ES2345167T3 - Utilizacion de nnmt como marcador de cancer de pulmon. - Google Patents
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Abstract
Método para la evaluación del cáncer de pulmón in vitro, que comprende medir en una muestra la concentración de proteínas de: a) nicotinamida N-metiltransferasa (NNMT), b) opcionalmente otro u otros marcadores de cáncer de pulmón, y c) utilizar la concentración determinada en la etapa (a), y opcionalmente en la etapa (b), en la evaluación de cáncer de pulmón, en la que un incremento de NNMT es indicativo de cáncer de pulmón.
Description
Utilización de NNMT como marcador de cáncer de
pulmón.
La presente invención se refiere a un método que
ayuda en la evaluación del cáncer pulmonar o de pulmón (=LC) y en
particular en la evaluación del carcinoma pulmonar de células no
pequeñas (NSCLC). Da a conocer la utilización de la proteína
nicotinamida N-metiltransferasa (=NNMT) como
marcador del LC, particularmente del NSCLC. Además, se refiere
especialmente a un método para evaluar el cáncer de pulmón en una
muestra líquida derivada de un individuo, mediante la medición de
NNMT en dicha muestra. La medición de NNMT puede utilizarse, por
ejemplo, para la detección precoz del cáncer de pulmón o para la
vigilancia de pacientes sometidos a cirugía.
El cáncer sigue siendo un reto importante de
salud pública a pesar de los avances en la detección y terapia.
Entre los diversos tipos de cáncer, LC es un cáncer frecuente en el
mundo occidental y entre las causas más frecuentes de mortalidad
relacionada con cáncer. Ello se debe en gran parte al vacío
diagnóstico en la detección precoz de la enfermedad. LC es en gran
parte asintomática en sus primeros estadios. La mayoría de todos los
cánceres de pulmón se detecta en un estadio tardío, cuando la
enfermedad ya se ha convertido en inoperable.
La mayoría de tumores de LC puede dividirse en
carcinoma de pulmón de células pequeñas (SCLC) y en carcinoma de
pulmón de células no pequeñas (NSCLC). SCLC explica aproximadamente
20% a 25% de todos los casos de cáncer de pulmón. SLCL es un tipo
neuroendocrino agresivo de LC y presenta un muy mal pronóstico,
incluso en el caso de que se detecte en estadios tempranos. El SCLC
raramente puede tratarse de manera curativa mediante resección.
Debido a la velocidad a la que progresa la enfermedad, el SCLC
generalmente se clasifica utilizando únicamente dos estadios:
enfermedad limitada y enfermedad extensiva, y no el sistema de
estadificación más complejo llamado TNM (ver posteriormente).
Aproximadamente 75% a 80% de los casos de LC se agrupan en la clase
de NSCLC, incluyendo el carcinoma de células escamosas
(carcinoma=CA), el adeno-CA (que comprende las
subclases de CA acinar, CA papilar, tumor broncoalveolar, tumor
sólido y subtipos mixtos) y el carcinoma de células grandes (que
comprende las subclases de tumores de células gigantes, el CA de
células claras, el CA adenoescamoso y el CA no diferenciado).
El NSCLC, en caso de detectarse en estadios
tardíos, también presenta un muy mal pronóstico. La estadificación
del cáncer es la clasificación de la enfermedad en términos de
extensión, progresión y severidad. Agrupa a los pacientes de cáncer
de manera que puedan realizarse generalizaciones sobre el pronóstico
y la elección de terapia.
En la actualidad, el sistema TNM es el sistema
de clasificación más ampliamente utilizado, basado en la extensión
anatómica del cáncer. Representa un sistema de estadificación
uniforme internacionalmente aceptado. Existen tres variables
básicas: T (la extensión del tumor primario), N (el estado del os
nódulos linfáticos regionales) y M (la presencia o ausencia de
metástasis distantes). Los criterios del TNM han sido publicados por
el UICC (International Union Against Cancer), en: TNM
Classification of Malignant Tumours, quinta edición, Sobin L.H. y
Witteking, Ch. (editores), Wiley-Liss, 1997, páginas
1803-1804).
La resección quirúrgica del tumor primario se
acepta ampliamente como el tratamiento de elección para el NSCLC de
estadio temprano. Con la progresión del NSCLC y, más
específicamente, la transición del estadio IIIa (T3N1M0, T1N2M0,
T2N2M0, T3N2M0) a IIIb (T4N0M0, T4N1M0, T4N2M0), se precipita un
cambio significativo en el enfoque médico. Sin embargo, en el caso
de que el cáncer se detecte durante los estadios más tempranos
(Ia-IIIa, preferentemente hasta el estadio T3N1M0),
la tasa de supervivencia a los cinco años varía entre 35% y 80%. La
detección en el estadio Ia ((T1N0M0), pequeño tamaño del tumor, sin
metástasis) evidentemente presenta un mejor pronóstico, con una
supervivencia a los cinco años de hasta 80%.
La cirugía se utiliza raramente o nunca en el
control del NSCLC de estadio IIIb-IV. El estadio IV
corresponde a metástasis distantes, es decir, la extensión de la
enfermedad más allá de los pulmones y de los nódulos linfáticos
regionales. La tasa de supervivencia a cinco años en los últimos
estadios (III-IV) cae a entre menos de 1% y
15%.
Lo que resulta especialmente importante es que
el diagnóstico precoz del NSCLC se traduce en un pronóstico mucho
mejor. Los pacientes diagnosticados como de estadio temprano, tal
como en estadio Ia (T1N0M0), Ib (T2N0M0), IIa (T1N1M0), IIb
(T3N0M0) e IIIa (T3N1M0), en caso de ser tratados correctamente
presentan una probabilidad de supervivencia a 5 años tras el
diagnóstico de hasta 80%. Esto debe compararse con una tasa de
supervivencia a 5 años inferior a 1% para los pacientes
diagnosticados una vez se encuentran ya presentes metástasis
distantes.
En el sentido de la presente invención, la
evaluación precoz del LC se refiere a una evaluación en un estadio
tumoral T1N0M0 o T1-3N0-1M0.
Resulta preferente que el LC se evalúe en el
estadio T1-3N0-1M0
(=T1-30-1M0).
La mayoría de cánceres de pulmón se detecta al
convertirse en sintomáticos. Entre los métodos actuales de
detección se incluyen los rayos X torácicos, la tomografía
computerizada espiral, la citología de esputo y la bronquioscopia.
Sin embargo, existe una controversia sobre la conveniencia de estos
medios para los cribados en masa.
Existen varios marcadores tumorales séricos para
los cánceres de pulmón que se utilizan clínicamente. El fragmento
soluble de 30 kDa de la citoqueratina 19 (CYFRA
21-1), el antígeno carcinoembriogénico (CEA), la
enolasa específica de neuronas (NSE) y el antígeno de carcinoma de
células escamosas (SCC) son los marcadores de LC más prominentes.
