WO2016143351A1 - カンナビノイド類の検出方法 - Google Patents

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WO2016143351A1
WO2016143351A1 PCT/JP2016/001353 JP2016001353W WO2016143351A1 WO 2016143351 A1 WO2016143351 A1 WO 2016143351A1 JP 2016001353 W JP2016001353 W JP 2016001353W WO 2016143351 A1 WO2016143351 A1 WO 2016143351A1
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receptor
cannabinoid
detection method
cannabinoid receptor
labeled
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PCT/JP2016/001353
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重城 加藤
美保 橋本
正彦 舩田
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プリマハム株式会社
国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G01N33/567—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds utilising isolate of tissue or organ as binding agent

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting cannabinoids, which are main components of dangerous drugs, and a kit for detecting cannabinoids that can be used in such a method.
  • Cannabis has been used for rituals and treatment since ancient times due to its sedative effect, anti-vomiting effect, euphoria-inducing action, and the like.
  • the components of cannabis include ⁇ 9 -tetrahydrocannabinol ((-)-(6aR, 10aR) -6,6,9-trimethyl-3-pentyl-6a, 7,8,10a -tetrahydro-6H-benzo [c ] chromen-1-ol: ⁇ 9-THC) is a major psychoactive component, and its derivatives include various cannabinoid components including cannabidiol (CBD) and cannabinol (CBN) Has been.
  • CBD cannabidiol
  • CBN cannabinol
  • Non-Patent Document 1 Ingestion of cannabis induces catalepsy-like immobility and hypothermia. In addition, it has been reported that abuse can affect the cerebral nervous system because mental dependence is formed or cytotoxicity is induced in a concentration-dependent manner (see, for example, Non-Patent Document 1). There are many countries where the use of is prohibited.
  • the cannabis component is also used as a pharmaceutical ingredient.
  • ⁇ 9-THC which is said to regulate mesolimbic dopamine nerves, is regulated by the US Food and Drug Administration (FDA) to control nausea and vomiting associated with chemotherapy, and is also suffering from debilitating syndrome It is approved as a drug for improving the appetite of AIDS patients and is marketed as Marinol (registered trademark) or the like.
  • cannabinoid type 1 (CB1) receptor is expressed in large amounts in the nervous system such as the brain and is considered to be involved in the inhibitory control of neurotransmission.
  • cannabinoid type 2 (CB2) receptors are expressed abundantly in organs and cells of the immune system such as the spleen and tonsils and are considered to be involved in the regulation of inflammatory reactions and immune responses.
  • N-arachidonoylethanolamine (anandamide) was extracted from pig brain as a candidate substance for endogenous ligand (see, for example, Non-Patent Document 2), and palmitoylethanolamine, oleamide, 2-arachidone.
  • Instrumental analysis such as gas chromatography and liquid chromatography is used in public institutions to identify the active components of so-called dangerous drugs (for example, see Non-Patent Document 8).
  • dangerous drugs for example, see Non-Patent Document 8
  • an evaluation system using a cultured cell system is widely used as a simple and sensitive method. Synthetic cannabinoids are also observed to be cytotoxic in a concentration-dependent manner (see, for example, Non-Patent Document 9).
  • the evaluation method using live cells requires several days for cell culture, and since a cell culture device is required, it can only be carried out by a research institution having a special facility. As described above, since there is no simple inspection method for synthetic cannabinoids, it takes time for the investigation, and development of a new inspection technique is demanded.
  • a cannabinoid measurement method in which a functional group having affinity with cannabinoids capable of hydrogen bonding is used as an adsorbent, the cannabinoid in the sample is adsorbed on the adsorbent, the adsorbed cannabinoid is eluted from the adsorbent, and the amount thereof is measured.
  • a functional group having affinity with cannabinoids capable of hydrogen bonding is used as an adsorbent
  • the cannabinoid in the sample is adsorbed on the adsorbent
  • the adsorbed cannabinoid is eluted from the adsorbent
  • An object of the present invention is to provide a method and a kit for simply and accurately determining whether or not a test sample contains cannabinoids.
  • the present inventors have focused on the fact that many of the drug components contained in the dangerous drug exhibit the same action as ⁇ 9-THC, and studied a method for detecting cannabinoids using a cannabinoid receptor.
  • a plate in which a cannabinoid receptor is immobilized is labeled with a compound having a high affinity for the cannabinoid receptor and a synthetic cannabinoid extracted with a surfactant is added and allowed to react competitively. It was confirmed that synthetic cannabinoids that are harmful to the human body can be detected easily and accurately without using cells or special equipment.
  • the present inventors further studied the extraction solvent.
  • cannabinoids obtained by diluting synthetic cannabinoids extracted with DMSO (dimethyl sulfoxide) with a buffer containing Tween 20 in order to prevent irreversible denaturation of the receptor, which is a protein. Although the diluted solution and the labeled standard substance reacted competitively, it was difficult to detect cannabinoids. However, when the surfactant is changed from Tween 20 which is a nonionic surfactant to SDS (sodium dodecyl sulfate) which is an anionic surfactant, it is surprisingly possible to detect cannabinoids. I found out.
  • synthetic cannabinoids are extracted using other organic solvents, and then a cannabinoid diluted solution diluted with an anionic surfactant is reacted competitively with a labeled standard substance, thereby accepting a protein receptor.
  • the present invention has been completed by confirming that irreversible denaturation of the protein can be prevented and detection with higher accuracy can be performed.
  • a method for detecting cannabinoids in a test sample comprising the following steps (A) to (E): (A) a step of preparing a solid phase receptor obtained by solidifying a cannabinoid receptor, a cannabinoid receptor-expressing cell or a cannabinoid receptor-expressing membrane fraction; (B) a step of preparing a labeled competitive solution containing a labeled standard substance by labeling a standard substance having affinity for the cannabinoid receptor with a labeling substance; (C) A step of extracting a detection target cannabinoid from a test sample to prepare a sample solution; (D) The solid phase receptor prepared in step (A) is contacted with the labeled competitive solution and the sample solution, and the labeled standard substance and the cannabinoids to be detected are competitively bound to the cannabinoid receptor, Competitive reaction step to remove unreacted labeled standard; (E) a measurement step for quantifying the amount
  • [17] The detection method according to any one of [13] to [16] above, wherein the anionic surfactant is SDS. [18] The method described in [17] above, wherein the SDS concentration is 0.01 to 10%. [19] A label in which a cannabinoid receptor or a cannabinoid receptor-expressing cell or a cannabinoid receptor-expressing membrane fraction is immobilized, and a standard substance having affinity for the cannabinoid receptor is labeled with a labeling substance A cannabinoid detection kit comprising a standard substance and a surfactant for extracting a detection target cannabinoid from a test sample.
  • cannabinoids blended in a dangerous drug and having a possibility of adversely affecting physiologically or mentally can be detected in a wide range regardless of the difference in molecular structure.
  • a sample solution containing cannabinoids extracted using Tween 20 of each concentration as an extraction solvent and a labeled standard substance are competitively bound to a cannabinoid receptor, and then the absorbance of the labeled standard substance bound to the cannabinoid receptor is measured. It is a graph to show.
  • the sample solution containing cannabinoids extracted with each concentration of ethanol as an extraction solvent and diluted with 0.2% Tween 20 and the labeled standard substance were competitively bound to the cannabinoid receptor, and then the cannabinoid receptor It is a graph which shows the light absorbency of the labeled standard substance amount couple
  • (A) is a sample solution not subjected to ethanol extraction
  • (b) is a sample solution diluted in 10.0% ethanol
  • (c) is a sample solution diluted in 20.0% ethanol
  • (d) is 40 It is a graph at the time of using the sample liquid diluted to ethanol of 0%.
  • a sample solution containing cannabinoids in a DMSO solution of 0, 10.0, 20.0, or 40.0% diluted with each concentration of SDS and a labeled standard substance were used as cannabinoid receptors. It is a graph which shows the light absorbency of the labeled standard substance quantity couple
  • (A) is a sample solution diluted with 0.2% SDS
  • a sample solution containing cannabinoids in methanol solution of 0, 10.0, 20.0, or 40.0% diluted with 0.5% SDS after extraction with methanol and a labeled standard substance are cannabinoid receptors 2 is a graph showing the absorbance of the amount of labeled standard substance bound to the cannabinoid receptor after competitively binding to.
  • a sample solution containing cannabinoids in 0, 10.0, 20.0, or 40.0% ethanol diluted with 1.0% SDS and a labeled standard substance were used as cannabinoid receptors. It is a graph which shows the light absorbency of the labeled standard substance quantity couple
  • a sample solution containing cannabinoids in a solution of 0, 10.0, 20.0, or 40.0% DMSO diluted with each concentration of Tween 20 and a labeled standard substance were used as cannabinoid receptors. It is a graph which shows the light absorbency of the labeled standard substance quantity couple
  • (A) is a sample solution diluted with 0.2% Tween 20
  • a cannabinoid receptor-expressing cell or a cannabinoid receptor-expressing membrane fraction, or a solid-phase receptor in which a cannabinoid receptor is immobilized is prepared.
  • test sample in the present invention includes whole blood, blood such as serum, plasma, etc., body fluid in a narrow sense such as lymph, spinal fluid, urine, saliva, sweat, In addition to specimens that can be obtained from mammals such as humans such as semen and other body fluids that are secreted and excreted outside the body, nausea, stomach contents, lung lavage fluid, etc. it can.
  • the cannabinoids in the present invention include cannabinoids having a naphthoylindole skeleton, cannabinoids having a phenylacetylindole skeleton, cannabinoids having a benzoylindole skeleton, cannabinoids having a cyclohexylphenol skeleton, cannabinoids having a diterpene skeleton, and ⁇ 9-
  • cannabinoids having a dibenzopyran ring similar to THC or a structure similar thereto analogs and modifications of these compounds, which can include compounds that bind to cannabinoid receptors,
  • the determination of the structure of the present invention for compounds that exert strong psychological effects such as inducing euphoria, mental dependence, catalepsy-like immobility, and inducing hypothermia.
  • cannabinoids Even a compound of the it to become non-reporting made, can be suitably included as cannabinoids.
  • a pre-metabolic compound that allows a metabolite metabolized in the body to bind to a cannabinoid receptor can also be included in the cannabinoids for convenience as a cannabinoid precursor.
  • Examples of the cannabinoid having the naphthoylindole skeleton include agonists of CB1 receptor and / or CB2 receptor, JWH-015, JWH-018, JWH-073, JWH-081, JWH-200, JWH-250, JWH. -WH, JWH-398 and other compounds of the JWH series synthesized by JWHuffman, and AM-2201, which is a potent agonist of the CB1 receptor and CB2 receptor.
  • Examples of the cannabinoid having the benzoylindole skeleton include AM630, which is a potent CB2 receptor antagonist / inverse agonist.
  • Examples of the cannabinoid having the cyclohexylphenol skeleton include CP55940 that acts on the CB1 receptor and CB2 receptor, and CP47497 that acts on the CB1 receptor.
