WO2014208157A1 - 新規肺癌マーカー（prdx4） - Google Patents

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lung
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泰宏 関
柴田　典緒
浅島　誠
晃 栗崎
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栄研化学株式会社
独立行政法人産業技術総合研究所
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    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y111/00—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
    • C12Y111/01—Peroxidases (1.11.1)
    • C12Y111/01015—Peroxiredoxin (1.11.1.15)

Definitions

  • the present invention relates to the technical field of clinical diagnostic agents that assist in the diagnosis of cancer. Furthermore, the present invention relates to a lung cancer marker for detecting lung cancer.
  • Lung cancer is one of the diseases with a poor prognosis whose early detection is difficult and its 5-year survival rate is less than 20%. However, if it is limited to early stage lung cancers of Stage IA and IB, the 5-year survival rate is significantly increased to about 70%.
  • the types of lung cancer are classified pathologically into small cell lung cancer and non-small cell lung cancer, and the latter is further classified into squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, and large cell carcinoma.
  • CYFRA 21-1, CEA, SLX, SCC, ProGRP, NSE, and the like are currently frequently used as lung cancer markers.
  • CEA is the most common tumor marker
  • SLX is highly specific for adenocarcinoma.
  • CYFRA 21-1 and SCC are said to be highly specific for squamous cell carcinoma
  • ProGRP and NSE are said to be highly specific for small cell carcinoma.
  • Patent Document 1 reports that the sensitivity is improved when NNMT is used in combination with conventional markers such as CYFRA 21-1, CEA, NSE, and SCC.
  • Non-Patent Document 1 reports a lung cancer marker using a sugar chain.
  • Markers used clinically such as CEA have an early lung cancer detection rate of about 30%, and a new marker with higher sensitivity is desired. Then, this invention makes it a 1st subject to provide a novel lung cancer marker. Moreover, this invention makes it a 2nd subject to provide a lung cancer marker with high detection efficiency. Furthermore, this invention makes it a 3rd subject to provide the lung cancer marker which can specify the kind (tissue type
  • PRDX4 peroxiredoxin 4
  • PRDX4 peroxiredoxin 4
  • a lung cancer tissue microarray the inventors of the present invention showed that PRDX4 was stained in lung tumor tissue but not in stromal tissue, and even in the protein level of clinical samples, lung tumor It was clarified that expression in the tissue was enhanced.
  • PRDX4 protein When the expression of PRDX4 protein was examined by lung cancer histology, it showed a high positive rate of 70% in lung adenocarcinoma and 90% in bronchioloalveolar carcinoma, while in lung squamous cell carcinoma and large cell carcinoma The positive rate was low at 40% and 20% in small cell carcinoma, and it was found that PRDX4 protein is a protein that is specifically expressed in non-small cell lung cancer. Based on these findings, the present inventors provide a marker that identifies the lung cancer tissue type. The present invention is excellent in providing a novel and highly reliable lung cancer marker.
  • This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2013-136784, which is the basis of the priority of the present application.
  • FIG. 1 shows the expression of lung cancer markers in lung cancer cell lines.
  • FIG. 2 shows the expression of lung cancer marker PRDX4 in lung cancer tissue.
  • FIG. 3 shows the results of observing PRDX4 expression by lung cancer histology.
  • FIG. 4 shows the amount of PRDX4 detected in serum in healthy individuals and cancer patients.
  • the present inventors first selected candidate genes that are expected to be significantly high in lung cancer, and from among the candidate genes, the expression level of a plurality of lung cancer-derived cell lines compared to normal lung-derived epithelial cells The ones with higher values were further selected to complete the present invention.
  • Lung cancer marker gene The inventors of the present application have identified a PRDX4 (peroxiredoxin 4) gene as a lung cancer marker.
