KR20230116125A - 점액성 물질 유래 중성 단당류 고감도 동시 정량방법 - Google Patents

점액성 물질 유래 중성 단당류 고감도 동시 정량방법 Download PDF

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Abstract

본 발명자들은 최적의 단백질 용해 조건하에서 점액 단백질을 선행적으로 분리한 뒤, 산가수분해되어 유리된 유사 중성 단당류들을 특이적으로 식별하고, 식별과 동시에 정량할 수 있는 LC/MRM-MS 기반의 고선택적 고민감도 분석법을 발명하였다.

Description

점액성 물질 유래 중성 단당류 고감도 동시 정량방법 {Highly sensitive simultaneous quantification of mucus-derived neutral monosaccharides}
본 발명은 식물 및 동물에서 끈적한 성상을 가지는 점액성 물질 (mucus)에서 유래한 다양한 중성 단당류를 동시에 절대 정량할 수 있는 고민감도, 고선택적 분석방법 및 분석을 위한 시료 제조방법에 관한 것이다.
점성 물질에 포함된 점액 단백질 (mucoprotein)은 1,000,000 - 10,000,000 Da의 분자량을 가지며 일반적으로 펩타이드 사슬에 4 - 20% 이상의 점액 다당류 (mucopolysaccharide)를 함유하고 있다. 점액 단백질은 자연계에서 끈적이는 성상을 가지는 물질에서 주로 발견되고, 특히 인체의 위장관, 생식기관, 기도, 관절의 상피 조직 또는 분비물에 다량으로 존재한다. 점액 단백질은 소수성 분자(예컨대 지질 등) 및 친수성 분자 (예컨대 단백질 등)와 쉽게 상호작용하여 점성을 띠게 하는 특유의 성질을 가지고 있어, 조직의 탄력성과 투과성을 결정하며 외부요인을 포획하거나 제거하는 보호 역할을 수행한다.
2018년 기준 2조 3천억원에 육박하는 건강기능식품 및 화장품 산업에서 점막 상태 개선 (위장 보호, 면역력 향상, 세포재생 등)에 유용한 원료로 점액 단백질이 각광받고 있으며, 이를 첨가한 제품들이 다양하게 출시되고 있어 점액 단백질에 대한 정확한 정보가 요구되고 있다.
건강기능식품의 기능성 원료 또는 성분으로 인정받기 위해서는 원료의 기능성분 규격 및 시험 방법을 통한 식품의약품안전처의 승인이 반드시 수반되어야 한다. 그러나 거대한 분자량의 점액 단백질은 분리 및 정제가 어렵고, 점액 단백질을 구성하는 성분 중 어떠한 물질이 기능성 효과를 나타내었는지 입증된 사례들이 불충분하다. 또한, 종래에는 건강기능식품에 점액 단백질의 함량을 정확히 제시하지 못하고, 뮤신 복합체와 같은 명칭으로 함유량을 표시하고 있어, 저품질 제품이 시장에 유통될 가능성이 있다.
특히, 점액 단백질 함량의 대부분을 차지하는 다당류는 친수성 특성에 영향을 끼칠 뿐만 아니라 점액 단백질의 유용한 기능을 주로 매개하기 때문에 다당류의 특성을 명확히 하는 것은 점액 단백질에 대한 더 깊은 이해를 제공하는 중요한 정보가 될 수 있다. 점액 단백질 다당류는 공통 코어 (N-Acetylgalatosamine, N-Acetylglucosamine, galactose)를 기준으로 단당류가 순차적으로 첨가되어 이루어지기 때문에 수많은 종류의 당사슬 구조를 가지고 있으며, 각 당사슬의 함량도 매우 다양하다. 따라서 점액 단백질을 구성하는 다당류의 정성 및 절대 정량 정보를 동시에 제공할 수 있는 분석방법이 매우 필요하다. 다당류에서 단당류 조성과 함량은 가장 기본적인 정보이며, 단당류 수준의 분석을 통해 점액 단백질 다당류에 대한 정성 및 절대 정량 정보를 포괄적으로 얻을 수 있는 장점이 있다. 게다가, 점액 단백질 원료의 특성 및 품질을 보다 더 신속하게 파악하고, 다당류 구조의 변화를 지속적으로 추적할 수 있다.
