ES2257087T3 - Metodo y reactivos para la deteccion del cancer. - Google Patents
Metodo y reactivos para la deteccion del cancer.Info
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Abstract
Un método in vitro para detectar una proteína marcadora asociada al cáncer, presente en un fluido corporal de un mamífero, comprendiendo dicho método las etapas de: (a) poner en contacto una muestra del fluido corporal de dicho mamífero, con anticuerpos dirigidos contra al menos un epítopo de dicha proteína marcadora; y (b) detectar la presencia de complejos formados entre dichos anticuerpos y cualquier proteína marcadora presente en dicha muestra; en donde dichos anticuerpos son autoanticuerpos de mamífero para dicha proteína marcadora asociada al cáncer que proceden de la misma especie que el mamífero, del cual se ha obtenido dicha muestra, y en donde dicha proteína marcadora asociada al cáncer es una forma modificada de una proteína de tipo natural.
Description
Método y reactivos para la detección del
cáncer.
La presente invención se refiere a métodos
específicos y altamente sensibles para detectar la presencia de
proteínas marcadoras de cáncer en los fluidos corporales de un
mamífero, a autoanticuerpos para uso en estos métodos, a células
inmortalizadas para obtener estos autoanticuerpos y a kits para
realizar los métodos. Estos métodos son útiles en la detección
temprana de modificaciones carcinógenas o
pre-neoplásicas en pacientes asintomáticos, en la
monitorización del progreso de cáncer, en el escrutinio de la
recidiva de la enfermedad en pacientes que han sufrido previamente
tratamiento anti-cancerígeno, en la monitorización
de la eficacia de un tratamiento sistemático en un paciente y en la
determinación del tratamiento más apropiado para un paciente
particular.
Las células cancerosas y
pre-neoplásicas se caracterizan por la producción de
proteínas marcadoras asociadas al cáncer. Estas consisten
frecuentemente en formas anómalas de proteínas de tipo natural, que
son producidas por las células cancerosas como resultado de
mutaciones genéticas o procesos post-traduccionales
alterados. Alternativamente, los marcadores cancerosos también
pueden ser proteínas que llegan a sobre-expresarse
en células tumorales, usualmente como resultado de la amplificación
de genes o de la regulación transcripcional anormal. En algunos
casos, estos dos fenómenos pueden ocurrir al mismo tiempo
conduciendo a una acumulación de proteínas modificadas a través del
desarrollo de la enfermedad. Por ejemplo, se ha encontrado que las
formas modificadas de Ras, p53, c-myc,
MUC-1, c-erb\beta2 están asociadas
con una amplia variedad de cánceres.
Las proteínas asociadas al cáncer se encuentran
tanto en los tejidos como en los fluidos corporales de un individuo
que lleva células pre-neoplásicas o cancerosas.
Estos niveles son muy bajos en las etapas tempranas del proceso
carcinógeno y aumentan durante el progreso de la enfermedad. La
detección de estas proteínas se ha usado ventajosamente en ensayos
habituales para el diagnóstico del cáncer pero, desafortunadamente,
estos ensayos tienen muchas limitaciones. En particular, los
anticuerpos comerciales disponibles para uso en ensayos estándares
no son en general suficientemente sensibles para detectar los bajos
niveles de proteínas asociadas al cáncer que se encuentran en las
etapas muy tempranas de la enfermedad, por ejemplo en pacientes
asintomáticos, cuando sería más eficaz el tratamiento. Además, la
mayoría de los anticuerpos comerciales no son específicos para
formas modificadas de marcadores asociados al cáncer y reaccionan
de forma cruzada con formas de tipo natural de estas proteínas.
Como consecuencia, solamente son útiles para detectar aumentos
sustanciales en niveles de suero de las proteínas marcadoras de
cáncer, que usualmente ocurren en etapas avanzadas de cáncer.
Por ejemplo, el ensayo comercial
CA15-3, que detecta tanto las formas no modificadas
como las modificadas de MUC1, es útil el diagnóstico de cánceres de
mama metastásicos, que se caracterizan por elevados niveles en
suero de MUC1. Sin embargo, este ensayo no puede usarse en escrutar
neoplasias o cáncer de mama primario porque los niveles en suero de
MUC1 en estas etapas no difieren significativamente de los
encontrados en individuos normales (Robertson et al. (1990),
Eur. J. Cancer 26: 1127-1132). Se ha
descrito que otras proteínas marcadoras, tales como, por ejemplo, el
antígeno carcinoembriónico (CEA) y el marcador CA19.9 se
encontraban en un número elevado en el suero de pacientes con
cáncer de mama y colorrectal metastásico pero no en el de pacientes
con cánceres primarios (Robertson et al. (1991), Cancer
Immunol. Immunother. 133: 403-410; Thomas
et al. (1991) Br. J. Cancer 63:
975-976). También en el caso de estos marcadores,
los ensayos comerciales disponibles no son capaces de discriminar
entre las formas modificadas y de tipo natural de las proteínas y
por tanto son de uso limitado. Además, los anticuerpos
comercialmente disponibles, por reacción cruzada con formas
normales de proteínas asociadas al cáncer, también pueden conducir
a falsos resultados positivos. Por tanto, existe la necesidad en la
técnica de anticuerpos específicos y más sensibles para usar en
estos ensayos con el fin de detectar las modificaciones
pre-neoplásicas y carcinógenas tempra-
nas.
nas.
Como se usan en la presente memoria las
expresiones "proteína marcadora asociada al cáncer",
"proteína asociada al cáncer", "proteína marcadora" o
"marcador canceroso" se refieren todas a formas modificadas
asociadas al cáncer de proteínas de tipo natural.
Los marcadores cancerosos difieren frecuentemente
de las proteínas de tipo natural correspondiente en que son
reconocidos como moléculas extrañas por el sistema inmune de un
individuo, desencadenando una respuesta autoinmune. La respuesta
inmune puede ser humoral, conduciendo a la producción de
autoanticuerpos contra la proteína marcadora de cáncer. Los
autoanticuerpos son anticuerpos que se presentan de forma natural
dirigidos contra un antígeno que el sistema inmune del individuo
reconoce como extraño incluso aunque dicho antígeno realmente se
origine en ese individuo. Por ejemplo, las formas modificadas de
las proteínas p53, MUC-1, c-myc,
c-erb3 y Ras pueden desencadenar la producción de
autoanticuerpos. Tal como se usa en la presente memoria el término
"autoanticuerpo" se refiere a un anticuerpo dirigido contra un
antígeno que se auto-origina, presentándose dicho
anticuerpo de forma natural en la circulación de un individuo o a
un anticuerpo que exhibe las características del anticuerpo que se
presenta de forma natural en que reconoce dicho antígeno
autooriginado pero que se produce fuera del organismo, por ejemplo,
por una célula inmortalizada.
Rao et al., en Proceedings of the
American Association for Cancer Research Annual Meeting, 1987,
Volumen 28, página 358, describen la detección de tumor de ovario
humano asociado con antígenos por anticuerpos autólogos aislados de
fluido ascítico de carcinoma de ovario. La naturaleza del antígeno
no está identificada.
Como se describirá en los Ejemplos siguientes,
los inventores de la presente solicitud han encontrado
sorprendentemente que los autoanticuerpos producidos por pacientes
que sufren cáncer reconocen específicamente las proteínas
marcadoras asociadas al cáncer de los mismos pacientes o de otros
pacientes con cáncer y muestran muy poca reactividad cruzada con
formas de tipo natural de estas proteínas. Además, los inventores
de la presente solicitud han encontrado que los autoanticuerpos
anteriores tienen mucha mayor sensibilidad que los anticuerpos
usados comúnmente en ensayos habituales y por lo tanto son capaces
de detectar cantidades más pequeñas de proteínas marcadoras
asociadas al cáncer. Los autoanticuerpos producidos por pacientes
con cáncer pueden por lo tanto usarse para diseñar ensayos
alternativos, más fiables y sensibles para detectar modificaciones
pre-neoplásicas o carcinógenas en un individuo desde
el comienzo de su presentación. Estos ensayos también pueden
emplearse para detectar cáncer o pre-neoplasia en
cualquier otro mamífero, utilizando los autoanticuerpos producidos
por un mamífero, de la misma especie que el del ensayo o
autoanticuerpos que tienen las mismas características que dicho
anticuerpo.