  • An example of the gene sequence of PRDX4 is the sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • An example of the amino acid sequence encoded by PRDX4 is the sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • sample for use in the method for confirming the presence of lung cancer cells, any sample can be used, but preferably a sample from a subject, specifically, any sample collected A body fluid and a biopsy sample can be mentioned, and a biopsy sample or sputum sample of a lung disease part of a subject can be particularly preferable. 4-2. Methods for detecting mRNA in samples and reagents and kits therefor For example, biopsy samples can be obtained by crushing cells and extracting total RNA by conventional methods such as surfactants, homogenizers, or freeze sawing. .
  • a LAMP method for quantification of the target mRNA, a LAMP method, a differential display method, a method using a DNA array (DNA chip), a quantitative PCR method, a real-time PCR method, or a competitive PCR method can be used.
  • the real-time PCR method there is a method of monitoring and analyzing production of marker gene amplification products in real time.
  • the real-time monitoring reagent include SYBRGreen I and TaqMan probe.
  • a competitive PCR method for example, cDNA is prepared from intracellular total RNA or mRNA using reverse transcriptase, and the cDNA and DNA competitor are reacted in the same tube. Examples include a method of reacting by adding an RNA competitor together with mRNA.
  • the internal sequence other than the competitor primer sequence may be, for example, a sequence homologous to the sequence of the amplification-target mRNA or a non-homologous sequence.
  • cDNA can be prepared from total extracted RNA by reverse transcription reaction using Oligo dT primer, and this can be measured by real-time PCR.
  • RNA extraction for example, ISOGEN method (Nippon Gene) can be used.
  • reverse transcription for example, PrimeScript® II 1st strand cDNA Synthesis Kit can be used.
  • the amplification product can be measured using THUNDERBIRD (trademark) SYBR Mix (TOYOBO), TaqMan probe, or the like.
  • the primer may be any primer as long as it can amplify the lung cancer marker gene PRDX4 by a gene amplification method such as PCR.
  • PCR a gene amplification method
  • any base having a length of 15 bases or more, preferably Primers having a length of 16-30 bases, more preferably 18-28 bases, can be used. Specifically, those described in Table 1 below can be used.
  • a differential display method or a DNA array (DNA chip) can also be used. Further, in the hybridization method, a labeled probe having a sequence complementary to the sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a sequence in which 1 to several bases are deleted, substituted, and / or added to the same sequence is used. it can.
  • the probe label include radioisotopes, fluorescent substances, luminescent substances, enzymes, and the like.
  • radioisotope for example, [32P], [33P], [125I], [131I] and the like can be used.
  • As the fluorescent substance for example, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7, fluorescein isothiocyanate, fluorescamine, rhodamine and the like can be used.
  • kits for carrying out the mRNA detection method include (1) a primer or a set of primers (primer set) that can amplify a PRDX4 (peroxiredoxin 4) lung cancer marker gene by a gene amplification method such as the LAMP method. (2) If an example is given, the kit containing 1 set of primers (primer set) listed in Table 1 will be mentioned. 4-3.
  • any method can be used as a method for detecting a marker protein as long as it can specifically detect the marker protein, such as a method for detection using an antibody or mass spectrometry. good.
  • an antibody against a protein encoded by the PRDX4 gene may be a commercially available one, but may be prepared by a conventional method.
  • Marker protein detection methods using antibodies include immunostaining, immunofluorescence, various enzyme immunoassays, radioimmunoassay (RIA) / enzyme linked immunoassay (ELISA), double monoclonal antibody sandwich immunoassay, monoclonal polyclonal antibody Examples include a sandwich assay method, a Western blotting method, a biotin-avidin method, and an immunoprecipitation method. 4-3-1.
  • a kit for carrying out the above-mentioned protein detection method of 4.3 the following may be mentioned.
  • (1) (i) Enzyme-labeled monoclonal antibody and (ii) Substrate solution Some kits for carrying out the sandwich ELISA method include the following reagents.
  • kits for carrying out the biotin-avidin method contains the following reagents.