지금까지 단당류의 분석에는 주로 기체 크로마토그래피 (Gas Chromatography; GC) 또는 액체 크로마토그래피 (Liquid Chromatography; LC) 기반의 분리 분석방법이 널리 사용되고 있으나, 단당류의 휘발을 용이하게 하거나 광학적 검출을 위해 표지자를 부착하는 부가 전처리 반응이 반드시 필요하다.
현재 구조화학적 유사체인 단당류들의 분리 및 분석을 위해 GC보다는 LC 기반 분석법이 좀 더 일반적인 기술로 채택되고 있고, PMP (1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone) 표지는 단당류 구조에 대한 파괴를 최소화할 수 있는 온화한 조건에서 반응하고 가장 일반적인 LC 정지상인 C18에서 분리가 용이하다는 장점이 있어, LC와 동반하여 널리 사용되어 왔다. 그러나, PMP를 인식하는 UV (Ultraviolet) 검출기는 단당류 외의 분자들의 UV를 흡수하기 때문에 검출의 특이성이 상대적으로 낮고, 정량 분석은 불순물로부터 모든 단당류들의 효과적인 크로마토그래피 분리에 크게 의존하므로 분석 시간이 길어지는 단점이 있으며, 단당류들 간의 완전한 분리가 이뤄지지 않는 경우 단당류를 식별하거나 정량함에 있어서 결과가 부정확해질 우려가 있다. 또한, PMP 표지 시 과량의 PMP는 질량분석시 이온을 억제하는데 영향을 미치기 때문에 PMP 사용을 최소화하거나 표지 반응 후 남은 PMP 시약을 제거할 필요가 있다.
이뿐만 아니라, 특히 점액 단백질의 다당류를 구성하는 중성 단당류들은 질량이 동일하고 구조가 매우 유사하기 때문에 LC 기반의 정성 및 정량 분석이 용이하지 않다. 나아가, 코어 구조를 이루는 단당류들은 과량으로 포함되어 있어 함량을 측정하는데 어려움이 없지만, 코어 구조를 수식하며 극미량으로 존재하는 푸코오스와 같은 특이적 단당류들의 함량을 여타 단당류들과 동시에 분석하는 것은 이 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 용이하지 않다.
WO 2011-138955 A1에는 유방암과 간질성 폐렴을 구별할 수 있는 유방암의 악성도 및 진전도의 마커 및 치료 효과의 모니터링 마커를 제공하는 기술로서, Siaα2-8 Siaα2-3 Galβ-R 당쇄를 가지는 뮤신 1에 특이적으로 결합하는 메인 프로브와 피검시료를 접촉시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 Siaα2-8 Siaα2-3 Galβ-R 당쇄를 가지는 뮤신 1 분석방법이 개시되어 있다. 이 방법은 뮤신의 당쇄를 구성하는 중성 단당류를 분석하는 방법과는 관련이 없다.
WO 2012-173228 A1에는 유방암 유래의 뮤신 1을 검출하는 방법으로서, Sulfo-3 Galβ1-3 GalNAc-R 당쇄에 결합하는 3' 황산화 코어 1 당쇄 결합 프로브와 피검시료를 접촉시키는 공정, Sulfo-3 Galβ1-3 GalNAc-R 당쇄를 가지는 뮤신 1에 결합하는 3' 황산화 코어 1 당쇄 뮤신 1 펩타이드 결합 프로브, 또는 뮤신 1에 결합하는 뮤신 1 결합 프로브와 피검시료를 접촉시키는 공정 및 Sulfo-3 Galβ1-3 GalNAc-R 당쇄를 가지는 뮤신 1과 프로브와의 결합체를 검출하는 공정를 포함하는 것을 특징으로 하는 Sulfo-3 Galβ1-3 GalNAc-R 당쇄를 가지는 뮤신 1을 분석하는 방법이 개시되어 있다. 이 방법은 유방암 세포에서 유래하는 뮤신 1을 검출하는 방법에 관한 것으로서, 점액 단백질의 당쇄를 구성하는 중성 단당류를 분석하는 방법과는 관련이 없다.