  • Examples of cannabinoids having a diterpene skeleton include reelamine (1,4a-Dimethyl-7-isopropyl-1,2,3,4,4a, 9,10, which is a potent agonist acting on CB1 receptor and CB2 receptor. , 10a-octahydro-1-phenanthrenemethylamine).
  • cannabinoids having a structure similar to the dibenzopyran ring include HU-210, which has a very high affinity for ⁇ 9-THC, CB1 receptor and CB2 receptor, and is a potent agonist. Can do.
  • agonists inverse agonists
  • antagonists antagonists
  • an agonist is a compound that activates a receptor and induces a physiological effect
  • an inverse agonist is a compound that stabilizes the receptor in an inactive higher-order structure
  • an antagonist is a compound that inhibits the action of an agonist.
  • the action of the receptor is an action that reduces the function of the cell, the cell function may be increased by inhibiting the action of the antagonist.
  • the solid phase receptor prepared in the step (A) is prepared by immobilizing a (purified) cannabinoid receptor or a cannabinoid receptor-expressing cell or a cannabinoid receptor-expressing membrane fraction.
  • a solid phase can be mentioned.
  • the cannabinoid receptor is a human CB1 receptor having a binding ability to cannabinoids, a seven-transmembrane, G protein (Gi / Go) -coupled receptor, and comprising a 472 amino acid sequence , And a natural receptor such as a human CB2 receptor composed of 360 amino acid sequences (see, for example, Biochemistry, Vol. 83, No.
  • cannabinoid receptor-expressing cells and receptor-expressing cells such as cannabinoid receptor-expressing membrane fractions may be used. It is desirable to use fractions.
  • either the CB1 receptor or the CB2 receptor can be used, but all cannabinoids that bind only to either the CB1 receptor or the CB2 receptor can be detected. In this respect, it is preferable to use CB1 receptor and CB2 receptor.
  • Preferred examples of the cannabinoid receptor-expressing cells include cells in which the cannabinoid receptor is expressed as a recombinant protein.
  • Examples of a method for preparing such recombinant receptor protein-expressing cells include a method using a known gene recombination technique.
  • Examples thereof include a method for preparing cells transformed with a vector in which DNA is incorporated into a suitable expression vector and DNA encoding the cannabinoid receptor protein is incorporated.
  • the cannabinoid receptor-expressing membrane fraction is not particularly limited as long as it is a cell membrane of a cell expressing a cannabinoid receptor.
  • Examples of such a cell membrane include a cell membrane such as a cell of a postsynaptic neuron and a cell expressing the cannabinoid receptor.
  • the medium in which the cannabinoid receptor-expressing cells are grown is removed by suction, the cell surface is washed with a buffer, and then the cells are detached from the medium.
  • Example of adding the medium again to the cells detached from the medium, centrifuging, aspirating the supernatant, suspending in buffer, and resuspending the membrane fraction precipitated by centrifugation with buffer can do.
  • the membrane fraction can be purified by separating the membrane fraction by ultrasonic disruption, physical disruption by friction, ultracentrifugation or the like.
  • a treatment for separating the membrane fraction by ultracentrifugation can be performed in ice-cooling and / or after adding a protease inhibitor.
  • a buffer solution for washing the cell surface and suspending the membrane fraction PBS (-) containing no calcium or magnesium is preferable in terms of loose binding to the dish and facilitating cell detachment. Can be listed.
  • a cannabinoid receptor suspension is added to the solid phase, or the cannabinoid receptor-expressing cells or the cannabinoid receptor-expressing membrane fraction is converted to 1.
  • An example is a method of blocking by adding PBS containing bovine serum albumin (BSA) after standing and washing with PBS containing Tween 20 (PBST).
  • BSA bovine serum albumin
  • the solid phase used for the preparation of the solid phase receptor includes a plate, a chip, a substrate, a test tube, a porous carrier made of a material capable of forming a solid surface excellent in adhesion of cells and cell fractions, etc.
  • a porous carrier made of a material capable of forming a solid surface excellent in adhesion of cells and cell fractions, etc.
  • the standard substance having affinity for the cannabinoid receptor includes an agonist having high affinity for the cannabinoid receptor and an inverse having high affinity for the cannabinoid receptor.
  • Agonists and antagonists having high affinity for cannabinoid receptors can be mentioned, and agonists having high affinity for cannabinoid receptors are preferable, and examples thereof include CP-55940, reelamine and oleamide.
  • the standard substance is a labeled substance such as enzyme, fluorescence, biotin, radioisotope, gold colloid, etc.
  • the labeling method include labeling, fluorescent labeling, biotin labeling, radioisotope labeling, and colloidal gold labeling.
  • a commercially available labeling kit or the like can also be used, and specifically, a method of peroxidase labeling a standard substance using a commercially available peroxidase labeling kit can be preferably mentioned.
  • a labeling competition solution can be prepared by suspending these labeling standards in a buffer containing a surfactant as appropriate.
  • a surfactant (method 1) or an organic solvent ( Method 2) can be mentioned.
  • the surfactant is used as the extraction solvent in the above method 1, it is more preferable to use an extraction solvent further containing a buffer solution.
  • the amount (volume) of the extraction solvent containing a surfactant and a buffer can be used 2 to 2000 times that of the test sample, and preferably 10 to 1000 times.
  • a nonionic surfactant, an anionic surfactant, a cationic surfactant, and an amphoteric surfactant that can prevent irreversible denaturation of a receptor that is a protein are used.
  • nonionic surfactant and anionic surfactant are preferable, these can be used 1 type or 2 types or more.
  • the nonionic surfactant include Tween 20 (polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate), and examples of the anionic surfactant include SDS.
  • the concentration of SDS in Method 1 may be 0.01 to 10%, preferably 0.1 to 5%, more preferably 0.5 to 2%, and 0.8 to 1.2%. Further preferred.
  • the concentration of Tween 20 can be 0.01 to 10%, preferably 0.1 to 5%, and more preferably 1.0 to 1.2%. In the present invention, the concentration (%) represents w / v%.
  • the buffer solution in Method 1 is not particularly limited as long as it does not interfere with the interaction between the cannabinoid receptor and cannabinoids in the present invention, and includes PBS (Phosphate Buffered Saline), Tris buffer solution, Examples thereof include citrate buffer and borate buffer.
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • Tris buffer solution examples thereof include citrate buffer and borate buffer.
  • the amount of the organic solvent used can be 2 to 2000 times that of the test sample, and can be 10 to 1000 times. Is preferred.
  • the amount of the buffer solution containing the anionic surfactant can be 2 to 2000 times that of the extracted sample extracted with the organic solvent, and more preferably 10 to 1000 times.
  • the organic solvent in Method 2 is not particularly limited as long as it can extract the above cannabinoids, and is not limited to lower alcohols such as methanol, ethanol, isopropanol, N, N-dimethylformamide (DMF), N-methylpyrrolidone ( NMP), aprotic polar solvents such as DMSO, acetonitrile and the like.
  • lower alcohols such as methanol, ethanol, isopropanol, N, N-dimethylformamide (DMF), N-methylpyrrolidone ( NMP), aprotic polar solvents such as DMSO, acetonitrile and the like.
  • the concentration of the organic solvent in the sample solution diluted with the buffer solution containing an anionic surfactant is, for example, preferably 5 to 75%, more preferably 10 to 60%, and more preferably 20 to 50%. Is more preferable, and 35 to 45% is particularly preferable.
  • the DMSO concentration in the sample solution diluted with an anionic surfactant is preferably 5 to 75%, more preferably 20 to 60%, and more preferably 30 to 50%. % Is more preferable, and 35 to 45% is particularly preferable.
  • the concentration of methanol in the sample solution diluted with an anionic surfactant is preferably 5 to 75%, more preferably 20 to 60%, still more preferably 30 to 50%, 35 to 45% is particularly preferable.
  • the ethanol concentration in the sample solution diluted with an anionic surfactant is preferably 2 to 50%, more preferably 5 to 15%, and even more preferably 8 to 12%.
  • anionic surfactant in Method 2 examples include higher alcohol sulfates, alkyl naphthalene sulfonates, alkyl benzene sulfonates, and alkyl phosphate esters. Specifically, SDS is preferably used. It can be illustrated.
  • concentration of the anionic surfactant examples include 0.1 to 1.5%, preferably 0.15 to 1.1%.
  • the buffer solution in Method 2 is not particularly limited as long as it does not interfere with the interaction between the cannabinoid receptor and cannabinoids in the present invention, and examples thereof include PBS, Tris buffer solution, citrate buffer solution, borate buffer solution and the like. can do.
  • the labeled competitive solution and the sample solution are brought into contact with the solid phase receptor prepared in the step (A), and the labeled standard substance and the cannabinoids are competitively brought into the cannabinoid receptor.
  • the solid phase receptor after blocking is washed with PBST, and the labeled competitive solution and the sample solution are added to and mixed with the solid phase receptor for 5 minutes to 10 hours. , Preferably 30 minutes to 4 hours, more preferably 1 hour to 2 hours, leaving the cannabinoid receptor immobilized on the solid phase receptor to the labeled standard substance in the labeling competition solution, and A method for competitively binding cannabinoids to be detected in the sample solution can be mentioned.
  • the solid phase receptor after competitively binding the labeled standard substance and the cannabinoids to be detected with the PBST is used.
  • a method of washing and removing the PBST solution in the solid phase receptor can be mentioned.
  • the measurement step of the step (E) is not particularly limited as long as it is a method for quantifying the amount of labeled standard substance bound to the cannabinoid receptor, and after performing a treatment that makes the label detectable with a color former or the like, A method for determining the content of cannabinoids in a test sample using a curve can be mentioned.
  • an inverse sigmoid type standard curve (see, for example, FIG. 1) can be exemplified, and the conditions under which such a standard curve can be created are highly reactive.
  • the cannabinoid (s) detected by the method of the present invention is further fractionated by immunoassay such as solid phase enzyme immunoassay (ELISA), affinity chromatography, HPLC, etc., and finally by NMR, LC / MS, etc. More detailed structure can be determined.
  • immunoassay such as solid phase enzyme immunoassay (ELISA), affinity chromatography, HPLC, etc.
  • ELISA solid phase enzyme immunoassay
  • HPLC HPLC
  • MS LC / MS
  • the kit of the present invention includes the above-described cannabinoid receptor or a cannabinoid receptor-expressing cell or a solid phase receptor on which the cannabinoid receptor-expressing membrane fraction is immobilized; a standard substance having affinity for the cannabinoid receptor is labeled
  • a human cannabinoid CB1 receptor aequorin cell line ES-110-A (manufactured by PerkinElmer) was seeded in a 100 mm standard dish to which the above-mentioned preparation medium was added, and 5% CO 2 at 37 ° C. The cells were cultured for 24-72 hours.