  • (3) (i) Biotinylated monoclonal antibody or polyclonal antibody, (ii) Enzyme-labeled avidin or streptavidin, and (iii) Substrate solution The kit for carrying out the sandwich ELISA method and the biotin-avidin method comprises the following reagents: Is included.
  • (4) (i) monoclonal antibody or polyclonal antibody, (ii) biotinylated monoclonal antibody or polyclonal antibody, (iii) enzyme-labeled avidin or streptavidin, and (iv) substrate solution.
  • a solution containing a substrate of an enzyme that produces a detectable change by an enzymatic reaction For example, when the substrate solution is labeled with alkaline phosphatase (AP), p-nitrophenyl phosphate-containing buffer solution is used. When the substrate solution is labeled with horseradish peroxidase (HRPO), o-phenylenediamine-containing buffer solution is used.
  • AP alkaline phosphatase
  • HRPO horseradish peroxidase
  • a buffer containing 4-methylumbellyl ferryl- ⁇ -galactoside can be used.
  • a method using a biotinylated antibody a known method can be used.
  • a method of binding a conjugate of streptavidin and peroxidase to biotin is used.
  • examples of such peroxidase include horseradish peroxidase.
  • a substance that develops color by the action of the peroxidase it is preferable to use a substance that develops color by the action of the peroxidase.
  • the inventors of the present application obtained eight kinds of novel lung cancer marker candidate factors by a preliminary study in which candidate genes that are expected to be significantly high in lung cancer are first selected.
  • qPCR was performed using a lung cancer-derived cell line to verify the expression of each candidate factor at the mRNA level.
  • 16 types of lung cancer-derived cell lines and 2 types of normal lung-derived cells were cultured to confluence on 6-well plates using the cells described in Table 2.
  • RNA extraction was performed using ISOGEN (Nippon Gene) or RNA easy mini kit (QIAGEN). Using the extracted 500 ng of total RNA as a template, cDNA was synthesized using PrimeScript II 1st strand synthesis kit (Takara Bio Inc.).
  • PRDX4 peroxiredoxin 4
  • SAEC small airway epithelial cells
  • NHBE alveolar epithelial cells
  • expression was more than doubled in multiple lung adenocarcinoma cell lines.
  • expression was increased in lung squamous cell carcinoma cell lines.
  • the vertical axis of the graph in the figure indicates the value obtained by dividing the gene expression level by the expression level of the internal standard gene GAPDH as a relative value to the expression level of the PC-3 cells.
  • tissue microarray In order to verify expression at the protein level, immunostaining was performed on a commercially available tissue microarray (Shanghai Outdo).
  • the tissue microarray used is spotted with 60 specimens of lung cancer tissue and formalin-fixed paraffin-embedded sections of 60 specimens of peripheral normal tissue derived from the same donor as the cancer specimen.
  • the types of lung cancer are lung squamous cell carcinoma, lung adenocarcinoma, lung adenosquamous cell carcinoma, bronchioloalveolar carcinoma, 10 large cell carcinomas and 10 small cell lung cancer samples.
  • lung cancer patient serum samples and healthy subject samples were analyzed by ELISA using anti-PRDX4 antibody.
  • Lung cancer serum samples were purchased from Bizcom Japan, healthy control samples were obtained from volunteers, and ELISA was performed using ELISA-Kit-for-Peroxyredoxin-4 from USCN life science as follows. On the antibody solid phase plate, 100 ⁇ l of “standard substance attached to kit (measurement range is 0-2000 pg / ml)” or “10-fold diluted serum sample (dilution buffer is 20% Block Ace / PBS + 0.05% Tween 20)” was added and reacted at 37 ° C. for 2 hours.
  • the sample was discarded, and 100 ⁇ l primary antibody (the antibody attached to the kit was diluted 100-fold with the buffer attached to the kit) and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • 100 ⁇ l secondary antibody (the antibody attached to the kit was diluted 100 times with the buffer attached to the kit) was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes.