WO 2020-097386 A1에는 StcE, ZmpC, Pic, BT4244, AM0627 등과 같은 뮤신 특이적 프로테아제를 이용하여 뮤신에 처리한 후 당펩타이드와 뮤신이 제거된 부산물 (de-mucinated byproduct)을 얻고, 이를 분석하는 방법이 개시되어 있다. 이 방법은 점액 단백질의 당쇄를 구성하는 중성 단당류들을 동시에 분석하는 방법에 관한 것이 아니다.
일본 특허 JP 3689842 B2는 당 조성물을 구성하는 각 단당을 동시에 정량 분석할 때, (1) 당 조성물에서 시알리다제 또는 산으로 시알산을 유리하고, (2) 유리한 시알산을 시알산 알돌라제로 N-아실만노사민으로 변환하고, (3) N-아실만노사민 및 당 잔기를 산 가수분해하고, (4) 상기 가수분해에 있어서 탈 N-아실화된 단당을 N-아세틸화하고, (5) 상기 얻어진 단당을 4-아미노안식향산 에틸(ABEE) 표지화하는 것을 특징으로 하는 당 조성물의 단당 분석방법을 개시한다.
또한, 일본 특허 JP 3735666 B2는 단당류 및 소당류를 포함한 당류 혼합물을 2 종류 이상의 다른 이동상을 이용한 액체 크로마토크래피법을 이용하여 각 성분으로 분리한 후, 분리된 각 성분마다 반응 시약을 반응시켜 그 유도체를 형성시키고, 이 유도체를 셀에 수용해 검출하는 당류 혼합물의 동시 분석방법에 있어서 검출 시에 이용한 셀을 검출마다 세척 처리해 분석하는 방법을 개시한다.
위 두 가지 일본 특허는 본 발명의 구성과는 다르며, 점액 단백질 유래 중성 단당류의 동시 정성, 정량 분석방법에 관한 기술을 개시하지 않는다.
WO 2011-138955 A1 "Siaα2-8 Siaα2-3 Galβ-R 당쇄를 가지는 뮤신 1의 분석 방법" (2011.11.10. 국제공개) WO 2012-173228 A1 "3' 황산화 코어 1 당쇄에 결합하는 프로브를 이용하는 무친 1의 분석 방법 및 유방암의 검출 또는 모니터링 방법" (2012.12.20. 국제공개) WO 2020-097386 A1 "METHODS EMPLOYING MUCIN-SPECIFIC PROTEASES" (2020.05.14. 국제공개) JP 3689842 B2 "당 조성물의 단당 분석방법" (2005.08.31. 공고) JP 3735666 B2 "당류 혼합물의 동시 분석 방법 및 그에 이용하는 분석 장치" (2006.01.18. 공고)
건강기능식품 시장에서 다양한 생체 기능성 물질로 주목받고 있는 점액 단백질에 포함된 점액 다당류의 정성 및 정량을 위한 분석법의 개발을 통해 점액 단백질에 대한 올바른 정보를 제공하고 고품질 제품을 생산할 수 있는 기반을 마련할 필요가 있다.
본 발명은 점성 물질에 포함된 점액 다당류를 구성하는 다양한 종류와 다양한 농도의 중성 단당류들을 동시에 고민감도 및 고선택도로 정량 및 정성 분석하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 최적의 단백질 용해 조건 하에서 점성 물질 유래 점액 단백질을 선행적으로 분리한 뒤, 가수분해로 유리된 유사한 중성 단당류들을 특이적으로 식별하고, 식별과 동시에 정량할 수 있는 LC/MRM-MS 기반의 고선택적 고민감도 분석법을 발명하였다.
본 발명에 사용된 다중 반응 모니터링 (Multiple Reaction Monitoring, MRM) 질량분석은 삼중-사중극자 탠덤 질량분석기 (Triple Quadrupole Mass Spectrometry, QQQ)를 통해 수행되는, 정량 가능한 질량분석 기법 중의 하나로서, 선택성과 민감도가 매우 우수하다. 질량분석기 첫 번째 사중극자 (Q1) 파트에서는 타겟하는 물질의 이온 (Precursor ion, m/z) 만을 필터한 뒤, 두 번째 사중극자 (Q2)에서 비활성 기체와 전기적 에너지를 이용한 충돌을 일으켜 (Fragmentation, Tandem, MS/MS), 조각 이온 (Product ion, m/z)을 생산한다. 마지막 사중극자 (Q3) 파트에서는 생성된 조각 이온들 중 타겟하는 물질의 특징적 이온을 선택하여 스캔한다. 이 분석기법은 타겟 분석대상과 동시에 존재할 수 있는 매트릭스 등의 간섭 물질의 영향을 최소화할 수 있어 좀 더 고감도로 표적 물질을 분석할 수 있으며, 이온의 모니터링을 통해 도출된 면적을 통하여 절대 정량분석이 가능하다.
