JP6192123B2 - 乳癌の予測および診断のためのバイオマーカー - Google Patents

Description

本発明は生物医療技術についてである。乳癌用のバイオマーカーおよびそれらの乳癌の診断への利用、動的検出および進行決定は本発明において述べられる。検査試薬および検査キットならびにそれらの個々のプロトコルも本発明に含まれる。

ＷＨＯによる癌についての報告によると、約１２００万件の乳癌の発生が毎年報告されている。４０万件超の乳癌が中国において毎年報告されており、その発生率は増加している。北京や上海などの都市部での乳癌発生率は他の癌よりも高い。上海での乳癌の発生率は過去三十年で１７．７／１０００００〜７０／１０００００に増加している。すべての悪性腫瘍の中で乳癌の発生率の順位は２番から１番に増加した。５年後の生存率は６０％未満である。

早期発見と５年生存率は、近年かなり改善されているが、乳癌による５４万の死亡がＷｏｒｌｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｐｏｒｔ ２００８（ＷＨＯ）において報告された。乳癌の国内死亡率は、毎年３％増加している。乳癌の予防および治療における多くの問題は、乳癌の早期発見および早期介入、乳癌治療評価、腫瘍診断モニタリングおよび治療後の患者の乳癌の再発および転移の正確な予測を包含する解決を必要とする。

高感度および特異性を有する乳癌の診断方法は乳癌の早期スクリーニングおよび患者の診断の改善に重要である。シスタチンスーパーファミリーは、カテプシン阻害作用を有するタンパク質の配列である。それらタンパク質は癌の発生および成長において重要な役割を演ずる。シスタチンスーパーファミリーに属するタンパク質は、組織および体液中のシステインプロテアーゼと可逆的に結合し、カテプシンの過剰活性化を抑制する。シスタチンＣは、カテプシンＢに最も高い親和性を有するリガンドである。卵巣癌および頭頚部癌の腫瘍における発現レベルは増加している。ステフィンＡ（シスタチンスーパーファミリーのメンバー）は非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍における発現を増加している。ステフィンＢのｍＲＮＡの発現は髄膜腫変化において阻害されている。シスタチンＦ（またはｌｅｕｋｏｃｙｓｔａｔｉｎ、ＣＭＡＰ）は種々の腫瘍において発現する可能性が高い。調査は、増加したシスタチンの発現が、カテプシン発現が上昇し、シスタチンの発現の増加をもたらし、フィードバック機構を通してカテプシンの過剰活性化を阻害する間に腫瘍の発生およびつきぬきにおいてカテプシンの関与に起因する可能性が高いことを示す。しかしながら、シスタチンの発現は必ずしも腫瘍増殖と積極的に関連しているわけではないことに注意されたい。例えば、シスタチンＣの低発現は、神経膠腫患者の後期、予後不良および高転移の可能性を示す。ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現の両方は調査され、その結論は両方の研究において確認されている。

本発明において、ＣＳＴ４（シスタチンスーパーファミリーのメンバー）とそのスプライスと乳癌腫瘍との強い関係は確認されている。ＣＳＴ４、またはシスタチンＳは、１４１個のアミノ酸残基を含むシステインプロテアーゼ阻害剤の一つである。シスタチンＳは、涙、唾液、血漿および血清などの種々の体液ならびに分泌物に見られる。

本発明の第一の目的は、ＣＳＴ４遺伝子、ＣＳＴ４のｍＲＮＡ、ＣＳＴ４のスプライスのｃＤＮＡ、ＣＳＴ４特異的プライマー用増幅産物、シスタチンＳのＣＳＴ４遺伝子およびエピトープペプチドによってコードされるシスタチンＳタンパク質の新規な用途を提供することである。これらの用途は、乳癌の新たな診断方法を開発する点でかなり重要である。

本発明に包含される技術を以下に記載する。
乳癌の診断および予防におけるＣＳＴ４遺伝子、ＣＳＴ４のｍＲＮＡ、ＣＳＴ４のスプライスのｃＤＮＡ、ＣＳＴ４特異的プライマ用増幅産物、シスタチンＳのＣＳＴ４遺伝子およびエピトープペプチドによってコードされるシスタチンＳタンパク質の利用。ＣＳＴ４遺伝子の配列は配列番号４２に存在する。ＣＳＴ４遺伝子、ＣＳＴ４のｍＲＮＡおよびＣＳＴ４のスプライスのｃＤＮＡのプローブは配列番号３に示されるような配列を有する。増幅産物の特異的プライマは配列番号１、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０（プライマー１）およ配列番号２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１（プライマー２）に示される配列を有する。配列番号１における配列は、配列番号２における配列と対にされる。配列番号４における配列は、配列番号５における配列と対にされる。配列番号６における配列は、配列番号７における配列と対にされる。配列番号８における配列は、配列番号９における配列と対にされる。配列番号１０における配列は、配列番号１１における配列と対にされる。配列番号１２における配列は、配列番号１３における配列と対にされる。配列番号１４における配列は、配列番号１５における配列と対にされる。配列番号１６における配列は、配列番号１７における配列と対にされる。配列番号１８における配列は、配列番号１９における配列と対にされる。配列番号２０における配列は、配列番号２１における配列と対にされる。シスタチンＳのエピトープペプチドの配列は配列番号５０に示される。本願の診断およびスクリーニングは乳癌の転移および微小転移巣、ｐＴＮＭステージ判定、癌治療および予後予測の間の腫瘍のリアルタイムモニタリングを意味する。これらの配列は本発明の範囲を限定しないということに留意されたい。それらの機能の全配列は本発明に含まれる。

本発明の第二の目的は乳癌マーカーと特異的に相互作用する種々のキャプチャーを提供することである。

上記目的を実現するために、技術を以下に記載する：
乳癌マーカー用のキャプチャーであり、キャプチャーは乳癌予測用および診断用の乳癌マーカー用キャプチャーである。乳癌マーカーは、ＣＳＴ４遺伝子、ＣＳＴ４のｍＲＮＡ、ＣＳＴ４のスプライスのｃＤＮＡ、ＣＳＴ４−特異的プライマー用の増幅産物シスタチンＳのＣＳＴ４遺伝子およびエピトープペプチドによってコードされるシスタチンＳタンパク質である。

特異的プライマーの配列は、配列番号１〜２に存在する。

ＣＳＴ４遺伝子、ＣＳＴ４のｍＲＮＡ、ＣＳＴ４のスプライスのｃＤＮＡ用プローブの配列は、配列番号３に存在する。

増幅産物の配列は、配列番号４３に存在する。

本願明細書で述べられるキャプチャーは、シスタチンＳまたはそのエピトープペプチドを具体的に実現する分子である。

シスタチンＳのエピトープペプチドの配列は、配列番号５０に示される。

本発明の第３の目的は、キャプチャーの新規な用途を提供することである。検査キットおよびそれらの個々のプロトコルはキャプチャーに基づく。新規な方法論として、これらの用途および乳癌検出用の検査キットは高い精度、簡易操作および大スケール診療の実現可能性を有する。

上述の目的の実現のために、技術は以下に記載されている。
乳癌検出用の検査試薬および検査キットの製造におけるキャプチャーの利用
これらのキャプチャーを含むすべての診断キット。

診断キットの詳細は以下のとおりである。

１）ＴａｑＭａｎプローブを用いるＣＳＴ４のｍＲＮＡ用のリアルタイムかつ定量的検査キット。プライマー配列は配列番号１〜２に示される。プローブの配列は配列番号３に示される。
２）プローブとして蛍光色素を用いるＣＳＴ４のｍＲＮＡ用のリアルタイムかつ定量的検査キット。プライマー配列は配列番号１〜２に示される。内部基準用のプライマーの配列は配列番号３０〜３１に示される。または
３）核酸ベースのＣＳＴ４のｍＲＮＡ用定量的検査キットは増幅（ＮＡＳＢＡ）または転写メジアン増幅（ＴＭＡ）。両方のキットは、ＣＳＴ４用のプライマーおよびプローブを包含し、その配列は、配列番号２、３２（プライマー用）および３（プローブ用）に示される。または
４）リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）に基づくＣＳＴ４のｍＲＮＡ用の定量的検査キット。４つのプローブは、その配列が配列番号３３〜３６に示されるように包含される。または
５）好熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）に基づくＣＳＴ４のｍＲＮＡ用の定量的検査キット。プライマー（配列番号３７〜４０に示される配列）およびプローブ（配列番号４１）は包含されている。

診断キットは以下であり得る：
１）固体基質、固体基質に固定されたキャプチャー、ビオチン化キャプチャーおよび酵素基質（比色分析）を包含している二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡキット。固定されたキャプチャーはモノクローナル抗体であり、ビオチン化キャプチャーはポリクローナル抗体である。または、
２）固体基質、キャプチャー、酵素標識第二抗体および比色検出用酵素基質を包含しているブロッティングキット。キャプチャーはモノクローナル抗体およびビオチン化キャプチャーはポリクローナル抗体である。または
３）固体基質、固定された抗原、ビオチン化キャプチャー、比色検出用酵素基質および特異的モノクローナル抗体を包含している競合ＥＬＩＳＡキット。ビオチン化キャプチャーはポリクローナル抗体である。

