatitis B Virus <400> 3 gcatacttca aagactgttt g 21 <210> 4 <211> 27 <212> Hepatitis B Virus <400> 4 ggagttgggg gaggagatta ggttaaa 27 <210> 5 <211> 19 <212> Hepatitis B Virus <400> 5 ctgttcacca gcaccatgc 19 <210> 6 <211> 18 <212> Hepatitis B Virus <400> 6 ctcatgttca tgtcctac 18 <210> 7 <211> 12 <212> Hepatitis B Virus <400> 7 gctttggggc at 12

Claims (12)

1. B형 간염 바이러스(HBV) 코어 프로모터 영역의 핵산 서열에서 유전자 변이를 확인하는 것으로 구성되는 HBV의 약제 저항성을 식별하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, B형 간염 바이러스(HBV)의 약제 저항성이 RNA 의존성 DNA 폴리머라제 저해 효과를 갖는 약제에 대한 저항성인 방법.
3. 제 2항에 있어서, RNA 의존성 DNA 폴리머라제 저해 효과를 갖는 약제가 라미부진인 방법.
4. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 코어 프로모터 영역의 핵산서열이 서열번호 1에 기재된 서열인 방법.
5. 제 1항 내지 제 4항중 어느 한 항에 있어서, HBV 코어 프로모터 핵산 서열의 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7에 기재된 핵산서열에 상당하는 부분 서열의 적어도 1 부분에서 유전자 변이를 확인하는 것으로 되는 방법.
6. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1에 기재된 7번째의 핵산 C, 28번째의 핵산 T, 33번째의 핵산 A, 57번째의 핵산 A, 73번째의 핵산 T, 106번째의 핵산 A, 107번째의 핵산 T, 200번째의 핵산 A, 250번째 핵산 G 또는 253번째의 핵산 G 중의 어느 하나 또는 그 이상의 핵산이 변화되어 있는 유전자 변이를 확인하는 방법.
7. 제 6항에 있어서, 서열번호 1에 기재된 7번째의 핵산 C가 T로, 28번째의 핵산 T가 C로, 33번째의 핵산 A가 G로, 57번째의 핵산 A가 G 또는 C로, 73번째의 핵산 T가 G로, 106번째의 핵산 A가 T 또는 C 또는 G로, 107번째의 핵산 T가 C 또는 G로, 200번째의 핵산 A가 T 또는 C로, 250번째 핵산 G가 A로 또는 253번째의 핵산 G가 A로 변화된 어느 하나 또는 그 이상의 유전자 변이를 확인하는 방법.
8. 서열번호 1에 기재된 7번째의 핵산 C, 28번째의 핵산 T, 33번째의 핵산 A, 57번째의 핵산 A, 73번째의 핵산 T, 106번째의 핵산 A, 107번째의 핵산 T, 200번째의 핵산 A, 250번째 핵산 G 또는 253번째의 핵산 G의 어느 하나 또는 그 이상의 핵산에 유전자 변이를 갖는 HBV 유전자형을 확인하는 방법.
9. 서열번호 1에 기재된 7번째의 핵산 C가 T로, 28번째의 핵산 T가 C로, 33번째의 핵산 A가 G로, 57번째의 핵산 A가 G 또는 C로, 73번째의 핵산 T가 G로, 106번째의 핵산 A가 T 또는 C 또는 G로, 107번째의 핵산 T가 C 또는 G로, 200번째의 핵산 A가 T 또는 C로, 250번째 핵산 G가 A로 또는 253번째의 핵산 G가 A로 변화된 어느 하나 또는 그 이상의 유전자 변이를 갖는 HBV 유전자형을 확인하는 방법.
10. 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서, 유전자 변이의 확인 또는 유전자형의 확인을 HBV 염기서열을 결정하는 것에 의해 실시하는 방법.
11. 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서, 유전자 변이의 확인 또는 유전자형의 확인을 프로브 또는 프라이머를 사용한 방법에 의해 실시하는 방법.
12. 염기서열 1 내지 7중 어느 하나에 기재된 핵산서열 또는 그의 일부로 구성되는 핵산을 사용한 HBV 치료약.