  • 90 ⁇ l of TMB substrate solution was added and a color reaction was carried out at 37 ° C. for 20 minutes.
  • the present invention can be used in industries that manufacture diagnostic agents and diagnostic kits. More specifically, tumor diagnostic agents and diagnostic kits can be used in the manufacturing industry. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

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Abstract

本願発明は、新規な肺癌マーカーを提供することを第１の課題とする。また、本願発明は、検出効率が高い肺癌マーカーを提供することを第２の課題とする。更に、本願発明は、肺癌の種類（組織型）を特定することができる肺癌マーカーを提供することを第３の課題とする。　本願発明者らは、PRDX4（peroxiredoxin 4）は複数の肺癌由来細胞株で正常肺由来上皮細胞と比較して発現が亢進し、肺癌において高発現している可能性が高いことを見出し、本願発明を完成させた。

Description

新規肺癌マーカー（ＰＲＤＸ４）
　本願発明は、癌の診断を補助する臨床検査薬の技術分野に関する。更に、本願発明は、肺癌検出用の肺癌マーカーに関する。
　肺癌は早期発見が困難でその５年生存率は２０％に満たない予後不良な疾患の一つである。しかし、Ｓｔａｇｅ　ＩＡ、ＩＢの早期肺癌に限ればその５年生存率は７０％程度と大幅に上昇する。肺癌の種類（組織型）は病理学的にはその形態から小細胞性肺癌及び非小細胞性肺癌に分類され、後者はさらに扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌に分類されている。肺癌マーカーとして現在良く使用されているものには、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＣＥＡ、ＳＬＸ、ＳＣＣ、ＰｒｏＧＲＰ、ＮＳＥなどがある。ＣＥＡはもっとも一般的な腫瘍マーカーであり、ＳＬＸは腺癌に特異性が高い。ＣＹＦＲＡ２１−１やＳＣＣは扁平上皮癌に特異性が高いとされ、ＰｒｏＧＲＰやＮＳＥは小細胞癌に特異性が高いといわれている。
　また、例えば、特許文献１には、従来からのＣＹＦＲＡ２１−１、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＳＣＣ等のマーカーと組み合わせてＮＮＭＴを用いると感度が向上することを報告している。非特許文献１には、糖鎖を利用した肺癌マーカーが報告されている。
特表２００９−５４５７３１号
実験医学増刊Ｖｏｌ．２５Ｎｏ．１７　「肺癌における糖鎖標的腫瘍マーカーの探索」植田幸嗣，醍醐　弥太郎，中村祐輔
　ＣＥＡ等、臨床で使用されているマーカーは早期肺癌の検出率は３０％程度であり、より高感度な新規マーカーが望まれている。そこで本願発明は、新規な肺癌マーカーを提供することを第１の課題とする。また、本願発明は、検出効率が高い肺癌マーカーを提供することを第２の課題とする。更に、本願発明は、肺癌の種類（組織型）を特定することができる肺癌マーカーを提供することを第３の課題とする。その上、他の肺癌マーカーと組み合わせることにより、検出効率及び／又は検出特異性を向上させることができる肺癌マーカーを提供することを第４の課題とする。
　本願発明者らは、ＰＲＤＸ４（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ　４）は複数の肺癌由来細胞株で正常肺由来上皮細胞と比較して発現が亢進し、肺癌において高発現している可能性が高いことを見出し、本願発明を完成させた。
　さらに本願発明者らは、肺癌組織マイクロアレイを用いた免疫組織染色の結果、ＰＲＤＸ４は肺腫瘍組織で染色が見られたが間質組織では染色が見られず、臨床サンプルのタンパク質レベルにおいても肺腫瘍組織での発現が亢進することを明らかにした。ＰＲＤＸ４タンパク質の発現を肺癌の組織型別に見てみると、肺腺癌で７０％、細気管支肺胞上皮癌で９０％と高い陽性率を示した一方で、肺扁平上皮癌及び大細胞癌で４０％、小細胞癌で２０％と陽性率は低く、ＰＲＤＸ４タンパク質が非小細胞肺癌で特異的に発現するタンパク質であることを見出した。これらの知見に基づき、本願発明者らは、肺癌の組織型を特定するマーカーを提供する。