陽性対照および陰性対照ならびにブランクサンプルは診断キットに包含される。

ダブル抗体ＥＬＩＳＡキットの成分として、モノクローナル抗体はラット抗シスタチンＳ抗体であり、固体基質はＥＬＩＳＡプレートであり、およびビオチン化ポリクローナル抗体はビオチン化ウサギ抗シスタチンＳポリクローナル抗体である。

または、彼は、検査キットはダブル抗体ＥＬＩＳＡキットに基づくと述べ、ここで、固体基質はＥＬＩＳＡプレートであり、固体基質上に固定されたキャプチャーはラット抗シスタチンＳモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ、ＭＡＢ １９２６、５μｇ／ｍＬ）であり、ビオチン標識ポリクローナル抗体は、ビオチン化ウサギ抗シスタチンＳポリクローナル抗体である。

または、検査キットは競合ＥＬＩＳＡキットに基づき、ここで、アッセイの固体基質は、ＥＬＩＳＡプレートであり、シスタチンＳの濃度は５μｇ／ｍＬであり、モノクローナル抗体は、価数１：２０００であるラット抗シスタチンＳ抗体であり、酵素標識二次抗体は、価数１：２０００であるＡＬＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧである。酵素基質はＡＬＰであり、シスタチンＳおよび酵素標識第二抗体の基質に対する体積比は１：２である。

または、検査キットは免疫ブロット法に基づき、ここで、固体基質はニトロセルロース膜であり、キャプチャーは価数１：１０００であるラット抗シスタチンＳモノクローナル抗体であり、酵素標識第二抗体はＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓａｒｃｈ）であり、比色検出用酵素基質はＴＭＢ溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ（ゲイザースバーグ、メリーランド）、「ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」溶液カタログ番号５０−７６−０１）である。

検査キットの述べられたプロトコルの詳細は以下に記載されている。

ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）をシスタチンＳ（Ａｂｎｏｖａ、カタログ番号Ｈ００００１４７２−Ｐ０１、５μｇ／ｍＬ）で被覆し、ＢＳＡ３％でバックフィル（裏込め）をする。ラット抗シスタチンＳモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＭＡＢ１２９６、価数１：２０００）をサンプリングし、血清（８倍希釈）を調製し、４℃で一晩インキュベートする。サンプルを前処理したＥＬＩＳＡプレート上にアプライ（付与）しおよび１時間３７℃でインキュベートした。サンプルを含む穴をＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄する。０．３％ＢＳＡを含むＴＢＳに溶解させたＡＬＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅａｒｃｈ、価数１：２０００）を穴にアプライし、１時間 ３７℃でインキュベートした。ＡＬＰの基質（ＫＰＬ、Ｂｌｕｅ Ｐｈｏｓ溶液、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ（ゲイザースバーグ、メリーランド）、カタログ番号５０８８０５）をアプライし、ＯＤ（４０５ｎｍ）をマイクロプレートリーダーで測定した。

本発明の第４の目的は、簡単操作、高感度および優れた特異性の乳癌診断用のインビトロ方法およびインビトロ診断用の検査キットを提供することである。

上記目的の実現のため、本発明の技術は以下に詳細に記載されている。

検査キットを用いて測定された乳癌マーカーの発現レベルまたは定量的成分は健常者の乳癌マーカーの発現レベルまたは定量的成分と比較され、その結果が陽性であるか否かを決定し、またはその結果は、カットオフ値より高い場合に陽性であると考えられるかどうか決定する。カットオフ値は、乳癌患者および健常者の体液または組織サンプルにおける乳癌マーカー発現／レベルの比較を通して得られる。カットオフ値は統計的有意性を有する。サンプルは以下の１以上を包含する：血液、尿、骨髄、乳癌細胞株、乳癌腫瘍および腫瘍隣接組織ならびにリンパ節組織。例えば、この場合において、カットオフ値は３．４３４ｎｇ／ｍＬである。

乳癌予測用および診断用検査キットは、シスタチンＳタンパク質発現の測定用キットである。キットは、固体基質、固体基質上に固定されたキャプチャー、ビオチン化キャプチャーおよび比色検出用酵素基質を包含する。固定されたキャプチャーは、モノクローナル抗体であり、ビオチン化キャプチャーはポリクローナル抗体である。

または、シスタチンＳタンパク質発現測定用検査キットは、固体基質、プレートに被覆されたシスタチンＳタンパク質、ラット抗シスタチンＳモノクローナル抗体、酵素標識第二抗体および比色検出用酵素基質を包含する。

または、シスタチンＳタンパク質発現測定用検査キットは、固体基質、キャプチャー、酵素標識第二抗体および比色検出用酵素基質を包含する。キャプチャーは、モノクローナル抗体であり、ビオチン化キャプチャーはポリクローナル抗体である。

検査キットは、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡに基づき、ここで、アッセイの固体基質はＥＬＩＳＡプレートであり、固定されたキャプチャーはラット抗シスタチンＳモノクローナル抗体であり、ビオチン化キャプチャーは、価数１：１０００であるウサギ抗シスタチンＳポリクローナル抗体である。酵素基質はＡＬＰである。

または、キットは競合ＥＬＩＳＡに基づき、ここで、アッセイの固体基質は、ＥＬＩＳＡプレートであり、シスタチンＳの濃度は５μｇ／ｍＬであり、モノクローナル抗体は、価数１：２０００であるラット抗シスタチンＳ抗体であり、酵素標識二次抗体は、価数１：２０００であるＡＬＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧである。酵素基質はＡＬＰであり、シスタチンＳおよび酵素標識第二抗体の基質に対する体積比は１：２である。

または、検査キットは免疫ブロット法に基づき、ここで、固体基質はニトロセルロース膜であり、キャプチャーは価数１：１０００であるラット抗シスタチンＳモノクローナル抗体であり、酵素標識第二抗体は、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧであり、比色検出用酵素基質はＴＭＢ溶液である。

本発明の利点は、１）乳癌の診断における発現ＣＳＴ４のｍＲＮＡおよびシスタチンＳタンパク質の利用、癌の成長および乳癌予後予測のリアルタイムモニタリングは、大量スケールのサンプルの場合本発明において変動する。当該結果はかなり正確であり、本発明は、乳癌診断およびリアルタイムモニタリングならびに乳癌予後予測用の新規な方法の開発において用いられ得、２）乳癌診断およびリアルタイムモニタリングならびに乳癌予後予測用の検査試薬および高感度のキットは本発明に包含される。

ＣＳＴ４を含む組み換えプラスミドＰｍｄ１８−Ｔを示す図である。 扁桃腺、下垂体後葉、甲状腺、唾液腺、骨格筋、骨髄、赤血球および血小板を含まない末梢血、肺、胃、肝臓、心臓、腎臓、副腎、腸管、結腸、膵臓、脾臓、膀胱、前立腺、卵巣、子宮、胎盤および精巣、ヒト乳癌細胞株（ＨＣＣ１９３７、ＳＫ−ＢＲ−３、およびＭＣＦ−７）ならびに正常な乳房組織細胞株（Ｈｓ５７８Ｂｓｔ）を包含している、正常組織におけるＣＳＴ４遺伝子の発現を示す図である。 プローブとして蛍光色素を含むリアルタイムｑＰＣを用いる乳癌腫瘍およびそれらの個々の腫瘍隣接組織の２０個の場合におけるＣＳＴ１２４、ＣＳＴ１、ＣＳＴ２、ＣＳＴ４の発現比較を示す図である。 乳癌腫瘍およびそれぞれの腫瘍隣接組織の１００個の場合におけるリアルタイムＰＣＲにより定量化されるＣＳＴ４の発現を示す図である。 乳癌腫瘍の４０個の場合と４０個の生検サンプルにおけるリアルタイムＰＣＲにより定量化されるＣＳＴ４の発現を示す図である。 乳房癌転移を有する３０個のリンパ節サンプルおよび乳房癌転移を有しない３０個のリンパ節サンプル中のリアルタイムＰＣＲにより定量化されたＣＳＴ４の発現を示す図である。 細胞学的研究およびリアルタイムＰＣＲにより定量化された末梢血におけるＣＳＴ４発現を用いる乳癌診断の正確さの比較を示す図である。 細胞学的研究およびリアルタイムＰＣＲにより定量化されたＣＳＴ４発現を用いる乳癌骨髄転移予想の正確さの比較を示す図である。 リアルタイムＰＣＲ（Ａ）および受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線（Ｂ）により定量化された５０人の乳癌患者、３０人の健常者および３０人の乳腺炎患者の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ４発現を示す図である。ＲＯＣ曲線は、乳腺炎および通常から乳癌を区別する方法の感度および特異性の評価のために用いられうる。 ＬＣＲにより定量化された５０人の乳癌患者、３０人の健常者および３０人の乳腺炎患者の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ４発現を示す図である。 逆転写ストランド置換増幅（ｒｔＳＤＡ）により定量化された５０人の乳癌患者、３０人の健常者および３０人の乳腺炎患者の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ４発現を示す図である。 核酸ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）により定量化される３０人の乳癌患者、２０人の健常者および２０人の乳腺炎患者の尿サンプルにおけるＣＳＴ４発現を示す図である。 種々のｐＴＮＭステージ（３０人のＩ＋ＩＩの例および５０人のＩＩＩ＋ＩＶの例）にある８０人の乳癌患者の転写増幅法（ＴＭＡ）によるＣＳＴ４発現を示す図である。 乳癌細胞株の培養上清（ｃｕｌｔｅｒ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）および健常者の血清におけるシスタチンＳ発現を示す図である。 乳癌細胞株および健常者の血清におけるシスタチンＳ発現を示す図である。 ３０人の乳癌患者および２０人の健常者の血清サンプルにおける競合ＥＬＩＳＡによるシスタチンＳ発現を示す図である。 乳癌予測のためのシスタチンＳおよびＣＥＡの特異性および感度比較（ＥＬＩＳＡにより測定）を示す図である。 中央値より高いまたは低いシスタチンＳ発現を有する処置後の乳癌患者の無病生存率（ＤＦＳ）を示す図である。