La presente invención proporciona un sistema de
ensayo específico y más sensible para la detección de
pre-neoplasia o cáncer en un mamífero, que permite
la detección de proteínas marcadoras asociadas al cáncer en las
etapas tempranas de la enfermedad.
Por consiguiente, en un primer aspecto la
invención proporciona un método in vitro para detectar una
proteína marcadora asociada al cáncer presente en un fluido
corporal de un mamífero, comprendiendo dicho método las etapas
de:
- (a)
- poner en contacto una muestra de un fluido corporal de dicho mamífero con anticuerpos dirigidos contra al menos un epítopo de dicha proteína marcadora; y
- (b)
- detectar la presencia de complejos formados entre dichos anticuerpos y cualquier proteína marcadora presente en dicha muestra;
en donde dichos anticuerpos son
autoanticuerpos de mamíferos para dicha proteína marcadora asociada
al cáncer que proceden de la misma especie que el mamífero del cual
se obtuvo dicha
muestra.
La presencia de dichos complejos es indicativa de
la presencia de proteínas marcadoras asociadas al cáncer en dicho
mamífero.
Tal como se usa en la presente memoria
"procede(n)" significa un autoanticuerpo o
autoanticuerpos aislado(s) de dicha especie o un
autoanticuerpo o autoanticuerpos que tiene(n) las
características de un autoanticuerpo o autoanticuerpos
aislado(s) de dicha especie.
El método de la invención puede emplear un solo
autoanticuerpo dirigido contra una proteína marcadora de cáncer
particular. Alternativamente, puede utilizarse un panel de
autoanticuerpos que reconocen cierto número de proteínas asociadas
al cáncer para obtener un perfil de marcadores de cáncer presentes
en un individuo particular. Esto conduce a un diagnóstico más
fiable y proporciona información útil en la elección del
tratamiento más apropiado para un individuo.
El método de ensayo de la invención se realiza
sobre una muestra de un fluido biológico del paciente tal como, por
ejemplo, plasma, suero, sangre completa, orina, linfa, heces,
fluido cerebroespinal o aspirado de pezón, dependiendo de la
naturaleza del cáncer que ha de detectarse. Puesto que es un ensayo
no invasivo puede repetirse tan frecuentemente como sea necesario
para escrutar modificaciones neoplásicas o carcinógenas tempranas,
para seguir el desarrollo de la enfermedad, para analizar la
recidiva de la enfermedad, para verificar la eficacia de un
tratamiento o para seleccionar el tratamiento más apropiado para un
paciente particular.
El método de la invención se puede realizar
usando cualquier técnica inmunológica conocida por los expertos en
la técnica de inmunoquímica. Como ejemplos, pueden utilizarse las
técnicas ELISA, radioinmunoensayo o similares. En general, un
autoanticuerpo apropiado se inmoviliza en una superficie sólida y
la muestra a ensayar se pone en contacto con el autoanticuerpo. Si
la proteína marcadora de cáncer reconocida por el autoanticuerpo
está presente en la muestra, se forma un complejo
autoanticuerpo-marcador. El complejo puede ser
dirigido o medido cuantitativamente usando, por ejemplo, un
anticuerpo secundario marcado que específicamente reconozca un
epítopo de la proteína marcadora. El anticuerpo secundario puede
ser marcado con marcadores bioquímicos, tales como, por ejemplo,
peroxidasa de rábano picante (abreviadamente HRP por la expresión
inglesa horseradish peroxidase) o fosfatasa alcalina
(abreviadamente AP por la expresión inglesa alkaline
phosphatase), y la detección del complejo puede conseguirse por
la adición de un sustrato para la enzima que genere un producto
colorimétrico, quimioluminiscente o fluorescente. Alternativamente,
la presencia del complejo puede determinarse mediante la adición de
una proteína marcadora etiquetada con un marcador detectable, por
ejemplo una enzima apropiada. En este caso, la cantidad de
actividad enzimática medida es inversamente proporcional a la
cantidad de complejo formado y se necesita como referencia un
control negativo para determinar la presencia de antígeno en la
muestra. Otro método para detector el complejo puede utilizar
anticuerpos o antígenos que han sido marcados con radioisótopos
seguido por medida de la radiactividad.
El método de la invención puede realizarse en un
formato cualitativo, que determina la presencia o ausencia de
proteína marcadora de cáncer en la muestra, o en un formato
cuantitativo, que, además, proporciona una medida de la cantidad de
proteína marcadora de cáncer presente en la muestra. La cantidad de
proteína marcadora presente en una muestra puede calcularse
utilizando cualquiera de las técnicas antes descritas. En este
caso, antes de realizar el ensayo, es necesario trazar una curva
patrón midiendo la señal obtenida, usando la misma reacción de
detección que se usará para el ensayo, de una serie de muestras
estándares que contienen concentraciones conocidas de la proteína
marcadora de cáncer. La cantidad de marcador de cáncer presente en
una muestra a escrutar se interpola luego en la curva patrón.
Si es necesario verificar la presencia de cierto
número de proteínas marcadoras de cáncer en una muestra, el ensayo
de la invención puede realizarse en una placa de ensayo de
múltiples pocillos en donde cada uno de los diferentes
autoanticuerpos utilizados se coloca en un pocillo diferente.
El método de la invención puede emplearse en una
variedad de situaciones clínicas, tales como, por ejemplo, en la
determinación de la predisposición de un individuo al desarrollo de
un cáncer, en la detección de modificaciones
pre-neoplásicas o carcinógenas en pacientes
asintomáticos, en el diagnóstico de cáncer primario o secundario,
en la monitorización del progreso de la enfermedad en un paciente,
en el escrutinio de la recidiva de modificaciones carcinógenas en
un paciente que previamente ha sido diagnosticado como portador de
células cancerosas y ha recibido terapia para reducir el número de
estas células o en la elección del tratamiento
anti-cancerígeno más apropiado para un paciente que
padece cáncer. El método de la invención también es adecuado para
uso veterinario en las mismas situaciones clínicas que las
descritas anteriormente.
El método de ensayo de la invención puede
emplearse para detectar proteínas marcadoras de cáncer que están
asociadas a una variedad de cánceres, tales como, por ejemplo,
linfomas, leucemia, cánceres de mama, cánceres colorrectales,
cánceres de pulmón, cánceres pancreáticos, cánceres de próstata,
cánceres del cuello del útero, cánceres de ovario, cánceres
endometriales y cánceres de la piel. El método de la invención es
particularmente adecuado para detectar y monitorizar cáncer de mama
primario (abreviadamente PBC por la expresión inglesa primary
breast cancer) y cáncer de mama avanzado (abreviadamente ABC por
la expresión inglesa advanced breast cancer).
En un segundo aspecto, la invención proporciona
autoanticuerpos y reactivos que comprenden dichos autoanticuerpos
para uso en el ensayo, que reconocen específicamente al menos un
epítopo de una proteína marcadora asociada al cáncer de mamífero.
Dichos autoanticuerpos pueden aislarse de la sangre de los
monocitos de sangre periférica de dicho mamífero, preferiblemente un
ser humano. Alternativamente, los autoanticuerpos pueden ser
producidos por linfocitos B inmortalizados y dirigidos a un
antígeno originado en el mamífero propiamente dicho. Los reactivos
que comprenden autoanticuerpos de acuerdo con este aspecto de la
invención son particularmente adecuados para uso en la detección de
proteínas marcadoras asociadas al cáncer de mamífero en fluidos
corporales. Los autoanticuerpos preferidos para usar en el ensayo
incluyen aquellos contra las formas asociadas al cáncer de la
glicoproteína MUC1 (Batra, SK. et al., (1992) Int J.