본 발명은
가) 점액 단백질을 포함하는 점성 시료를 염기성 용액으로 처리하여 용해된 시료를 얻는 단계;
나) 가)의 용해된 시료에 포함되어 있는 불순물을 분획분자량 기반 정제 컬럼으로 제거하여 점액 단백질을 선별하는 단계;
다) 선별된 점액 단백질을 가수분해하여 점액 단백질 가수분해물을 얻는 단계;
라) 점액 단백질 가수분해물을 중화하는 단계;
마) 라)의 중화 단계 이후 점액 단백질 가수분해물을 원심분리하여 중성 단당류 포함 시료를 얻는 단계;
바) 마) 단계에서 얻은 중성 단당류 포함 시료에 PMP (1-phenyl-3-methyl-5- pyrazolone)를 반응시켜 PMP 표지된 중성 단당류 포함 시료를 얻고 중화하는 단계;
사) 중화된 PMP 표지된 중성 단당류 포함 시료를 액체-액체 추출 (Liquid Liquid Extraction, LLE)하여 상층액을 얻는 단계; 및
아) 사)에서 얻은 상층액을 농축하는 단계;를 포함하는 점액 단백질 유래 중성 단당류 동시 정량을 위한 시료 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 나) 단계의 분획분자량 기반 정제 컬럼이 스핀 컬럼인 것을 특징으로 하는, 점액 단백질 유래 중성 단당류 동시 정량을 위한 시료 제조방법에 관한 것이다.
상기 가) 단계의 염기성 용액은 수산화나트륨 (NaOH) 기준으로 0.5 ~ 2 M 농도 범위, 바람직하게는 1 M NaOH를 사용할 수 있으며, 염기 시약의 종류에 따라 농도 범위는 달라질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 사) 단계의 액체-액체 추출은 중화된 PMP 표지된 중성 단당류 포함 시료에 클로로포름 (CHCl3)을 가하여 수행함을 특징으로 하는, 점액 단백질 유래 중성 단당류 동시 정량을 위한 시료 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
a) PMP 표지된 중성 단당류 포함 시료를 고체상 추출 카트리지에 로딩하는 단계;
b) TFA (trifluoroacetic acid) 함유 용액을 이용하여 상기 a)의 고체상 추출 카트리지로부터 크로마토그래피용 PMP 표지된 중성 단당류 시료를 용출하는 단계;
c) 고체상 추출법으로 용출된 크로마토그래피용 PMP 표지된 중성 단당류 시료를 정제 및 농축하고, 과량의 PMP를 제거하는 단계; 및
d) c)에서 얻은 정제 및 농축된 PMP 표지된 중성 단당류 시료를 LC/MRM-MS (Liquid Chromatography/Multiple Reaction Monitoring - Mass Spectrometry)로 정성 및 정량 분석하는 단계;를 포함하는 점액 단백질에서 유래한 다양한 농도와 다양한 종류의 중성 단당류의 동시 정성 및 정량 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 TFA (trifluoroacetic acid) 함유 용액이 TFA 함유 ACN (acetonitrile)인 것을 특징으로 하는, 점액 단백질에서 유래한 다양한 농도와 다양한 종류의 중성 단당류의 동시 정성 및 정량 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 d) 단계의 LC/MRM-MS가
ㄱ) UHPLC로 PMP 표지된 중성 단당류 포함 시료로부터 중성 단당류를 분리하는 단계; 및
ㄴ) 분리된 PMP 표지된 중성 단당류에 대하여 사중극자 질량분석기 (QqQ-MS)를 이용하여 특이적 탄뎀 이온 모니터링을 통해 도출된 크로마토그램의 면적 값을 기반으로 정량분석을 수행하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 점액 단백질에서 유래한 다양한 농도와 다양한 종류의 중성 단당류의 동시 정성 및 정량 분석방법에 관한 것이다.