1． 分子検出
上述されている分子生物学的技術は以下の実施例に例証されている。これらの実施例は、本発明の用途を限定する代わりに本発明を明確にするためのものであることに留意されたい。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編）におけるプロトコルは、実験手順が記載されていない場合、厳密に従った。または、製造業者の取扱説明書は以下の通りであった。もし述べられていない場合、百分率および割合は重量に基づく。

材料および方法
全ての臨床サンプルはＢｅｉｊｉｎｇ Ｆｒｉｅｎｄｓｈｉｐ Ｈｏｓｐｉｔａｌから、病院の厳密な観察および患者に署名された同意書の基準と共に得られる。

腫瘍の可能性のある生検サンプルまたはそれらの隣接組織を比較する。これらのサンプルとリンパ節サンプル中のＲＮＡは、サンプル取得の後すぐ抽出され、または液体窒素またはＲＮＡ ｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）中に保存されるだろう。

末梢血、骨髄または尿サンプルは２０分間（４０００ｒｐｍ、４℃）で遠心分離される。上清は別の１０分間（１３０００ｒｐｍ、４℃）遠心分離される。上清および沈殿を分離する。ＲＮＡ抽出をすぐに続けて行い、またはサンプルを−２０℃または−８０℃で貯蔵する。

ＴａｑＭａｎプローブを用いるリアルタイムＰＣＲ：
サンプルから市販キットを用いて核酸を抽出した。限定を意図しない例は、フェノール−クロロホルム抽出である。サンプル中のＲＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロゲン）により製造されたトリゾールキット（Ｔｒｉｚｏｌ ｋｉｔ）を続けて用いて得られた。抽出されたＲＮＡの品質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ（分子生物学実験）（Ｊ．Ｌｉによる）などの参考文献中のプロトコルに従って分析された。ｍＲＮＡの逆転写は市販キットにより行われ、その指針は以下の通りであった。ｃＤＮＡ溶液を適切な濃度勾配で調製した。生化学反応用のプライマーを最適化した。ＣＳＴ４用のプライマーをエクソン１に基づき設計した。ＣＳＴ４増幅産物を含む組み換えプラスミドは、Ｐｅｇｍ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ（図１に示されているように））から市販されている。プライマーをエクソン１および３に基づき設計した。ＰＣＲプロセスをＴａｑＭａｎプローブの加水分解により観測した。

ＣＳＴ４のプライマー用に最適化された配列は、

である。プローブの配列は、

である。増幅産物の部分は１４２ｂｐである。

ＣＳＴ４増幅産物を含有する組み換えプラスミドのプライマー用に最適化された配列は、

である。

典型的に試験において、サンプル、陽性対照および陰性対照ならびに組み換えプラスミド標準は同時に増幅される。組み換えプラスミド標準と濃度に対する適当な濃度勾配との交差点（ＣＰ）をプロットし、校正曲線を得る。サンプルおよび対照サンプル中の遺伝子発現のコピーを、当該校正曲線を用いて定量化する。

プローブとして蛍光色素を用いるリアルタイムＰＣＲ：
サンプルの前処理は、ＴａｑＭａｎプローブを用いるリアルタイムＰＣＲのセクションに記載されているものと同じである。同時に増幅されるＣＳＴ１、ＣＳＴ２およびＣＳＴ４の増幅用のプライマーの配列は、

である。ＣＳＴ４増幅用のプライマーの配列は

である。ＣＳＴ２増幅用のプライマーの配列は、

である。ＣＳＴ１増幅用のプライマーの配列は、

である。β−アクチンは内部基準として用いられる。β−アクチン増幅用のプライマーの配列は、

である。癌性腫瘍、腫瘍隣接組織（ＴＡＴ）および内部基準遺伝子中の遺伝子を同時に増幅する。遺伝子のコピーは以下の等式によって定量化され、ここで、蛍光シグナルがバックグラウンドを超える時、ｃｔはサイクル数である。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎｋ、Ｅｖｅ Ｇｒｅｅｎ、ＬＣ Ｇｒｅｅｎなどはアプライする蛍光色素に含まれる。

核酸ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）によるインビトロでのＲＮＡ増幅：キットは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ、鳥骨髄性白血病ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、リボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、「ＴａｑＭａｎプローブを用いるリアルタイムＰＣＲ」の区分に述べられていたＣＳＴ４増幅用プライマー、（Ｒｉｂｏ−Ｇｒｅｅｎ蛍光色素）を観測するＲＮＡ増幅用蛍光色素を包含する。ＲＮＡテンプレートは、４２℃で２時間のインキュベートした後、２^９〜２^１２倍に増幅される。増幅された製品の蛍光を増幅前のテンプレート濃度の定量化のために測定した。

実施例１．ＣＳＴ４およびＣＳＴスーパーファミリーの他のメンバーの発現
１．種々のヒト組織中のＣＳＴ４
全組織サンプルを、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｆｒｉｅｎｄｓｈｉｐ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＢＦＨ）から得られる乳房組織を除いて購入した。種々のヒト組織サンプル中のＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現をＨＧ−Ｕ９５ＡＶ Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｉｒｘ）上で測定した（使用マニュアルからのプロトコルは以下の通りであった）。ＣＳＴ１ｍＲＮＡ発現の定量化を、β−アクチン蛍光校正曲線により実現した。

図２に示されているように、ＣＳＴ４発現は、唾液腺中でだけ高い。ＣＳＴ４発現は、試験されている他の組織において全く観察されなかった。当該結果は、その低いバックグラウンドシグナルのため、ＣＳＴ４は、病理診断の良好な候補であることを示す。ＣＳＴ４は、ＨＣＣ１９３７、ＳＫ−ＢＲ−３およびＭＣＦ−７（乳癌細胞株である）中に過剰発現し、およびＨｓ５７８Ｂｓｔ（正常な乳房組織細胞株である）中に発現しない。ＣＳＴ４は乳癌診断用のマーカーでとして使用され得ることが結論付けられた。

２．乳房癌性腫瘍および腫瘍隣接組織におけるＣＳＴ４、ＣＳＴ１２４、ＣＳＴ１およびＣＳＴ２のｍＲＮＡ発現
乳癌腫瘍とそれらの個々の隣接組織の２０の組み合わせ（Ｃ１、Ｃ２．．．Ｃ２０と番号づけられた）におけるＣＳＴ４、ＣＳＴ１２４、ＣＳＴ１およびＣＳＴ２のｍＲＮＡの発現を比較した。腫瘍およびそれらの隣接組織におけるＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現差異は有意であり、ＣＳＴ１を除いて全遺伝子より大きい（図３）。全サンプルを乳癌について病理学的に診断した。プローブとして蛍光色素を用いるリアルタイムＰＣＲを、遺伝子発現を定量化するために用い、そのリアルタイムＰＣＲは陽性対照サンプルおよび陰性対照サンプルの同時に生じる増幅により変動した。当該対照の結果は予測と合致していた。

ｍＲＮＡ発現の定量化用のプローブとして蛍光色素を有するリアルタイムＰＣＲに基づく検査キットは、以下を含有する。
１）ＣＳＴ４増幅用プライマー（その配列は以下に示される）：

内部基準としてのβ−アクチンの増幅用プライマー

２）核酸抽出用試料および逆転写用試料、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ蛍光色素、ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ、リボヌクレアーゼを含まない水、標準溶液、陽性対照サンプルおよび陰性対照サンプル、１０倍緩衝液および塩化マグネシウム溶液。

実施例２種々の組織および位置におけるＣＳＴ４発現
１．乳癌腫瘍および腫瘍隣接組織におけるＣＳＴ４発現
ＴａｑＭａｎプローブを有するリアルタイムＰＣＲに基づくＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現用検査キット。当該キットは以下を含有する。