  • a suspension containing the CB1 receptor-expressing cell membrane fraction was prepared in PBS so that the cell count was 1.0 ⁇ 10 6 / mL, and was added to a Nunc 96-well microplate (manufactured by Thermo Scientific) at 50 ⁇ L / Each well was added and allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours to immobilize the cell membrane fraction containing the CB1 receptor on the plate. After washing the plate with PBST, PBS containing 1% BSA (manufactured by Sigma) was added at 150 ⁇ L / well, and the plate was allowed to stand at 37 ° C. for 1.0 hour for blocking. A body-expressing cell membrane fraction solid phase microplate was prepared.
  • Labeled reelamine as a labeled standard substance was prepared using reelamine (manufactured by Cayman Chemical) as an agonist of CB1 receptor as a standard substance.
  • reelamine manufactured by Cayman Chemical
  • peroxidase as a labeling substance, according to the labeling kit Peroxidase Labeling Kit-NH2 (manufactured by Dojindo Laboratories)
  • the enzyme was labeled so that the concentration of reelamine was 500 ⁇ mol / L, and a peroxidase-labeled reelamine solution was prepared as a label competition solution.
  • the plate was allowed to stand at 37 ° C. for 1.5 hours and then washed with PBST, and the solution in the well was well removed.
  • a color developing solution Sure Blue TMB peroxidase substrate (1-Component) (manufactured by KPL) was added at 100 ⁇ L / well and allowed to stand at room temperature under light shielding. While confirming the degree of color development, 100 mol / well of 1 mol / L hydrochloric acid was added appropriately to stop color development. Immediately, the absorbance was measured using a microplate reader under conditions of a main wavelength of 450 nm and a sub wavelength of 620 nm.
  • FIGS. The results when using PBS containing 0.2%, 0.5%, or 1.0% sodium dodecyl sulfate (SDS: manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) are shown in FIGS. Each is shown in c). Moreover, the result at the time of using PBS containing 0.2, 1.0, 5.0, or 10.0% Tween20 is shown to Fig.3 (a) (b) (c) and (d), respectively. .
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • CP-55940 was used as a cannabinoid to be detected.
  • a 50 mg / mL CP-55940 extraction sample was prepared using ethanol (99.5%, reagent grade, catalog number 057-00451, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as an extraction solvent.
  • ethanol 99.5%, reagent grade, catalog number 057-00451, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Such a CP-55940 extracted sample was prepared using PBS containing 0.2% Tween 20 as a diluent, so that the ethanol concentration was 10.0, 20.0, or 40.0%.
  • a diluted solution of 5000 ppm CP-55940 was prepared using 0.2% Tween 20 containing 10.0%, 20.0%, 40.0% as diluent.
  • the above Sure Blue TMB peroxidase substrate (1-Component) was added in an amount of 100 ⁇ L / well and allowed to stand at room temperature in the dark. While confirming the degree of color development, 100 mol / well of 1 mol / L hydrochloric acid was added appropriately to stop color development. Immediately, the absorbance was measured using a microplate reader under conditions of a main wavelength of 450 nm and a sub wavelength of 620 nm. The results when PBS containing 0%, 10.0%, 20.0%, or 40.0% ethanol and 0.2% Tween 20 are used are shown in FIGS. Shown in c) and (d), respectively.
  • Example 2 [Examination of Extract 3-DMSO in PBS] (Preparation of CB1 receptor-expressing cell membrane fraction solid phase microplate) In the same manner as in Example 1, the receptor-expressing cells were cultured, the cannabinoid receptor-expressing cell membrane fraction suspension was prepared, and the CB1 receptor-expressing cell membrane fraction solid phase microplate was prepared.
  • CP-55940 was used as a cannabinoid to be detected.
  • a 50 mg / mL CP-55940 extracted sample was prepared using DMSO (99.0%, reagent grade, catalog number 043-07216, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as an extraction solvent.
  • DMSO 99.0%, reagent grade, catalog number 043-07216, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the DMSO concentration becomes 10.0, 20.0, or 40.0%.
  • a solution was prepared.
  • Example 3 [Examination of Extract 4-Methanol in PBS] (Preparation of CB1 receptor-expressing cell membrane fraction solid phase microplate) In the same manner as in Example 1, the receptor-expressing cells were cultured, the cannabinoid receptor-expressing cell membrane fraction suspension was prepared, and the CB1 receptor-expressing cell membrane fraction solid phase microplate was prepared.
  • CP-55940 was used as a cannabinoid to be detected.
  • a 50 mg / mL CP-55940 extraction sample was prepared using methanol (99.8%, reagent grade, catalog number 137-01823, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as an extraction solvent.
  • methanol 99.8%, reagent grade, catalog number 137-01823, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Such a CP-55940 extracted sample was prepared using PBS containing 0.5% SDS as a diluent, so that the methanol concentration was 10.0, 20.0, or 40.0%.
  • a diluted solution of 5000 ppm CP-55940 was prepared using 0.5% SDS containing 10.0%, 20.0%, or 40.0%.
  • Example 4 [Examination of Extract 5-Ethanol in PBS] (Preparation of CB1 receptor-expressing cell membrane fraction solid phase microplate) In the same manner as in Example 1, the receptor-expressing cells were cultured, the cannabinoid receptor-expressing cell membrane fraction suspension was prepared, and the CB1 receptor-expressing cell membrane fraction solid phase microplate was prepared.
  • CP-55940 was used as a cannabinoid to be detected.
  • a 50 mg / mL CP-55940 extracted sample was prepared using ethanol as the extraction solvent.