　本願発明は、新規な、高い信頼性の肺癌マーカーを提供するという優れたものである。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１３−１３６７８４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　図１は、肺癌マーカーの肺癌細胞株における発現を示す。
　図２は、肺癌マーカーＰＲＤＸ４の肺癌組織における発現を示す。
　図３は、ＰＲＤＸ４の発現を肺癌組織型別に観察した結果を示す。
　図４は、健常人とがん患者におけるＰＲＤＸ４の血清中の検出量を示す。
１．はじめに
　本願発明者らは、肺癌で発現が有意に高いと予想される候補遺伝子をまず選抜し、その候補遺伝子の中から、複数の肺癌由来細胞株で正常肺由来上皮細胞と比較して発現量が高いものを更に選抜し、本願発明を完成させた。
２．肺癌マーカー遺伝子
　本願発明者らは、肺癌マーカーとして、ＰＲＤＸ４（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ　４）遺伝子を同定した。
　ＰＲＤＸ４の遺伝子配列としては、配列番号１で表される配列が例示できる。またＰＲＤＸ４によりコードされるアミノ酸配列としては、配列番号２で表される配列が例示できる。
　以下の実施例に示されるとおり、上記遺伝子は、複数の種類の肺癌由来細胞株で、正常肺由来細胞と比較して発現が亢進していたことが確認されている。
３．肺癌マーカー遺伝子の発現の確認
　遺伝子発現の確認には、当該遺伝子のｍＲＮＡ又は当該遺伝子がコードする蛋白質を検出する周知の方法を用いることができる。ｍＲＮＡの存在を確認する方法としては、例えば、ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法、マイクロアレイ法などを用いることができる。蛋白質の確認方法としては、免疫染色法、ＥＬＩＳＡ法などの抗体を用いる方法などを用いることができる。
４．肺癌マーカーを用いた、肺癌細胞の存在を確認する方法及び肺癌診断を補助する方法
　４−１．サンプル
　肺癌細胞の存在を確認する方法に使用するためのサンプル（試料）としては、任意の試料を用いることができるが、好適には被験者からの採取物、具体的には、任意の採取された体液、生検された試料を挙げることができ、特に好適には、被験者の肺疾患部の生検試料または喀痰試料を挙げることができる。
　４−２．サンプル中のｍＲＮＡの検出法並びにそのための試薬及びキット
　例えば、生検試料は、細胞を、例えば、界面活性剤、ホモジナイザー、又はフリーズソーイングなどの定法により、破砕し、全ＲＮＡを抽出することができる。目的のｍＲＮＡの定量には、ＬＡＭＰ法、ディファレンシャルディスプレイ法やＤＮＡアレイ（ＤＮＡチップ）を用いる方法、定量ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、コンペティティブＰＣＲ法を利用することができる。
　例えば、リアルタイムＰＣＲ法では、マーカー遺伝子の増幅産物の生成をリアルタイムでモニタリングし、解析する方法があげられる。前記リアルタイムモニタリング試薬としては、例えば、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ　Ｉ、ＴａｑＭａｎプローブ等が挙げられる。
　また、コンペティティブＰＣＲ法としては、例えば、細胞内の全ＲＮＡやｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製し、当該ｃＤＮＡ及びＤＮＡコンペティターを同一チューブ内で反応させる方法や、さらに前記逆転写反応時にｍＲＮＡとともにＲＮＡコンペティターを加えて反応させる方法等があげられる。またコンペティターのプライマー配列以外の内部配列としては、例えば、増幅目的ｍＲＮＡの配列と相同配列でもよく、非相同な配列でもよい。
　また、リアルタイムＰＣＲ法を利用する場合について、より具体的に例示すると、全抽出ＲＮＡからＯｌｉｇｏ　ｄＴプライマーを用いて逆転写反応で、ｃＤＮＡを調製し、これをリアルタイムＰＣＲで計測することができる。ＲＮＡ抽出には、例えば、ＩＳＯＧＥＮ法（ニッポンジーン）を用いることができる。また、逆転写法には、例えば、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（Ｒ）　ＩＩ　１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔを用いることができる。リアルタイムＰＣＲには、例えば、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（商標）ＳＹＢＲ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社）やＴａｑＭａｎプローブなどを用いて増幅産物を測定することができる。