１）プライマーおよびプローブ：

２）核酸抽出用試料および逆転写用試料、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ蛍光色素、ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ、リボヌクレアーゼを含まない水、標準溶液、陽性対照サンプルおよび陰性対照サンプル、ＣＳＴ４遺伝子を含む組み換えプラスミドサンプル、１０倍緩衝液および塩化マグネシウム溶液。

全サンプルは、ｃＤＮＡが得られることで、ＲＮＡ抽出および逆転写の前に乳癌と診断された。リアルタイムＰＣＲは、乳癌腫瘍およびそれらの個々の隣接組織におけるＣＳＴ４の発現の定量化に用いられた。１００のサンプルがこの試験において検査された。校正曲線および増幅収率の直線性は個々の必須要件を満たした。陽性対照および陰性対照サンプルの増幅のための結果は予想したものだった。鋳型のないサンプルの増幅は観測されなかった。

図４において示されるように、ＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現は、病理学上診断される悪性乳癌腫瘍において高く、個々の隣接組織において低い。腫瘍中のＣＳＴ４発現の中央値は、隣接組織中のものより７．０８倍高く、ＣＳＴ４のｍＲＮＡは乳癌の優れたマーカーであることを示す。乳癌組織は２６４．９２のコピーがカットオフ値である場合、正常組織から区別され得、乳癌の臨床診断用の参照として提案される。

２．乳癌患者および乳腺炎患者の生検サンプル中のＣＳＴ４発現
生検サンプルは、腫瘍細胞の百分率が変動する外科サンプルと大きく異なる。腫瘍組織はときどき、全生検プルの非常に小さな一部であり、または腫瘍組織は生検サンプル中に包含されない。発明者らは試験し、乳腺炎患者からの４０個の生検サンプルおよび乳癌患者からの４０個の乳癌生検サンプル中のＣＳＴ４発現と比較した。癌性サンプルにおけるＣＳＴ４発現の中央値は、腸炎サンプル中におけるより９．１５倍大きいことがわかった。もし１１３．７９５がカットオフ値である場合、癌性腫瘍は炎症から区別されえ、生検サンプルを用いる乳癌診断用の参照文献を提供する。当該結果は、図５でまとめている。リアルタイムＰＣＲを遺伝子発現の定量化に用いた。校正曲線および増幅収率の直線性は個々の需要を満たした。陽性対照および陰性対照サンプルの増幅の結果は予想通りであった。鋳型のないサンプルの増幅は観測されなかった。

３．乳癌転移を伴うまたは伴わないリンパ節サンプル中のＣＳＴ４発現
異なるサイズの薬理学的診断された乳房転移を含むリンパ節の３０個の外科サンプルおよび初期段階の非転移性乳癌を伴う患者からの３０のリンパ節サンプルを得た。初期段階の癌患者は、検出できないリンパ節転移および得られたアーチファクトを避けるために選択された。リアルタイムＰＣＲはＣＳＴ４の発現の定量化に用いられ、詳細な実験手順は実施例２（乳癌腫瘍および腫瘍隣接組織におけるＣＳＴ４発現）に記載しているものと同じである。校正曲線および増幅収率の直線性は個々の要求を満たした。陽性対照および陰性対照サンプルの増幅のための結果は予想通りであった。鋳型のないサンプルの増幅は観測されなかった。

図６に示されているように、ＣＳＴ４発現は、乳癌転移を伴うサンプルにおいて高く、癌転移を伴わないサンプルにおいて比較的低い。転移を伴うサンプル中のＣＳＴ４発現の中央値は、乳癌転移を伴わないサンプル中に中央値より８．４５８倍高い。１２０．６６のコピーのカットオフ値は転移を区別するのは可能である。ＣＳＴ４発現の２つの陽性の場合を非転移グループにおいて報告した。これらのサンプルは、注意深く研究され、そして微小転移巣は両方において発見された。これらの２つの場合が転移性のサンプルとして考えられる場合、ＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現試験は、検査においてすべての転移の場合を区別することができる。伝統的な病理学的研究の可能性を超えている微小転移巣は発見され、より高い感度を示す。

４．リアルタイムＰＣＲおよび末梢血中に循環している乳癌細胞の発見のための細胞学的研究によるＣＳＴ４発現測定の精度比較

ＲＮＡは、赤血球および血小板を含まない末梢血から抽出され、ＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲで定量化し、乳腺炎患者および健常者からのサンプルと比較して、循環する乳癌細胞の存在を決定した。得られた結果を細胞学的研究と比較した。

図７にまとめるように、ＣＳＴ４発現方法は、細胞学的研究により診断される全ての癌のケースを検出することができる。癌転移は細胞学的陰性な患者において発見され、本発明で述べられるその方法は細胞学的な方法より感度がよく、細胞学的な方法がし得るものを超えている微小転移巣も検出され得ることを証明する。

５．リアルタイムＰＣＲおよび細胞学的研究により検出される骨髄転移
乳癌患者からの生検骨髄サンプルのＣＳＴ４のｍＲＮＡをリアルタイムＰＣＲにより定量化した。得られた結果を転移または微小転移巣の発見用の通常の骨髄サンプルと比較した。これらの検査結果を細胞学的研究と比較した。

図８に示されるように、骨髄転移を伴う９５％のサンプル（細胞学的研究に基づく）はＣＳＴ４のｍＲＮＡ検査により検出され得る。細胞学的研究よりより高い陽性の割合はより高い感度を示す。

実施例３．乳癌患者、乳腺炎患者および健常者におけるＣＳＴ４発現
１．乳癌患者、乳腺炎患者および健常者の血清無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ４発現
乳癌患者（５０例）、乳腺炎患者（３０例）および健常者（３０例）からの血漿サンプルを集めた。無細胞ＲＮＡを市販キットを通して抽出し、リアルタイムＰＣＲをＣＳＴ４発現の定量化に用いた。

癌性のグループのＣＳＴ４発現の中央値は、炎症グループおよび正常グループのそれぞれおよそ８．８７倍および２５．６２倍高い（図９Ａ）。７１．２１８のカットオフ値は、非癌性サンプルから癌性サンプルを区別することができる。乳癌診断のための方法としてＣＳＴ４発現検査の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は図９Ｂに存在する。高感度および特異性を０．９８７の曲線の積分により結論付ける。ＣＳＴ４は、血漿サンプルによる非浸潤性の乳癌診断用の特異的なマーカーである。

２．リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）により検査された乳癌患者、乳腺炎患者および健常者の血清無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ４発現
ＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現用の検査キットは以下を含有する。

１）ハプテン標識化した４つのプローブ：

２）市販の核酸抽出用試料および逆転写用試料。他の試薬は、ＬＣｘキット（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と同一である。
無細胞ＲＮＡを乳癌患者（５０例）、乳腺炎患者（３０例）および健常者（３０例）の血漿サンプルから抽出した。ＣＳＴ４のｍＲＮＡの発現をＬＣＲ方法により検査した。図１０に示すように、癌性サンプルの相対発光量（ＲＬＵ）の中央値は、炎症を伴うサンプルや正常サンプルのそれぞれの１０．８８１倍および３５．２８６倍高い。乳癌サンプルは１７．４５８ＲＬＵのカットオフ値と区別し得る。

３．逆転写ストランド置換増幅（ｒｔＳＤＡ）により検査された乳癌患者、乳腺炎患者および健康者の血清無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ４発現
ｔＳＤＡに基づくＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現の定量化用の検査キットは以下を含有する：
１）

２）核酸抽出および逆転写用試料、ｄＣＴＰαＳ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、Ｂｓｏｂ Ｉおよびｅｘｏ−Ｂｃａ．

無細胞ＲＮＡを、乳癌患者（５０例）、乳腺炎患者（３０例）および健常者（３０例）の血漿サンプルから抽出した。ＣＳＴ４のｍＲＮＡの発現を好熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）により検査した。図１１に示すように、癌性サンプルの相対発光量（ＲＬＵ）の中央値は、炎症および正常サンプルをそれぞれ伴うサンプルより、３４．５８倍および３５．８９倍高い。乳癌サンプルは、２４．０９５ＲＬＵのカットオフ値と区別され得る。

４．乳癌患者、乳腺炎患者および健常者の尿無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ４発現
核酸ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）に基づくＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現定量化用の検査キットは、以下を含有する。

１）ＣＳＴ４用のプライマーおよびプローブ：

２）ＲＮＡ抽出用および逆転写用試薬、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ、鳥骨髄性白血病ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、リボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）およびＲＮＡ蛍光色素（リボグリーン蛍光色素）

無細胞ＲＮＡを乳癌患者（３０例）、乳腺炎患者（２０例）および健常者（２０例）の尿サンプルから抽出した。ＣＳＴ４のｍＲＮＡの発現をＮＡＳＢＡにより検査した。図１２に示されているように、癌性サンプルの相対発光量（ＲＬＵ）の中央値は、炎症および正常サンプルを伴うサンプルよりそれぞれ１５．８６および３８．３５倍高い。乳癌サンプルは、３０．９２ＲＬＵのカットオフ値と区別され得る。それゆえ、ＣＳＴ４は、乳癌診断用の非浸潤性の尿検査における優れたマーカーである。

