CN106645722A

CN106645722A - 一种肺癌筛查试剂盒

Info

Publication number: CN106645722A
Application number: CN201610902897.6A
Authority: CN
Inventors: 周斌; 张�林; 王艳云
Original assignee: West China Second University Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Second University Hospital of Sichuan University
Priority date: 2016-10-17
Filing date: 2016-10-17
Publication date: 2017-05-10
Anticipated expiration: 2036-10-17
Also published as: CN106645722B

Abstract

本发明公开了一种肺癌筛查试剂盒，它包括任选的用于检测磷酸化MUSK表达水平的试剂。本发明还公开了检测磷酸化MUSK表达水平的试剂在制备肺癌筛查用试剂中的用途。本发明试剂盒通过检测磷酸化MUSK的表达水平，可以判断待检人群患肺癌的风险，可用于临床肺癌的辅助诊断，为患者采取相关的治疗措施或者决策提供有效的依据，临床应用前景良好。

Description

一种肺癌筛查试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肺癌筛查试剂盒。

背景技术

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，目前发病率居世界首位，严重威胁着人类健康和生命。

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明确，大量资料表明，长期大量吸烟与肺癌的发生有非常密切的关系。已有的研究证明：长期大量吸烟者患肺癌的概率是不吸烟者的10～20倍，开始吸烟的年龄越小，患肺癌的几率越高。此外，吸烟不仅直接影响本人的身体健康，还对周围人群的健康产生不良影响，导致被动吸烟者肺癌患病率明显增加。城市居民肺癌的发病率比农村高，这可能与城市大气污染和烟尘中含有致癌物质有关。

肺癌的病因复杂，一般认为影响因素包括：①吸烟；②环境污染：如雾霾、室内装修；③不良生活方式：如饮食习惯差、生活压力大；④慢性肺部疾病：如肺结核、尘肺，矽肺、慢性支气管炎；⑤人体内在因素：如家族遗传、免疫机能降低、内分泌功能失调等。

同时，肺癌是一种善于隐匿的疾病，经常在疾病发展到晚期才表现出临床症状，70～80％的肺癌患者在诊断出患有肺癌症状时已是中、晚期，癌细胞已经扩散，错过了最佳治愈时机，五年生存率低。对于早期的肺癌患者，经过及时治疗可大大提高患者的5年及以上生存率和生存质量。因此肺癌的早期诊断和进行有效的筛查至关重要。

肺癌的筛查，是指对那些没有肺癌相关症状的人群进行常规体检，在出现症状前及时发现肺癌。如果可以找到肺癌分子标志物，用于提示临床医生早期对患者采取相关的治疗措施或者决策具有重要的意义。

申请号为CN201110328294.7，名称为一种有关肺癌诊断试剂盒用于肺癌的检测方法的发明专利，公开了一种有关肺癌诊断试剂盒用于肺癌的检测方法，通过基因重组技术纯化生产S100A2蛋白，纯化的S100A2蛋白，注射于动物体内以诱导产生特异性结合S100A2蛋白的多克隆抗体，另一方面方面，提供了一种肺癌的诊断试剂盒，该试剂盒含有容器，容器中含有S100A2蛋白；以及标签，所述标签说明所述试剂盒用于诊断肺癌。还含有抗S100A2蛋白的特异性抗体。试剂盒中或含有免疫组化相关试剂：PBS缓冲液，或0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液，或3%H2O2溶液，或辣根酶检测试剂，本发明深入地研究和大规模验证S100A2与肺癌的相关性，研究出可供临床应用的检测试剂，对肺癌进行诊断及为患者提供个体化辅助治疗方法。

申请号为CN201510069543.3，名称为一种用于肺癌诊断的SALL4免疫组织化学检测试剂盒的发明专利，公开了一种用于肺癌诊断的SALL4免疫组织化学检测试剂盒、使用方法及应用，属于医学和生物学检测领域。本发明的试剂盒包括如下组分：阳性对照、阴性对照、一抗、二抗、固定剂、脱脂和透明剂、复水剂、脱水剂、缓冲液A、缓冲液B、抗原修复剂、通透剂、过氧化物酶失活剂、非特异性蛋白阻断剂、显色液和染色剂。本发明的试剂盒，具有特异性高、敏感性高、差异性表达的特点，不仅可以有效地区分肺癌组织和正常组织，还可为肺癌个体化治疗提供新的诊断和分类依据，可最大程度地将肺癌的检出时间提前，解决了现有检测手段灵敏度都相对较低、难以实现肺癌的早期监测的问题，具有较高的临床应用价值和社会效益。