　また、ＰＲＤＸ４の配列又は同配列に１から数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された配列に相補的な配列の標識したプローブによるハイブリダイゼーション方法も含まれる。
　なお、プライマーとしては、肺癌マーカー遺伝子であるＰＲＤＸ４をＰＣＲ法などの遺伝子増幅方法で増幅できるプライマーであれば、いずれのプライマーでもよい。例えば、配列番号１で示される配列又は同配列に１から数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された配列について、その配列の任意の連続する１５塩基長以上の塩基、好ましくは１６−３０塩基長、より好ましくは、１８~２８塩基長からなるプライマーを使用することができる。具体的には、以下の表１に記載のものを用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　また、ディファレンシャルディスプレイ法やＤＮＡアレイ（ＤＮＡチップ）を用いることもできる。
　更にハイブリダイゼーション法には、配列番号１で示される配列又は同配列に１から数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された配列に相補的な配列の標識したプローブを用いることができる。
　プローブの標識としては、例えば、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、酵素などを挙げることができる。放射性同位元素としては、例えば、〔３２Ｐ〕、〔３３Ｐ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕などを用いることができる。蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、フルオレセインイソチオシアネート、フルオレスカミン、ローダミンなどを用いることができる。酵素としては、例えば、標識として常用される、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが挙げられる。
　４−２−１．
　上記ｍＲＮＡ検出方法を実施するためのキットとしては、例えば、（１）ＰＲＤＸ４（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ　４）肺癌マーカー遺伝子をＬＡＭＰ法などの遺伝子増幅方法で増幅できるプライマー又は１組のプライマー（プライマーセット）を含むキット、（２）一例を挙げれば、表１に掲げた１組のプライマー（プライマーセット）を含むキットが挙げられる。
　４−３．サンプル中のタンパク質の検出方法
　本願発明では、マーカー蛋白質の検出法として、例えば、抗体を用いて検出する方法や質量分析法などマーカー蛋白質を特異的に検出できる方法であればいかなる方法を用いても良い。抗体を用いる方法では、上記ＰＲＤＸ４遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体は、既に市販されているものを利用しても良いが、定法により調製してもよい。抗体を用いるマーカー蛋白質の検出法としては、免疫染色法、免疫蛍光法、各種のエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）・酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ法、モノクローナルポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ法、ウェスタンブロッティング法、ビオチン−アビジン法、免疫沈降法などを挙げることができる。
　４−３−１．
　例えば、上記４．３のタンパク質検出方法を実施するためのキットとしては次のようなものが挙げられる。
（１）（ｉ）酵素標識化モノクローナル抗体及び（ｉｉ）基質溶液
　サンドイッチＥＬＩＳＡ法を実施するためのキットとしては下記の試薬を含むものがある。
（２）（ｉ）モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、（ｉｉ）酵素標識化モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、及び（ｉｉｉ）基質溶液
　ビオチン−アビジン法を実施するためのキットは下記の試薬を含むものである。
（３）（ｉ）ビオチン化モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、（ｉｉ）酵素標識化アビジン又はストレプトアビジン、及び（ｉｉｉ）基質溶液