Pancreatology 12: 271-283), la proteína
c-myc reguladora de la transducción de señal/ciclo
celular (Blackwood, E. M. et al. (1994) Molecular Biology
of the Cell 5: 597-609), p. 53
(Matlashewski, G. et al. (1984) EMBO J. 3:
3257-3262), c-erb\beta2 (Dsouza,
B. et al. (1993) Oncogene 8:
1797-1806) y Ras (Gnudi, L. et al., (1997).
Mol. Endocrinol. 11: 67-76). Sin
embargo, en este ensayo pueden emplearse autoanticuerpos contra
otras proteínas marcadoras asociadas al cáncer. Son particularmente
adecuados para la detección de cánceres de mama los autoanticuerpos
contra una proteína modificada MUC1, BRCA1, BRCA2, p53,
c-myc, c-erb\beta2 o Ras asociada
al cáncer de mama primario y los autoanticuerpos contra una
proteína modificada MUC1, BRCA1, BRCA2, p53, c-myc,
c-erb\beta2 o Ras asociada con cáncer de mama
avanzado. Estos autoanticuerpos proceden preferiblemente de
pacientes a las que se ha diagnosticado el mismo tipo de cáncer que
al que está asociada esta proteína marcadora de cáncer.
La invención también proporciona poblaciones de
células inmortalizadas capaces de producir los autoanticuerpos
anteriores.
Las poblaciones de células de la invención pueden
producirse por cualquier método conocido en la técnica. Como se
describirá con detalle en el Ejemplo 1 más adelante, las células B
de pacientes a las que se había diagnosticado cáncer pueden, por
ejemplo, ser inmortalizadas con el virus de
Epstein-Barr. Pueden aplicarse técnicas ELISA u
otras cualesquiera similares para escrutar la producción de
autoanticuerpos, utilizando proteínas marcadoras obtenidas de un
paciente afectado de cáncer que han sido inmovilizadas en un soporte
sólido.
La invención proporciona además kits para
detectar una o más proteínas marcadoras asociadas al cáncer en los
fluidos biológicos de un mamífero. Dichos kits incluyen al menos
autoanticuerpos de mamíferos dirigidos contra uno o más epítopos de
una proteína marcadora asociada al cáncer y medios para detectar la
formación de complejos entre los autoanticuerpos y la proteína
marcadora asociada al cáncer. Preferiblemente, los autoanticuerpos
se inmovilizan sobre una superficie sólida.
La presente invención se entenderá más con
referencia a los siguientes Ejemplos y a las Figuras que se
acompañan en las que:
La Figura 1 muestra los resultados de un ensayo
ELISA para examinar la reactividad de autoanticuerpos producidos
por células B procedentes de seis pacientes a las que se había
diagnosticado cáncer de mama (1 a 4, con cáncer de mama primario, 7
y 11 con cáncer de mama avanzado). Para cada grupo de
autoanticuerpos, se usaron como antígenos inmovilizados la proteína
MUC1 purificada de la misma paciente de la cual se tomaron las
células B, de otras pacientes o de mujeres normales. La reactividad
del anticuerpo monoclonal anti-MUC1 B55 de ratón en
un ensayo paralelo se incluye como control comparativo. Como
controles negativos se usa solución salina tamponada con fosfato
(abreviadamente PBS por la expresión inglesa phosphate buffered
saline) o anticuerpos producidos por linfocitos B procedentes
de 4 mujeres sanas (N10, N12, N13 y N14). La MUC1 se eluyó en
columnas de inmunoafinidad usando glicina 0,25 M pH 2,5.
La Figura 2 muestra los resultados de un ensayo
ELISA para determinar la reactividad de autoanticuerpos obtenidos
de células B procedentes de pacientes a las que se había
diagnosticado cáncer de mama primario con la proteína MUC1 de
diferentes fuentes. La reactividad de B55 se incluye como control
comparativo. Se usa PBS como control negativo.
La Figura 3 muestra los resultados de un
experimento de resonancia de plasmón superficial para medir la
unión de los autoanticuerpos producidos por células B procedentes
de pacientes a las que se había diagnosticado cáncer de mama
primario a la proteína MUC1 aislada (a) del suero de pacientes con
cáncer de mama avanzado o (b) de la orina de individuos
normales.
La Figura 4 muestra la secuencia del péptido que
se usó para purificar por inmunoafinidad los anticuerpos MUC1 de
los sueros de pacientes con cáncer de mama avanzado.
La Figura 5 muestra los resultados de un ensayo
ELISA que emplea autoanticuerpos inmovilizados de una paciente con
(2) cáncer de mama primario o (3) cáncer de mama avanzado para
detectar la proteína MUC1 purificada del suero de una paciente a la
que se había diagnosticado cáncer de mama avanzado o de la orina de
una mujer sana. Se incluye como ejemplo comparativo el resultado de
un ensayo paralelo que utiliza el anticuerpo C595
anti-MUC1 (1).
La Figura 6 muestra los resultados de un ensayo
ELISA que utiliza autoanticuerpos inmovilizados de las células B de
pacientes con cáncer de mama primario para detectar la proteína
MUC1 en muestras de suero de individuos sanos o de pacientes a las
que se había diagnosticado cáncer de mama primario o avanzado. Se
incluyen como ejemplos comparativos los resultados obtenidos con el
anticuerpo C595 en un ensayo paralelo.
La Figura 7 muestra los resultados de un ensayo
ELISA usando autoanticuerpos inmovilizados de células B de
pacientes con cáncer de mama primario para detectar la proteína
MUC1 en muestras secuenciales de suero de una paciente con cáncer
de mama avanzado durante el progreso de la enfermedad. Los
resultados obtenidos con el anticuerpo monoclonal C595 en un ensayo
paralelo o con el ensayo comercial CA15-3 se
incluyen como ejemplos comparativos.
La Figura 8 muestra los resultados de cierto
número de determinaciones de la reactividad de sueros de pacientes
con cáncer de mama con MUC1 de ABC y MUC1 de orina.
Los mononucleocitos de sangre periférica se
purificaron de una muestra de 4 ml de sangre heparinizada de
pacientes o mujeres normales usando medio de separación de
linfocitos (flujo ICN), como se describe con detalle en las
instrucciones del fabricante. Los mononucleocitos aislados se
lavaron en PBS y se volvieron a poner en suspensión en 1 ml de una
preparación semipurificada del virus de
Epstein-Barr (EBV) a partir de la línea celular
B95-8 productora de EBV de leucocitos transformados
del mono tití. Las células se incubaron luego durante 1 hora a 37ºC
en CO_{2} al 5% y se centrifugaron a 17000 rpm. El líquido
sobrenadante de EBV se separó y los mononucleocitos se lavaron tres
veces con medio RPMI, se volvieron a poner en suspensión en medio
RPMI suplementado con suero de bovino fetal al 10% y 5 \mug/ml de
fitohematoaglutinina (PHA-P) y se sembraron en
placas de cultivo de tejidos de múltiples pocillos. El medio se
cambió cada 3 días y se usó como una fuente de autoanticuerpos.
El antígeno MUC1 se purificó del suero de
pacientes a las que se había diagnosticado cáncer de mama primario
o avanzado o de la orina de mujeres sanas de acuerdo con el
protocolo siguiente.