  • CP-55940 extracted sample as a diluent with PBS containing 0.2, 0.5, or 1.0% SDS, the ethanol concentration becomes 10.0, 20.0, or 40.0%. It was prepared as follows. Further, 2500 ppm of CP-55940 diluted solution was prepared using 0.2%, 0.5, or 1.0% SDS containing 10.0%, 20.0%, 40.0% ethanol as a diluent. did.
  • CP-55940 was used as a cannabinoid to be detected.
  • CP-55940 was prepared by using 0, 10.0, 20.0, or 40.0% DMSO as an extraction solvent so that CP-55940 was 50 mg / mL.
  • 2500 ppm CP-55940 diluted solution was prepared using PBS containing 0.2, 0.5, or 1.0% Tween 20 as the diluent.
  • the present invention can detect cannabinoids which are harmful components in dangerous drugs.

Abstract

　被検試料が、カンナビノイド類を含有するか否かを簡便かつ精確に判定するための方法やキットを提供する。カンナビノイド受容体を固相化したプレートに、カンナビノイド受容体に高い親和性を持つ化合物を標識したものと、界面活性剤や有機溶媒で抽出した合成カンナビノイド類とを添加して競合的に反応させることにより、生細胞や特別な装置を使用することなく人体に有害である合成カンナビノイド類を簡易かつ精確に検出できることを確認した。

Description

カンナビノイド類の検出方法
　本発明は、危険ドラッグの主要成分であるカンナビノイド類の検出方法や、かかる方法に使用することができるカンナビノイド類の検出キットに関する。
　大麻は、その鎮静作用、嘔吐抑制作用、多幸感の惹起作用等により、古来から儀式や治療に用いられてきた。大麻の成分としては、Δ9－テトラヒドロカンナビノール（(-)-(6aR,10aR)-6,6,9-trimethyl-3-pentyl-6a,7,8,10a -tetrahydro-6H-benzo[c]chromen-1-ol：Δ９－ＴＨＣ）が主要な精神活性成分として、また、その誘導体としてカンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビノール（ＣＢＮ）をはじめとする種々のカンナビノイド成分が含まれることが明らかにされている。大麻の摂取によりカタレプシー様無動状態や体温降下が誘発される。また、精神依存が形成されたり、濃度依存的に細胞毒性が惹起されることから、乱用により脳神経系に影響を及ぼすおそれがある旨が報告されており（例えば、非特許文献１参照）、大麻の使用が禁止されている国も多い。
　また、大麻の成分は、医薬成分としても用いられている。例えば、中脳辺縁ドーパミン神経を調節するとされるΔ９－ＴＨＣは、米国食品・医薬品庁（ＦＤＡ）によって、化学療法に伴う悪心や嘔吐を調節するため、また、消耗性症候群に罹患しているエイズ患者の食欲を増進させるための薬物として承認されており、マリノール（Ｍａｒｉｎｏｌ）（登録商標）等として市販されている。
　他方、カンナビノイド受容体を介したカンナビノイドの作用機構の解明も、近年になって急速に進んでいる。例えば、カンナビノイド１型（ＣＢ１）受容体は、脳などの神経系で多量に発現し、神経伝達の抑制的制御に関与しているとされる。また、カンナビノイド２型（ＣＢ２）受容体は、脾臓や扁桃腺など、免疫系の臓器や細胞に多く発現しており、炎症反応や免疫応答の調節に何らかの関与をしているとされる。
　また、上記カンナビノイド受容体に作用する生体内物質がもともと存在するであろうとの推定のもと、上記カンナビノイド受容体に結合する内在性のリガンドの探索が行われてきた。その結果、Ｎ－アラキドノイルエタノールアミン（アナンダミド）が内在性リガンドの候補物質としてブタの脳から取り出された(例えば、非特許文献２参照)のを皮切りに、パルミトイルエタノールアミン、オレアミド、２－アラキドン酸グリセロール（２－ＡＧ）等のカンナビノイド受容体に相互作用する生体内物質が特定され、これらの内在性カンナビノイドは、鎮痛（例えば、非特許文献３参照）、摂食の調整（例えば、非特許文献４参照）、睡眠の促進（例えば、非特許文献５参照）等の多様な生理活性を、カンナビノイド受容体を介して有していることが確認された。
　一方、近年乾燥した植物片に、Δ９－ＴＨＣと薬理作用が類似する化合物を混在させたものが、お香や観賞用の製品と称して、いわゆる“危険ドラッグ”として世界的に流通しており、その乱用が大きな社会問題になっている。天然成分よりも作用の強い化合物は、精神依存が早期にもたらされ、その乱用のため死に至る事例も報告されている。これまでに、有害性や危険性が確認された薬物成分について規制や取締りが実施されてきたが、規制した薬物成分と類似した構造や作用を有する新たな薬物成分が登場することが繰り返されており、規制が追いついていない現状がある。このため、厚生労働省は、薬事法で規制されている「指定薬物」と化学構造が類似していれば一括して規制対象とする「包括指定」の導入を決め、現在、合成カンナビノイドに多くみられるナフトイルインドール骨格を有する化合物が包括的に規制されている（例えば、非特許文献６及び７参照）。
　いわゆる危険ドラッグの作用成分の特定にはガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーなどの機器分析が公的機関等では用いられている（例えば、非特許文献８参照）。しかし、すでに規制されている薬物で標準品などが存在する場合は成分の特定が可能であるが、現在も増え続けている標準品の存在しない未規制の薬物に対しての分析は極めて困難である。さらに、新たに標準品を合成するためには数ヶ月かかることもあり、原因の究明に時間を要することが多い。また、薬物の有害性を評価する方法として、培養細胞系を利用する評価系が、簡便かつ感度の高い方法として汎用されている。合成カンナビノイドについても濃度依存的に細胞毒性の発現が認められている（例えば、非特許文献９参照）。しかしながら、生細胞を利用して評価する方法は細胞培養に数日間必要であり、また、細胞培養装置が必要なことから、特別な施設を保有する研究機関などでしか実施することができない。このように、合成カンナビノイド類に関しては簡易検査法がないことから、捜査に時間がかかることも課題とされており、新たな検査技術の開発が求められている。
　例えば、カンナビノイドとの親和性を有する水素結合可能な官能基等を吸着材として、試料中のカンナビノイドを吸着材に吸着させ、吸着したカンナビノイドを吸着材より溶出し、その量を測定するカンナビノイド測定方法（例えば、特許文献１参照）や、抗体を用いて試料中の対象分析物の存在を判定するための方法（例えば、特許文献２参照）が提案されているが、精度の点や、カンナビノイド類の全般的な検出という点からすると不十分といわれている。
特開２００２－０６２２８３号公報 特開２０１４－２０９１２３号公報
第１０８回日本精神神経学会学術総会シンポジウム、脱法ハーブの薬物依存性と細胞毒性の評価 Science, 258: 1946-1949, 1992 Nature, 394: 277-281, 1998 Nature, 414: 209-212, 2001 Science, 268: 1506-1509, 1995 指定薬物を包括指定する省令の公布、厚生労働省、平成２５年２月２０日 薬事法第２条第１４項に規定する指定薬物及び同法第７６条の４に規定する医療等の用途を定める省令の一部改正について（施行通知）（平成２５年２月２日） 兵庫県立健康生活科学研究所健康科学研究センター研究報告５：５２－５５、２０１４ Tomiyama、 K., et al., Cytotoxicity of synthetic cannabinoids found in "Spice" products：the role of cannabinoid receptors and the caspasecascade in the NG 108-15 cell line. Toxicol Lett, 207: 12-17, 2011
　本発明の課題は、被検試料が、カンナビノイド類を含有するか否かを簡便かつ精確に判定するための方法やキットを提供することにある。
　本発明者らは、危険ドラッグに含まれる薬物成分の多くがΔ９-ＴＨＣと同様の作用を示すことに着目し、カンナビノイド受容体を用いたカンナビノイド類の検出方法を検討した。カンナビノイド受容体を固相化したプレートに、カンナビノイド受容体に高い親和性を持つ化合物を標識したものと、界面活性剤で抽出した合成カンナビノイド類とを添加して競合的に反応させることにより、生細胞や特別な装置を使用することなく人体に有害である合成カンナビノイド類を簡易かつ精確に検出できることを確認した。本発明者らはさらに抽出溶媒について検討を続け、まず、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）で抽出した合成カンナビノイド類を、タンパク質である受容体の不可逆的変性を防ぐためにＴｗｅｅｎ２０を含む緩衝液で希釈したカンナビノイド類希釈溶液と、標識標準物質とを競合的に反応させたが、カンナビノイド類の検出は困難であった。しかし、界面活性剤を非イオン性界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０から、陰イオン性界面活性剤であるＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）に代えた場合には、驚くべきことにカンナビノイド類の検出が可能となることをみいだした。さらに、他の有機溶媒を用いて合成カンナビノイド類を抽出し、その後陰イオン性界面活性剤で希釈したカンナビノイド類希釈溶液と、標識標準物質とを競合的に反応させることにより、タンパク質である受容体の不可逆的変性を防ぎ、かつ、より精確性の高い検出をすることができることを確認して、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］以下の（Ａ）～（Ｅ）の工程を備えることを特徴とする被検試料中のカンナビノイド類の検出方法。
（Ａ）カンナビノイド受容体、又はカンナビノイド受容体発現細胞若しくはそのカンナビノイド受容体発現膜画分を、固相化した固相受容体を調製する工程；
（Ｂ）カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質を標識化物質で標識して、標識標準物質を含む標識競合液を調製する工程；
（Ｃ）被検試料から検出対象カンナビノイド類を抽出してサンプル液を調製する工程；
（Ｄ）工程（Ａ）で調製した固相受容体に、前記標識競合液とサンプル液とを接触させ、カンナビノイド受容体に、標識標準物質及び検出対象カンナビノイド類を競合的に結合させた後、未反応の標識標準物質を除去する競合反応工程；
（Ｅ）カンナビノイド受容体に結合した標識標準物質量を定量する測定工程；
［２］カンナビノイド受容体が、カンナビノイドＣＢ１受容体及び／又はカンナビノイドＣＢ２受容体であることを特徴とする上記［１］記載の検出方法。
［３］カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質が、カンナビノイド受容体に親和性を有するアゴニストであることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の検出方法。
［４］カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質が、リールアミンであることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の検出方法。
［５］標識化物質が、ペルオキシダーゼであることを特徴とする上記［１］～［４］のいずれか記載の検出方法。
［６］被検試料が、危険ドラッグであることを特徴とする上記［１］～［５］のいずれか記載の検出方法。
［７］界面活性剤を含む抽出溶媒を用いてサンプル液を調製することを特徴とする上記［１］～［６］のいずれか記載の検出方法。
［８］界面活性剤を含む抽出溶媒が、さらに緩衝液を含む抽出溶媒であることを特徴とする上記［７］記載の検出方法。
［９］界面活性剤が、ＳＤＳであることを特徴とする上記［７］又は［８］記載の検出方法。
［１０］ＳＤＳの濃度が、０．０１～１０％であることを特徴とする上記［９］記載の検出方法。
［１１］界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ２０であることを特徴とする上記［７］又は［８］記載の検出方法。
［１２］Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が、０．０１～１０％であることを特徴とする上記［１１］記載の検出方法。
