CN107884583A - 细胞浆定位的cd133作为肝癌预后标志物的应用 - Google Patents

细胞浆定位的cd133作为肝癌预后标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属生物医学领域，涉及CD133的亚细胞结构定位作为肝癌预后标志物的用途，尤其是细胞浆定位的CD133作为肝癌预后标志物及其在制备肝癌的预后诊断的试剂或试剂盒中的用途。CD133由细胞膜表达转位到细胞浆表达预示着肝癌病人更差的预后；在肝癌细胞系Huh7中证实了存在细胞浆表达的CD133，且CD133的表达促进肝癌细胞的增殖和自我更新能力；本发明为肝癌的预后诊断提供了新的标志物细胞浆定位表达的CD133；该标志物可进一步为肝癌患者的相对个性化的治疗选择提供依据，对采取个性化的治疗和降低肝癌死亡率具有重要的意义。

Description

细胞浆定位的CD133作为肝癌预后标志物的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及CD133作为肝癌预后标志物的用途，具体涉及CD133的亚细胞结构定位作为肝癌预后标志物的用途，尤其是细胞浆定位的CD133作为肝癌预后标志物及其在制备肝癌的预后诊断的试剂或试剂盒中的用途。
背景技术
肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，据WHO统计，肝癌每年的死亡人数达74.5万人，在癌症中死亡率排第二，仅次于肺癌，并且肝癌的发病率还呈逐年上升的趋势。研究显示，肝癌主要分为起源于肝细胞的癌症和由其他组织的癌细胞扩散到肝脏的转移性肝癌，据统计，约90％的肝癌为肝细胞癌，通常肝癌术语所指的是肝细胞癌。
肝癌的预后是指预见患有肝癌的病人的各种情况，如经治疗后从肝癌疾患中全面康复的可能性，经治疗后复发和转移的可能性，研究显示，肝癌患者的预后与诊断时间、疾病严重程度、治疗方案等各种情况具有相关性。业内认为，对肝癌病人疾病的恶性程度和预后较为准确的判断有利于实施相对个性化的治疗方案，如评估为良好预后的患者，可以避免采用将可能引起严重副作用的危险的干预治疗方法，另一方面，对于被评估为较差预后的患者，拟建议采用积极的化疗或手术干预以增加患者的生存期，等等。因此，肝癌患者预后判断的相关标志物的发现则显得非常重要。
资料公开了CD133是具有五次跨膜结构的糖蛋白，通常定位于细胞表面。肿瘤中以CD133分子作为细胞表面标记物的分选证明，CD133表达的细胞具有肿瘤干细胞特点；肿瘤干细胞能够通过自我更新维持自身群体稳定，通过逐步分化和增殖产生具备不同功能的肿瘤细胞并促进肿瘤的形成。研究表明，CD133表达细胞有更强的自我更新能力、成瘤能力、放化疗抵抗能力和迁移能力等，CD133可作为肝癌等多种实体瘤的肿瘤干细胞标志蛋白。有文献报道，CD133高表达的肝癌患者总的生存期和无病生存期均明显比CD133低表达的肝癌患者短(Stephanie Ma等，miR-130b Promotes CD133+Liver Tumor-Initiating CellGrowth and Self-Renewal via Tumor Protein 53-Induced Nuclear Protein 1：CellStem Cell，Volume 7，Issue 6，3December 2010，Pages 694-707)。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供CD133的亚细胞结构定位与肝癌的预后的相关性以及作为肝癌预后标志物在用于制备肝癌的预后诊断的试剂或试剂盒中的用途。
发明内容
本发明的目的在于提供CD133蛋白的新用途，具体涉及CD133的亚细胞结构定位作为肝癌预后标志物的用途，尤其是细胞浆定位的CD133作为肝癌预后标志物及其在制备肝癌的预后诊断的试剂或试剂盒中的用途。
本发明通过免疫组织化学芯片，对多例肝癌组织进行免疫组织化学抗CD133蛋白染色，证实了CD133蛋白存在亚细胞定位的改变-由细胞膜转位到细胞浆；
本发明进一步采用细胞浆表达CD133的肝癌细胞系Huh7试验证实，所述CD133表达具有促进肝癌细胞增殖和自我更新的能力；
本发明的实验结果显示，在CD133表达的肝癌患者当中，CD133的亚细胞结构定位与患者的预后相关，具有细胞浆定位表达CD133的患者预后比细胞膜定位表达CD133的患者预后更差，且CD133的表达促进了肝癌细胞的增殖和自我更新，表明CD133定位到细胞浆的肝癌患者恶性程度更高；实验结果证实，细胞浆定位的CD133可作为肝癌预后的诊断标志物。
本发明的进一步目的是提供CD133蛋白的细胞浆定位在制备肿瘤预后的临床诊断的试剂或试剂盒的应用，通过检测CD133蛋白的亚细胞结构定位诊断肝癌患者的预后。
本发明中，所述的细胞浆定位的CD133蛋白的肿瘤预后诊断试剂或试剂盒是以能够鉴定CD133蛋白的亚细胞结构定位的实验技术结合抗CD133抗体的检测方法，建立起检测CD133蛋白亚细胞结构定位的方法及配套的试剂或试剂盒。