Sin embargo, ninguno de ellos cumple los criterios de sensibilidad y
especificidad requeridos para una herra-
mienta de cribado (Thomas L., Labor und Diagnose, TH Books Verlagsgesellschaft, Frankfurt/Main, Alemania, 2000).
mienta de cribado (Thomas L., Labor und Diagnose, TH Books Verlagsgesellschaft, Frankfurt/Main, Alemania, 2000).
Con el fin de que resulten de utilidad clínica,
un marcador diagnóstico nuevo como marcador único debería ser
comparable a otros marcadores conocidos de la técnica, o mejor.
Alternativamente, un marcador nuevo debería conducir a un avance en
la sensibilidad y/o especificidad diagnóstico en el caso de que se
utilice solo o en combinación con uno o más otros marcadores,
respectivamente. La sensibilidad y/o especificidad diagnósticas de
un ensayo se evalúan mejor a partir de sus características de
operación por parte del receptor, que se describen en detalle
posteriormente.
Las fuentes más ampliamente utilizadas de
muestra en la rutina clínica son la sangre completa, el suero o el
plasma. La identificación de un marcador precoz de tumor de LC que
ayudaría en la detección fiable del cáncer o proporcionaría
información pronóstica precoz podría conducir a un método que
ayudaría mucho en el diagnóstico y en el control de esta
enfermedad. Por lo tanto, existe una necesidad clínica urgente de
mejorar la evaluación in vitro de LC. Resulta especialmente
importante mejorar el diagnóstico precoz del LC, debido a que los
pacientes diagnosticados precozmente, la probabilidad de
supervivencia es mucho más alta en comparación con aquellos
diagnosticados en un estadio avanzado de la enfermedad.
La utilidad clínica de los marcadores
bioquímicos en el cáncer de pulmón se ha revisado recientemente
(Duffy M.J., Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 38:225-262,
2001).
En la actualidad CYFRA 21-1 se
considera el mejor de los marcadores tumorales conocidos actualmente
para el cáncer de pulmón. Aunque no es específico de un órgano, se
encuentra predominantemente en tejido pulmonar. La sensibilidad de
CYFRA 1-1 para el cáncer de pulmón se describe que
se encuentra comprendida entre 46% y 61% a una especificidad de 95%
hacia otras enfermedades pulmonares benignas. Los niveles séricos
incrementados de CYFRA 21-1 también se asocian a
enfermedades hepáticas benignas pronunciadas, insuficiencia renal y
cáncer de vejiga invasivo. Se recomienda el análisis de CYFRA
21-1 para la vigilancia de la terapia
postoperatoria.
CEA pertenece al grupo de antígenos
carcinofetales, habitualmente producidos durante la embriogénesis.
CEA no es específico de un órgano y se utiliza predominantemente
para el seguimiento del cáncer colorrectal. Aparte de las
malignidades, también varias enfermedades benignas, tales como la
cirrosis, la bronquitis, la pancreatitis y las enfermedades
autoinmunológicas, se asocian a niveles séricos incrementados de
CEA. La especificidad para las enfermedades pulmonares benignas es
de 95%, mientras que su sensibilidad para el cáncer de pulmón se
informa que es de entre 29% y 44%. Un uso preferente de CEA es la
vigilancia de la terapia del cáncer de pulmón.
NSE es un marcador tumoral de SCLC. Generalmente
se encuentran niveles séricos incrementados de NSE en asociación
con tumores neuroectodérmicos y neuroendocrinos. También se observan
niveles séricos incrementados en pacientes con enfermedades
pulmonares benignas y enfermedades cerebrales, tales como meningitis
u otras enfermedades inflamatorias del cerebro, y lesiones
traumáticas de la cabeza. Aunque la sensibilidad para el SCLC a una
especificidad de 95% se informa que es de entre 60% y 87%, el
rendimiento del ensayo de NSE para el NSCLC es pobre (7% a 25%). Se
recomienda NSE para la vigilancia de la terapia del SCLC.
SCC fue identificado originalmente en el CA de
células escamosas del cérvix. La sensibilidad de SCC para el LC en
general es baja (18% a 27%). Por lo tanto, el ensayo de SCC no se
considera adecuado para el cribado. Sin embargo, debido a la mayor
sensibilidad del CA de células escamosas, un uso preferente de SCC
es la vigilancia de la terapia, aunque CYFRA 21-1
generalmente funciona mejor.
Con respecto a los perfiles de marcadores y con
el objetivo de alcanzar un diagnóstico mejorado del cáncer de
pulmón, ha sido publicado un método (Schneider J. et al.,
Int. J. Clin. Oncol. 7:145-151, 2002) utilizando
algoritmos de clasificación basados en lógica difusa para combinar
niveles séricos de CYFRA 21-1, NSE y proteína C
reactiva (CRP), que es un marcador general de inflamación. Los
autores informan de una sensibilidad de 92% a una especificidad de
95%.
La tarea de la presente invención fue investigar
si puede identificarse un marcador bioquímico que pueda utilizarse
para evaluar el LC.
Inesperadamente se ha encontrado que la
utilización del marcador NNMT puede superar, por lo menos
parcialmente, algunos de los problemas de los marcadores
actualmente conocidos del estado de la técnica.
La presente invención se refiere a un método
para evaluar el cáncer de pulmón in vitro, que comprende
medir en una muestra la concentración de NNMT, y utilizar la
concentración determinada en la evaluación del cáncer de pulmón.
Inesperadamente pudo establecerse que un nivel incrementado de NNMT
en una muestra es indicativo, por ejemplo, para la presencia de
cáncer de pulmón en un individuo.
La presente invención también se refiere a un
método para evaluar el LC in vitro mediante marcadores
bioquímicos, que comprende medir en una muestra la concentración de
NNMT y uno o más otros marcadores de LC y utilizar las
concentraciones determinadas en la evaluación del LC. Resulta
preferente la selección de otro u otros marcadores de LC de entre
el grupo que consiste de CYFRA 21-1, CEA, NSE y
SCC.
La presente invención, en una realización
preferente, también se refiere a la utilización de un panel de
marcadores que comprende por lo menos NNMT y
CYFRA-21 en la evaluación del LC.
La presente invención también se refiere a la
utilización de un panel de marcadores que comprende por lo menos
NNMT y CEA en la evaluación del LC.
La presente invención también se refiere a la
utilización de un panel de marcadores que comprende por lo menos
NNMT y SCC en la evaluación del LC.
En una realización preferente, la presente
invención se refiere a un método para evaluar el cáncer de pulmón
in vitro, que comprende medir en una muestra la concentración
de: a) NNMT, b) opcionalmente uno o más otros marcadores del cáncer
de pulmón, y c) utilizar las concentraciones determinadas en la
etapa (a), y opcionalmente en la etapa (b), en la evaluación del
cáncer de pulmón.
La NNMT (nicotinamida
N-metiltransferasa, EC 2.1.1.1) cataliza la
N-metilación de la nicotinamida y otras piridinas.