El anticuerpo monoclonal de ratón B55 (también
conocido como NCRC 11 que ha sido descrito por Ellis et al.,
(1984) en Histopathology 8: 501-516 y
en la solicitud de patente internacional Nº WO 89/01153) se conjugó
a perlas de CNBr-Sepharose. Se diluyeron 1/10,
muestras de suero u orina en PBS y se incubaron con las perlas de
Sepharose conjugadas al anticuerpo durante una noche a 4ºC con
rodadura. Las perlas se centrifugaron y se retiró el líquido
sobrenadante. Para separar cualquier molécula no unida
específicamente a las perlas, estas se lavaron con PBS 5 veces o
hasta que el tampón de lavado no mostró absorbancia a 280 nm. Cada
lavado se realizó volviendo a poner en suspensión las perlas en
PBS, haciéndolas rodar durante 10 minutos, centrifugando y
retirando el líquido sobrenadante. Las perlas lavadas se volvieron
a poner en suspensión en glicina 0,25 M pH 2,5, se hicieron rodar a
temperatura ambiente durante 10 minutos y se centrifugaron. El
líquido sobrenadante se retiró, se ajustó a pH 7 por adición de
TRIS y se conservó a 4ºC etiquetándose "fracción de glicina".
Las perlas se volvieron a poner en suspensión luego en dietilamina
25 mM (DEA) pH 11, se hizo rodar a temperatura ambiente durante
10 minutos y se centrifugaron. El líquido sobrenadante se retiro
de nuevo, se ajustó a pH 7 por adición de TRIS y se conservó a 4ºC
etiquetándose "fracción 25 DEA". Finalmente las perlas se
volvieron a poner en suspensión en DEA 100 mM pH 11, se hicieron
rodar a temperatura ambiente durante 10 minutos y se centrifugaron.
El líquido sobrenadante se retiró, se ajustó a pH 7 por adición de
TRIS y se conservó a 4ºC etiquetándose "fracción 100 DEA". La
presencia de MUC1 en las tres fracciones se confirmó por ELISA
usando el anticuerpo monoclonal B55 o C595 (también conocido como
NCRC proporcionado por Cancer Research Campaign). Para
retirar las inmunoglobulinas contaminantes, las fracciones se
incubaron con DTT (a 50 mM) durante 30 minutos, y luego
yodoacetamida (a 75 mM) antes de ser sometidas a filtración por gel
en una columna de S300. Se analizó el contenido de MUC1 de las
fracciones por ELISA. Las frac-
ciones que contenían MUC1 se titularon de modo que dieran absorbancias equivalentes a las de las tandas previas.
ciones que contenían MUC1 se titularon de modo que dieran absorbancias equivalentes a las de las tandas previas.
Las diferentes preparaciones de MUC1, obtenidas
como se ha descrito antes, se diluyeron apropiadamente con PBS y se
cultivaron en placas a 50 \mul por pocillo en una microplaca de
ensayo de 96 pocillos y se dejó secar durante la noche. La placa
se lavó luego una vez con PBS/Tween para retirar los cristales de
sal residuales, se bloqueó durante 60 minutos con una solución
recientemente preparada de polivinilpirrolidona (PVP) al 2% (p/v)
en PBS y se lavó tres veces con PBS/Tween. El líquido sobrenadante
del cultivo de linfocitos inmortalizados procedentes de pacientes a
las que se había diagnosticado cáncer de mama primario o secundario
se cultivó en placas por triplicado, a 50 \mul por pocillo. Como
control comparativo también se cultivo por triplicado el
anticuerpo B55 monoclonal anti-MUC1 de ratón. La
placa se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente con
agitación y se lavó cuatro veces con PBS/Tween. Se añadieron 50
\mul de anticuerpo secundario anti-humano o
anti-ratón conjugado a HRP (obtenido de Dako) a cada
pocillo a la dilución recomendada por el fabricante, y se incubó
durante 60 minutos a temperatura ambiente con agitación. La placa
se lavó luego de nuevo cuatro veces con PBS/Tween. Se añadieron 50
\mul de tetrametilbencidina (TMB) a cada pocillo y se leyó
cinéticamente la densidad óptica (DO) a 650 nm para cada pocillo de
la placa de ensayo durante un periodo de 10 minutos.
La Figura 1 muestra el resultado de un ensayo
ELISA para determinar la reactividad de autoanticuerpos producidos
por linfocitos procedentes de seis pacientes a las que se había
diagnosticado cáncer de mama (1 a 4, con cáncer de mama primario, 7
y 11 con cáncer de mama avanzado) con la proteína MUC1 purificada
de la misma paciente de la cual se tomó el anticuerpo, de otras
pacientes o de mujeres sanas. Las mujeres sanas que participaron en
este estudio eran mujeres que no habían presentado signos clínicos
y/o mamográficos de cáncer de mama. La reactividad del anticuerpo
B55 monoclonal anti-MUC1 se midió como control
comparativo. Los anticuerpos producidos por linfocitos de cuatro
sujetos sanos (N10 a N14) se usaron como control negativo.
Los resultados presentados demuestran que los
linfocitos B procedentes de pacientes con cáncer de mama producen
autoanticuerpos que son capaces de reconocer la proteína MUC1
aislada tanto de las mismas pacientes como de diferentes pacientes.
Además, estos autoanticuerpos se unen con alta especificidad a MUC1
presente en pacientes con cáncer, no mostrando casi reactividad con
MUC1 aislada de individuos sanos. Estos resultados son altamente
reproducibles, puesto que diferentes autoanticuerpos muestran un
perfil de reactividad muy similar con la proteína MUC1 purificada
de diferentes fuentes. Además, los resultados obtenidos también
indican que la sensibilidad de los autoanticuerpos para MUC1
asociada al cáncer es mucho mayor que la observada para el
anticuerpo monoclonal B55. Además, los anticuerpos producidos por
linfocitos de pacientes normales no mostraron este perfil.
La Figura 2 muestra la reactividad de
autoanticuerpos secretados por linfocitos B inmortalizados
derivados de pacientes con cáncer de mama primario con la proteína
MUC1 de diferentes fuentes, en comparación con la de B55. El perfil
de reactividad de los diferentes autoanticuerpos es de nuevo muy
reproducible. Los autoanticuerpos muestran alta especificidad para
la MUC1 presente en el suero de pacientes con cáncer y no tienen
casi afinidad por la MUC1 aislada de mujeres sanas o de la línea
celular de cáncer de mama ZR75-1. Además, la
afinidad de los autoanticuerpos por la proteína MUC1 asociada al
cáncer de mama primario o cáncer de mama avanzado es mucho más alta
que la medida para B55.
La resonancia de plasmón superficial se realizó
en un aparato Iasys Biosensor Plus (de Affinity Sensor). La
proteína MUC1 de pacientes con cáncer de mama avanzado y de
individuos normales se adhirió a células revestidas con aminosilano
siguiendo las instrucciones del fabricante y las células se
bloquearon con polivinilpirrolidona (PVP) al 1% (p/v). También se
produjeron células de control revestidas solamente con PVP al 1%.
Se midió la unión de diferentes diluciones del líquido sobrenadante
de cultivo de células B de pacientes con cáncer de mama primario
usando las siguientes condiciones experimentales:
\newpage
| Intervalo de muestreo: | 0,3 milisegundos |
| Velocidad del agitador: | 70 rpm |
| Temperatura: | 24ºC |
| Tiempo de unión: | 3 minutos |
| Disociación con PBS: | 2 minutos |
| Regeneración con HCl 20 mM: | 3 minutos |
| Re-equilibración con PBS: | 5 minutos |
La Figura 3 muestra que los autoanticuerpos
producidos por linfocitos B procedentes de una paciente con cáncer
de mama primario se unen con una afinidad mucho mayor a MUC1
aislada de otra paciente con cáncer de mama que a la MUC1 aislada
de una mujer sana.