実施例４ 乳癌ｐＴＮＭステージ判定、治療中の腫瘍成長のリアルタイムモニタリングおよび乳癌予後診断予測用のマーカーとしてのＣＳＴ４
ＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現定量化用診断キットは、以下を含有する転写増幅法（ＴＭＡ）に基づく。

１）増幅用のプライマーおよびプローブ：

２）プライマーおよびプローブ以外のＧｅｎ−ｐｒｏｂｅのＴＭＡアッセイに包含されている任意の試薬

１．ＣＳＴ４発現および乳癌ｐＴＮＭステージ判定
８０人の乳癌患者（Ｉ＋ＩＩステージの３０例およびＩＩＩ＋ＩＶステージの５０例）からの血漿サンプルにおける無細胞ＲＮＡを市販キットによって抽出した。ＣＳＴ４発現を、ＴＭＡ（転写増幅）方法を用いて測定した。図１３に示すように、末期患者のＲＬＵ中央値（ステージＩＩＩ＋ＩＶ）は、初期患者（ステージＩ＋ＩＩ）より７．２倍高い。当該結果は、ＣＳＴ４は乳癌ステージの良好な指標であり、癌ステージ決定のために用いられうる。

２．乳癌治療におけるリアルタイムモニタリングにおけるＣＳＴ４発現の利用
治療を受ける乳癌患者の血清ＣＳＴ４発現（化学療法での６人の患者および放射線療法での４人の患者）は、リアルタイムＰＣＲにより観測された。腫瘍レベル成長を血液中のＣＳＴ４発現レベルと比較し対応させた。

表１にまとめるように、ＣＳＴ４発現は効果的な治療をする患者で減少し、これは、腫瘍の減少した大きさから明らかであった。ＣＳＴ４発現は、効果的でない治療をする患者の治療の継続とともに増加し、これは腫瘍の増加した大きさからも明らかであった。したがって、ＣＳＴ４を治療の有効性のリアルタイムモニタリング用のマーカーとして提案する。

３．乳癌の予後予測用ＣＳＴ４発現
５人の処置後の乳癌患者の血液ＣＳＴ４発現を定量的リアルタイムＰＣＲによる治療後１月後、３月後および１年後に観測した。表２に示されているように、２人の患者は癌が再発した。ＣＳＴ４発現の増加はこれらの２人の患者で観測された。癌の再発は、ＣＳＴＴ４発現がおよそ１０００のコピーに達するまで検出されなかった。他の３人の患者はがんが再発せず、あまりＣＳＴ４発現の増加は彼らに観測されなかった。したがって、ＣＳＴ４は癌の予後予測に良好なマーカーである。

（パートＩＩ）マーカーとしてのタンパク質
非浸潤性のタンパク質プローブ、検査キット、乳房疾患診断の方法およびプロトコル、観測および治療評価を本発明の以下の部分において議論されている。

組み換えシスタチンＳタンパク質をＡｂｎｏｖａから購入した（０．０６μｇ／μＬ、カタログ番号Ｈ００００１４７２−Ｐ０１）。価数１：２０００であるラット抗シスタチンＳモノクローナル抗体をＲ＆Ｄから購入した（カタログ番号ＭＡＢ１２９６）。価数１：１８００であるウサギ抗シスタチンＳポリクローナル抗体をＡｂｃａｍから購入した（カタログ番号ａｂ５８５１５）。

本発明は、乳癌の再発および転移の乳房組織状態の決定および予測のための方法を提供する。治療の評価は本発明に記載されている方法により理解され得る。この方法は、患者に与えられるサンプル中の少なくとも１つのタンパク質の濃度を測定する。サンプル中のシスタチンＳタンパク質およびその定量的なまたは半定量的な測定は非常に好ましい。様々な分子は、タンパク質検出のために繰り返されたが、シスタチンの特定の抗体またはそれらのフラグメントは、本発明において好ましい。方法検出プロトコルおよび検査キットは、癌の兆候のないヒトの乳癌検診に用いられうる。

少なくとも１つの（好ましい）抗体またはシスタチンＳの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するフラグメントは本願明細書に述べられている検出において利用される。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。好ましいモノクローナル抗体は、シスタチンＳを配列番号５０に示される配列と結合する。抗体はシスタチンＳを免疫原として獲得される。免疫原濃度は好ましい成分である。それゆえ、本発明は、シスタチンＳの存在に対する抗体の免疫応答によるシスタチンＳの定量化方法を提供する。

本発明における被検体はヒトであり、ここで、試験特徴的な抗体およびヒトペプチド中の免疫応答である。免疫反応は任意の好ましい方法によって測定されてよく、これらに限定されないが、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット法または両方の組み合わせ、競合ＥＬＩＳＡおよび二重抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡキットを包含する。

乳癌組織状態のモニタリングおよび診断、乳房疾患の治療の有効性のモニタリングは、シスタチンＳ発現の定量化を介する免疫反応により定量化され得る。

我々は、サンプル中のマーカー（シスタチンＳおよびその本願明細書におけるエピトープ）の検出のための全ての検査キットを本願明細書において主張する。乳房組織および乳房疾患の状況は上記キットを介して診断され得る。乳房疾患の治療のモニタリングならびに癌の再発および転移の予測はキットの利用の範囲内でもある。抗シスタチンＳ抗体またはそれらのフラグメントはキットに包含される。これらの抗体またはそれらのフラグメントは、血清のような流体サンプル中のシスタチンＳと結合する。抗体またはそのフラグメントおよびシスタチンＳの結合事象はモニタリングされ、報告単位によって検出される。

好ましいまたは最適化されたキットの報告単位は抗体またはそれらの機能を標識化したフラグメントであり得る。ここで、報告単位は、適切なＩｇＧまたはＩｇＭ抗体として好ましい。当該標識は、ペルオキシダーゼによるなど基質の色の変化を伴う反応を触媒する酵素としてあり得、好ましい。当該標識は二次抗体に共有結合しているのが好ましい。または、当該標識は蛍光色素であり得る。

ＥＬＩＳＡに基づく検査キットは本発明において好ましい。

述べられるＥＬＩＳＡ検査キットは、競合ＥＬＩＳＡキットまたは二重抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡキットであり、その詳細は次に記載されている。抗体またはそのフラグメントは、検体をインキュベートされている。抗体はモノクローナル抗体である。抗体はモノクローナル抗体である。抗シスタチンＳ抗体の製造用の免疫源であるシスタチンＳタンパク質を、マイクロプレート（本願明細書の固体基質）とコンジュゲートさせている。事前にインキュベートした混合物をＥＬＩＳＡプレート上で利用し、その後結合されていない抗体をプレート上に固定されているタンパク質に結合している。報告単位は、免疫グロブリ、とりわけＩｇＧおよびＩｇＭであり、プレート上で抗体を検出することができる。抗体は、酵素または検出用の蛍光標識とコンジュゲートされているということに留意されたい。

本発明の別の方法論は免疫ブロット法、またはウエスタンブロット法であり、ここで、サンプル中のタンパク質を、ＰＡＧＥなどのゲル電気泳動によって分離し、次いでニトロセルロース膜などの固体基質に移す。当該移す方法の１つは電気移動である。当該検体は、特定の抗体（モノクローナル抗体が好ましい）と関係する。免疫反応は、酵素／フルオロフォア標識抗体などによる適切な方法で観測され得る。

本発明における別の好ましい方法論は親和性カラムに基づく検査キットである。典型的なプロセスにおいて、抗体またはそのフラグメントはカラム上で固定され、サンプル溶液はカラムをゆっくり通過する。本願明細書において、抗体はモノクローナルまたはポリクローナルである。上述されている抗体は好ましい。

サンプル溶液はカラムを通過する。検体のタンパク質が固定された抗体と接触するとき、そのタンパク質はカラム中に残る。その後、検体のタンパク質は、抗体用の競合抗原を利用することにより、またはランニングバッファー条件を変更することにより溶出される。複数のタンパク質を分析する場合、異なるときにタンパク質を溶出するのが好ましい。タンパク質は、ＵＶ吸光度検出など、周知の種々の補法により定量化され得る。

シスタチンＳ検査キットは本発明において提供される。２つのチャネルシスタチンＳ指標は、シスタチンＳレベルが通常より高いかどうかを正確に示す。流体サンプルは前記試験に好ましい。キットはサンプル、抗体およびそれらのフラグメントならびに指示薬のための容器を包含する。モノクローナル抗体、とりわけ、上述した抗体は好ましい。試験および操作やデータ解釈に必要な全溶液および緩衝液は、キットに包含されるだろう。キットは病院、診療所および家などの任意の場所において専門家により行われるだろう。