나아가, 본 발명은 상기 ㄴ) 단계가 중성 단당류 표준품 시료와 함께 분석을 수행하여 얻은 표준품과 샘플간의 크로마토그램의 면적 값을 비교하여 정량값 도출함을 특징으로 하는, 점액 단백질에서 유래한 다양한 농도와 다양한 종류의 중성 단당류의 동시 정성 및 정량 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 중성 단당류가 만노스, 글루코스, 갈락토스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 퓨코스, 람노스, 아라비노스 및 자일로스 중 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 점액 단백질에서 유래한 다양한 농도와 다양한 종류의 중성 단당류의 동시 정성 및 정량 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 중성 단당류가 0.025 내지 10 pg/㎕ 범위, 바람직하게는 0.05 내지 2.5 pg/㎕ 범위에서 정량 가능한, 점액 단백질에서 유래한 다양한 농도와 다양한 종류의 중성 단당류의 동시 정성 및 정량 분석방법에 관한 것이다.
본 발명의 점성 물질 내에 포함된 점액 단백질 유래 중성 단당류 동시 정량을 위한 시료 제조방법은 최적의 점액 단백질 용해 조건, 점액 단백질 외의 불순물의 효과적인 제거 및 손실 없는 최적화된 중성당 산 가수분해 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 점액 단백질 유래 중성 단당류 동시 정량을 위한 시료 제조방법은 과량의 PMP 표지 시약 제거 및 중성 단당류 정제 농축을 한 단계에서 용이하게 수행하여 시료의 손실을 줄이고, 분석 소요시간을 단축하는 효과를 거두었다.
특히, 본 발명의 분석 방법은 화학적 구조가 매우 유사한 9종 이상의 단당류에 대한 정성 및 정량 분석을 한 번에 수행할 수 있었으며, 특히 달팽이 뮤신을 대상으로 한 단당류 분석시 함량이 약 만 배 가량 차이 나는 글루코스 람노스의 농도를 정확히 정량할 수 있었다. 나아가, 점성 시료로부터 점액 단백질을 분리하고, 이를 가수분해하는 과정을 최적화함으로써 이 분야에서 통상의 지식을 가진 자들이 지금까지 분석하지 못했던 점액 단백질의 고민감도 정량 및 정성 분석을 최소의 시간과 노력을 투여하여 수행할 수 있었다.
본 발명의 점액 단백질 유래 중성 단당류의 정성 및 정량 분석방법은 LC를 이용하여 한 번의 분석으로 중성 단당류의 분리 및 MRM (Multiple Reaction Monitoring) 기반으로 분자량이 유사하고 구조에 큰 차이가 없으며, 다양한 농도 범위로 존재하는 중성 단당류들을 한꺼번에 특이적으로 정성 및 정량할 수 있다.
본 발명은 식/의약 신소재로 사용될 수 있는 점액 단백질의 검증법으로 실용화 될 수 있을 뿐만 아니라 작용기전 및 약리작용에 대한 객관적인 규명에 활용하여 임상 영역에 효과적으로 적용할 수 있다.
본 발명은 또한, 추가적으로 인체 내에도 광범위하게 존재하는 점액 단백질을 생체 지표로 활용하여 질병을 조기탐색할 수 있는 바이오마커 발굴에도 확장 응용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예를 나타내는 흐름도로서, 점성 시료로부터 점액 단백질을 선별한 다음 중성 단당류를 분리 및 분석하는 방법의 흐름을 나타낸다. 도 1에서는 점성 단백질의 일종인 뮤신을 이용한 예를 도시하였다.
도 2는 시료를 용해시키는 용액의 pH 조건에 따라 검출되는 점성 단백질 함량의 차이를 나타내는 그래프이다. 최고의 단백질 정량이 가능한 1 M NaOH (pH 12)에 시료를 녹인 뒤, 이후 실험단계를 수행하였다. 위쪽은 마에서 추출한 점액성 시료, 아래쪽은 달팽이에서 추출한 점액성 시료에 적용한 예시이다.
도 3은 대표 중성 단당류인 글루코스의 탄뎀 질량분석을 통한 전이이온의 생성을 확인한 결과이다. 크로마토그래피에서 분리된 머무름 시간과 질량분석에서 생성된 특이적 전이이온을 모니터링하여 정성 및 정량 분석을 수행하였다.