El péptido TAP2 de MUC1, con la secuencia
mostrada en la Figura 4, se conjugó a perlas de
CNBr-Sepharose. Los sueros reunidos de pacientes a
las que se había diagnosticado cáncer de mama avanzado se diluyeron
1/10 en PBS y se incubaron con las perlas conjugadas con Sepharose
durante una noche a 4ºC con rodadura (en la relación de 25 ml de
suero a 1 ml de perlas). Después de centrifugación se retiró el
líquido sobrenadante y las perlas se lavaron 5 veces con PBS o
hasta que la absorbancia a 280 nm fuera cero. Cada lavado se realizó
volviendo a poner en suspensión las perlas en PBS, haciéndolas
rodar 10 minutos, centrifugando y separando el líquido
sobrenadante. Las perlas se volvieron a poner en suspensión en 1 ml
de tiocianato de sodio 3 M en PBS, se hicieron rodar a temperatura
ambiente durante 10 minutos y se centrifugaron. El líquido
sobrenadante se retiró y se dializó frente a PBS a 4ºC. El contenido
de anti-MUC1 se confirmó luego por ELISA usando
como antígeno inmovilizado tanto MCU1 aislada de pacientes con
cáncer de mama avanzado como un péptido de MUC1, con la secuencia
APDTRTPAPG y conjugado a BSA.
Los autoanticuerpos obtenidos como se ha descrito
antes se concentraron hasta un volumen de 100 \mul usando
filtros centrífugos y luego se diluyeron hasta un volumen de 1 ml
con tampón de tetraborato sódico 0,1 M de pH 8,8. Se añadieron 20
\mug de
N-hidroxisuccinimida-biotina y la
solución autoanticuerpos/biotina se incubó durante 4 horas a
temperatura ambiente con rodadura. La reacción se detuvo mediante
la adición de 10 \mul de NH_{4}Cl 1M e incubación durante 10
minutos. Los autoanticuerpos se dializaron luego frente a PBS
durante treinta y seis horas a 4ºC para separar la biotina no
unida. Las partes alícuotas de la solución de autoanticuerpos se
congelaron y conservaron a -20ºC en la oscuridad hasta su uso.
El líquido sobrenadante de linfocitos
procedentes de pacientes con cáncer de mama primario o cáncer de
mama avanzado o el anticuerpo C595 monoclonal
anti-MUC1 se cultivó en placas a 50 \mul por
pocillo en una microplaca de ensayo de 96 pocillos y se incubó una
noche a 4ºC. La placa se lavó luego 4 veces con PBS/Tween, se
bloqueó durante 60 minutos con una solución recién preparada de
polivinilpirrolidona (PVP) al 2% (p/v) en PBS y se lavó dos veces
con PBS/Tween. Se añadieron 50 \mul por pocillo de MUC1 de
diferentes fuentes. Después de la incubación a temperatura ambiente
durante sesenta minutos, la placa se lavó de nuevo cuatro veces con
PBS/Tween. 50 \mul del anticuerpo secundario biotinilado
apropiado, bien sea C595 o autoanticuerpo purificado de una mezcla
de sueros de una paciente con cáncer de mama avanzado, preparado
como se ha descrito antes, se añadieron a cada pocillo y se
incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de 4
lavados con PBS/Tween, se añadieron 50 \mul de
estreptavidina-HRP a cada pocillo y se incubó a
temperatura ambiente durante 60 minutos. La placa se lavó de nuevo
cuatro veces, se añadieron 50 \mul de TMB a cada pocillo y se leyó
cinéticamente la densidad óptica (DO) a 650 nm para cada pocillo
de la placa de ensayo durante un periodo de 10 minutos.
La Figura 5 muestra los resultados de un ensayo
ELISA utilizando como anticuerpos inmovilizados los autoanticuerpos
producidos por linfocitos B procedentes de pacientes con cáncer de
mama primario o avanzado, en comparación con los obtenidos en un
ensayo paralelo con el anticuerpo C595 monoclonal
anti-MUC1. Los datos indican que pueden usarse los
autoanticuerpos de pacientes con cáncer de mama en ensayos ELISA
para detectar específicamente las formas modificadas de la proteína
MUC1 asociada al cáncer. Estos ensayos son más sensibles y muestran
mayor especificidad que los que utilizan el anticuerpo C595
monoclonal.
Se realizó un ensayo ELISA, como se ha descrito
en el Ejemplo 4, en muestras de suero de individuos sanos o
pacientes con cáncer de mama primario o avanzado, utilizando como
anticuerpos inmovilizados los autoanticuerpos producidos por
linfocitos B procedentes de pacientes con cáncer de mama primario.
Se realizó un ensayo paralelo utilizando el anticuerpo C595
monoclonal anti-MUC1 en las mismas muestras. Los
resultados, mostrados en la Figura 6, indican que el ensayo que
emplea autoanticuerpos puede detectar con alta sensibilidad MUC1
circulante en la sangre de pacientes con cáncer de mama. Además,
contrariamente a la utilización del anticuerpo C595 monoclonal,
este ensayo tiene una especificidad muy alta para formas de MUC1
asociadas al cáncer
Se realizó un ensayo ELISA, como se ha descrito
en el Ejemplo 4, sobre muestras de suero secuenciales de una
paciente a la que se había diagnosticado cáncer metastásico durante
el progreso de la enfermedad, usando como anticuerpos inmovilizados
los autoanticuerpos producidos por linfocitos B procedentes de
pacientes con cáncer de mama primario o el anticuerpo C595
monoclonal anti- MUC1. El ensayo comercial CA15-3
también se realizó sobre las mismas muestras. La Figura 7 muestra
que puede usarse el ensayo que emplea autoanticuerpos para seguir
el progreso del cáncer en una paciente, en donde los niveles
crecientes de MUC1 detectados en el ensayo indican exacerbación de
la enfermedad. Los datos también demuestran que el uso de
autoanticuerpos conduce a resultados que representan mejor el
desarrollo de la enfermedad que los obtenidos con el anticuerpo
C959 o con el ensayo CA15-3.
Se obtuvieron preparaciones de MUC1 de ABC (MUC1
aislada del suero de pacientes a las que se había diagnosticado
cáncer de mama avanzado) y MUC1 de orina como se describe en el
Ejemplo 2.
Partes alícuotas preparaciones de MUC1 de ABC y
de orina se secaron sobre los pocillos de microplacas por separado
a concentraciones que proporcionaban la unión a
NCRC-11 equivalente. Después de bloquear con PVP al
2%, se añadieron a los pocillos muestras de suero tomadas de
pacientes con cáncer de mama, diluidas 1/100 con PBS, y se dejó que
se unieran los anticuerpos anti-MUC1 contenido en
los sueros. Después de lavado, los anticuerpos unidos se sondaron
con IgM-HRP anti-humana y
conjugados de IgG-HRP
anti-humana.
La Figura 8 muestra los resultados de cierto
número de determinaciones de reactividad de sueros de pacientes con
cáncer de mama con MUC1 de ABC y de orina. Los sueros de la mayoría
de las pacientes exhibían claramente mayor especificidad para la
MUC1 de ABC en comparación con la MUC1 de orina.
Claims (47)
1. Un método in vitro para detectar una
proteína marcadora asociada al cáncer, presente en un fluido
corporal de un mamífero, comprendiendo dicho método las etapas
de:
- (a)
- poner en contacto una muestra del fluido corporal de dicho mamífero, con anticuerpos dirigidos contra al menos un epítopo de dicha proteína marcadora; y
- (b)
- detectar la presencia de complejos formados entre dichos anticuerpos y cualquier proteína marcadora presente en dicha muestra;
en donde dichos anticuerpos son
autoanticuerpos de mamífero para dicha proteína marcadora asociada
al cáncer que proceden de la misma especie que el mamífero, del
cual se ha obtenido dicha muestra, y en donde dicha proteína
marcadora asociada al cáncer es una forma modificada de una
proteína de tipo
natural.
2. Un método según la reivindicación 1, en donde
dicha muestra es de un mamífero sustancialmente asintomático de
pre-neoplasia o cáncer.
3. Un método según la reivindicación 1, en donde
dicha muestra es de un mamífero sintomático de cáncer.