　サンドイッチＥＬＩＳＡ法及びビオチン−アビジン法を実施するためのキットは下記の試薬を含むものである。
（４）（ｉ）モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、（ｉｉ）ビオチン化モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、（ｉｉｉ）酵素標識化アビジン又はストレプトアビジン及び（ｉｖ）基質溶液
　なお上記の基質溶液とは、抗体に標識した酵素の基質であって、酵素反応により検出可能な変化を生じる基質を含有する溶液のことである。例えば、基質溶液としては、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）で標識した場合はｐ−ニトロフェニルリン酸含有緩衝液が、ホースラディシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）で標識した場合はｏ−フェニレンジアミン含有緩衝液が、β−ガラクトシダーゼで標識した場合は、４−メチルウンベリルフェリル−β−ガラクトシドを含有する緩衝液を用いることができる。
　ビオチン化抗体を用いる方法としては公知の方法を用いることができるが、好ましくはストレプトアビジンとパーオキシダーゼとのコンジュゲートをビオチンに結合させる方法を用いる。このようなパーオキシダーゼとしては、ホースラディッシュパーオキシダーゼが挙げられる。さらに、パーオキシダーゼの検出には、そのパーオキシダーゼの作用によって発色する物質を用いることが好ましい。
　以下に本願発明を、実施例を用いてより具体的に説明する。但し、本願は以下の実施例により限定されるものではない。
　本願発明者らは、肺癌で発現が有意に高いと予想される候補遺伝子をまず選抜する予備的研究により、８種の新規肺癌マーカー候補因子を得た。これら因子の肺癌における発現を検証するため肺癌由来細胞株を用いてｑＰＣＲを行い、ｍＲＮＡレベルでの各候補因子の発現を検証した。表２記載の細胞を同表記載の培地を用いて、１６種類の肺癌由来細胞株および２種類の正常肺由来細胞を６−ｗｅｌｌプレートでコンフルエントまで培養した。次に、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）あるいはＲＮＡ　ｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＲＮＡの抽出を行った。抽出した５００ｎｇの全ＲＮＡを鋳型としＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ　１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。そして合成したｃＤＮＡを鋳型としＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　ＳＹＢＲ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてｑＰＣＲを行った。
　ＰＲＤＸ４（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ　４）についての結果を図１に示す。正常肺由来上皮細胞（ＳＡＥＣ　：小気道上皮細胞、ＮＨＢＥ：肺胞上皮細胞）と比較し、複数の肺腺癌細胞株で２倍以上の発現が確認された。また、肺扁平上皮癌細胞株で発現が上昇していた。図中グラフの縦軸は遺伝子の発現量を内部標準遺伝子ＧＡＰＤＨの発現量で除した値を、ＰＣ−３細胞の発現量との相対値で示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　タンパク質レベルでの発現を検証するため、市販の組織マイクロアレイ（上海Ｏｕｔｄｏ社）に対する免疫染色を行った。用いた組織マイクロアレイには肺癌組織６０検体および癌検体と同一ドナー由来の周辺正常組織６０検体のホルマリン固定パラフィン包埋切片がスポットされている。肺癌のタイプは、肺扁平上皮癌、肺腺癌、肺腺扁平上皮癌、細気管支肺胞上皮癌、大細胞癌および小細胞肺癌各１０検体である。
　まず、キシレン処理を１０分間、２回、１００％ＥｔＯＨ（エタノール）で１０分間処理を２回、した後、９０％ＥｔＯＨで１０分間処理し、最後に、７０％ＥｔＯＨエタノールで１０分間処理して、脱パラフィンし、親水化した。