도 4는 본 발명에서 최적화한 조건에서 LC/MRM-MS 방법으로 분리 및 분석된 중성 단당류의 크로마토그램이다.
도 5는 단당류 9종의 정량분석을 위한 정량곡선과 정량가능범위를 나타내는 표이다.
도 6은 기존에 가장 널리 채택되는 LC-UV 기반 분석 시 단당류의 분리 및 동시 정량이 어려움을 예시하는 크로마토그램이다. 표준품의 경우 분리 분석이 잘 이뤄졌지만, 실제 시료의 경우 분석을 방해하는 많은 매트릭스 물질들이 검출되었을 뿐만 아니라 단당류마다 존재하는 농도범위가 달라 만노스, 글루코스, 갈락토스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민은 포화되었고, 특이적 단당류인 퓨코스는 검출되지 않았다. 특히, 과량의 PMP 피크가 용출됨에 따라 뒤에 검출되는 단당류 피크의 억제가 일어날 수 있음을 보여준다.
도 7은 마, 달팽이 시료에 본 발명의 방법을 적용하여 점성 물질 유래 중성단당류들을 LC/MRM-MS를 이용하여 정성 및 정량 분석한 결과이다. 액체 크로마토그래피로 단당류들의 완전히 분리가 가능하였으며, 광범위한 농도로 존재하는 단당류들이 동시에 정량 분석이 가능하였다. 특히 LC-UV 분석 시 검출되지 않았던 특이적 단당류들인 퓨코스, 람노스 등의 존재 및 함량도 확인 가능하였다.
아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
실시예 1: 점성 시료 내 점성 단백질 선별 및 중성 단당류 분리
1. 점성 시료 50 mg을 1 M NaOH 500 μL 에 용해하였다.
2. 시료에 포함되어 있는 불순물을 Spin Column (MWCO 10kDa)을 이용하여 제거하여 점액 단백질을 1차로 선별하였다.
3. 2 M TFA (Trifluoroacetic acid) 500 μL를 주입한 뒤 heating block에서 100℃로 4시간 동안 반응시켜 가수분해를 진행하였다.
4. 가수분해된 시료에 2 M NaOH 500 μL를 주입해서 중화하였다 (pH 6).
5. 원심분리기에서 4℃로 30분 동안 14,000 rpm으로 원심분리 후 하층에 가라앉은 잔여물을 제외하고 모두 취하였다.
6. 취한 상층액을 완전히 건조한 뒤 3차 증류수 150 μL를 가해 재용해하였다.
실시예 2: 단당류 검출을 위한 PMP (1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone) 표지
1. 재용해한 시료에 0.5 M PMP-MeOH 250 μL와 0.3 M NaOH 250 μL를 넣고 heating block에서 70 ℃로 30분 동안 반응시켰다.
2. 표지 반응이 완료된 시료에 0.3 M HCl 250 μL를 주입해서 중화하였다 (pH 6).
3. CHCl3 900 μL를 주입해서 액체-액체추출 (Liquid Liquid Extraction, LLE)을 진행 후 상층액만 얻었다.
4. 얻은 상층액을 진공 농축기 (vacuum concentrator)에 넣고 빛을 차단한 후 완전히 건조한 다음, 3차 증류수를 이용하여 500 μL에 재용해하였다.
실시예 3: C18-고체상 추출법 (Solid phase extraction, SPE)을 이용한 과량의 PMP 표지 시약 제거 및 중성 단당류 정제 농축
1. C18 충진 카트리지 세척
① C18 카트리지를 3차 증류수 3 mL로 2회 이상 충분히 세척하였다.
② C18 카트리지를 0.1 % TFA가 든 80 % ACN 용액 3 mL로 2회 이상 충분히 세척하였다.
③ C18 카트리지를 3차 증류수 3 mL로 2회 이상 충분히 세척하였다.
2. 샘플 로딩 및 정제
① PMP 표지된 단당류 시료 전체를 C18 카트리지에 로딩한 후 샘플 튜브에 500 μL 3차 증류수를 추가하여 이를 C18 카트리지에 재로딩하였다.
② 이후 3차 증류수 3 mL로 C18 카트리지를 2회 이상 충분히 세척하였다.