本発明の受験者は、乳房の心地悪いヒトであり得る。当該検査はその受験者の乳癌の早期スクリーニングを包含する。

本発明の受験者は乳腺炎であるヒトであり得る。その試験は、受験者の乳癌の早期スクリーニングを包含する。

本発明の受験者は乳癌の家族歴を有するヒトであり得る。その試験は受験者の乳癌の早期スクリーニングを包含する。

本発明に用いるサンプルは、これらに限定されないが、全血液またはその画分を包含する血清、血漿、尿および血液を包含する。

上記のように、本発明における抗体は、乳癌の診断ならびに乳癌の再発および転移の予測のために用いられうる。この出願において周知の方法は、キットと組み合され得る。例えば、蛍光方法は、血漿、血清または尿、次いで、特定の疾患の存在におけるシスタチンＳの量を試験するためのキットと組み合され得る。

本発明の目的、利点および特徴部は、以下の実施例において明らかとなる。その上、請求項および上記になされる結論を支持する実験の詳細も、以下の実施例に包含される。

材料および方法
組み換えシスタチンＳタンパク質をＡｂｎｏｖａから購入した（０．０６μｇ／μＬ、カタログ番号Ｈ００００１４７２−Ｐ０１）。

抗体：価数１：２０００であるラット抗シスタチンＳモノクローナル抗体をＲ＆Ｄから購入した（カタログ番号ＭＡＢ１２９６）。価数１：１８００であるウサギ抗シスタチンＳポリクローナル抗体をＡｂｃａｍから購入した（カタログ番号ａｂ５８５１５）。

免疫沈澱：２ｍＭフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）、ブドウ球菌タンパク質Ａの固定されたアガロースゲルおよびシスタチンＳ抗体を、サンプル中に添加する。混合物を、４℃で一晩穏やかに撹拌する。ジメチルピメルイミドエステルを、アガロースゲルに抗シスタチンＳ抗体をコンジュゲートするために用いる。その沈殿を、Ｎ−グリコシダーゼＦで洗浄かつ処理し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製する。

Ｎ−グリコシダーゼＦの塗布前に、沈殿物は１０μＬのクエン酸塩緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０、０．５％のＳＤＳ）中で沸騰させられる。１０μＬのリン酸塩緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ８．０（４０ｍＭのＥＤＴＡを含む））およびＮ−オクチルグルコシド（３％）およびＮ−キシラナーゼは混合物（４０ｍＵ）に添加され、一晩（３７℃）培養される。添加液は、その後添加され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製のために沸騰させられる。他に示されない限り、１５％ポリアクリルアミドゲルはＰＡＧＥに用いられる。ゲルは２０％の２，５−ジフェニルオキサゾール溶液によりイメージ化する。

タンパク質の電子移動および免疫ブロット法：タンパク質を、５％の脱脂粉乳および０．１％のＰＢＳ緩衝液を含むＢｒｉｊ−３５を含むＰＢＳ緩衝液に２時間（常温）であるニトロセルロース膜に転移する。当該幕をＰＢＳ緩衝液（０．１％のＢｒｉｊ−３５を含む）で３倍洗浄する。それをペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ溶液（０．２７μＬ）で１時間（３７℃）インキュベートし、続いて、緩衝液（０．１％Ｂｒｉｊ−３５）で４回、ＰＢＳの洗浄を１回行った。膜は、市販のＴＭＢ溶液（ＴＭＢペルオキシターゼ基板、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（ゲイザースバーグ、メリーランド）カタログ番号５０−７６−０１）により撮像される。または、膜が５．４ｍＭの過酸化水素溶液、２．５ｎＭのｌｕｍｉｎｏｌおよび４００ｍＭｐ−クマル酸（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌに溶解され、ｐＨ８．５）に浸されれ間、ＥＬＣ方法によって試験され、Ａｇｆａ ＣＰ−ＢＵ−ｆｏｉｌ上にイメージ化される。

競合ＥＬＩＳＡ：
ＥＬＩＳＡプレート（コーニング）をシスタチンＳ溶液（５μｇ／ｍＬ）で被覆し、３％のＢＳＡ溶液によってバックフィルする。８つの血清サンプル（２倍希釈物）およびポリクローナルラット抗シスタチンＳ抗体（価数１：１０００である）を一晩（４℃）でインキュベートし、および前処理したＥＬＩＳＡプレート上にアプライされた。プレートは３７℃で１時間３７℃でインキュベートする。サンプルの穴をＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５４ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）によって洗浄洗浄する。添加したアルカリのホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（価数１：２０００のであるＪａｃｋｓｏｎｗｉ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）溶液を添加し、１時間（３７℃）の間インキュベートした。ＴＭＢ溶液（ＴＭＢペルオキシダーゼ基質、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（ゲイザースバーグ、メリーランド）カタログ番号５０−７６−０１）を添加し、４０５ｎｍにおけるＯＤをマイクロプレートリーダーにより定量化する。

二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ：
ＥＬＩＳＡプレート（コーニング）をモノクローナルラット抗シスタチンＳ溶液（５μｇ／ｍＬ）により被覆し、３％ＢＳＡ溶液によりバックフィルした。８個の血清サンプル（２倍希釈）を１時間（３７℃）プレートの穴にインキュベートした。プレートをＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５４ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄する。ビオチン化ウサギ−抗シスタチンＳポリクローナル抗体（価数：１：１０００）を穴にアプライし、１時間（３７℃）インキュベートする。当該穴をＴＢＳ緩衝液で洗浄し、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣコンプレックス）を添加する。プレートを１時間３７℃でインキュベートし、穴をＴＢＳ緩衝液で洗浄する。ＴＭＢ溶液（ＴＭＢペルオキシダーゼ基質、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（ゲイザースバーグ、メリーランド）カタログ番号５０−７６−０１）を添加し、４０５ｎｍにおけるＯＤをマイクロプレートリーダーにより定量化する。

実施例１
１．乳癌細胞株培養上清におけるシスタチンＳ検出
ＣＳＴ４のｍＲＮＡを上で論じたように乳癌腫瘍中で過剰発現する。分泌タンパク質として、シスタチンＳは種々の体液および分泌物中に見られうる。乳癌のマーカーとしてシスタチンＳを樹立するため、ＣＳＴ４のｍＲＮＡの高発現を伴うＨＣＣ１９７３（乳癌細胞株）の上清を１５％ポリアクリルアミドゲル（レーン１〜２、図１４）に充填し、対照試料（健常者の血清）をゲル（レーン３〜４、図１４）に充填した。電気泳動の後、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、ペルオキシダーゼ標識抗シスタチンＳ抗体およびヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させた。ＴＭＢをタンパク質のイメージ化に用いた。上記方法に従った。

図１４に示されているように、β−アクチン（内部基準）はゲルのボトムにある。１６ｋＤａタンパク質を伴うバンドをレーン１〜２で観測し、レーン３〜４は、バンドが非常に薄かった。

２．乳癌患者の血清におけるシスタチンＳ検出
セクション「１」に記載されているプロトコルは以下の通りであった。図１５に示されているように、β−アクチン（内部基準）は、ゲルのボトムにある。１６ｋＤａタンパク質を有するバンドはレーン１〜２（癌性サンプル）に観測され、レーン３〜４（対照試料）のバンドは極めてかすかであった。

３．モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡによる血清シスタチンＳレベルの測定
実験：シスタチンＳ（５μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレートにアプライし、一晩（４℃）インキュベートした。５０個の血清サンプル（乳癌患者から３０個および健常者から２０個）を抗シスタチンＳモノクローナル抗体（価数１：２０００、３％のＢＳＡをＴＢＳに溶解させた）と混合し、当該サンプル混合物を前処理したＥＬＩＳＡプレートにアプライし、１時間（常温）インキュベートした。当該ＥＬＩＳＡプレートをＴＢＳ緩衝液で洗浄し、ヤギ抗ウサギ抗体（０．０８μｇ／ｍＬ、ＴＢＳに溶解させた）でインキュベートした。プレートをｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐ−ＮＰＰ）と反応させた。マイクロプレートリーダーを定量化のために用いた。

図１６に示されているように、正常な血清中のシスタチンＳレベルの中央値は１．３５ｎｇ／ｍＬであり、乳癌血清中で２．９５ｎｇ／ｍＬである。３．１０５ｎｇ／ｍＬのカットオフ値は、癌性サンプルおよび健常サンプルを区別するのが可能である。

４．乳癌診断および予測のためにシスタチンＳおよびＣＥＡの感度および特異性の比較
シスタチンＳをセクション「３」に記載されている方法に従って測定した。ＣＥＡを市販キット（ＤＲＧ、ドイツ、カタログ番号ＥＩＡ５０７１）を用いて測定し、取扱説明書に従っている。

図１７および表３に示されているように、受信動作特性（ＲＯＣ）曲線（ＡＵＣ）の積分値は、シスタチンＳが０．８３２およびＣＥＡが０．７７６であり、前者はより感度と選択性が良いことを意味する。

５．方法、検査キットおよびプロトコル
限定を意図せず、例証的な方法、検査キットおよびプロトコル

乳癌の検出方法は以下を包含する。シスタチンＳアンチゲンを基板上に固定する。Ｒ＆Ｄ抗体（ＭＡＢ１２９６）を前処理した基板にアプライする。当該基板を洗浄し、ＡＬＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｉｎｃ．、カタログ番号Ａ２３９）などの二次抗体をアプライする。当該基板を洗浄し、直接的または間接的に標識（例におけるＡＬＰ）からの応答からタンパク質の量を測定および検出する。