［１３］有機溶媒で抽出後に、さらに陰イオン性界面活性剤を含む緩衝液で希釈してサンプル液を調製することを特徴とする上記［１］～［６］のいずれか記載の検出方法。
［１４］陰イオン性界面活性剤を含む緩衝液で希釈後の有機溶媒の濃度が５～５０％であるサンプル液を調製することを特徴とする上記［１３］記載の検出方法。
［１５］有機溶媒が、ＤＭＳＯ、メタノール、エタノールから選ばれることを特徴とする上記［１３］又は［１４］記載の検出方法。
［１６］有機溶媒が、ＤＭＳＯであることを特徴とする上記［１５］記載の検出方法。
［１７］陰イオン性界面活性剤がＳＤＳであることを特徴とする上記［１３］～［１６］のいずれか記載の検出方法。
［１８］ＳＤＳの濃度が、０．０１～１０％であることを特徴とする上記［１７］記載の方法。
［１９］カンナビノイド受容体又はカンナビノイド受容体発現細胞若しくはそのカンナビノイド受容体発現膜画分を固相化した固相受容体と、カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質を標識化物質で標識した標識標準物質と、被検試料から検出対象カンナビノイド類を抽出するための界面活性剤とを備えたことを特徴とするカンナビノイド類の検出キット。
［２０］カンナビノイド受容体又はカンナビノイド受容体発現細胞若しくはそのカンナビノイド受容体発現膜画分を固相化した固相受容体と、カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質を標識化物質で標識した標識標準物質と、被検試料から検出対象カンナビノイド類を抽出するための有機溶媒と、抽出されたカンナビノイド類を希釈するための陰イオン性界面活性剤とを備えたことを特徴とするカンナビノイド類の検出キット。
　本発明によると、危険ドラッグに配合されている、生理的に又は精神的に悪影響を与える可能性があるカンナビノイド類を、分子構造の多少の相違に関わらず広範囲に検出することができる
逆シグモイド型の標準曲線を表すグラフである。 抽出溶媒として各濃度のＳＤＳを用いて抽出したカンナビノイド類を含むサンプル液と、標識標準物質とをカンナビノイド受容体に競合的に結合させた後、カンナビノイド受容体に結合した標識標準物質量の吸光度を示すグラフである。（ａ）は０．２％のＳＤＳを含むＰＢＳ、（ｂ）は０．５％のＳＤＳを含むＰＢＳ、（ｃ）は、1．０％のＳＤＳを含むＰＢＳを用いた場合のグラフである。 抽出溶媒として各濃度のＴｗｅｅｎ２０を用いて抽出したカンナビノイド類を含むサンプル液と、標識標準物質とをカンナビノイド受容体に競合的に結合させた後、カンナビノイド受容体に結合した標識標準物質量の吸光度を示すグラフである。（ａ）は０．２％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、（ｂ）は１．０％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、（ｃ）は、５．０％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、（ｄ）は、１０．０％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを用いた場合のグラフである。 抽出溶媒として各濃度のエタノールを用いて抽出し、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈したカンナビノイド類を含むサンプル液と、標識標準物質とをカンナビノイド受容体に競合的に結合させた後、カンナビノイド受容体に結合した標識標準物質量の吸光度を示すグラフである。（ａ）はエタノール抽出を行っていないサンプル液、（ｂ）は１０．０％のエタノールに希釈したサンプル液、（ｃ）は２０．０％のエタノールに希釈したサンプル液、（ｄ）は４０．０％のエタノールに希釈したサンプル液を用いた場合のグラフである。 ＤＭＳＯで抽出後、各濃度のＳＤＳで希釈した、０、１０．０、２０．０、又は４０．０％のＤＭＳＯ溶液中のカンナビノイド類を含むサンプル液と、標識標準物質とをカンナビノイド受容体に競合的に結合させた後、カンナビノイド受容体に結合した標識標準物質量の吸光度を示すグラフである。（ａ）は０．２％ＳＤＳで希釈したサンプル液、（ｂ）は０．５％ＳＤＳで希釈したサンプル液、（ｃ）は１０．０％ＳＤＳで希釈したサンプル液のグラフである。 メタノールで抽出後、０．５％ＳＤＳで希釈した、０、１０．０、２０．０、又は４０．０％のメタノール溶液中のカンナビノイド類を含むサンプル液と、標識標準物質とをカンナビノイド受容体に競合的に結合させた後、カンナビノイド受容体に結合した標識標準物質量の吸光度を示すグラフである。 エタノールで抽出後、１．０％ＳＤＳで希釈した、０、１０．０、２０．０、又は４０．０％のエタノール中のカンナビノイド類を含むサンプル液と、標識標準物質とをカンナビノイド受容体に競合的に結合させた後、カンナビノイド受容体に結合した標識標準物質量の吸光度を示すグラフである。 ＤＭＳＯで抽出後、各濃度のＴｗｅｅｎ２０で希釈した０、１０．０、２０．０、又は４０．０％のＤＭＳＯの溶液中のカンナビノイド類を含むサンプル液と、標識標準物質とをカンナビノイド受容体に競合的に結合させた後、カンナビノイド受容体に結合した標識標準物質量の吸光度を示すグラフである。（ａ）は０．２％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈したサンプル液、（ｂ）は０．５％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈したサンプル液、（ｃ）は１．０％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈したサンプル液のグラフである。
　本発明の被検試料中のカンナビノイド類の検出方法としては、（Ａ）カンナビノイド受容体発現細胞若しくはそのカンナビノイド受容体発現膜画分、又はカンナビノイド受容体を、固相化した固相受容体を調製する工程、（Ｂ）カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質を標識化物質で標識して、標識標準物質を含む標識競合液を調製する工程、（Ｃ）被検試料から検出対象カンナビノイド類を抽出してサンプル液を調製する工程、（Ｄ）上記（Ａ）工程で調製した固相受容体に、前記標識競合液とサンプル液とを接触させ、カンナビノイド受容体に、標識標準物質及び検出対象カンナビノイド類を競合的に結合させた後、未反応の標識標準物質を除去する競合反応工程、（Ｅ）カンナビノイド受容体に結合した標識標準物質量を定量する測定工程を備える方法であれば特に制限されず、本発明における被検試料としては、全血、血清、血漿等の血液、リンパ液、髄液等の狭義の体液や、尿、唾液、汗、精液等の体外に分泌・排泄される広義の体液や、吐瀉物、胃内容物、肺洗浄液など、ヒト等の哺乳類から得ることができる試料の他、いわゆる脱法ハーブ等の危険ドラッグを挙げることができる。
　本発明におけるカンナビノイド類としては、ナフトイルインドール骨格を有するカンナビノイド、フェニルアセチルインドール骨格を有するカンナビノイド、ベンゾイルインドール骨格を有するカンナビノイド、シクロヘキシルフェノール骨格を有するカンナビノイド、ジテルペン骨格を有するカンナビノイド、天然カンナビノイドであるΔ９－ＴＨＣと同様のジベンゾピラン環又はそれに類似する構造を有するカンナビノイド等を挙げることができる他、これらの化合物の類縁体や改変体であって、カンナビノイド受容体に結合する化合物を含めることができ、とりわけ、多幸感の惹起、精神依存性、カタレプシー様無動状態、体温下降を誘発する等の強い精神作用を起こす効果を奏する化合物について、構造決定が本発明による検出を機になされることとなる未報告の化合物であったとしても、カンナビノイド類として好適に含めることができる。また、体内に入って代謝された代謝物がカンナビノイド受容体と結合することができることになる代謝前化合物も、カンナビノイドの前駆体として、カンナビノイド類に便宜上含めることができる。
　上記ナフトイルインドール骨格を有するカンナビノイドとしては、ＣＢ１受容体及び／又はＣＢ２受容体のアゴニストである、ＪＷＨ－０１５、ＪＷＨ－０１８、ＪＷＨ－０７３、ＪＷＨ－０８１、ＪＷＨ－２００、ＪＷＨ－２５０、ＪＷＨ－２５１、ＪＷＨ－３９８等のJ.W.Huffmanにより合成されたＪＷＨシリーズの化合物や、ＣＢ１受容体及びＣＢ２受容体の強力なアゴニストであるＡＭ－２２０１を挙げることができる。上記ベンゾイルインドール骨格を有するカンナビノイドとしては、ＣＢ２受容体の強力なアンタゴニスト／インバースアゴニストであるＡＭ６３０等を挙げることができる。上記シクロヘキシルフェノール骨格を有するカンナビノイドとしては、ＣＢ１受容体及びＣＢ２受容体に作用するＣＰ５５９４０、ＣＢ１受容体に作用するＣＰ４７４９７等を挙げることができる。上記ジテルペン骨格を有するカンナビノイドとしては、ＣＢ１受容体及びＣＢ２受容体に作用する強力なアゴニストであるリールアミン（1,4a-Dimethyl-7-isopropyl-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-1-phenanthrenemethylamine）を挙げることができる。上記ジベンゾピラン環に類似する構造を有するカンナビノイドとしては、Δ９－ＴＨＣや、ＣＢ１受容体及びＣＢ２受容体に対して非常に高い親和性を有し、強力なアゴニストであるＨＵ－２１０を例示することができる。
　上記アゴニスト（作用薬）、インバースアゴニスト（逆作用薬）、アンタゴニスト（拮抗薬）は、当該技術分野で通常使用されている各用語の意味を有する。例えば、アゴニストは、受容体を活性化し、生理作用を惹起させる化合物として、インバースアゴニストは、受容体を不活性な高次構造に安定化させる化合物として、アンタゴニストは、アゴニストの作用を阻害する化合物として説明される。したがって、受容体の作用が、細胞の機能を低下させる作用である場合には、アンタゴニストがかかる作用を阻害することにより、細胞機能が高まることがある。
　上記工程（Ａ）において調製される固相受容体としては、（精製された）カンナビノイド受容体を、又はカンナビノイド受容体発現細胞若しくはそのカンナビノイド受容体発現膜画分を、固相化して調製される固相体を挙げることができる。
　上記カンナビノイド受容体としては、カンナビノイド類に対する結合能を有し、７回膜貫通、Ｇタンパク質（Ｇｉ／Ｇｏ）共役型の受容体であって、４７２個のアミノ酸配列から構成されるヒトＣＢ１受容体、及び３６０個のアミノ酸配列から構成されるヒトＣＢ２受容体等の天然型受容体（例えば、生化学第８３巻第６号、５２５－５３５，２０１１参照）や、かかる天然型受容体タンパク質のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が置換、付加及び／若しくは欠失し、及び／又は、糖鎖が置換、付加及び／若しくは欠失しているが、カンナビノイド類に対する結合能を有するＣＢ１受容体及び／又はＣＢ２受容体の改変体や、これらの受容体や改変体のタンパク質の部分断片やこれらの受容体のタンパク質と別のタンパク質との融合タンパク質であって、カンナビノイド類に結合できるタンパク質からなる受容体類縁体を例示することができる。また、市販の精製受容体を用いることもできるが、精製方法によっては受容体の活性が低下するおそれがあるため、カンナビノイド受容体発現細胞や、カンナビノイド受容体発現膜画分等の受容体発現細胞画分を使用することが望ましい。本発明の検出方法においては、ＣＢ１受容体、ＣＢ２受容体のいずれか一方の受容体を用いることができるが、ＣＢ１受容体、ＣＢ２受容体のいずれか一方にのみ結合するカンナビノイド類をもれなく検出できる点で、ＣＢ１受容体及びＣＢ２受容体を用いることが好ましい。
　上記カンナビノイド受容体発現細胞としては、上記カンナビノイド受容体を組換えタンパク質として発現した細胞を好適に挙げることができる。かかる組換え受容体タンパク質発現細胞の調製方法としては、公知の遺伝子組換え技術による方法を挙げることができるが、上記カンナビノイド受容体を構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを単離又は調製し、該ＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込み、該カンナビノイド受容体のタンパク質をコードするＤＮＡが組み込まれたベクターにて形質転換した細胞を作製する方法を例示することができる。
　上記カンナビノイド受容体発現膜画分としては、カンナビノイド受容体を発現している細胞の細胞膜であれば特に制限されず、かかる細胞膜としてはシナプス後部ニューロンの細胞等の細胞膜や、上記カンナビノイド受容体発現細胞から調製されたカンナビノイド受容体発現膜画分を挙げることができる。