La proteína NNMT (Swiss-PROT:P40261) se caracteriza
por la secuencia proporcionada en SEC ID nº 1. NNMT presenta un
peso molecular aparente de 29,6 kDa y un punto isoeléctrico de
5,56.
La actividad de NNMT resulta importante para la
biotransformación de muchos fármacos y compuestos xenobióticos. Se
ha informado que la proteína se expresa predominantemente en el
hígado y que se localiza en el citoplasma. NNMT ha sido clonada a
partir de ADNc de hígado humano y contiene un marco de lectura
abierto de 792 nucleótidos codificante de una proteína de 264
aminoácidos con una masa molecular calculada de 29,6 kDa (Aksoy S.
et al., J. Biol. Chem. 269:14835-14840,
1994). Se conoce poco en la literatura sobre un papel potencial del
enzima en el cáncer humano. En un artículo, se ha informado de
actividad enzimática hepática incrementada de NNMT como marcador de
la caquexia del cáncer en ratones (Okamura A. et al., Jpn. J.
Cancer Res. 89:649-656, 1998). En un informe
reciente, se demostró la regulación negativa del gen NNMT en
respuesta a radiación en líneas celulares sensibles a la radiación.
En la patente US nº 2006/0024692, se encontró que el nivel de ARNm
de NNMR era más bajo en células de carcinoma pulmonar de células no
pequeñas en comparación con tejido no canceroso. La patente WO nº
02/0827076 describe una proteína NNMR como marcador de subtipos de
carcinoma renal.
Tal como se utiliza en la presente memoria, cada
una de las expresiones siguientes presenta el significado asociado
a las mismas en la presente sección.
Los artículos "uno" y "una" se
utilizan en la presente memoria para referirse a uno o a más de uno
(es decir, a por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo.
A título de ejemplo, "un marcador" se refiere a un marcador o
a más de un marcador.
La expresión "marcador" o "marcador
bioquímico" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere
a una molécula que se utilizará como diana en el análisis de la
muestra de un paciente. Son ejemplos de dichas dianas moleculares
las proteínas o polipéptidos mismos, así como anticuerpos de dichas
dianas tal como se encuentran presentes en una muestra. La
expresión "uno o más" se refiere a 1 a 20, preferentemente 1 a
10, preferentemente 1 a 5, más preferentemente 3 ó 4.
Las proteínas o polipéptidos utilizados como
marcador en la presente invención se contempla que incluyan
variantes naturales de dicha proteína, así como fragmentos o
complejos naturales de dicha proteína o de dicha variante, en
particular fragmentos o complejos inmunológicamente detectables,
respectivamente.
Tal como resultará evidente para el experto en
la materia, la presente invención no debe interpretarse como
limitada a la medición de la proteína NNMT de longitud completa de
secuencia SEC ID nº 1. También pueden medirse fragmentos
fisiológicos de NNMT y utilizarse como marcador para el cáncer de
pulmón durante la práctica de la presente invención. Los fragmentos
inmunológicamente detectables preferentemente comprenden por lo
menos 6, 7, 8, 10, 12, 15 ó 20 aminoácidos contiguos de dicho
polipéptido marcador. El experto en la materia reconocerá que las
proteínas que son liberadas por las células o que se encuentran
presentes en la matriz extracelular pueden resultar dañadas, por
ejemplo durante la inflamación, y podrían ser degradadas o cortadas
en dichos fragmentos. Tal como apreciará el experto en la materia,
NNMT o fragmentos de la misma también pueden encontrarse presentes
como parte de un complejo. Dicho complejo también puede utilizarse
como marcador en el sentido de la presente invención. Además, o
alternativamente, el polipéptido NNMT puede incluir una modificación
post-traduccional, preferentemente una
glucosilación, acilación y/o fosforilación, y dicha NNMT modificada
también puede servir como marcador del LC.
La expresión "evaluación del cáncer de
pulmón" se utiliza para indicar que el método según la presente
invención ayudará (solo o conjuntamente con otros marcadores o
variables, por ejemplo los criterios proporcionados por la UICC
(ver anteriormente)), por ejemplo, al médico para establecer o
confirmar la ausencia o presencia del LC, o ayudará al médico en el
pronóstico, detección de la recurrencia (en el seguimiento de los
pacientes tras la cirugía) y/o en el seguimiento del tratamiento,
especialmente de la quimioterapia.
El término "muestra" tal como se utiliza en
la presente memoria se refiere a una muestra biológica obtenida con
el propósito de la evaluación in vitro. En los métodos de la
presente invención, la muestra o muestra del paciente
preferentemente puede comprender cualquier líquido corporal. Son
muestras preferentes, sangre completa, suero, plasma, lavado
bronquial o esputo, respectivamente, siendo los más preferentes
plasma o suero.
Los inventores de la presente invención
inesperadamente han podido detectar el marcador NNMT en un
porcentaje significativo de muestras derivadas de pacientes con LC.
Todavía más inesperadamente, han podido demostrado que la presencia
de NNMT en dicha muestra líquida obtenida de un individuo puede
utilizarse en la evaluación del cáncer de pulmón.
En una realización preferente, la presente
invención se refiere a un método para evaluar el LC mediante la
medición en una muestra, de la concentración de NNMT y la
utilización de la concentración determinada en la evaluación del
LC.
Tal como apreciará el experto en la materia,
cualquiera de dichas mediciones se realiza in vitro. La
muestra del paciente se descarta posteriormente. La muestra del
paciente se utiliza únicamente para el método diagnóstico in
vitro de la invención y el material de la muestra del paciente
no se transfiere nuevamente al cuerpo del paciente. Típicamente la
muestra es una muestra líquida, por ejemplo sangre completa, suero o
plasma.
Tal como apreciará el experto en la materia a
partir de los ejemplos descritos, NNMT ha sido identificada
mediante la medición en un inmunoensayo como marcador que resulta
útil en el diagnóstico del LC; pueden utilizarse maneras
alternativas para alcanzar un resultado comparable a los resultados
de la presente invención. La proteína marcadora NNMT puede
detectarse mediante cualquier medio apropiado y utilizarse como
marcador del LC. Dichos medios apropiados preferentes comprenden la
detección de la NNMT mediante un procedimiento de inmunoensayo,
mediante cualquier otra forma de ensayo de unión, mediante la
medición de su actividad enzimática, mediante cromatografía
líquida, especialmente cromatografía líquida de alto rendimiento,
mediante electroforesis, especialmente SDS-PAGE en
combinación con transferencia western y mediante espectroscopía de
masas.