目前，暂未见有包括有用于检测肺组织中磷酸化MUSK表达水平的试剂的试剂盒，以及检测肺组织中磷酸化MUSK表达水平的试剂在制备肺癌诊断用试剂中的用途的相关报道。

发明内容

本发明提出了一种肺癌筛查试剂盒，实现了预测待检人群患肺癌的风险的目的。

本发明的肺癌筛查试剂盒，它包括任选的用于检测磷酸化MUSK表达水平的试剂。

进一步的，所述试剂是用于检测肺组织中磷酸化MUSK表达水平的试剂。

进一步的，所述检测磷酸化MUSK表达水平的试剂为免疫组化检测方法用试剂。

进一步的，所述检测磷酸化MUSK表达水平的试剂为Western Blot或ELISA检测方法用试剂。

本发明还提供了检测磷酸化MUSK表达水平的试剂在制备肺癌筛查用试剂中的用途。

本发明带来的有益效果有：

本发明试剂盒通过检测磷酸化MUSK的表达水平，可以判断肺癌组织与正常肺组织的磷酸化MUSK表达水平差异，进而判断待检人群患肺癌的风险：若磷酸化MUSK的表达水平高，则患肺癌的风险高，若磷酸化MUSK的表达水平低，则患肺癌的风险低，可用于临床肺癌的辅助诊断，临床应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

实施例1 肺癌筛查试剂盒

一种肺癌筛查试剂盒，它包括任选的用于检测磷酸化MUSK表达水平的试剂。

本发明所述试剂是用于检测肺组织中磷酸化MUSK表达水平的试剂。

本发明所述检测磷酸化MUSK表达水平的试剂为免疫组化检测方法用试剂。

本发明所述试剂盒内的试剂包括：磷酸化MUSK抗体、抗体稀释液、抗原修复液、洗涤液、二抗、DAB显色剂和免疫组化笔。

本发明所述检测磷酸化MUSK表达水平的试剂为Western Blot或ELISA检测方法用试剂。

实施例2检测磷酸化MUSK表达水平的试剂在制备肺癌筛查用试剂中的用途

检测磷酸化MUSK表达水平的试剂在制备肺癌筛查用试剂中的用途。所述试剂是用于检测肺组织中磷酸化MUSK表达水平的试剂。所述检测磷酸化MUSK 表达水平的试剂为免疫组化检测方法用试剂。所述检测磷酸化MUSK表达水平的试剂为Western Blot或ELISA检测方法用试剂。

实施例3 磷酸化MUSK表达水平与肺癌的关系

1、选取肺癌患者石蜡切片20例，远端组织对照20例，基本信息见表1。

表1 临床基本信息

^*注：其他包括大细胞癌、腺鳞癌、小细胞癌。

2、磷酸化MUSK表达水平的检测

MUSK（muscle associated receptor tyrosine kinase，肌肉特异性酪氨酸激酶），MUSK免疫原经过磷酸化，用其制备的抗体就称之为磷酸化MUSK。

本发明对肺癌患者石蜡切片、远端组织对照石蜡切片，进行免疫组化（IHC)。

本发明采用的磷酸化MUSK抗体：兔多克隆抗体（购自abcam公司，货号：ab192583）。

本发明采用的二抗、抗体稀释液、DAB显色剂、抗原修复液、Wash Buffer、免疫组化笔均购自丹麦Dako公司。

本发明中的洗涤液采用蒸馏水。

本发明按照如下方法检测磷酸化MUSK的表达水平：

（1）封闭过氧化物酶：取石蜡切片进行脱蜡，脱蜡至水化后，用3% H₂O₂溶液于暗处封闭内源性过氧化物酶，室温孵育15 min。

（2）蒸馏水漂洗：切片置于蒸馏水中，摇床上洗5 min/次，共三次。

（3）抗原修复：加入pH 8.0的Tris-EDTA或pH 6.0的柠檬酸钠溶液，在95℃水浴锅中水浴50 min，进行抗原修复。

（4）蒸馏水漂洗：取出切片，自然冷却至室温后，用蒸馏水冲洗三遍，再用WashBuffer润洗一次。

（5）孵育一抗：用免疫组化笔将组织圈住，在圈内滴加磷酸化MUSK抗体液，4 ℃孵育过夜。

（6）蒸馏水漂洗：用蒸馏水洗三遍，Wash Buffer润洗一次。

（7）滴加二抗：滴加Dako HRP标记的二抗工作液，室温孵育60 min。

（8）蒸馏水漂洗：流水冲洗3-5 min，双蒸水漂洗3次；Wash Buffer润洗一次。

（9）DAB显色：滴加DAB显色剂，在显微镜下观察显色情况，于蒸馏水中终止反应。

（10）苏木素复染：将切片放入苏木素染液中染色2 min，1%盐酸酒精分化后，流水冲洗10 min。

（11）脱水透明：经80%、95%、100%梯度酒精脱水、二甲苯透明，于通风厨中干燥。

（12）封片：用中性快干胶封片，在光学显微镜下观察，DP Controller图像采集系统采图。采图后，根据肺癌患者和远端组织的肿瘤细胞染色强度及阳性面积给予免疫组化评分。