4. Un método según la reivindicación 1, en donde
dicha muestra es de un mamífero que ha recibido terapia para
cáncer.
5. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde el mamífero es un ser humano
y los autoanticuerpos son autoanticuerpos humanos.
6. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde dicho fluido corporal es
plasma, suero, sangre completa, orina, heces, linfa, fluido
cerebroespinal o aspirado de pezón.
7. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde dicha proteína marcadora
asociada al cáncer está asociada a linfomas, leucemias, cánceres de
mama, cánceres colorrectales, cánceres de pulmón, cánceres
pancreáticos, cánceres de próstata, cánceres del cuello del útero,
cánceres de ovario, cánceres endometriales o cánceres de la
piel.
8. Un método según la reivindicación 7, en donde
dicha proteína marcadora asociada al cáncer es una proteína
marcadora asociada al cáncer de mama.
9. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde dicha proteína marcadora
asociada al cáncer es una forma asociada al cáncer de la proteína
MUC1, BRCA1, p53, c-myc,
c-erb\beta2 o Ras.
10. Un método según la reivindicación 8, en donde
dicha proteína marcadora asociada al cáncer es una forma asociada
al cáncer de una proteína MUC1, BRCA1, BRCA2, p53,
c-myc, c-erb\beta2 o Ras asociada
al cáncer de mama primario.
11. Un método según la reivindicación 8, en donde
dicha proteína marcadora asociada al cáncer es una forma asociada
al cáncer de una proteína MUC1, BRCA1, BRCA2, p53,
c-myc, c-erb\beta2 o Ras asociada
al cáncer de mama avanzado.
12. Un método según la reivindicación 10, en
donde dichos autoanticuerpos se obtienen a partir de monocitos
aislados de una paciente con cáncer de mama primario.
13. Un método según la reivindicación 11, en
donde dichos autoanticuerpos se obtienen de monocitos aislados de
una paciente con cáncer de mama avanzado.
14. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde dichos autoanticuerpos son
producidos por una célula o población de células
inmortalizadas.
15. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en donde dichos autoanticuerpos son
anticuerpos policlonales.
16. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde dichos autoanticuerpos está
inmovilizados sobre una superficie sólida.
17. Un método según la reivindicación 16, en
donde los complejos formados entre dichos autoanticuerpos y
cualquier proteína marcadora asociada al cáncer presente en dicha
muestra se detectan usando anticuerpos secundarios o
autoanticuerpos específicos para al menos un epítopo de dicha
proteína marcadora, llevando dichos autoanticuerpos secundarios un
marcador detectable.
18. Un método según la reivindicación 16, en
donde además se añade a dicha muestra una proteína marcadora
asociada al cáncer marcada que lleva al menos un epítopo reconocido
por dichos autoanticuerpos.
19. Uso de un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, para escrutar la recidiva de cáncer
después de un tratamiento, para monitorizar las terapias sistémicas
o para seleccionar las terapias.
20. Un reactivo de diagnóstico que comprende
autoanticuerpos de mamífero con una especificidad para al menos un
epítopo de una proteína marcadora asociada al cáncer de mamífero,
en donde dicha proteína marcadora asociada al cáncer es una forma
modificada de una proteína de tipo natural.
21. Un reactivo de diagnóstico según la
reivindicación 20, para uso en la detección de la presencia de una
proteína marcadora asociada al cáncer de mamífero en una muestra de
fluido corporal.
22. Un reactivo según la reivindicación 20 o la
reivindicación 21, en donde dichos autoanticuerpos son
autoanticuerpos humanos y dicha proteína marcadora es una proteína
marcadora asociada al cáncer humana.
23. Un reactivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 21 ó 22, en donde dichos autoanticuerpos tiene
especificidad para al menos un epítopo de una proteína marcadora
asociada al cáncer asociada a linfomas, leucemias, cánceres de
mama, cánceres colorrectales, cánceres de pulmón, cánceres
pancreáticos, cánceres de próstata, cánceres del cuello del útero,
cánceres de ovario, cánceres endometriales o cánceres de la
piel.
24. Un reactivo según la reivindicación 23, en
donde dichos autoanticuerpos tiene especificidad para al menos un
epítopo de una proteína marcadora asociada al cáncer de mama.
25. Un reactivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 24, en donde dicha proteína marcadora es una
forma asociada al cáncer de una proteína MUC1, BRCA1, BRCA2, p53,
c-myc, c-erb\beta2 o Ras.
26. Un reactivo según la reivindicación 24, en
donde dicha proteína marcadora es una forma asociada al cáncer de
una proteína MUC1, BRCA1, BRCA2, p53, c-myc,
c-erb\beta32 o Ras asociada al cáncer de mama
primario.
27. Un reactivo según la reivindicación 24, en
donde dicha proteína marcadora es una forma asociada al cáncer de
una proteína MUC1, BRCA1, BRCA2, p53, c-myc,
c-erb\beta2 o Ras asociada al cáncer de mama
avanzado.
28. Un reactivo según la reivindicación 26 en
donde dichos autoanticuerpos se obtienen de monocitos aislados de
una paciente con cáncer de mama primario.
29. Un reactivo según la reivindicación 27, en
donde dichos autoanticuerpos se obtienen de monocitos aislados de
una paciente con cáncer de mama avanzado.
30. Una población de células inmortalizadas capaz
de producir autoanticuerpos dirigidos contra al menos un epítopo de
una proteína marcadora asociada al cáncer de mamífero, en donde
dicha proteína marcadora asociada al cáncer es una forma modificada
de una proteína de tipo natural.
31. Una población de células inmortalizadas según
la reivindicación 30, que es capaz de producir autoanticuerpos
dirigidos contra al menos un epítopo de una proteína marcadora
asociada al cáncer humana.
32. Una población de células inmortalizadas según
la reivindicación 31 o la reivindicación 32, en donde dichos
autoanticuerpos se dirigen contra al menos un epítopo de una
proteína marcadora asociada al cáncer asociada a linfomas,
leucemias, cánceres de mama, cánceres colorrectales, cánceres de
pulmón, cánceres pancreáticos, cánceres de próstata, cánceres del
cuello del útero, cánceres de ovario, cánceres endometriales o
cánceres de la piel.
33. Una población de células inmortalizadas según
la reivindicación 32, en donde dichos autoanticuerpos están
dirigidos contra un epítopo de una proteína marcadora asociada al
cáncer de mama.
34. Una población de células inmortalizadas según
una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, en donde dichos
autoanticuerpos están dirigidos contra una forma asociada al cáncer
de una proteína MUC1, BRCA1, BRCA2, p53, c-myc,
cerb\beta2 ó Ras.
35. Una población de células inmortalizadas según
la reivindicación 33, en donde dichos autoanticuerpos son
autoanticuerpos para una forma asociada al cáncer de la proteína
MUC1, BRCA1, BRCA2, c-myc, p53,
c-erb\beta2 o Ras asociada al cáncer de mama
primario.
36. Una población de células inmortalizadas según
la reivindicación 33, en donde dichos autoanticuerpos son
autoanticuerpos para una forma asociada al cáncer de una proteína
MUC1, BRCA1, BRCA2, c-myc,
c-erb\beta2 o Ras asociada al cáncer de mama
avanzado.
37. Una población de células inmortalizadas según
una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 36, que procede de
linfocitos B aislados de una paciente o un grupo de pacientes que
tiene cáncer u otra neoplasia.
38. Una población de células inmortalizadas según
la reivindicación 35, en donde dicha población de células procede
de linfocitos B de una paciente o grupo de pacientes que tienen
cáncer de mama primario.
39. Una población de células inmortalizadas según
la reivindicación 36, en donde dicha población de células procede
de linfocitos B de una paciente o grupo de pacientes con cáncer de
mama avanzado.