El escenario ideal para el diagnóstico sería una
situación en la que un único suceso o proceso causaría la
enfermedad respectiva, tal como, por ejemplo, en enfermedades
infecciosas. En los demás casos, el diagnóstico correcto puede
resultar muy difícil, especialmente en el caso de que la etiología
de la enfermedad no se entiende por completo, tal como ocurre con
el LC. Tal como apreciará el experto en la materia, ningún marcador
bioquímico, por ejemplo en el campo del LC, es diagnóstico con una
especificidad del 100% y simultáneamente con una sensibilidad de
100% para una enfermedad dada. Por el contrario, pueden utilizarse
marcadores bioquímicos, por ejemplo CYFRA 21-1,
CEA, NSE, SCC, o tal como se muestra en la presente memoria, NNMT,
par evaluar con una determinada probabilidad o valor predictivo, la
presencia o ausencia de una enfermedad. Por lo tanto, en el
diagnóstico clínico rutinario, generalmente se consideran
conjuntamente diversos síntomas clínicos y marcadores biológicos en
el diagnóstico, tratamiento y control de la enfermedad
subyacente.
Los marcadores bioquímicos pueden determinarse
individualmente o, en una realización preferente de la invención,
pueden medirse simultáneamente utilizando un chip o una tecnología
de matrices basada en perlas. Las concentraciones de los marcadores
biológicos seguidamente se interpretan individualmente utilizando un
valor de corte individual para cada marcador o se combinan para la
interpretación.
En una realización preferente adicional, la
evaluación del LC según la presente invención se lleva a cabo en un
método que comprende medir en una muestra la concentración de: a)
NNMT, b) uno o más otros marcadores de cáncer de pulmón, y c)
utilizando la concentración determinada en las etapas (a) y (b) en
la evaluación del cáncer de pulmón. Tal como resultará evidente
para el experto en la materia, la medición de la NNMT y la medición
del marcador o marcadores de cáncer de pulmón pueden realizarse
alternativamente a partir de la misma alícuota de una muestra, o a
partir de diferentes alícuotas.
Según los datos mostrados en la sección de
Ejemplos, el marcador NNMT, tanto en el análisis univariante como
en el análisis multivariante realizados, presenta (a una
especificidad de aproximadamente 95%), una sensibilidad notable
para el LC, de prácticamente 50%, y a este respecto se encontró que
era comparable o incluso superior a otros marcadores del LC
investigados. En la evaluación del LC, el marcador NNMT resultará
ventajoso en uno o más de los aspectos siguientes: cribado, ayuda
al diagnóstico, pronóstico, seguimiento de la terapia, tal como la
quimioterapia, la radioterapia y la inmunoterapia.
\vskip1.000000\baselineskip
El cribado se define como la aplicación
sistemática de un ensayo para identificar los individuos bajo
suficiente riesgo de sufrir LC para beneficiarse de la
investigación adicional o la acción preventiva directa, de entre
personas que no han buscado atención médica respecto a síntomas de
LC.
Tal como demuestran los datos proporcionados en
la sección de Ejemplos, NNMT por sí solo no resulta suficiente para
permitir un cribado general, por ejemplo de la población de riesgo
de LC. Con toda probabilidad ningún marcador bioquímico en
circulación cumplirá jamás los criterios de sensibilidad y
especificidad requeridos para los fines de cribado. Por el
contrario, debe esperarse que resulte necesario utilizar un panel de
marcadores en el cribado del LC. Los datos establecidos en la
presente invención indican que el marcador NNMT formará una parte
integral de un panel de marcadores apropiados para fines de cribado
del LC. Un nivel incrementado de NNMT es indicativo de la presencia
de LC. Los presentes datos indican además que determinadas
combinaciones de marcadores resultarán ventajosas en el cribado del
LC. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a la
utilización de un panel de marcadores que comprende NNMT y CYFRA
21-1, o de un panel de marcadores que comprende
NNMT y CEA, o de un panel de marcadores que comprende NNMT y NSE, o
de un panel de marcadores que comprende NNMT y SCC, o de un panel
de marcadores que comprende NNMT y dos marcadores seleccionados de
entre el grupo que consiste de CYFRA 21-1, CEA, NSE
y SCC, con el fin de cribado del LC.
Los marcadores pueden ayudar al diagnóstico
diferencial de enfermedades benignas y malignas en un órgano
particular, o ayudar a distinguir entre diferentes tipos
histológicos de un tumor. Tal como informan Molina R. et al.,
Tumor Biol. 24:209-218, 2003, CEA, CA 125, CYFRA
21-1, SSC y NSE fueron utilizados como marcadores
séricos para ayudar al diagnóstico histológico del LC. Los
resultados de este estudio también indican que, de entre los
marcadores analizados, CYFRA 21-1 es el marcador más
sensible en el cáncer de pulmón, aunque sin relación con los
resultados histológicos.
Debido a que NNMT como marcador único según los
datos de la presente invención podría resultar superior a otros
marcadores del LC tales como CEA o NSE, debe esperarse que NNMT se
utilizará como ayuda al diagnóstico, especialmente mediante el
establecimiento de un valor de línea base antes de la cirugía. De
esta manera, la presente invención también se refiere a la
utilización de NNMT para establecer un valor de línea base antes de
la cirugía de LC.
Los indicadores pronósticos pueden definirse
como características clínicas, patológicas o bioquímicas de los
pacientes de cáncer y sus tumores que predicen el resultado de la
enfermedad. Su utilización principal es ayudar a planificar
racionalmente el control del paciente, es decir, a evitar el
infratratamiento de una enfermedad agresiva, o el sobretratamiento
de una enfermedad indolente. Molina R. et al., Tumor Biol.
24:209-218, 2003, evaluaron el valor pronóstico de
CEA, CA 125, CYFRA 21-1, SSC y NSE en el NSCLC, por
ejemplo se evaluó la supervivencia global de los pacientes, en los
que los niveles séricos anormales de los marcadores NSE, CEA y LDH
(lactato deshidrogenasa) aparentemente indican una supervivencia más
corta.
Debido a que NNMT por sí solo contribuye
significativamente a la diferenciación de los pacientes de LC de
los controles sanos, debe esperarse que ayude a evaluar el
pronóstico de los pacientes que sufren LC. El nivel preoperatorio
de NNMT muy probablemente se combinará con uno o más otros
marcadores de LC y/o el sistema de estadificación TNM. En una
realización preferente, NNMT se utiliza en el pronóstico de
pacientes que presentan LC.
Merle P. et al., Int. J. of Biological
Markers 19:310-315, 2004, han evaluado las
variaciones del nivel sérico de CYFRA 21-1 en
pacientes con NSCLC localmente avanzado tratado mediante
quimioterapia de inducción. Concluyeron que el seguimiento precoz
de los niveles séricos de CYFRA 21-1 podría resultar
una herramienta pronóstica útil para la respuesta tumoral y la
supervivencia en pacientes de NSCLC de estadio III. Además, algunos
informes han descrito la utilización de CEA en el seguimiento del
tratamiento de pacientes que presentan LC (Fukasawa T. et
al., Gan to Kagaku Ryoho. Cancer & Chemotherapy
13:1862-1867, 1986 (en japonés); Zhang H. et
al., Shandong Yike Daxue Xuebao 39:537-538,
2001, 541 (en chino)). La mayoría de estos estudios eran
retrospectivos, no aleatorizados y contenían un número reducido de
pacientes. Tal como en el caso de los estudios con CYFRA
21-1, los estudios con CEA sugieren que: a) los
pacientes con una reducción de los niveles de CEA mientras reciben
quimioterapia generalmente presentan un mejor resultado clínico que
aquellos pacientes cuyos niveles de CEA no se redujeron, y (b) para
la práctica totalidad de los pacientes, el incremento de los
niveles de CEA se asoció a progresión de la enfermedad.