　次に、１０ｍＭクエン酸緩衝液中で１１０℃１０分間オートクレーブを行うことで抗原の賦活化を行った。０．３％Ｈ２Ｏ２／ＭｅＯＨで３０分処理して、内在性ペルオキシダーゼを失活させた。その後、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ　ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ社）を用いて免疫染色を行い、ＤＡＢ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ社）を用いて発色を行った。また、免疫染色後にヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ社）で対比染色を行った。
　顕微鏡（ＢＸ５０（ＯＬＹＭＰＵＳ社）、ＥＯＳ　ｋｉｓｓ　Ｘ６ｉで観察し、撮影した結果を図２に示す。肺腺癌組織において、腫瘍細胞の細胞質で強く発現していることが確認された。
　実施例１及び２の結果より、ＰＲＤＸ４は、新規肺癌マーカー候補として有力であると判断した。そこで、以下に肺癌組織型別にＰＲＤＸ４が高発現している割合を検討し、その結果を示す（図３）。図中の数値は組織マイクロアレイにスポットされている１０検体中どのくらいの割合でＰＲＤＸ４が高発現しているかを示している。結果、肺腺癌（ＡＣ）では７０％と高い割合でその発現が確認でき、腺癌と類似した乳頭状所見を示す細気管支肺胞上皮癌（ＢＡＣ）でも同じく９０％と非常に高い割合で発現が確認できた。一方、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）および大細胞癌（ＬＣＣ）では４０％とやや低く、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）では１０検体中２検体でのみその発現が確認され、非小細胞肺癌に特異的であることが示唆された。
　次に、肺がん患者血清検体と健常人検体とを、抗ＰＲＤＸ４抗体を用いてＥＬＩＳＡ法で分析した。
　肺癌血清検体はビジコムジャパン社より購入し、健常者対照検体はボランティアより得、ＥＬＩＳＡは、ＵＳＣＮ　ｌｉｆｅ　ｓｃｉｅｎｃｅ社のＥＬＩＳＡ−Ｋｉｔ−ｆｏｒ−Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ−４を用いて次のようにして行った。
　抗体固相プレートで、１００μｌの「キットに添付の標準物質（測定レンジは０−２０００ｐｇ／ｍｌ）」あるいは「１０倍希釈血清サンプル（希釈バッファーは２０％ブロックエース／ＰＢＳ＋０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０）」を添加して３７℃２時間反応させた。次に、サンプルを捨てて１００μｌ一次抗体（キットに添付の抗体をキットに添付のバッファーで１００倍希釈）を加えて３７℃　１時間反応させた。キットに添付の洗浄液で３回洗浄後、１００μｌ二次抗体（キットに添付の抗体をキットに添付のバッファーで１００倍に希釈）を加えて３７℃　３０分間反応させた。キットに添付の洗浄液（上記洗浄操作と同じバッファー）で５回洗浄後、９０μｌ　ＴＭＢ基質液を添加し３７℃　２０分発色反応させた。その後、５０μｌキットに添付の反応停止液を加えて発色反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図４に示す。
　図４からわかるように、ＰＲＤＸ４抗体を用いたＥＬＩＳＡ法で、肺癌患者を特異的に検出できた。
　本願発明は、診断剤及び診断キット製造を製造する産業で利用することができる。より具体的には、腫瘍診断剤及び診断キットを製造業で利用することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (9)

  1. 　ＰＲＤＸ４遺伝子によりコードされるポリペプチドである肺癌マーカー。
  2. 　ＰＲＤＸ４をコードするｍＲＮＡである肺癌マーカー。
  3. 　配列番号１で示される配列又は同配列に１から数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された配列に相補的な配列の標識したプローブ。
  4. 　ＰＲＤＸ４遺伝子を検出するためのＰＲＤＸ４遺伝子配列中の連続する１５塩基以上の塩基を含む肺癌検出用プライマー。
  5. 　配列番号１で示される配列又は同配列に１から数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された配列について、その配列の任意の連続する１５塩基長以上の塩基を含む肺癌検出用プライマー。
  6. 　ＰＲＤＸ４に対する抗体を含む肺癌検出剤。
  7. 　抗体がモノクローナル抗体である請求項６記載の肺癌検出剤。
  8. 　請求項４又は５記載のプライマーを含む肺癌検出キット。
  9. 　請求項６又は７記載の肺癌検出剤を含む肺癌検出キット。
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