3、免疫组化评分标准

肿瘤细胞染色强度*肿瘤细胞阳性面积=0-9分，

结果统计：阴性：0分；低度阳性：1-3分；高度阳性>3分。

其中，肿瘤细胞染色强度、阳性面积的评分如下：

^@注：由两名经验丰富的病理医生独立对肿瘤细胞染色强度结果进行评分

4、结果分析

采用SPSS17.0对肺癌组织组和远端组织对照组进行统计学分析。

5、实验结果

肺癌组织与远端组织对照中磷酸化MUSK的表达水平检测结果见表2。

表2 磷酸化MUSK的表达水平

由表2可见，远端正常组织中磷酸化MUSK的阳性表达率为15%，肺癌组织中的磷酸化MUSK阳性表达率为80%，磷酸化MUSK在肺癌组织中显著升高，与远端正常组织相比，磷酸化MUSK表达水平差异具有统计学意义（P<0.01）。

由以上结果可以看出，与癌旁正常肺组织相比，肺癌组织的磷酸化MUSK表达水平显著升高（P<0.01），说明肺癌与磷酸化MUSK表达水平呈正相关，磷酸化MUSK的高表达会显著提高患肺癌的可能性。由于癌旁正常肺组织的磷酸化MUSK水平可反应正常人肺组织的磷酸化MUSK水平，因此，可以通过检测待检人群的磷酸化MUSK 的表达水平，将肺癌的易感人群筛查出来。

实施例4 本发明检测肺组织磷酸化MUSK表达水平的试剂盒的组成及其使用方法

1、试剂盒的组成

检测试剂盒（50人份）：

本表格按每张切片滴加各类实验试剂为100μl/张，具体用量可根据组织大小适当增减。

2、试剂盒的使用方法

将待检样本肺组织，制备石蜡切片，作为检测标本，按照如下方法检测磷酸化MUSK的表达水平。

（1）封闭过氧化物酶：取检测标本进行脱蜡，脱蜡至水化后（脱蜡过程如下：二甲苯Ⅰ 10min→二甲苯Ⅱ 10min→无水乙醇 5min→95%乙醇5min→85%乙醇 5min→75%乙醇5min），用3% H₂O₂溶液于暗处封闭内源性过氧化物酶，室温孵育15 min。

（5）孵育一抗：用免疫组化笔将组织圈住，在圈内滴加磷酸化MUSK抗体液，（磷酸化MUSK抗体液为磷酸化MUSK抗体与抗体稀释液混合配制，二者比例为磷酸化MUSK/抗体稀释液=1/100），4 ℃孵育过夜。

（6）蒸馏水漂洗：用蒸馏水洗三遍，Wash Buffer润洗一次。

（8）蒸馏水漂洗：蒸馏水中洗5 min/次，共三次。

（9）DAB显色：滴加显色底物DAB，在显微镜下观察显色情况，于蒸馏水中终止反应。

（11）脱水透明：具体步骤为：80%乙醇1 min→90%乙醇1 min→95%乙醇1 min→无水乙醇Ⅰ 1 min→无水乙醇Ⅱ 1 min→二甲苯Ⅰ 1 min→二甲苯Ⅱ 1 min，于通风厨中干燥。

（12）封片：用中性快干胶封片，在光学显微镜下观察，DP Controller图像采集系统采图。采图后，对检测标本进行免疫组化评分。

综上，磷酸化MUSK在肺组织中的表达水平与肺癌呈正相关。本发明试剂盒通过检测磷酸化MUSK的表达水平，可以判断肺癌组织与正常肺组织的磷酸化MUSK表达水平差异，进而筛查待检人群患肺癌的风险：若磷酸化MUSK的表达水平高，则患肺癌的风险高，若磷酸化MUSK的表达水平低，则患肺癌的风险低，可用于临床肺癌的辅助诊断，为患者采取相关的治疗措施或者决策提供有效的依据，临床应用前景良好。

Claims

1.一种肺癌筛查试剂盒，其特征在于：它包括任选的用于检测磷酸化MUSK表达水平的试剂。

2.根据权利要求1所述的的一种肺癌筛查试剂盒，其特征在于：所述试剂是用于检测肺组织中磷酸化MUSK表达水平的试剂。

3.根据权利要求1或2所述的一种肺癌筛查试剂盒，其特征在于：所述检测磷酸化MUSK表达水平的试剂为免疫组化检测方法用试剂。

4.根据权利要求2所述的一种肺癌筛查试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内的试剂包括：磷酸化MUSK抗体、抗体稀释液、抗原修复液、洗涤液、二抗、DAB显色剂和免疫组化笔。

5.根据权利要求1或2所述的一种肺癌筛查试剂盒，其特征在于：所述检测磷酸化MUSK表达水平的试剂为Western Blot或ELISA检测方法用试剂。

6.检测磷酸化MUSK表达水平的试剂在制备肺癌筛查用试剂中的用途。

7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述试剂是用于检测肺组织中磷酸化MUSK表达水平的试剂。

8.根据权利要求5或6所述的用途，其特征在于：所述检测磷酸化MUSK 表达水平的试剂为免疫组化检测方法用试剂。

9.根据权利要求5或6所述的用途，其特征在于：所述检测磷酸化MUSK 表达水平的试剂为Western Blot或ELISA检测方法用试剂。