Basándose en los datos mostrados en la sección
de Ejemplos, debe esperarse que NNMT sea un marcador por lo menos
tan bueno para el seguimiento de la quimioterapia como CYFRA
21-1 o CEA. Por lo tanto, la presente invención
también se refiere a la utilización de NNMT en el seguimiento de los
pacientes de LC bajo quimioterapia.
Una gran parte de los pacientes que presentan LC
sometidos a resección quirúrgica con objeto de eliminar por
completo el tejido canceroso, posteriormente desarrollan enfermedad
recurrente o metastásica (Wagner H., Chest
117:110-116, 2000; Buccheri G. et al., Ann.
Thorac. Surg. 75:973-980, 2003). La mayoría de estas
recaídas se produce dentro de los primeros 2 a 3 años de la
cirugía. Debido a que la enfermedad recurrente/metastásica
invariablemente es falta, mucha investigación se ha centrado en la
identificación del LC en un estadio precoz y de esta manera,
potencialmente tratable.
En consecuencia, muchos pacientes de LC se
someten a un programa de vigilancia postoperatoria que
frecuentemente incluye el seguimiento regular con CEA. El
seguimiento en serie con CEA un años después de la resección
quirúrgica se ha demostrado que detecta una enfermedad
recurrente/metastásica postoperatoria temprana con una sensibilidad
de aproximadamente 29%, especificidad de aproximadamente 97%,
incluso en ausencia de síntomas o indicios sospechosos (Buccheri G.
et al., Ann. Thorac. Surg. 75:973-980, 2003).
De esta manera, el seguimiento de los pacientes que presentan LC
tras la cirugía es uno de los campos más importantes de utilización
de un marcador bioquímico apropiado. Debido a la elevada
sensibilidad de NNMT en los pacientes investigados que presentaban
LC, se esperaba que NNMT solo o en combinación con uno o más otros
marcadores, resultase de gran ayuda en el seguimiento de los
pacientes de LC, especialmente en los pacientes de LC tras la
cirugía. La utilización de un panel de marcadores que comprenda
NNMT y uno o más otros marcadores de LC en el seguimiento de los
pacientes de LC representa una realización preferente adicional de
la presente invención.
La presente invención se refiere, en una
realización preferente, a la utilización de NNMT en el campo
diagnóstico del LC, o en la evaluación del LC, respectivamente.
En todavía una realización preferente adicional,
la presente invención se refiere a la utilización de NNMT como
molécula marcadora del cáncer de pulmón en combinación con una o más
moléculas marcadores del cáncer de pulmón, en la evaluación del
cáncer de pulmón a partir de una muestra líquida obtenida de un
individuo.
De esta manera, una realización preferente de la
presente invención es la utilización de NNMT como molécula
marcadora del cáncer de pulmón en combinación con una o más
moléculas marcadoras del cáncer de pulmón, en la evaluación del
cáncer de pulmón a partir de una muestra líquida obtenida de un
paciente. Son otros marcadores de LC preferentes seleccionados con
los que puede combinarse la medición de NNMT, CYFRA
21-1, CEA, NSE y SCC. Todavía más preferentemente,
el panel de marcadores utilizado en la evaluación del LC comprende
NNMT y por lo menos otra molécula marcadora seleccionada de entre
el grupo que consiste de CYFRA 21-1 y CEA.
Tal como apreciará el experto en la materia,
existen muchas maneras de utilizar las mediciones de dos o más
marcadores con el fin de mejorar la cuestión diagnóstica bajo
investigación. En un enfoque bastante simple, aunque con frecuencia
eficaz, se supone un resultado positivo en el caso de que una
muestra sea positiva para por lo menos uno de los marcadores
investigados. Éste puede ser el caso, por ejemplo, del diagnóstico
de una enfermedad infecciosa, tal como el SIDA.
Sin embargo, con frecuencia se evalúa una
combinación de marcadores. Preferentemente, los valores medidos de
marcadores de un panel, por ejemplo de CYFRA y de CEA, se combinan
matemáticamente y el valor combinado se correlación con la cuestión
diagnóstica subyacente. Los valores de los marcadores pueden
combinarse mediante cualquier método matemático apropiado del
estado de la técnica. Son métodos matemáticos bien conocidos para
correlacionar una combinación de marcadores con una enfermedad, el
análisis discriminante (AD) (es decir, el AD lineal, cuadrático o
regularizado), los métodos núcleo ("kernel"; es decir SVM), los
métodos no paramétricos (es decir, clasificadores del vecino k más
próximo), PLS (mínimos cuadrados parciales), los métodos basados en
árboles de decisión (es decir, regresión logística, CART, métodos de
bosque aleatorio, métodos de boosting/bagging), los modelos
lineales generalizados (es decir, la regresión logística), los
métodos de tipo componentes principales (es decir, SIMCA), los
modelos aditivos generalizados, los métodos de tipo lógica difusa, y
los métodos basados en redes neuronales y algoritmos genéticos. El
experto en la materia no tendrá dificultad en evaluar una
combinación de marcadores de la presente invención.
Preferentemente, el método utilizado para correlacionar la
combinación de marcadores de la invención a, por ejemplo, la
ausencia o presencia de LC, se selecciona de entre AD (análisis
discriminante lineal, cuadrático o regularizado), los métodos núcleo
(es decir, SVM), los métodos no paramétricos (es decir
clasificadores del vecino k más próximo), PLS (mínimos cuadrados
parciales), los métodos basados en árboles de decisión (es decir,
regresión logística, CART, métodos de bosque aleatorio, métodos de
boosting), los modelos lineales generalizados (es decir, la
regresión logística). Pueden encontrarse datos referentes a dichos
métodos estadísticos en las referencias siguientes: Ruczinski I.
et al., J. of Computational and Graphical Statistics
12:475-511, 2003; Friedman J.H., J. of the American
Statistical Association 84:165-175, 1989; Hastie T.
et al., The Elements of Statistical Learning, Springer Series
in Statistics, 2001; Breiman L. et al., Classification and
Regression Trees, Wadsworth International Group, Belmont,
California, 1984; Breiman L., Random Forests, Machine Learning
45:5-32, 2001; Pepe M.S., The Statistical Evaluation
of Medical Tests for Classification and Prediction, Oxford
Statistical Science Series 28, 2003; y Duda R.O. et al.,
Pattern Classification, Wiley Interscience, 2a edición, 2001.