　かかるカンナビノイド受容体発現膜画分をカンナビノイド受容体発現細胞から調製する方法としては、カンナビノイド受容体発現細胞が増殖した培地を吸引除去し、緩衝液で細胞表面を洗浄した後、細胞を培地から剥離し、培地から剥離した細胞に再度培地を添加した後遠心分離を行い、上清を吸引後、緩衝液で懸濁し、遠心分離により沈殿した膜画分を緩衝液で再度懸濁する方法を例示することができる。また、超音波による破砕、摩擦による物理的な破砕、超遠心分離等により膜画分を分離することにより膜画分に精製することができる。これらの処理後、さらに、氷冷中において、及び／又はプロテアーゼインヒビターを添加したうえで、超遠心分離により膜画分を分離する処理を行うこともできる。なお、細胞表面を洗浄し、また膜画分を懸濁する緩衝液としては、ディッシュへの結合が緩くなり、細胞剥離が容易になる点で、カルシウム・マグネシウム不含のＰＢＳ（－）を好適に挙げることができる。
　上記固相受容体を調製する方法としては、カンナビノイド受容体の懸濁液を固相に添加するか、あるいは、カンナビノイド受容体発現細胞若しくはそのカンナビノイド受容体発現膜画分を細胞数換算で１．０×１０３／ｍＬ～１．０×１０９／ｍＬ、好ましくは１．０×１０４／ｍＬ～１．０×１０８／ｍＬ、より好ましくは１．０×１０５／ｍＬ～１．０×１０７／ｍＬ相当となるようにＰＢＳで調製し、かかる懸濁液を固相に添加して、５分～１０時間、好ましくは３０分～５時間、より好ましくは１時間～３時間静置し、Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ(ＰＢＳＴ)を用いて洗浄後、ウシ血清アルブミン(Bovine serum albumin：ＢＳＡ)含有ＰＢＳを添加し、ブロッキングを行う方法を例示することができる。
　上記固相受容体の調製のために用いられる固相としては、細胞や細胞画分の付着性に優れた固体表面を形成しうる材料からなるプレート、チップ、基板、試験管、多孔質担体等を挙げることができ、具体的には、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜等を挙げることができる。
　前記工程（Ｂ）の標識競合液を調製する工程における、カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質としては、カンナビノイド受容体に高い親和性を有するアゴニストや、カンナビノイド受容体に高い親和性を有するインバースアゴニストやカンナビノイド受容体に高い親和性を有するアンタゴニストを挙げることができ、カンナビノイド受容体に高い親和性を有するアゴニストが好ましく、例えば、ＣＰ－５５９４０、リールアミン、オレアミドを挙げることができる。
　上記標準物質を標識化物質で標識して、標識標準物質を調製する方法としては、上記標準物質を、酵素、蛍光、ビオチン、放射性同位元素、金コロイド等の標識化物質で、公知技術により酵素標識、蛍光標識、ビオチン標識、放射性同位元素標識、金コロイド標識等の標識をする方法を挙げることができる。また、市販の標識キットなどを用いることもでき、具体的には、市販のペルオキシダーゼの標識キットを用いて標準物質をペルオキシダーゼ標識する方法を好適に挙げることができる。これら標識標準物質を、適宜界面活性剤を含む緩衝液等に懸濁させることにより標識競合液を調製することができる。
　前記工程（Ｃ）のサンプル液を調製する工程において、上記被検試料から検出対象カンナビノイド類を抽出してサンプル液を調製するための抽出溶媒としては、界面活性剤（方法１）や有機溶媒（方法２）を挙げることができる。
　上記方法１において界面活性剤を抽出溶媒として用いる場合には、さらに緩衝液を含む抽出溶媒とすることがより好ましい。例えば、血液が被検試料である場合、界面活性剤と緩衝液を含む抽出溶媒の使用量（容量）は被検試料に対して２～２０００倍用いることができ、１０～１０００倍が好ましい。
　上記方法１における界面活性剤としては、タンパク質である受容体の不可逆的変性を防ぐことができる非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤を挙げることができるが、非イオン性界面活性剤や陰イオン性界面活性剤が好ましく、これらは１種又は２種以上用いることができる。上記非イオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン(２０)ソルビタンモノラウレート）を挙げることができ、陰イオン性界面活性剤としては、ＳＤＳを挙げることができる。また方法１におけるＳＤＳの濃度としては、０．０１～１０％を挙げることができ、０．１～５％が好ましく、０．５～２％がより好ましく、０．８～１．２％がさらに好ましい。また、上記Ｔｗｅｅｎ２０の濃度としては、０．０１～１０％を挙げることができ、０．１～５％が好ましく、１．０～１．２％がより好ましい。なお、本発明において濃度（％）は、ｗ／ｖ％を表す。
　上記方法１における緩衝液としては、本発明におけるカンナビノイド受容体とカンナビノイド類との相互作用を妨げない限り特に制限されず、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline：リン酸緩衝生理食塩水）や、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等を例示することができる。
　上記方法２において有機溶媒を抽出溶媒として用いる場合には、血液が被検試料である場合、上記有機溶媒の使用量は被検試料に対して２～２０００倍用いることができ、１０～１０００倍が好ましい。また、陰イオン性界面活性剤を含む緩衝液の使用量は、有機溶媒により抽出された抽出試料に対し２～２０００倍とすることができ、１０～１０００倍がより好ましい。
　上記方法２における有機溶媒としては、上記カンナビノイド類を抽出できる有機溶媒であれば特に限定されず、メタノール、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ＤＭＳＯ、アセトニトリル等の非プロトン性極性溶媒などを例示することができる。
　上記方法２において、陰イオン性界面活性剤を含む緩衝液により希釈後のサンプル液における有機溶媒の濃度としては、例えば、５～７５％が好ましく、１０～６０％がより好ましく、２０～５０％がさらに好ましく、３５～４５％が特に好ましい。
　より詳細には、上記有機溶媒がＤＭＳＯの場合、陰イオン性界面活性剤で希釈後のサンプル液におけるＤＭＳＯの濃度としては、５～７５％が好ましく、２０～６０％がより好ましく、３０～５０％がさらに好ましく、３５～４５％が特に好ましい。
　上記有機溶媒がメタノールの場合、陰イオン性界面活性剤で希釈後のサンプル液におけるメタノールの濃度としては、５～７５％が好ましく、２０～６０％がより好ましく、３０～５０％がさらに好ましく、３５～４５％が特に好ましい。
　上記有機溶媒がエタノールの場合、陰イオン性界面活性剤で希釈後のサンプル液におけるエタノールの濃度としては、２～５０％が好ましく、５～１５％がより好ましく、８～１２％がさらに好ましい。
　上記方法２における陰イオン性界面活性剤としては、高級アルコール硫酸エステル塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルリン酸エステル塩などを挙げることができ、具体的にはＳＤＳを好適に例示することができる。
　上記陰イオン界面活性剤の濃度としては、０．１～１．５％、好ましくは０．１５～１．１％を例示することができる。
　上記方法２における緩衝液としては、本発明におけるカンナビノイド受容体とカンナビノイド類との相互作用を妨げない限り特に制限されず、ＰＢＳや、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等を例示することができる。
　前記競合反応工程（Ｄ）における、前記工程（Ａ）で調製した固相受容体に、前記標識競合液とサンプル液とを接触させ、カンナビノイド受容体に、標識標準物質及びカンナビノイド類を競合的に結合させる方法としては、前記ブロッキング後の固相受容体を、ＰＢＳＴを用いて洗浄し、該固相受容体に、上記標識競合液と上記サンプル液とを添加・混合し、５分～１０時間、好ましくは３０分～４時間、より好ましくは１時間～２時間静置することにより、固相受容体に固相化されているカンナビノイド受容体に、標識競合液中の標識標準物質、及び、サンプル液中の検出対象カンナビノイド類を競合的に結合させる方法を挙げることができる。
　前記競合反応工程（Ｄ）における、未反応の標識標準物質を除去する方法としては、標識標準物質及び検出対象カンナビノイド類を競合的に結合させた後の固相受容体を、上記ＰＢＳＴを用いて洗浄し、固相受容体内のＰＢＳＴ溶液を取り除く方法を挙げることができる。
　前記工程（Ｅ）の測定工程としては、カンナビノイド受容体に結合した標識標準物質量を定量する方法であれば特に制限されず、上記標識を発色剤等により検出可能とする処理をした後に、標準曲線を用いて、被検試料中のカンナビノイド類の含有量を決定する方法を挙げることができる。具体的には、被検試料中の検出対象カンナビノイド類が少ないときは、標識標準物質が受容体により多く結合するため標識による発色等が強くなり、被検試料中の検出対象カンナビノイド類が多いときは、標識標準物質が受容体により少なく捕捉されるため標識による発色等が弱くなるため、かかる競合的阻害が成立している場合、標的対象カンナビノイド類が濃度依存的に低くなる吸光度のカーブを示す。したがって、カンナビノイド類の濃度が既知の試料溶液を複数調製して、吸光度と濃度との関係が明らかにした標準曲線をあらかじめ作成し、被検試料を同様に処理したときに得られた吸光度から被検試料中のカンナビノイド類の濃度を求める。
　上記標準曲線の理想形としては、逆シグモイド型の標準曲線（例えば図１参照）を例示することができ、かかる標準曲線が作成できる条件を反応性がよいということがある。
　本発明の方法により検出されたカンナビノイド（類）は、さらに固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）等のイムノアッセイ、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等で分画後、最終的にはＮＭＲ、ＬＣ／ＭＳ等により、より詳細な構造を決定することができる。
　本発明のキットとしては、前述した、カンナビノイド受容体又はカンナビノイド受容体発現細胞若しくはそのカンナビノイド受容体発現膜画分を固相化した固相受容体；カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質を標識化物質で標識した標識標準物質；被検試料から検出対象カンナビノイド類を抽出するための界面活性剤；とを備えたカンナビノイド類の検出キットや、カンナビノイド受容体又はカンナビノイド受容体発現細胞若しくはそのカンナビノイド受容体発現膜画分を固相化した固相受容体；カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質を標識化物質で標識した標識標準物質；被検試料から検出対象カンナビノイド類を抽出するための有機溶媒；抽出されたカンナビノイド類を希釈するための陰イオン性界面活性剤；とを備えたキットを挙げることができ、被検試料中のカンナビノイド類の検出方法が説明されている取扱説明書が通常添付されている。
　以下、実施例により、本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［実施例１］
［抽出液の検討１－界面活性剤のＰＢＳ溶液］
（受容体発現細胞の培養）
　ハムＦ－１２（１ｍＭのＬ－グルタミン含有）培地（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、ゼオシン（インビトロジェン社製）、Ｇ－４１８硫酸塩溶液（和光純薬工業株式会社製）を加えた培地を調製培地とした。ＣＢ１受容体発現細胞として、ヒトカンナビノイドＣＢ１レセプターイクオリン細胞株ＥＳ－１１０－Ａ（パーキンエルマー社製）を、上記調製培地が添加されている１００ｍｍスタンダードディッシュに播種し、３７℃にて５％ＣＯ２下で２４～７２時間培養した。
（カンナビノイド受容体発現細胞膜画分懸濁液の調製）
　上記ＣＢ１受容体発現細胞が十分に増殖した１００ｍｍディッシュの培地を吸引除去し、ＰＢＳ（－）（和光純薬工業株式会社製）で細胞表面を洗浄した後、０．０５％トリプシン／０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（和光純薬工業株式会社製）を２ｍＬ添加し、３７℃にて５％ＣＯ２下で静置し、細胞を上記調製培地から剥離した。培地から剥離した細胞に上記調製培地を１０ｍＬ添加後、ピペッティングにより５０ｍＬ遠沈管に回収し、１２５０ｒｐｍにて５分間遠心分離を行った後、上清を吸引し、ＰＢＳ（－）で再度懸濁して遠心分離する操作をさらに２回繰り返した。遠心分離により沈殿した細胞膜画分をＰＢＳ（－）で懸濁し、－４０℃にて凍結保管した。解凍後ＣＢ１受容体細胞膜画分を含む懸濁液は、調整培地により再度培養処理を行い、細胞が生存していない（死細胞画分である）ことを確認した。
（ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートの作製）