基板は、これに限定されないが、セルロースシート、プラスティックプレートおよび粒子などのセルロースベース材料である樹脂粒子を包含する。

抗原を共有結合でまたは非共有結合で固定し得る。試験用サンプルはヒト血清である。選択されまたは好ましい基板は、血清および基板中の他の成分間の非特異的相互作用を最小化するために、サンプルの添加前にＢＳＡによってバックフィルすべきである。その後、当該基板を界面活性剤を含むリン酸緩衝液などの適切な緩衝液によって洗浄する。

標識二次抗体の限定を意図しない例は標識抗マウスポリクローナル抗体である。当該標識は、ＡＬＰ、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよび蛍光色素（フルオロセイン（ｆｌｕｏｒｏｃｅｉｎ）など）などの酵素を包含するが、これらに限定されない。ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびジギタリス配糖体などの分子は、抗体およびその標識の結合のために用いられてよい。

酵素が標識である場合、その定性的検出および／または定量的検出は、酵素基質の添加および酵素による比色反応および／または発光反応により実現され得る。蛍光色素が標識である場合、その定性的検出および／または定量的検出は、ＵＶ露光および蛍光測定／検出により実現され得る。感光薬が必要に応じて用いられる。

本発明の応用として、シスタチンＳまたはそのエピトープ（配列番号５０）に結合する分子は、必要に応じて、抗シスタチンＳ抗体またはそれらのフラグメント、二次抗体および固体基質、および１つまたは複数の補助供給品である。これらの必要な試薬または任意の試薬は検査キット内に供給される。上述した試薬は乳癌診断、ｐＴＮＭステージ判定、転移検出および治療の有効性の評価に用いられてよい。

例えば、検査キットは、特異的抗体またはそのフラグメントとなる。また、検査キットは、サンプル中のターゲットタンパク質の検出のため任意にまたは好ましくは報告単位となる。報告単位は好ましくは適切な二次抗体であり、任意にまたは好ましくは（必要に応じて）検出のための標識化を含む。キットは任意にまたは好ましくは、タンパク質の基板インキュベート用およびサンプル中のタンパク質の非特異的相互作用の除去用のタンパク質のバックフィル用ならびに基板に固定されたタンパク質用の緩衝液などの１以上の緩衝液やサンプル、二次抗体および／または上述された試薬をインキュベートした後の基板の洗浄用緩衝液を包含する。

任意に、キットは、競合方法用のコントロールタンパク質の固定化のための固体基質を提供する。この場合、抗体およびサンプルは事前にインキュベートされ、その後、その混合物は、基板にアプライされる。報告単位は抗体および基板の検出に用いられる。専門家は、抗体が血清サンプルからエピトープと結合するかどうかを決定し、血清エピトープと結合する抗体の量を定量的に測定するかもしれない。したがって、当該ターゲットタンパク質の量は決定され得る。

任意に、キットは、二重抗体サンドイッチ法において用い得、抗シスタチンＳ抗体を基板上に固定する。シスタチンＳ標準溶液および前処理したサンプル血清を基板にアプライする。報告単位標識（ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ−ｕｎｉｔ−ｌａｂｅｌｉｎｇ）を有する抗シスタチンＳポリクローナル抗体を基板にアプライする。専門家は、抗体が血清サンプルからのエピトープと結合しているかどうか確かめ、血清エピトープに結合する抗体の量を定量的に測定できる。このようにして、ターゲットタンパク質の量は決定され得る。

検査試薬および／または検査キット、ならびに／または測定器具および／またはキットおよび器具の組み合わせの必要条件の選択は検出に用いる方法に依存する。上述のように、これらの方法はタンパク質ブロッティングおよびフローサイトメトリを包含するが、これに限定されない。ＥＬＩＳＡ方法は上述されており、ブロッティングはより正しいが、さらなる設備および／または操作時間を必要とする。

６．実証的検査キットおよびそのプロトコル
取得物をサンプルし貯蔵する。血清について、血液サンプルを２時間室温で保存しまたは一晩４℃で保存する。当該サンプルを２０分間（１０００ｇ）遠心分離し、上清を血清として収集する。得られた血清サンプルを−２０℃または−８０℃で保存かつ繰り返して解凍し、凍結しないようにすべきである。血漿について、抗凝固薬としてＥＤＴＡまたはヘパリンを用いる。当該サンプルを、血液の収集後３０分未満の、１５分間（２〜８℃、１０００ｇ）遠心分離する。得られた血漿サンプルを−２０℃または−８０℃で保存し、解凍を繰り返して、凍結しないようにすべきである。

前処理物をサンプリングする。血清または血漿サンプルを１０倍に薄めることを勧める。例えば、１００μＬ血清または血漿サンプルを９００μＬのＰＢＳ緩衝液と混ぜる。得られたサンプルを０．１ＭのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０〜７．２）で希薄する。

検査キットは以下を包含するだろう：１）プラスチック箔で閉じたＥＬＩＳＡプレート、２）シスタチンＳ標準溶液。シスタチンＳ溶液を１％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液を用いて１０ｎｇ／ｍＬの濃度で調製する。当該原液を薄めて、５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬおよび０．５ｎｇ／ｍＬの濃度の一連の溶液を調製する。１％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液を０ｎｇ／ｍＬシスタチンＳを含む溶液として用いる。得られた溶液を試験前に１５分以内に調製すべきである。例えば、４ｎｇ／ｍＬシスタチンＳの調製を、エッペンドルフチューブ中、０．５ｍＬ（０．５ｍＬも）シスタチンＳ溶液（８ｎｇ／ｍＬ）および０．５ｍＬの希釈緩衝液を混合して行うことができる。他の濃度を同様にして実現し得る。３）バックフィル用の３％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液。４）コーティング用抗体：５μｇ／ｍＬのラット抗シスタチンＳモノクローナル抗体および希釈用緩衝液（０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ_３溶液、ｐＨ９．０）。５）ビオチン化ウサギ抗シスタチンＳ（価数１：２００）および希釈緩衝液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ）。６）ＡＢＣ（ストレプトアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体）。７）比色検出用ＴＭＢ溶液。８）ＢＳＴ緩衝液（ＰＢＳ中、０．０５％トゥイーン−２０）。９）停止液：２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４。

詳細な操作プロトコルを以下に記載する。

１）コーティング．ラット抗シスタチンＳ溶液を炭酸水素ナトリウム緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ９．０）を用いて５μｇ／ｍＬに希釈する。得られた溶液をポリスチレンプレート上の穴（０．１ｍＬ／１つの穴）にアプライする。当該プレートを一晩インキュベートする。穴の中の溶液を廃棄し、その穴を各３分間かけて３回洗浄する。

２）バックフィル．上記穴に３％ＢＳＡを含む２００μＬＰＢＳＴ緩衝液を加える。当該プレートを１時間（３７℃）または一晩（４℃）でインキュベートする。その穴の中の溶液を廃棄し、当該穴を洗浄緩衝液を用いて３回、各回３分間洗浄する。

３）サンプル充填．穴にブランク、標準溶液およびサンプル溶液を割り当てる。希釈緩衝液１００μＬ、標準溶液およびサンプル溶液をブランクの穴、標準穴およびサンプル穴のそれぞれに添加する。気泡をできないようにする。上記溶液を当該穴のボトムで充填し、溶液が穴の壁と接しないようにする。プレートを緩やかに振り、蓋またはプラスチック箔によって穴を閉じる。プレートを１２０分間（３７℃）インキュベートする。標準溶液を新たに調製し、結果物の精度を確かめる。

４）穴の残留溶液を廃棄し、プレートを乾燥する。プレートを洗浄しない。ビオチン化ウサギ抗シスタチンＳポリクローナル抗体溶液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで２００倍に希釈する）を加える。蓋またはプラスチック箔によって穴を閉じる。６０分間（３７℃）、プレートをインキュベートする。

５）６０分間、プレートをインキュベートし、穴の中の残留液体を廃棄する。当該プレートを乾燥した後に、プレートを３回、各回１〜２分間、３００μＬ洗浄緩衝液に浸して洗浄する。プレートを乾燥し、プレートをシェイクして、穴の中の残留液体を除去する。

６）１００μＬのＡＢＣ溶液を穴に加える。箔によって穴を閉じ、６０分間（３７℃）、プレートをインキュベートする。

７）６０分間、プレートをインキュベートし、穴の中の液体を廃棄し、プレートを乾燥する。プレートを５回、各回１〜２分間、３００μＬ洗浄緩衝液を浸して洗浄する。プレートを乾燥し、プレートを振盪して、穴の中の残留液体を除去する。

８）続けて、穴の中に５０μＬ酵素基質溶液を加え、プレートを箔で閉じ、プレートを１５分未満、暗闇（３７℃）でインキュベートする。標準穴の中の溶液が濃度に応じて青色であり、ブランクの穴において無色であるときに反応を止める。