Es una realización preferente de la invención
utilizar un valor de corte multivariante optimizado para la
combinación subyacente de marcadores biológicos y para discriminar
el estado A del estado B, por ejemplo enfermo de sano. En este tipo
de análisis, los marcadores ya no son independientes, sino que
forman un panel de marcadores. Podría establecerse que la
combinación de las mediciones de NNMT con las de CYFRA
21-1 o de CEA, respectivamente, mejore
significativamente la exactitud diagnóstica del LC en comparación
con controles sanos.
La exactitud de un método diagnóstico se
describe mejor a partir de las características operativas del
receptor (ROC) (ver especialmente Zweig M.H. y Campbell G., Clin.
Chem. 39:561-577, 1993). El gráfico ROC es un
gráfico de todas las parejas de sensibilidad/especificidad
resultante de modificar continuamente el umbral de decisión a lo
largo del intervalo completo de datos observados.
El rendimiento clínico de un ensayo de
laboratorio depende de su exactitud diagnóstico, o de la capacidad
de clasificar correctamente los sujetos en subgrupos clínicamente
relevantes. La exactitud diagnóstica mide la capacidad del ensayo
de distinguir correctamente dos condiciones diferentes de los
sujetos investigados. Dichas condiciones son, por ejemplo, salud y
enfermedad, o enfermedad benigna frente a maligna.
En cada caso, el gráfico ROC ilustra el
solapamiento entre las dos distribuciones dibujando la sensibilidad
frente a (1 - especificidad para el intervalo completo de umbrales
de decisión). En el eje y está la sensibilidad, o la fracción
positiva verdadera [definida como (número de resultados de ensayo
positivos verdaderos)/(número de resultados de ensayo positivos
verdaderos + número de resultados de ensayo falsos negativos)]. A
esto también se le ha denominado positividad en presencia de una
enfermedad o condición. Se calcula únicamente a partir del subgrupo
afectado. En el eje x está la fracción falsa positiva, o (1 -
especificidad [definida como (número de resultados falsos
positivos)/(número de resultados negativos verdaderos + número de
resultados falsos positivos)]. Es un índice de especificidad y se
calcula completamente a partir del subgrupo no afectado. Debido a
que las fracciones positivas verdaderas y falsas positivas se
calculan de manera completamente separada, mediante la utilización
de los resultados de ensayo de los dos subgrupos diferentes, el
gráfico ROC es independiente de la prevalencia de la enfermedad en
la muestra. Cada punto en el gráfico ROC representa una pareja de
sensibilidad/1-especificidad correspondiente a un
umbral de decisión particular. Un ensayo con discriminación perfecta
(sin solapamiento entre las dos distribuciones de resultados)
presenta un gráfico ROC que pasa a través de la esquina izquierda
superior, en la que la fracción positiva verdadera es 1,0, o 100%
(sensibilidad perfecta), y la fracción falsa positiva es 0
(especificidad perfecta). El gráfico teórico para un ensayo sin
discriminación (distribuciones idénticas de resultados para los dos
grupos) es una línea diagonal en 45º entre la esquina izquierda
inferior y la esquina derecha superior. La mayoría de gráficos se
encuentra entre estos dos extremos (en el caso de que el gráfico
ROC se encuentre completamente debajo de la diagonal en 45º, esto se
soluciona fácilmente invirtiendo el criterio de "positividad"
de "superior a" a "inferior a", o viceversa).
Cualitativamente, cuanto más próximo se encuentre el gráfico a la
esquina izquierda superior, más alta será la exactitud global del
ensayo.
Un objetivo conveniente para cuantificar la
exactitud diagnóstica de un ensayo de laboratorio es expresar su
comportamiento mediante un único número. Este parámetro global, por
ejemplo el denominado "error total", o alternativamente el
"área bajo la curva=AUC". La medida global más común es el área
bajo el gráfico ROC. Convencionalmente este área es siempre
\geq0,5 (si no lo es, puede invertirse la regla de decisión para
que sí lo sea). Los valores se encuentran comprendidos entre 1,0
(separación perfecta de los valores de ensayo de los dos grupos) y
0,5 (sin diferencia aparente entre distribuciones de los dos grupos
de valores de ensayo). El área no depende únicamente de una parte
particular del gráfico, tal como el punto más próximo a la diagonal
o la sensibilidad con especificidad de 90%, sino del gráfico
completo. Ésta es una expresión descriptiva cuantitativa de la
proximidad del gráfico ROC al gráfico perfecto (área=1,0).
La combinación de mediciones de NNMT con otros
marcadores, tales como CYFRA 21-1 o CEA, o con otros
marcadores del LC todavía no descubiertos, NNMT conduce, y
conducirá, respectivamente, a mejoras adicionales en la evaluación
del LC.
La combinación de los dos marcadores, NNMT y
CYFRA 21-1, mejora significativamente la exactitud
diagnóstica del LC. La combinación de los dos marcadores, NNMT y
CEA, también mejora significativamente la exactitud diagnóstica del
LC.
En una realización preferente, la presente
invención se refiere a un método para mejorar la exactitud
diagnóstica de LC frente a controles sanos, mediante la medición en
una muestra de la concentración de por lo menos NNMT y CYFRA
21-1, CEA, NSE o SCC, respectivamente, y la
correlación de las concentraciones determinadas con la presencia o
ausencia de LC, resultando la mejora en que se clasifican
correctamente más pacientes como que sufren LC frente a controles
sanos en comparación con una clasificación basada en un único
marcador investigado por sí solo.
En un método preferente según la presente
invención, se determina por lo menos la concentración de los
marcadores biológicos NNMT y CYFRA 21-1,
respectivamente, y se utiliza la combinación de marcadores en la
evaluación del LC.
En un método preferente adicional según la
presente invención, se determina por lo menos la concentración de
los marcadores biológicos NNMT y CEA, respectivamente, y se utiliza
la combinación de marcadores en la evaluación del LC.
En todavía un método preferente adicional según
la presente invención, se determina por lo menos la concentración
de los marcadores biológicos NNMT, CYFRA 21-1 y CEA,
respectivamente, y se utiliza la combinación de marcadores en la
evaluación del LC.
En todavía un método preferente adicional según
la presente invención, se determina por lo menos la concentración
de los marcadores biológicos NNMT, CYFRA 21-1 y SCC,
respectivamente, y se utiliza la combinación de marcadores en la
evaluación del LC.
Los ejemplos siguientes se proporcionan para
ayudar a la comprensión de la presente invención, el alcance real
de la cual se proporciona en las reivindicaciones adjuntas. Se
entiende que pueden realizarse modificaciones en los procedimientos
proporcionados sin apartarse del espíritu de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generó anticuerpo policlonal contra la
proteína marcadora NNMT de cáncer de pulmón para la utilización
adicional del anticuerpo en la medición de niveles séricos,
plasmáticos y sanguíneos de NNMT mediante ensayos de
inmunodetección, por ejemplo transferencia western y ELISA.