40. Un kit para detectar una proteína marcadora
asociada al cáncer presente en un fluido corporal de un mamífero,
comprendiendo dicho kit:
- (a)
- autoanticuerpos de mamífero dirigidos contra una proteína marcadora asociada al cáncer de la misma especie que dichos autoanticuerpos; y
- (b)
- medios para detectar la formación de complejos entre dichos autoanticuerpos y dicha proteína marcadora asociada al cáncer;
en donde dicha proteína marcadora
asociada al cáncer es una forma modificada de una proteína de tipo
natural.
41. Un kit según la reivindicación 40, en donde
dichos autoanticuerpos son autoanticuerpos humanos.
42. Un kit según la reivindicación 40 ó 41, en
donde dichos autoanticuerpos son autoanticuerpos humanos.
43. Un kit según una cualquiera de las
reivindicaciones 40 a 42, en donde dicha proteína marcadora es una
proteína marcadora asociada al cáncer asociada a linfomas,
leucemias, cánceres de mama, cánceres colorrectales, cánceres de
pulmón, cánceres pancreáticos, cánceres de próstata, cánceres del
cuello del útero, cánceres de ovario, cánceres endometriales o
cánceres de la piel.
44. Un kit según la reivindicación 43, en donde
dicha proteína marcadora es una proteína marcadora asociada al
cáncer de mama.
45. Un kit según una cualquiera de las
reivindicaciones 40 a 44, en donde dicha proteína marcadora es una
forma asociada al cáncer de una proteína MUC1, BRCA1, BRCA2, p53,
c-myc, c-erb\beta2 o Ras.
46. Un kit según la reivindicación 45, en donde
dicha proteína marcadora es una forma asociada al cáncer de una
proteína MUC1, BRCA1, BRCA2, c-myc, p53,
c-erb\beta2 o Ras asociada al cáncer de mama
primario.
47. A kit según la reivindicación 45, en donde
dicha proteína marcadora es una forma asociada al cáncer de una
proteína MUC1, BRCA1, BRCA2, p53, c-myc,
c-erb\beta2 o Ras asociada al cáncer de mama
avanzado.
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
| ES99959578T Expired - Lifetime ES2257087T3 (es) | 1998-12-10 | 1999-12-10 | Metodo y reactivos para la deteccion del cancer. |
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|---|---|
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Families Citing this family (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9810040D0 (en) | 1998-05-11 | 1998-07-08 | Univ Nottingham | Blood borne tumour markers |
| US20030232399A1 (en) * | 2000-06-14 | 2003-12-18 | Robertson John Forsyth Russell | Cancer detection methods and reagents |
| GB2395270B (en) | 2002-11-14 | 2006-08-16 | Univ Nottingham | Tumour marker proteins and uses thereof |
| US20040137538A1 (en) * | 2003-01-10 | 2004-07-15 | Bradford Sherry A. | Cancer comprehensive assay kit for identifying cancer protein patterns |
| US7858323B2 (en) | 2004-06-09 | 2010-12-28 | The Regents Of The University Of Michigan | Phage microarray profiling of the humoral response to disease |
| ATE527285T1 (de) * | 2005-01-28 | 2011-10-15 | Univ Ramot | Anti-muc1-alpha-beta-antikörper |
| GB2426581A (en) | 2005-05-27 | 2006-11-29 | Univ Nottingham | Immunoassay methods |
| BRPI0610267B8 (pt) | 2005-05-27 | 2021-07-27 | Oncimmune Ltd | métodos de detecção de um estado doentio ou de uma suscetibilidade à doença em um indivíduo mamífero, e, uso do método |
| US20090197285A1 (en) * | 2005-11-10 | 2009-08-06 | University Of Kentucky | Lung Cancer Diagnostic Assay |
| EP2041569A4 (en) * | 2006-07-08 | 2009-11-18 | Univ Kentucky Res Found | DIAGNOSTIC TEST OF LUNG CANCER |
| CN101632020B (zh) | 2006-09-13 | 2013-11-27 | 昂西免疫有限公司 | 改进的免疫测定方法 |
| US9111950B2 (en) * | 2006-09-28 | 2015-08-18 | Philips Lumileds Lighting Company, Llc | Process for preparing a semiconductor structure for mounting |
| MX2009005466A (es) | 2006-11-22 | 2009-08-17 | Adnexus A Bristol Myers Sqibb | Terapeuticos dirigidos a base de proteinas manipuladas para receptores de tirosina cinasas, incluyendo receptor de factor de crecimiento tipo insulina-i. |
| GB0725239D0 (en) * | 2007-12-24 | 2008-02-06 | Oncimmune Ltd | Calibrator for autoantibody assay |
| US8642347B2 (en) * | 2008-01-31 | 2014-02-04 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Urinary CA125 peptides as biomarkers of ovarian cancer |
| WO2009102421A2 (en) | 2008-02-14 | 2009-08-20 | Bristol-Myers Squibb Company | Targeted therapeutics based on engineered proteins that bind egfr |
| US20120003225A1 (en) * | 2008-05-09 | 2012-01-05 | Duke University | Autoantibodies in the detection and treatment of cancer |
| AR071874A1 (es) | 2008-05-22 | 2010-07-21 | Bristol Myers Squibb Co | Proteinas de dominio de armazon basadas en fibronectina multivalentes |
| WO2010005718A1 (en) * | 2008-06-16 | 2010-01-14 | University Of Louisville Research Foundation, Inc | Systems and methods for diagnosis and prognosis of cancer |
| TWI496582B (zh) | 2008-11-24 | 2015-08-21 | 必治妥美雅史谷比公司 | 雙重專一性之ｅｇｆｒ／ｉｇｆｉｒ結合分子 |
| EP2548025A4 (en) * | 2010-03-17 | 2013-09-25 | Univ Michigan | USE OF PHOTOEPITOPES FOR PROFILING AN IMMUNE REACTION |
| WO2011120015A2 (en) * | 2010-03-26 | 2011-09-29 | Armune Biosciences, Inc. | Method and system of particle-coupled phage epitope |
| TW201138808A (en) | 2010-05-03 | 2011-11-16 | Bristol Myers Squibb Co | Serum albumin binding molecules |
| EP2576615B1 (en) | 2010-05-26 | 2016-03-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Fibronectin based scaffold proteins having improved stability |
| CN102680456B (zh) * | 2011-03-16 | 2015-07-08 | 北京联众泰克科技有限公司 | 一种电化学发光免疫测定方法 |
| PL2697257T3 (pl) | 2011-04-13 | 2017-04-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Białka fuzyjne fc o nowatorskim układzie lub zawierające nowatorskie łączniki |
| WO2012158678A1 (en) | 2011-05-17 | 2012-11-22 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for maintaining pegylation of polypeptides |
| US20130040839A1 (en) * | 2011-06-27 | 2013-02-14 | Ambergen, Inc. | Method for Diagnosing or Determining the Prognosis of Colorectal Cancer (CRC) Using Novel Autoantigens: Gene Expression Guided Autoantigen Discovery |
| WO2013038412A2 (en) | 2011-09-15 | 2013-03-21 | Vaxil Bio Therapeutics Ltd. | Antibodies directed against signal peptides, methods and uses thereof |
| KR20220162886A (ko) | 2014-03-20 | 2022-12-08 | 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 | 혈청 알부민-결합 피브로넥틴 유형 iii 도메인 |
| GB201501930D0 (en) | 2015-02-05 | 2015-03-25 | Univ London Queen Mary | Biomarkers for pancreatic cancer |
| EP3281016A1 (en) | 2015-04-10 | 2018-02-14 | Applied Proteomics Inc. | Protein biomarker panels for detecting colorectal cancer and advanced adenoma |
| WO2017053617A1 (en) | 2015-09-23 | 2017-03-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Fast-off rate serum albumin binding fibronectin type iii domains |