3. PMP 표지된 단당류 추출
① 0.1% TFA가 든 60 % ACN 용액 3 mL로 2회 용출하였다.
② 용출된 용액을 진공 농축기에 넣고 빛을 차단한 후 완전히 건조한 다음 3차 증류수를 이용하여 분말 시료 3종을 50 μL에 재용해하였다.
실시예 4: LC/MRM-MS을 이용한 중성 단당류 정량 분석
1. UHPLC/QqQ MS를 통하여 중성 단당류를 분리하고 단당류 특이적 탄뎀 이온 모니터링을 통해 도출된 크로마토그램의 면적 값을 기반으로 정량분석을 수행하였다.
2. 2.1×100 ㎜ 분석 컬럼의 1.8μm C 18 정지상 패킹된 컬럼을 사용하였다.
3. 크로마토그래피 방법에 의한 분리는 최적화된 분리 조건에 따라 수행되었다. 간단히 설명하면, 시료를 로딩한 후 빠른 용출 농도구배 용액을 분당 0.3μL씩 흘려주었다. 용매 A는 25mM 아세트산 암모늄 (ammonium acetate) 5% 포함 ACN 용액, 용매 B는 95% ACN 수액이고, 농도구배 용출 조건은 다음과 같다. 10% B, 0~5 min; 10~15% B, 5~55 min; 15~95% B, 55~55.1 min; 95% B, 55.1~60 min; 95~10% B, 60~60.1 min; 10% B, 60.1~65 min.
4. LC로 분리된 중성 단당류들이 이후 사중극자 질량분석기 (QqQ-MS) 의 첫 번째 4중극 (quadrupole; Q1)에서 단당류에 해당되는 이온을 선택하고 충돌 셀(collision cell 즉, 두 번째 4중극; q2) 에서 선택된 분자에 특정한 에너지를 가하여 단편화 (fragmentation)하여 단편 이온 (fragment ion)이 생성된 다음 세 번째 4중극 (Q3) 에서는 충돌 셀에서 생성된 단편 중 선택된 이온만을 통과시켜 검출하는 단계로 정량분석이 이루어진다 (표 1).
5. 중성 단당류 표준품들을 분석하기 위하여 A 용매에 희석하여 준비하고 샘플과 함께 분석하였다.
6. 도출된 표준품과 샘플간의 크로마토그램의 면적 값을 비교하여 정량 값을 도출하였다.
실험결과
본 발명의 실시예에서는 점액성 물질을 다량 함유하고 있는 마 (식물성 시료), 달팽이 (동물성 시료)를 대표 시료로 선정하고, 샘플에 포함되어 있는 점액 단백질을 용출할 수 있는 최적의 용해 조건을 확립하고, 점액 단백질 당사슬 중 중성 단당류 9종을 타겟으로 하여 정량을 수행하였다.
그 결과, 도 7과 같이 화학적 구조가 매우 유사한 9종의 단당류에 대한 정성 및 정량 분석을 한 번에 수행할 수 있었으며, 특히 달팽이 뮤신에 포함된 단당류 분석시 함량이 가장 많은 글루코스와 함량이 가장 적게 나타난 람노스를 비교해보면 글루코스 농도의 약 1/10,000인 람노스 농도도 정확히 정량할 수 있었다. 또한, 점성 시료로부터 점액 단백질을 분리하고, 이를 가수분해하는 과정을 최적화함으로써 이 분야에서 통상의 지식을 가진 자들이 지금까지 분석하지 못했던 점액 단백질의 고민감도 정량 및 정성 분석을 최소의 시간과 노력을 투여하여 수행할 수 있었다.