　上記ＣＢ１受容体発現細胞膜画分を含む懸濁液を細胞数換算で１．０×１０６／ｍＬとなるようにＰＢＳで調製し、Ｎｕｎｃ９６ウェルマイクロプレート（サーモサイエンティフィック社製）に５０μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃にて２時間静置して、ＣＢ１受容体を含む細胞膜画分をプレートに固相化した。かかるプレートを、上記ＰＢＳＴを用いて洗浄した後、１％のＢＳＡ（シグマ社製）を含むＰＢＳを１５０μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃にて１．０時間静置しブロッキングを行い、ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートを作製した。
（被検試料の調製）
　ＣＢ１受容体及びＣＢ２受容体いずれに対しても完全作用薬として非常に強力な結合能を有することが知られているＣＰ－５５９４０((-)-cis-3-[2-Hydroxy-4-(1,1-dimethylheptyl)-phenyl]-trans-4-(3-hydroxypropyl)cyclohexanol))（シグマ社製）を検出対象のカンナビノイドとして用いた。界面活性剤を含む緩衝液である、０．２、１．０、５．０、又は１０．０％のＴｗｅｅｎ２０（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（－）、カタログ番号０５９１３、日水製薬株式会社製）と、０．２％、０．５％、又は１．０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ：和光純薬工業株式会社製）を含むＰＢＳとを抽出溶媒として用いて、５０００μｇ／ｍＬのＣＰ－５５９４０抽出試料を調製した。
（標識競合液の調製）
　ＣＢ１受容体のアゴニストであるリールアミン（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を標準物質として用いて標識標準物質である標識リールアミンを作製した。ペルオキシダーゼを標識化物質として、標識キットであるＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２（同仁化学研究所製）の説明書にしたがって、リールアミンの濃度が５００μｍｏｌ／Ｌとなるように酵素標識し、ペルオキシダーゼ標識リールアミン溶液を標識競合液として調製した。
（競合式受容体バイオアッセイ）
　上記のブロッキング後のＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートを上記ＰＢＳＴで洗浄し、１５μｍｏｌ／Ｌのペルオキシダーゼ標識リールアミン溶液となるようにＰＢＳＴで調製した標識リールアミンを、２５μＬ／ウェルずつ添加した。さらに、５０００μｇ／ｍＬに調製された上記ＣＰ－５５９４０を、上記各界面活性剤を含むＰＢＳを抽出溶媒として用いて３倍の希釈段によりさらに６μｇ／ｍＬまで調製して、それぞれのサンプル液を２５μＬ／ウェルずつ添加し、プレートミキサーで１分間撹拌しウェル内の溶液をよく混合した。３７℃にて１．５時間静置したのちＰＢＳＴで洗浄し、ウェル内の溶液をよく取り除いた。発色液として、シュアブルーＴＭＢペルオキシダーゼ基質（１－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ＫＰＬ社製）を１００μＬ／ウェルずつ添加し室温にて遮光下により静置した。発色の程度を確認しながら適宜１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を１００μＬ／ウェルずつ添加し発色を停止した。直ちに、マイクロプレートリーダーにより主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍの条件で測定し、吸光度を測定した。０．２％、０．５％、又は１．０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ：和光純薬工業株式会社製）を含むＰＢＳを用いた場合の結果を図２（ａ）（ｂ）及び（ｃ）にそれぞれ示す。また、０．２、１．０、５．０、又は１０．０％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを用いた場合の結果を、図３（ａ）（ｂ）（ｃ）及び（ｄ）にそれぞれ示す。
（結果）
　図２（ａ）（ｂ）及び（ｃ）、ならびに図３（ａ）（ｂ）（ｃ）及び（ｄ）から明らかなとおり、ＣＰ－５５９４０の吸光度は、界面活性剤としてＳＤＳを用いた場合も、Ｔｗｅｅｎ２０を用いた場合も、濃度依存的に小さくなった。これは、標識標準物質であるペルオキシダーゼ標識リールアミンと検出対象カンナビノイドであるＣＰ－５５９４０との競合アッセイが成立しているからであると考えられ、このアッセイシステムを用いることにより危険ドラッグ中の合成カンナビノイド類を検出できると考えられた。また、従来有機溶媒にしか溶解できないと考えられてきた合成カンナビノイド類を、界面活性剤を含む緩衝液で溶解した場合においても、受容体の活性が失われることなく、受容体とカンナビノイド類の結合が測定できることが確認された。また、抗原抗体反応では反応が阻害されてしまうような、例えば、１０％と高濃度の界面活性剤下においても、受容体を使用する安定した測定が可能であることが示された。
　ＳＤＳの濃度については、逆シグモイド型のグラフとなった１．０％が最適であると考えられた。Ｔｗｅｅｎ２０の濃度については、濃度依存的に吸光度が小さくなっている１．０％が最適であると考えられた。
［比較例１］
［抽出液の検討２－エタノールのＰＢＳ溶液］
（ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートの作製）
　上記実施例１と同様の手順で、受容体発現細胞の培養、カンナビノイド受容体発現細胞膜画分懸濁液の調製、ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートの作製を行った。
（被検試料の調製）
　ＣＰ－５５９４０を検出対象のカンナビノイドとして用いた。抽出溶媒としてエタノール（９９．５％、試薬特級、カタログ番号０５７－００４５１、和光純薬工業株式会社製）を用いて、５０ｍｇ／ｍＬのＣＰ－５５９４０抽出試料を調製した。かかるＣＰ－５５９４０抽出試料を０．２％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを希釈液として用いて、エタノール濃度が１０．０、２０．０、又は４０．０％となるように調製し、さらに、エタノールを１０．０％、２０．０％、４０．０％含む０．２％のＴｗｅｅｎ２０を希釈液として用いて、５０００ｐｐｍのＣＰ－５５９４０希釈溶液を調製した。
（標識競合液の調製）
　上記実施例１と同様、ＣＢ１受容体のアゴニストであるリールアミンを標準物質として用いて標識標準物質である標識リールアミンを作製した。ペルオキシダーゼを標識化物質として、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２の説明書にしたがって、リールアミンの濃度が５００μｍｏｌ／Ｌとなるようにリールアミンを酵素標識し、ペルオキシダーゼ標識リールアミン溶液を標識競合液として調製した。
（競合式受容体バイオアッセイ）
　上記のブロッキング後のＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートを上記ＰＢＳＴで洗浄し、１５μｍｏｌ／Ｌのペルオキシダーゼ標識リールアミン溶液となるようにＰＢＳＴで調製した標識リールアミンを、２５μＬ／ウェルずつ添加した。さらに、上記５０００ｐｐｍに調製されたＣＰ－５５９４０（Ｔｗｅｅｎ２０）希釈溶液をそれぞれ２５μＬ／ウェルずつ添加し、プレートミキサーで１分間撹拌しウェル内の溶液をよく混合した。３７℃にて１．５時間静置したのちＰＢＳＴで洗浄し、ウェル内の溶液をよく取り除いた。発色液として、上記シュアブルーＴＭＢペルオキシダーゼ基質（１－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を１００μＬ／ウェルずつ添加し室温にて遮光下により静置した。発色の程度を確認しながら適宜１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を１００μＬ／ウェルずつ添加し発色を停止した。直ちに、マイクロプレートリーダーにより主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍの条件で測定し、吸光度を測定した。０％、１０．０％、２０．０％、又は４０．０％のエタノールをそれぞれ含み、かつ０．２％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを用いた場合の結果を図４（ａ）（ｂ）（ｃ）及び（ｄ）にそれぞれ示す。
（結果）
　図４（ａ）から明らかなとおり、０．２％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを抽出溶媒として用いた場合は、ＣＰ－５５９４０がより多く存在するときに吸光度が小さくなっており、競合反応による阻害が生じて、ペルオキシダーゼ標識リールアミンとＣＰ－５５９４０の競合アッセイが成立していることが示された。しかし、図４（ｂ）（ｃ）及び（ｄ）から明らかなとおり、０．２％のＴｗｅｅｎ２０とエタノールが抽出溶媒に含まれる場合は、ＣＰ－５５９４０がより多く存在するときに吸光度が大きくなっており、これは、エタノールを高濃度に含む条件では受容体が変性することにより、非特異的な反応が生じているためであると考えられた。したがって、合成カンナビノイド類をＴｗｅｅｎ２０とエタノールで抽出する条件で測定することは困難であることが確認された。
［実施例２］
［抽出液の検討３－ＤＭＳＯのＰＢＳ溶液］
（ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートの作製）
　上記実施例１と同様の手順で、受容体発現細胞の培養、カンナビノイド受容体発現細胞膜画分懸濁液の調製、ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートの作製を行った。
（被検試料の調製）
　ＣＰ－５５９４０を検出対象のカンナビノイドとして用いた。抽出溶媒としてＤＭＳＯ（９９．０％、試薬特級、カタログ番号０４３－０７２１６、和光純薬工業株式会社製）を用いて、５０ｍｇ／ｍＬのＣＰ－５５９４０抽出試料を調製した。かかるＣＰ－５５９４０抽出試料を０．２、０．５、又は１．０％のＳＤＳを含むＰＢＳを希釈液として用いて、ＤＭＳＯ濃度が１０．０、２０．０、又は４０．０％となるように調製し、さらに、ＤＭＳＯを１０．０％、２０．０％、又は４０．０％含む０．２、０．５、又は１．０％のＳＤＳを用いて、５０００ｐｐｍのＣＰ－５５９４０希釈溶液を調製した。
（標識競合液の調製）
　標識競合液の調製は上記実施例１と同様の手順で行った。
（競合式受容体バイオアッセイ）
　上記のブロッキング後のＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートを上記ＰＢＳＴで洗浄し、１５μｍｏｌ／Ｌのペルオキシダーゼ標識リールアミン溶液となるようにＰＢＳＴで調製した標識リールアミンを、２５μＬ／ウェルずつ添加した。さらに、上記５０００ｐｐｍに調製されたＣＰ－５５９４０（ＳＤＳ）希釈溶液をそれぞれ２５μＬ／ウェルずつ添加し、プレートミキサーで１分間撹拌しウェル内の溶液をよく混合した。その後実施例１と同様の手順で吸光度を測定した。０．２％、０．５％、又は１．０％のＳＤＳを含むＰＢＳを希釈液として用いた場合の結果を図５（ａ）（ｂ）及び（ｃ）にそれぞれ示す。
　（結果）
　図５（ａ）（ｂ）及び（ｃ）から明らかなとおり、抽出溶媒としてＤＭＳＯを用いた後、ＳＤＳを含むＰＢＳを用いて希釈した場合、いずれの濃度においても、ＣＰ－５５９４０の吸光度は、ＤＭＳＯを用いない場合（ＤＭＳＯ０％）よりも小さくなった。各グラフにおいて、ブランク（ＰＢＳ溶液）の値を１００とすると、０．２％ＳＤＳを含むＰＢＳで希釈した場合には、ＤＭＳＯが０％のとき８０．４を示した。ＤＭＳＯが１０．０％のとき７１．４を示し、０％の値の８８．８１％であった。ＤＭＳＯが２０．０％のとき６６．９を示し、０％の値の８３．２１％であった。ＤＭＳＯが４０．０％のとき５２．３を示し、０％の値の６５．０５％であった。０．５％ＳＤＳを含むＰＢＳで希釈した場合には、ＤＭＳＯが０％のとき７４．２を示した。ＤＭＳＯが１０．０％のとき６６．６を示し、０％の値の８９．７５％であった。ＤＭＳＯが２０．０％のとき５６．８を示し、０％の値の７６．５５％であった。ＤＭＳＯが４０．０％のとき５０．１を示し、０％の値の６７．５２％であった。１％ＳＤＳを含むＰＢＳで希釈した場合には、ＤＭＳＯが０％のとき５３．９を示した。ＤＭＳＯが１０．０％のとき５１．６を示し、０％の値の９５．７３％であった。ＤＭＳＯが２０．０％のとき４８．６を示し、０％の値の９０．１７％であった。ＤＭＳＯが４０．０％のとき５２．０を示し、０％の値の９６．４７％であった。
　以上のとおり、合成カンナビノイド類を、ＤＭＳＯを用いて抽出し、さらにＳＤＳを含むＰＢＳを用いて希釈してＣＰ－５５９４０希釈溶液を調製した場合、ＳＤＳを含むＰＢＳのみで調製した場合よりも反応性が向上した。具体的には０．２％ＳＤＳを含むＰＢＳを用いて４０％ＤＭＳＯに希釈した場合、０．５％ＳＤＳを含むＰＢＳを用いて４０％ＤＭＳＯに希釈した場合、１．０％ＳＤＳを含むＰＢＳを用いて２０．０％ＤＭＳＯに希釈した場合のＣＰ－５５９４０希釈溶液が特に反応性がよいことが確認された。