Con el fin de generar anticuerpos contra NNMT,
se llevó a cabo la expresión recombinante de la proteína para la
obtención de inmunógenos. La expresión se realizó mediante la
aplicación de una combinación del sistema de expresión RTS 100 y la
expresión en E. coli. En una primera etapa, se analizó la
secuencia del ADN y se obtuvieron recomendaciones para variantes
mutacionales silenciosas de ADNc de alto rendimiento y secuencias
de cebador de PCR respectivas, utilizando el sistema "ProteoExpert
RTS E. coli HY". Éste es un servicio comercial en
internet (www.proteoexpert.com). Mediante la utilización de las
parejas de cebadores recomendadas, se utilizó el sistema "RTS 100
E. coli Lineal Template Generation Set,
His-tag" (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Alemania, nº de cat. 3186237) para generar moldes lineales de PCR a
partir del ADNc y para la transcripción y expresión in vitro
de la secuencia de nucleótidos codificante de la proteína NNMT. Para
la detección mediante transferencia western y la purificación
posterior, la proteína expresada contenía una etiqueta de His. Se
identificó la variante de mejor expresión. Todas las etapas entre la
PCR y la expresión y detección se llevaron a cabo siguiendo las
instrucciones del fabricante. El producto de PCR respectivo, que
contenía todas las regiones reguladoras de T7 necesarias (promotor,
sitio de unión ribosómica y terminador de T7) se clonaron en el
vector pBAD TOPO® (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania, nº de cat.
K4300/01) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la
expresión de las secuencias reguladoras de T7, el constructo se
transformó en E. coli BL 21 (DE 3) (Studier F.W. et
al., Methods Enzymol. 185:60-89, 1990) y las
bacterias transformadas se cultivaron en un lote de 1 litro para la
expresión de proteínas.
La purificación de la proteína de fusión
His-NNMT se realizó siguiendo los procedimientos
estándares en una columna de quelato de Ni. Brevemente, se peletizó
mediante centrifugación un cultivo bacteriano de 1 litros que
contenía el vector de expresión para la proteína de fusión
His-NNMT. El pellet celular se resuspendió en
tampón de lisis, que contenía fosfato, pH 8,0, cloruro de guanidinio
7 M, imidazol y tioglicerol, seguido de homogeneización utilizando
un Ultra-Turrax®. El material insoluble se peletizó
mediante centrifugación de alta velocidad y el sobrenadante se
aplicó a una columna cromatográfica de quelato de Ni. La columna se
lavó con varios volúmenes de lecho de tampón de lisis, seguido de
lavados con tampón, que contenía fosfato, pH 8,0, y urea.
Finalmente, el antígeno unido se eluyó utilizando un tampón fosfato
que contenía SDS bajo condiciones ácidas.
Para la inmunización, se preparó una emulsión
fresca de la solución de proteína (100 \mug/ml de proteína NNMT)
y adyuvante completo de Freund en una proporción de 1:1. Se inmunizó
cada conejo con 1 ml de la emulsión los días 1, 7, 14 y 30, 60 y
90. Se extrajo sangre y el suero anti-NNMT
resultante se utilizó para experimentos adicionales, tal como se
describe en los Ejemplos 3 y 4.
Se diluyó un volumen de suero de conejo con 4
volúmenes de tampón acetato (60 mM, pH 4,0). Se ajustó el pH a 4,5
con base Tris 2 M. Se añadió gota a gota ácido caprílico (25
\mul/ml de muestra diluida) bajo agitación vigorosa. Tras 30
minutos, la muestra se centrifugó (13.000xg, 30 minutos, 4ºC), se
descartó el pellet y se recogió el sobrenadante. Se ajustó el pH
del sobrenadante a 7,5 mediante la adición de base Tris 2 M y se
filtró (0,2 \mum).
La inmunoglobulina en el sobrenadante se
precipitó bajo agitación vigorosa mediante la adición gota a gota
de una solución de sulfato amónico 4 M hasta una concentración final
de 2 M. Las inmunoglobulinas precipitadas se recogieron mediante
centrifugación (8.000xg, 15 minutos, 4ºC).
Se descartó el sobrenadante. El pellet se
disolvió en NaH2PO4/NaOH 10 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM y se dializó
exhaustivamente. El dializado se centrifugó (13.000xg, 15 minutos,
4ºC) y se filtró (0,2 \mum).
Se llevó IgG policlonal de conejo a 10 mg/ml en
NaH2PO4/NaOH 10 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM. Por cada ml de solución de
IgG, se añadieron 50 \mul de
biotín-N-hidroxisuccinimida (3,6
mg/ml en DMSO). Tras 30 minutos a temperatura ambiente, se
cromatografió la muestra en Superdex 200 (NaH2PO4/NaOH 10 mM, pH
7,5, NaCl 30 mM). Se recogió la fracción que contenía IgG
biotinilado. Se han biotinilado anticuerpos monoclonales siguiendo
el mismo procedimiento.
Se llevó IgG policlonal de conejo a 10 mg/ml en
NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, NaCl 30 mM, pH 7,5. Por cada ml de
solución de IgG, se añadieron 50 \mul de
N-hidroxisuccinimida éster de ácido
dioxigenín-3-O-metilcarbonil-\varepsilon-aminocaproico
(Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania, nº de cat. 1 333 054) (3,8
mg/ml en DMSO). Tras 30 minutos a temperatura ambiente, la muestra
se cromatografió en Superdex® 200 (NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH
7,5, NaCl 30 mM). Se recogieron las fracciones que contenían IgG
digoxigenilado. Se han marcado anticuerpos monoclonales con
digoxigenina siguiendo el mismo procedimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la detección de NNMT en suero o plasma
humano, se desarrolló una ELISA sándwich. Para la captura y
detección del antígeno, se conjugaron alícuotas del anticuerpo
policlonal anti-NNMT (ver el Ejemplo 2) con biotina
y con digoxigenina, respectivamente.
Se incubaron placas de microtitulación de 96
pocillos recubiertas con estreptavidina, con 100 \mul de
anticuerpo policlonal anti-NNMT biotinilado durante
60 minutos a una concentración de 10 \mug/ml en fosfato 10 mM, pH
7,4, BSA al 1%, NaCl al 0,9% y Tween 20 al 0,1%. Tras la incubación,
las placas se lavaron tres veces con NaCl 0,9%, Tween 20 al 0,1%. A
continuación, los pocillos se incubaron durante 2 horas con una
dilución en serie de la proteína recombinante (ver el Ejemplo 2)
como antígeno estándar, o con muestras diluidas de plasma
procedentes de pacientes. Tras la unión de NNMT, las placas se
lavaron tres veces con NaCl al 0,9%, Tween 20 al 0,1%. Para la
detección específica de NNMT unido, los pocillos se incubaron con
100 \mul de anticuerpo policlonal anti-NNMT
digoxigenilado durante 60 minutos a una concentración de 10
\mug/ml en fosfato 10 mM, pH 7,4, BSA al 1%, NaCl al 0,9% y Tween
20 al 0,1%. A continuación, las placas se lavaron tres veces para
eliminar el anticuerpo no unido. En una etapa posterior, los
pocillos se incubaron con 20 mU/ml de conjugados de
anti-digoxigenina-POD (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, nº de catálogo 1633716)
durante 60 minutos en fosfato 10 mM, pH 7,4, BSA al 1%, NaCl al
0,9% y Tween 20 al 0,1%. Las placas seguidamente se lavaron tres
veces con el mismo tampón. Para la detección de los complejos de
antígeno-anticuerpo, los pocillos se incubaron con
100 \mul de solución de ABTS (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Alemania, nº de catálogo 11685767) y se midió la DO tras 30 a 60
minutos a 405 nm con un lector ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
En un primer estudio, se utilizaron muestras
derivadas de 56 pacientes bien caracterizados de LC con la
clasificación según UICC proporcionada en la Tabla 1. El estudio de
esta cohorte se centraba en NSCLC (50 muestras), debido a que esta
forma de LC presenta un mejor pronóstico que el tipo SC, y de esta
manera su detección precoz resulta especialmente importante.