Claims (10)

  1. 가) 점액 단백질을 포함하는 점성 시료를 염기성 용액으로 처리하여 용해된 시료를 얻는 단계;
    나) 가)의 용해된 시료에 포함되어 있는 불순물을 분획분자량 기반 정제 컬럼으로 제거하여 점액 단백질을 선별하는 단계;
    다) 선별된 점액 단백질을 가수분해하여 점액 단백질 가수분해물을 얻는 단계;
    라) 점액 단백질 가수분해물을 중화하는 단계;
    마) 라)의 중화 단계 이후 점액 단백질 가수분해물을 원심분리하여 중성 단당류 포함 시료를 얻는 단계;
    바) 마) 단계에서 얻은 중성 단당류 포함 시료에 PMP (1-phenyl-3-methyl-5- pyrazolone)를 반응시켜 PMP 표지된 중성 단당류 포함 시료를 얻고 중화하는 단계;
    사) 중화된 PMP 표지된 중성 단당류 포함 시료를 액체-액체 추출 (Liquid Liquid Extraction, LLE)하여 상층액을 얻는 단계; 및
    아) 사)에서 얻은 상층액을 농축하는 단계;를 포함하는 점액 단백질에서 유래한 다양한 농도와 다양한 종류의 중성 단당류 동시 정량을 위한 시료 제조방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 나) 단계의 분획분자량 기반 정제 컬럼은 스핀 컬럼인, 점액 단백질에서 유래한 다양한 농도와 다양한 종류의 중성 단당류 동시 정량을 위한 시료 제조방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 사) 단계의 액체-액체 추출은 중화된 PMP 표지된 중성 단당류 포함 시료에 CHCl3 (Chloroform)를 가하여 수행함을 특징으로 하는, 점액 단백질에서 유래한 다양한 농도와 다양한 종류의 중성 단당류 동시 정량을 위한 시료 제조방법.
  4. a) PMP (1-phenyl-3-methyl-5- pyrazolone) 표지된 중성 단당류 포함 시료를 고체상 추출 카트리지에 로딩하는 단계;
    b) TFA (trifluoroacetic acid) 함유 용액을 이용하여 상기 a)의 고체상 추출 카트리지로부터 크로마토그래피용 PMP 표지된 중성 단당류 시료를 용출하는 단계;
    c) 고체상 추출법으로 용출된 크로마토그래피용 PMP 표지된 중성 단당류 시료를 정제 및 농축하고, 과량의 PMP를 제거하는 단계; 및
    d) c)에서 얻은 정제 및 농축된 PMP 표지된 중성 단당류 시료를 LC/MRM-MS로 정성 및 정량 분석하는 단계;를 포함하는 점액 단백질에서 유래한 다양한 농도와 다양한 종류의 중성 단당류의 동시 정성 및 정량 분석방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    PMP 표지된 중성 단당류 포함 시료는 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 것인, 점액 단백질에서 유래한 다양한 농도와 다양한 종류의 중성 단당류의 동시 정성 및 정량 분석방법.
  6. 청구항 4에 있어서,
    TFA (trifluoroacetic acid) 함유 용액은 TFA 함유 ACN (acetonitrile)인 것을 특징으로 하는, 점액 단백질에서 유래한 다양한 농도와 다양한 종류의 중성 단당류의 동시 정성 및 정량 분석방법.
  7. 청구항 4에 있어서,
    d) 단계의 LC/MRM-MS는
    ㄱ) UHPLC로 PMP 표지된 중성 단당류 포함 시료로부터 중성 단당류를 분리하는 단계; 및
    ㄴ) 분리된 PMP 표지된 중성 단당류에 대하여 사중극자 질량분석기 (QqQ-MS)를 이용하여 특이적 탄뎀 이온 모니터링을 통해 도출된 크로마토그램의 면적 값을 기반으로 정량분석을 수행하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 점액 단백질에서 유래한 다양한 농도와 다양한 종류의 중성 단당류의 동시 정성 및 정량 분석방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 ㄴ) 단계는 중성 단당류 표준품 시료와 함께 분석을 수행하여 얻은 표준품과 샘플간의 크로마토그램의 면적 값을 비교하여 정량값 도출함을 특징으로 하는, 점액 단백질에서 유래한 다양한 농도와 다양한 종류의 중성 단당류의 동시 정성 및 정량 분석방법.
  9. 청구항 4에 있어서,
    상기 중성 단당류는 만노스, 글루코스, 갈락토스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 퓨코스, 람노스, 아라비노스 및 자일로스 중 선택된 1종 이상인, 점액 단백질에서 유래한 다양한 농도와 다양한 종류의 중성 단당류의 동시 정성 및 정량 분석방법.
  10. 청구항 4에 있어서,
    상기 중성 단당류는 각각 0.025 내지 10 pg/㎕ 범위에서 정량 가능한, 점액 단백질에서 유래한 다양한 농도와 다양한 종류의 중성 단당류의 동시 정성 및 정량 분석방법.
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