［実施例３］
［抽出液の検討４－メタノールのＰＢＳ溶液］
（ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートの作製）
　上記実施例１と同様の手順で、受容体発現細胞の培養、カンナビノイド受容体発現細胞膜画分懸濁液の調製、ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートの作製を行った。
（被検試料の調製）
　ＣＰ－５５９４０を検出対象のカンナビノイドとして用いた。抽出溶媒としてメタノール（９９．８％、試薬特級、カタログ番号１３７－０１８２３、和光純薬工業株式会社製）を用いて、５０ｍｇ／ｍＬのＣＰ－５５９４０抽出試料を調製した。かかるＣＰ－５５９４０抽出試料を０．５％のＳＤＳを含むＰＢＳを希釈液として用いて、メタノール濃度が１０．０、２０．０、又は４０．０％となるように調製し、さらに、メタノールを１０．０％、２０．０％、又は４０．０％含む０．５％のＳＤＳを用いて、５０００ｐｐｍのＣＰ－５５９４０希釈溶液を調製した。
（標識競合液の調製）
　標識競合液の調製は上記実施例１と同様の手順で行った。
（競合式受容体バイオアッセイ）
　上記のブロッキング後のＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートを上記ＰＢＳＴで洗浄し、１５μｍｏｌ／Ｌのペルオキシダーゼ標識リールアミン溶液となるようにＰＢＳＴで調製した標識リールアミンを、２５μＬ／ウェルずつ添加した。さらに、上記５０００ｐｐｍに調製されたＣＰ－５５９４０（メタノール）希釈溶液をそれぞれ２５μＬ／ウェルずつ添加し、プレートミキサーで１分間撹拌しウェル内の溶液をよく混合した。その後実施例１と同様の手順で吸光度を測定した。結果を図６に示す。
　（結果）
　図６から明らかなとおり、抽出溶媒としてメタノールを用いた後、０．５％のＳＤＳを含むＰＢＳを用いて希釈した場合、吸光度は、メタノールを用いない場合（メタノール０％）よりも小さくなった。具体的には、ブランク（ＰＢＳ溶液）の値を１００とすると、０．５％ＳＤＳを含むＰＢＳで希釈した場合には、メタノールが０％のとき７４．２を示した。メタノールが１０．０％のとき６８．６を示し、０％の値の９２．４５％であった。メタノールが２０．０％のとき６５．５を示し、０％の値の８８．２７％であった。メタノールが４０．０％のとき４８．１を示し、０％の値の６４．８２％であった。
　以上のとおり、合成カンナビノイド類を、メタノールを用いて抽出し、さらにＳＤＳを含むＰＢＳを用いて希釈してＣＰ－５５９４０希釈溶液を調製した場合、ＳＤＳを含むＰＢＳのみで調製した場合よりも反応性が向上した。具体的には、０．５％ＳＤＳを含むＰＢＳを用いて４０％メタノールに希釈した場合のＣＰ－５５９４０希釈溶液が最も反応性が高かった。
［実施例４］
［抽出液の検討５－エタノールのＰＢＳ溶液］
（ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートの作製）
　上記実施例１と同様の手順で、受容体発現細胞の培養、カンナビノイド受容体発現細胞膜画分懸濁液の調製、ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートの作製を行った。
（被検試料の調製）
　ＣＰ－５５９４０を検出対象のカンナビノイドとして用いた。抽出溶媒としてエタノールを用いて、５０ｍｇ／ｍＬのＣＰ－５５９４０抽出試料を調製した。かかるＣＰ－５５９４０抽出試料を０．２、０．５、又は１．０％のＳＤＳを含むＰＢＳを希釈液として用いて、エタノール濃度が１０．０、２０．０、又は４０．０％となるように調製した。さらに、エタノールを１０．０％、２０．０％、４０．０％含む０．２、０．５、又は１．０％のＳＤＳを希釈液として用いて、２５００ｐｐｍのＣＰ－５５９４０希釈溶液を調製した。
（標識競合液の調製）
　標識競合液の調製は上記実施例１と同様の手順で行った。
（競合式受容体バイオアッセイ）
　上記のブロッキング後のＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートを上記ＰＢＳＴで洗浄し、１５μｍｏｌ／Ｌのペルオキシダーゼ標識リールアミン溶液となるようにＰＢＳＴで調製した標識リールアミンを、２５μＬ／ウェルずつ添加した。さらに、上記２５００ｐｐｍに調製されたＣＰ－５５９４０希釈溶液をそれぞれ２５μＬ／ウェルずつ添加し、プレートミキサーで１分間撹拌しウェル内の溶液をよく混合した。その後実施例１と同様の手順で吸光度を測定した。結果を図７に示す。
（結果）
　図７から明らかなとおり、抽出溶媒としてエタノールを用いた後、１．０％ＳＤＳを含むＰＢＳを用いて希釈した場合、吸光度は、エタノールを用いない場合（エタノール０％）よりも小さくなった。具体的には、ブランク（ＰＢＳ溶液）の値を１００とすると、１．０％ＳＤＳを含むＰＢＳで希釈した場合には、エタノールが０％のとき６７．６を示した。エタノールが１０．０％のとき６０．７を示し、０％の値の８９．８０％であった。エタノールが２０．０％のとき６３．８を示し、０％の値の９４．３８％であった。エタノールが４０．０％のとき６３．１を示し、０％の値の９３．３４％であった。
　以上のとおり、合成カンナビノイド類を、エタノールを用いて抽出し、さらにＳＤＳを含むＰＢＳを用いて希釈してＣＰ－５５９４０希釈溶液を調製した場合、ＳＤＳを含むＰＢＳのみで調製した場合よりも反応性が向上した。具体的には、１．０％ＳＤＳを含むＰＢＳを用いて１０％エタノールに希釈した場合が最も反応性が高かった。
［比較例２］
［希釈液の検討－Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液］
（ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートの作製）
　上記実施例１と同様の手順で、受容体発現細胞の培養、カンナビノイド受容体発現細胞膜画分懸濁液の調製、ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートの作製を行った。
（被検試料の調製）
　ＣＰ－５５９４０を検出対象のカンナビノイドとして用いた。０、１０．０、２０．０、又は４０．０％のＤＭＳＯを抽出溶媒として用いてＣＰ－５５９４０が５０ｍｇ／ｍＬとなるように調製してＣＰ－５５９４０抽出試料とした。かかるＣＰ－５５９４０抽出試料それぞれについて０．２、０．５、又は１．０％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを希釈液として用いて２５００ｐｐｍのＣＰ－５５９４０希釈溶液を調製した。
（標識競合液の調製）
　標識競合液の調製は上記実施例１と同様の手順で行った。
（競合式受容体バイオアッセイ）
　上記のブロッキング後のＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートを上記ＰＢＳＴで洗浄し、１５μｍｏｌ／Ｌのペルオキシダーゼ標識リールアミン溶液となるようにＰＢＳＴで調製した標識リールアミンを、２５μＬ／ウェルずつ添加した。さらに、上記２５００ｐｐｍに調製されたＣＰ－５５９４０（Ｔｗｅｅｎ２０）希釈溶液をそれぞれ２５μＬ／ウェルずつ添加し、プレートミキサーで１分間撹拌しウェル内の溶液をよく混合した。その後実施例１と同様の手順で吸光度を測定した。０．２％、０．５％、又は１．０％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを希釈液として用いた場合の結果を図８（ａ）（ｂ）及び（ｃ）にそれぞれ示す。
（結果）
　図８（ａ）（ｂ）及び（ｃ）から明らかなとおり、抽出溶媒としてＤＭＳＯを用いた後、Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを用いて希釈した場合、いずれの濃度においても、ＣＰ－５５９４０の吸光度は、ＤＭＳＯを用いない場合よりも大きくなった。したがって、非イオン性界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０は、本発明における有機溶媒による抽出後の希釈液としては好ましくないことが確認された。なお、ブランク（ＰＢＳ）の値（１００）に対して０．２～１．０％のＴｗｅｅｎ２０溶液は、４９．９～５８.２の値を示したので、測定自体は適切に行われている。
　本発明は、危険ドラッグ中の有害成分であるカンナビノイド類を検出することができる。

Claims (20)

  1. 以下の（Ａ）～（Ｅ）の工程を備えることを特徴とする被検試料中のカンナビノイド類の検出方法。
    （Ａ）カンナビノイド受容体、又はカンナビノイド受容体発現細胞若しくはそのカンナビノイド受容体発現膜画分を、固相化した固相受容体を調製する工程；
    （Ｂ）カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質を標識化物質で標識して、標識標準物質を含む標識競合液を調製する工程；
    （Ｃ）被検試料から検出対象カンナビノイド類を抽出してサンプル液を調製する工程；
    （Ｄ）工程（Ａ）で調製した固相受容体に、前記標識競合液とサンプル液とを接触させ、カンナビノイド受容体に、標識標準物質及び検出対象カンナビノイド類を競合的に結合させた後、未反応の標識標準物質を除去する競合反応工程；
    （Ｅ）カンナビノイド受容体に結合した標識標準物質量を定量する測定工程；
  2. カンナビノイド受容体が、カンナビノイドＣＢ１受容体及び／又はカンナビノイドＣＢ２受容体であることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
  3. カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質が、カンナビノイド受容体に親和性を有するアゴニストであることを特徴とする請求項１又は２記載の検出方法。
  4. カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質が、リールアミンであることを特徴とする請求項１又は２記載の検出方法。
  5. 標識化物質が、ペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項１～４のいずれか記載の検出方法。
  6. 被検試料が、危険ドラッグであることを特徴とする請求項１～５のいずれか記載の検出方法。
  7. 界面活性剤を含む抽出溶媒を用いてサンプル液を調製することを特徴とする請求項１～６のいずれか記載の検出方法。
  8. 界面活性剤を含む抽出溶媒が、さらに緩衝液を含む抽出溶媒であることを特徴とする請求項７記載の検出方法。
  9. 界面活性剤が、ＳＤＳであることを特徴とする請求項７又は８記載の検出方法。
  10. ＳＤＳの濃度が、０．０１～１０％であることを特徴とする請求項９記載の検出方法。
  11. 界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ２０であることを特徴とする請求項７又は８記載の検出方法。
  12. Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が、０．０１～１０％であることを特徴とする請求項１１記載の検出方法。
  13. 有機溶媒で抽出後に、さらに陰イオン性界面活性剤を含む緩衝液で希釈してサンプル液を調製することを特徴とする請求項１～６のいずれか記載の検出方法。
  14. 陰イオン性界面活性剤を含む緩衝液で希釈後の有機溶媒の濃度が５～５０％であるサンプル液を調製することを特徴とする請求項１３記載の検出方法。
  15. 有機溶媒が、ＤＭＳＯ、メタノール、エタノールから選ばれることを特徴とする請求項１３又は１４記載の検出方法。
  16. 有機溶媒が、ＤＭＳＯであることを特徴とする請求項１５記載の検出方法。
  17. 陰イオン性界面活性剤がＳＤＳであることを特徴とする請求項１３～１６のいずれか記載の検出方法。
  18. ＳＤＳの濃度が、０．０１～１０％であることを特徴とする請求項１７記載の方法。
  19. カンナビノイド受容体又はカンナビノイド受容体発現細胞若しくはそのカンナビノイド受容体発現膜画分を固相化した固相受容体と、カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質を標識化物質で標識した標識標準物質と、被検試料から検出対象カンナビノイド類を抽出するための界面活性剤とを備えたことを特徴とするカンナビノイド類の検出キット。
  20. カンナビノイド受容体又はカンナビノイド受容体発現細胞若しくはそのカンナビノイド受容体発現膜画分を固相化した固相受容体と、カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質を標識化物質で標識した標識標準物質と、被検試料から検出対象カンナビノイド類を抽出するための有機溶媒と、抽出されたカンナビノイド類を希釈するための陰イオン性界面活性剤とを備えたことを特徴とするカンナビノイド類の検出キット。
     
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