９）反応を５０μＬ停止溶液を加えて止める。溶液は青から黄に変化する。停止溶液の添加の順番は、酵素基質の添加の順番と同一である。停止溶液を、反応が、終了しかけているときに、すぐに添加し、試験の精度を確認する。

１０）酵素反応の停止後すぐに生じる穴の中の溶液のＯＤ値の測定（４０５ｎｍ）

計算：ＯＤ値に対して個々の溶液の濃度をプロットする。校正方程式を、データ調整を通して得、Ｒ^２を計算し、それは効果的試験用の０．９５より高いはずである。検体を、サンプルおよび校正方程式のＯＤ値を用いて計算する。

７．乳癌ｐＴＮＭステージ判定用のシスタチンＳ発現
実験の詳細は、セクション６と同一である。乳癌患者（２０個のＴステージの例、３０個のＮステージの例および３０個のＭステージの例）サンプルを細胞的に８０人診断する。癌の成長を表４にまとめるように、シスタチンＳ発現は増加し、シスタチンＳタンパク質発現はｐＴＮＭステージ判定のために用いられうることを示す。

８．乳房癌転移診断用のシスタチンＳ発現
実験の詳細は、セクション７と同一である。乳癌患者５０人のサンプルを細胞的に診断し、そのうち３０人の患者は癌転移している。表５にまとめるように、シスタチンＳ発現は、癌転移をしていない患者より転移する患者において高く、シスタチンＳ発現が乳癌転移診断用のマーカーであることを示している。

９．乳癌の治療のために化学療法と組み合わせられる内分泌セラピーの評価用シスタチンＳ発現
実験の詳細は、セクション７と同一である。２８８５人の乳癌（Ｎ０−１ステージ）を研究した。患者をＡＣ（ドキソルビシン＋シクロホスファミド）又は（ドキソルビシン＋パクリタキセル）の４サイクルで処理した。内分泌セラピーは、ホルモン受容体条件に基づいて行われた。すべての患者は、７６ヶ月間追跡した。シスタチンＳ発現を上記セラピーの最終サイクルの後測定した。７７６人の場合が研究で検証され、そのシスタチンＳ発現中央値は３．９６ｎｇ／ｍＬだった。図１８に示されているように、中央値よりも高いシスタチンＳ発現を有する患者の無病生存率（ＤＦＳ）は４９％であり、中央値よりも低いシスタチンＳ発現を有する群の生存率（６４％）より低かった。

全実施例は本発明のいくつかの特徴部をよりよくかつより明らかに説明することに留意されたい。それは、一つの特徴部と組み合わせられうる。全特徴部またはそれに隣接する特徴部を必要に応じて組み合わせ得る。

本発明における方法は実施例により例示され提供された。多くの置換、改良および変更がこの分野での専門家に進められている。これらの置換、改良および変更の任意の効果は請求項およびそれらの妥当な拡張の部分である。本特許において参照されている任意の出版物、特許および特許出願は、実施工程および本発明に包含されていないプロトコルの詳細を説明するために用いられるべきである。本発明に述べられている任意の参照は本発明の技術の代替として認知されていない。

Claims (8)

1. 下記（１）〜（４）のいずれかの、乳癌転移検出用、乳癌の微小転移巣検出用、乳癌のｐＴＮＭステージ判定用、乳癌治療の間の腫瘍のリアルタイムモニタリング用又は乳癌予後予測用の検査キット。
   （１）配列番号１で示されるプライマー、配列番号２で示されるプライマー及び配列番号３で示されるプローブを含み、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに基づいてＣＳＴ４のｍＲＮＡをリアルタイムで定量する検査キット
   （２）配列番号２で示されるＣＳＴ４用プライマー、配列番号３２で示されるＣＳＴ４用プライマー、及び配列番号３でプローブを含み、核酸ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）または転写媒介増幅（ＴＭＡ）に基づいてＣＳＴ４のｍＲＮＡを定量する検査キット
   （３）配列番号３３〜３６で示される４つのプローブを含み、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）に基づいてＣＳＴ４のｍＲＮＡを定量する検査キット
   （４）配列番号３７〜４０で示されるプライマーおよび配列番号４１で示されるプローブを含み、好熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）に基づいてＣＳＴ４のｍＲＮＡを定量する検査キット
2. 陽性対照および陰性対照ならびにブランクサンプルを含む、請求項１に記載の検査キット。
3. 前記検査キットを介して測定される乳癌マーカーの発現レベルまたは定量的含有量が健常者の前記検査キットを介して測定される乳癌マーカーの発現レベルまたは定量的含有量と比較され、その結果が陽性か否かを決定し、またはその結果がカットオフ値より高ければ陽性と決定する、請求項１に記載の検査キットであって、前記カットオフ値が乳癌患者および健常者の体液または組織サンプル中の乳癌マーカー発現／レベルの比較を通して得られ、前記カットオフ値が統計的に有意であり、前記サンプルが血液、尿、骨髄、乳癌細胞株、乳癌腫瘍および腫瘍隣接組織ならびにリンパ節組織よりなる群から選択される１以上を含有する、請求項１に記載の検査キット。
4. 乳癌転移診断用又は乳癌ｐＴＮＭステージ判定用の検査キットであって、前記検査キットが、血液のシスタチンＳレベルを検出し、固体基質、前記基質上に固定されたキャプチャー、ならびにビオチン化キャプチャーおよび比色検出用の対応する基質を包含し、固定されたキャプチャーは特異的モノクローナル抗体であり、ビオチン化キャプチャーはポリクローナル抗体であるか、または
   前記検出キットが、血液シスタチンＳレベルを検出し、固体基質、前記固体基質上に固定されたシスタチンＳ、マウス抗シスタチンＳモノクローナル抗体、酵素標識化二次抗体および比色検出用の対応する基質を包含するか、または
   前記検出キットが、血液シスタチンＳレベルを検出し、固体基質、キャプチャー、酵素標識化二次抗体および比色検出用の対応する基質を包含し、キャプチャーが特異的モノクローナル抗体を包含し、ビオチン化キャプチャーがポリクローナル抗体である、乳癌転移診断用又は乳癌ｐＴＮＭステージ判定用の検査キット。
5. 二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡキット、免疫ブロッティングキット、又は競合ＥＬＩＳＡキットである、請求項４に記載の乳癌転移診断用又は乳癌ｐＴＮＭステージ判定用の検査キット。
6. 前記検査キットが二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡキットであり、モノクローナル抗体がラット抗シスタチンＳ抗体であり、固体基質がＥＬＩＳＡプレートであり、ビオチン化ポリクローナル抗体がビオチン化ウサギ抗シスタチンＳポリクローナル抗体である、請求項５に記載の乳癌転移診断用又は乳癌ｐＴＮＭステージ判定用の検査キット。
7. ラット抗シスタチンＳ抗体によりＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、その後に３％ＢＳＡでバックフィルされ、８倍に希釈したサンプルを前記プレートにアプライし、それを３７℃でインキュベートし、ＴＢＳによってサンプルを含む前記穴を洗浄し、ビオチン化ウサギ抗シスタチンＳポリクローナル抗体を加え、３７℃で前記プレートをインキュベートし、ＴＢＳによってサンプルを含む穴を洗浄し、ストレプトアビジン−ビオチン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体を加え、３７℃で前記プレートをインキュベートし、続いて、ＴＢＳでプレートを洗浄し、最後に検体をアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を添加し、マイクロプレートリーダーにおけるＯＤ（４０５ｎｍ）で読んで定量化される、請求項６に記載の乳癌転移診断用又は乳癌ｐＴＮＭステージ判定用の検査キット。
8. 前記検査キットが二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡキットであり、ＥＬＩＳＡプレートが固体基質であり、固定されたキャプチャーがラット抗シスタチンＳモノクローナル抗体であり、前記ビオチン化キャプチャーがウサギ抗シスタチンＳポリクローナル抗体（価数１：１０００である）でありおよび前記比色検出用基質がアルカリホスファターゼであるか、または
   前記検査キットが競合ＥＬＩＳＡキットであり、ＥＬＩＳＡプレートが前記固体基質であり、シスタチンＳの濃度が５μｇ／ｍＬであり、前記特異的モノクローナル抗体がラット抗シスタチンＳ抗体（価数１：２０００である）であり、酵素ラベル化二次抗体がＡＬＰラベル化ヤギ抗マウスＩｇＧ（価数１：２０００であり）であり、および前記比色検出用基質がＡＬＰ基質であり、シスタチンＳ、酵素ラベル化二次抗体およびＡＬＰ基質の体積比が１：２であるか、または
   前記検査キットが免疫ブロッティングキットであり、前記固体基質はニトロセルロース膜であり、前記キャプチャーはモノクローナルシスタチンＳ抗体（価数１：１０００である）であり、前記酵素ラベル化二次抗体はペルオキシダーゼラベル化ヤギ抗ウサギＩｇＧであり、および前記酵素基質はＴＭＢ溶液である、請求項５に記載の乳癌転移診断用又は乳癌ｐＴＮＭステージ判定用の検査キット。
   

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