| CN109116024B (zh) * | 2018-06-14 | 2021-04-23 | 郑州大学第一附属医院 | 一种肺癌标志物抗-actr3自身抗体及其应用 |
Family Cites Families (48)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4241044A (en) * | 1978-12-28 | 1980-12-23 | Abbott Laboratories | Method of diagnosing cancer by detecting elevated anti-T antibody activity |
| US4562160A (en) * | 1983-04-01 | 1985-12-31 | Sloan-Kettering Institute | Melanoma tumor antigen and autologous antibody |
| US5106738A (en) * | 1984-01-31 | 1992-04-21 | Akzo Nv | Tumor specific monoclonal antibodies |
| NZ211453A (en) | 1984-03-22 | 1989-01-06 | Biotechnology Research Enterpr | Aryl azides, their preparation and use in the detection, localisation and isolation of polynucleotides |
| ATE77700T1 (de) | 1986-03-10 | 1992-07-15 | Imre Corp | Immunkomplextestverfahren. |
| US4937185A (en) | 1987-07-31 | 1990-06-26 | The Ohio State University Research Foundation | Detection of circulating antibodies to a cancer marker protein |
| US7282345B1 (en) * | 1989-08-04 | 2007-10-16 | Schering Ag | C-erbB-2 external domain: GP75 |
| US5110911A (en) * | 1989-11-02 | 1992-05-05 | Biomira, Inc. | Human tumor-associated thomsen-friedenreich antigen |
| US5157020A (en) * | 1990-05-24 | 1992-10-20 | Research Corporation Tech., Inc. | Synthetic senescent cell antigen |
| DK9091D0 (da) * | 1991-01-18 | 1991-01-18 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af antistoffer |
| DE4120412C1 (es) * | 1991-06-20 | 1993-01-07 | Henning Berlin Gmbh Chemie- Und Pharmawerk, 1000 Berlin, De | |
| US6322989B1 (en) | 1991-11-25 | 2001-11-27 | Yoreh Biotechnologies, Ltd. | Whole blood/mitogen assay for the early detection of a subject with ovarian or breast cancer and kit |
| US6280962B1 (en) * | 1991-11-25 | 2001-08-28 | Yoreh Biotechnologies Ltd. | Whole blood/mitogen assay for the early detection of a subject with cancer and kit |
| PT1024191E (pt) * | 1991-12-02 | 2008-12-22 | Medical Res Council | Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos |
| EP0636248A4 (en) | 1992-04-14 | 1996-11-13 | Univ Duke | METHOD FOR DETECTING P53 AND HSP70 COMPLEX CONTAINING TUMORS. |
| US5801005A (en) | 1993-03-17 | 1998-09-01 | University Of Washington | Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated |
| US5763164A (en) | 1993-04-16 | 1998-06-09 | Northwestern University | Immunogenic cancer proteins and peptides and methods of use |
| US5747268A (en) * | 1993-04-22 | 1998-05-05 | Dade International Inc. | Tumor marker control |
| IT1270939B (it) * | 1993-05-11 | 1997-05-26 | Angeletti P Ist Richerche Bio | Procedimento per la preparazione di immunogeni e reagenti diagnostici,e immunogeni e reagenti diagnostici cosi' ottenibili. |
| US5744144A (en) * | 1993-07-30 | 1998-04-28 | University Of Pittsburgh University Patent Committee Policy And Procedures | Synthetic multiple tandem repeat mucin and mucin-like peptides, and uses thereof |
| US5721105A (en) * | 1994-02-20 | 1998-02-24 | B.R.A.H.M.S. Diagnostica Gmbh | Method for the immunological determination of proteins and kit for carrying out the method |
| EP0764030B1 (en) * | 1994-06-24 | 2000-09-20 | Vladimir P. Torchilin | Composition containing autoantibodies for tumor therapy and prophylaxis |
| IL110464A0 (en) | 1994-07-26 | 1994-10-21 | Univ Ramot | Novel proteins for the diagnosis, imaging, and therapy of human cancer |
| US5561049A (en) * | 1994-09-21 | 1996-10-01 | Behringwerke Ag | Method for detecting antibodies |
| US5876728A (en) | 1995-02-15 | 1999-03-02 | Howard David Kass | Natural composition extracted from plants used in the treatment of cancer |
| GB9521544D0 (en) | 1995-10-20 | 1995-12-20 | Univ Dundee | Activation of P53 protein and therapeutic applications thereof |
| JPH09189702A (ja) | 1996-01-09 | 1997-07-22 | Hitachi Chem Co Ltd | 抗ムチン抗体の測定法、癌の測定法及び癌診断薬 |
| ATE283069T1 (de) * | 1996-08-16 | 2004-12-15 | Univ Johns Hopkins Med | Melanomzellinien, welche immundominante melanomantigene teilen und verfahren zu deren anwendung |
| DE19805815C1 (de) * | 1998-02-13 | 1999-11-11 | Ansgar W Lohse | Diagnostikum zum Erkennen der autoimmunen Hepatitis |
| GB9810040D0 (en) * | 1998-05-11 | 1998-07-08 | Univ Nottingham | Blood borne tumour markers |
| EP1125134B1 (en) | 1998-11-05 | 2009-11-04 | The Regents Of The University Of Michigan | S100 proteins and autoantibodies as serum markers for cancer |
| US6387639B1 (en) * | 1998-11-10 | 2002-05-14 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Ma family polypeptides and anti-Ma antibodies |
| US7807810B2 (en) * | 1999-04-08 | 2010-10-05 | The Ohio State University Research Foundation | Nucleic acids encoding the major outer membrane protein of the causative agent of human granulocytic ehrlichiosis and peptides encoded thereby |
| US6645465B2 (en) * | 1999-08-06 | 2003-11-11 | Michigan, University Of The Regents | Annexin proteins and autoantibodies as serum markers for cancer |
| US20020064801A1 (en) * | 1999-12-01 | 2002-05-30 | Ryan Jeffrey R. | Novel and practical serological assay for the clinical diagnosis of leishmaniasis |
| US6667160B2 (en) * | 2000-03-15 | 2003-12-23 | Kenneth D. Fine | Method for diagnosing immunologic food sensitivity |
| US20030232399A1 (en) * | 2000-06-14 | 2003-12-18 | Robertson John Forsyth Russell | Cancer detection methods and reagents |
| US20030138860A1 (en) * | 2000-06-14 | 2003-07-24 | Robertson John Forsyth Russell | Cancer detection methods and reagents |
| CA2451045A1 (en) * | 2001-06-21 | 2003-09-04 | New York University | Mycobacterial proteins as early antigens for serodiagnosis and vaccines |
| US20030049692A1 (en) * | 2002-09-16 | 2003-03-13 | Norman Latov | Detection of anti-glycolipid antibodies by latex agglutination assay |
| GB2395270B (en) * | 2002-11-14 | 2006-08-16 | Univ Nottingham | Tumour marker proteins and uses thereof |
| JP2005352771A (ja) * | 2004-06-10 | 2005-12-22 | Hitachi Software Eng Co Ltd | 発現プロファイルによるパターン認識システム |
| US20060141547A1 (en) * | 2004-11-16 | 2006-06-29 | Das Hasi R | Novel diagnostic marker, a diagnostic kit and a method for diagnosis of rheumatoid arthritis |
| GB2426581A (en) * | 2005-05-27 | 2006-11-29 | Univ Nottingham | Immunoassay methods |
| EP1789435B1 (en) * | 2005-09-12 | 2010-02-24 | Industry Foundation of Chonnam National University | A method for production of mature natural killer cell |
| TWI304443B (en) * | 2005-12-30 | 2008-12-21 | Nat Health Research Institutes | Alpha-enolase specific antibody and method of use |
| CN101632020B (zh) * | 2006-09-13 | 2013-11-27 | 昂西免疫有限公司 | 改进的免疫测定方法 |
| GB0725239D0 (en) * | 2007-12-24 | 2008-02-06 | Oncimmune Ltd | Calibrator for autoantibody assay |
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