Las muestras de LC de la Tabla 1 se evaluaron en
comparación con muestras de control obtenidas de 121 individuos
evidentemente sano sin ninguna enfermedad pulmonar maligna conocida
(=cohorte de control).
\vskip1.000000\baselineskip
Se calculó la sensibilidad de cada marcador a un
nivel de especificidad común de 95% para cada marcador individual
sometido a ensayo. La Tabla 2 proporciona la sensibilidad en
porcentaje para cada uno de los marcadores de LC más
prometedores.
Tal como resulta fácilmente evidente a partir de
la Tabla 2, se encontró que el marcador NNMT presentaba la segunda
sensibilidad más alta para LC de entre todos los marcadores
investigados, tras CYFRA 21-1. El marcador CEA
aparentemente presentaba una sensibilidad significativamente más
baja, mientras que NSE aparentemente presentaba un comportamiento
pobre.
\vskip1.000000\baselineskip
Se clasificó un individuo como presentando LC en
el caso de que por lo menos uno de los marcadores de la combinación
respectiva excediese un determinado umbral. Estos valores de corte
se definieron de manera que proporcionasen una especificidad de 95%
respecto a la cohorte de control.
La Tabla 3 presenta los resultados de
clasificación de pacientes diagnosticados con LC frente a controles
sanos.
La combinación de los marcadores NNMT y Cyfra
21-1 en este análisis proporcionó la sensibilidad
más alta a un nivel de especificidad de 95%. Se han evaluado
diversos otros marcadores en combinación con NNMT. Tal como se
muestra en la Tabla 3, CEA en combinación con NNMT también conduce a
una mejora significativa de la sensibilidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Un segundo estudio totalmente independiente del
primero se centró en los tipos principales de NSCLC, adenocarcinoma
y carcinoma de células escamosas. La Tabla 4a describe la
distribución de tipos y estadios de la cohorte de cánceres.
Se definió más específicamente la cohorte de
control en el presente estudio para que contuviese muestras de
fumadores y no fumadores, tal como se describe en la Tabla 4b. Se
llevó a cabo un ensayo de función pulmonar (espirometría, Miller
M.R. et al., Eur. Respir. J. 26:319-338,
2005) con cada individuo. Las muestras se incluyeron en la cohorte
de control únicamente en el caso de que el resultado del donante en
el ensayo de función pulmonar se encontrase dentro del intervalo
normal.
Se calculó la sensibilidad de cada marcador tal
como anteriormente, basándose en las muestras indicadas en la Tabla
4b. Se proporciona la sensibilidad (en porcentaje) a un nivel de
especificidad común de 95% para cada marcador individual sometido a
ensayo. La Tabla 5 ilustra la sensibilidad para el adenocarcinoma y
el carcinoma de células escamosas, respectivamente, así como la
sensibilidad global de cada uno de los marcadores.
Resulta evidente en este caso que NNMT es
superior a Cyfra 21-1 por dos motivos: en primer
lugar, la sensibilidad global de NNMT es significativamente mejor.
En segundo lugar, y que también resulta muy importante, Cyfra
21-1 indica los adenocarcinoma con menor eficiencia
que los carcinomas de células escamosas, mientras que NNMT funciona
de manera similar con ambos tipos de cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados con las combinaciones de
marcadores en el estudio II se muestran en la Tabla 6. El tipo de
combinación era el mismo que el indicado anteriormente para el
estudio I.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La combinación de dos cualesquiera de los
marcadores investigados conduce a una mejora significativa de la
sensibilidad de la combinación de marcadores en comparación con la
sensibilidad obtenida al utilizar los marcadores individualmente
(comparar el conjunto de marcadores nº 7 con los conjuntos nº 1 y nº
2, a título ilustrativo). Se obtiene cierto beneficio mediante la
adición de un tercer marcador (comparar los conjuntos nº 8 y nº 10).
La combinación de los cuatro marcadores (conjunto nº 14), sin
embargo, no proporciona un mejor comportamiento que el mejor
conjunto de tres (conjunto nº 10).
Las combinaciones dobles y triples que
comprenden NNMT en todos los casos son mejores que las
correspondientes que presentan NNMT en lugar de cualquier otro
marcador.
En resumen, NNMT solo demuestra una buena
sensibilidad en la detección de los dos tipos principales de cáncer
de pulmón NSC. Se obtuvieron resultados muy impresionantes
utilizando una combinación de NNMT con Cyfra 21-1
y/o CEA, respectivamente. La utilización de una combinación que
comprendía los tres marcadores, se clasificaron correctamente 93%
de las muestras de cáncer y 95% de los controles.
Claims (9)
1. Método para la evaluación del cáncer de
pulmón in vitro, que comprende medir en una muestra la
concentración de proteínas de:
a) nicotinamida
N-metiltransferasa (NNMT),
b) opcionalmente otro u otros marcadores de
cáncer de pulmón, y
c) utilizar la concentración determinada en la
etapa (a), y opcionalmente en la etapa (b), en la evaluación de
cáncer de pulmón, en la que un incremento de NNMT es indicativo de
cáncer de pulmón.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho otro u otros marcadores se selecciona de entre el grupo que
consiste de CYFRA 21-1, CEA, NSE y SCC.
3. Método según la reivindicación 2, en el que
dicho otro u otros marcadores es CYFRA 21-1.
4. Método según la reivindicación 2, en el que
dicho otro u otros marcadores es CEA.
5. Método según la reivindicación 2, en el que
dicho otro u otros marcadores es SCC.
6. Utilización in vitro de la
concentración de proteína NNMT en la evaluación del cáncer de
pulmón.
7. Utilización in vitro de un panel de
marcadores que comprende la concentración de proteína NNMT y otro u
otros marcadores del cáncer de pulmón en la evaluación del cáncer de
pulmón.
8. Utilización del panel de marcadores según la
reivindicción7, en la que el otro u otros marcadores se seleccionan
de entre el grupo que consiste de CYFRA 21-1, CEA,
NSE y SCC.
9. Utilización de un panel de marcadores según
la reivindicación 8, que comprende por lo menos NNMT y CYFRA
21-1.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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