所述的鉴定CD133蛋白的亚细胞结构定位的实验技术，可以是肝癌组织切片免疫组化CD133抗体染色、肝癌组织切片免疫荧光CD133抗体染色、能分离肝癌组织中细胞膜和细胞浆组分并用CD133抗体检测的实验方法等。
所述的针对CD133蛋白的抗体为常规的抗体制备方法所制备，抗CD133蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
所述的试剂或试剂盒，可以是酶联免疫分析ELISA试剂盒、化学发光试剂盒、固态或液态芯片试剂盒，或者根据抗体包被检测抗原的方法制备的其它试剂盒。
本发明为肝癌的预后诊断提供了新的标志物，CD133作为包括肝癌在内的多种肿瘤干细胞标志物，其蛋白亚细胞结构定位的改变，即CD133由细胞膜表达转位到细胞浆表达预示着肝癌病人更差的预后(肝癌标本中证实)；在肝癌细胞系Huh7中证实了存在细胞浆表达的CD133，且CD133的表达促进肝癌细胞的增殖和自我更新能力；而肝癌中异常高表达糖基转移酶MGAT4A对CD133N-糖链的修饰促进了CD133由细胞膜转位到细胞浆表达；因此，所述细胞CD133可作为肝癌预后的标志物，所述CD133为细胞浆定位表达；本发明的标志物可进一步为肝癌患者的相对个性化的治疗选择提供依据，对采取个性化的治疗和降低肝癌死亡率具有重要的意义，具有重要的临床应用价值。
附图说明
图1为肝癌组织芯片中CD133免疫组织化学染色的代表图，
其中，左边为低倍镜下的组织图，右边为左边图中方框中组织放大后的高倍镜下的图，A图为CD133染色阴性的肝癌组织，图B代表细胞膜表达CD133的肝癌组织，图C代表细胞浆表达CD133的肝癌组织。
图2显示了针对具有CD133表达的肝癌组织，CD133表达的亚细胞定位(细胞膜定位和细胞浆定位)与相应患者的生存预后的关系，其中，存在CD133定位在细胞浆表达的患者总的生存和无病生存时间更短；A图为CD133在细胞膜或细胞浆定位总生存期比较的K-M曲线，B图为CD133在细胞膜或细胞浆定位无病生存期比较的K-M曲线。
图3为Huh7细胞中CD133免疫荧光染色后，共聚焦观察CD133亚细胞结构定位的结果图，图(A)红光代表CD133在Huh7细胞中的表达分布，图(B)蓝光代表Huh7细胞的细胞核染色，图(C)为第一和第二幅图的合并图。
图4为Western杂交检测对照组(shLacz)和CD133敲低组(shCD133-1和shCD133-2)Huh7细胞CD133蛋白量的结果，检测β-actin蛋白量作为内参。
图5为CD133敲低的Huh7细胞成球能力的检测结果，shLacz代表对照组细胞，shCD133-1和shCD133-2代表CD133敲低的细胞，A图为形成的细胞球的示意图，B图为细胞球数量统计结果(***P＜0.001)，C图为细胞球直径统计结果(*P＜0.05，**P＜0.01)。
图6为MGAT4A敲低的Huh7细胞用CD133抗体免疫沉淀的检测结果(CD133-IP)，其中，Control-Mouse-IgG-IP为对照组细胞(shLacz)用鼠的同型(IgG)抗体免疫沉淀，Control-CD133-IP为对照组细胞(shLacz)用CD133抗体免疫沉淀，shMGAT4A-CD133-IP为MGAT4A敲低后的Huh7细胞用CD133抗体免疫沉淀，然后Western杂交检测了3组免疫沉淀样品中CD133、DSL和PHA-L，同时检测了对照组和MGAT4A敲低组全细胞裂解液(Input)中CD133和MGAT4A。
图7为分别在Huh7细胞中过表达MGAT4A(图7A)或者敲低MGAT4A表达(图7B)后，利用生物素标记细胞表面膜蛋白，然后抽提细胞总膜蛋白组分和细胞浆蛋白组分后，Strep-Tactin亲和纯化生物素标记的蛋白，其中，Western杂交检测了抽提的膜组分蛋白和细胞浆组分蛋白中CD133和MGAT4A的表达，以β-Tubulin作为细胞浆蛋白标志物，Na，K-ATPaseα1作为细胞膜蛋白标志物，
Western杂交检测了亲和纯化的膜组分蛋白和细胞浆组分蛋白中的CD133表达，以β-Tubulin作为细胞浆蛋白标志物。
具体实施方式
本发明提供的具体实施方式对本发明的内用作详细说明，但本发明的实施并不仅限于此。
本实施例中未注明的具体条件和实验方法，通常按照《分子克隆实验指南》中所述常规条件，或者参照试剂生产商提供的条件实施。
实施例1 CD133蛋白在肝癌组织芯片中的免疫组织化学分析
一、免疫组织化学的实验过程及结果判定
实验过程：
1、本实验使用的肝癌组织芯片由上海芯超生物科技有限公司制作，共256例肝癌标本，共两张芯片(T12-341TAM1和T12-341TAM3)，每张芯片各128例肝癌标本；
2、肝癌组织芯片处理：石蜡切片脱蜡至水，二甲苯(三缸各5min)，梯度乙醇(无水、95％、75％)每缸5min，TBS冲洗3次，每次5min；
3、抗原修复-微波热修复(TEG buffer，Tris 10mM，EGTA 0.5mM，pH 9)：将切片至于抗原修复液，高火2-3min，中火5min，低火5min，冷却至室温，TBS冲洗3次，每次5min；
4、内源性酶阻断：移去TBS，3％双氧水阻断内源性过氧化物酶室温20min，TBS冲洗3次，每次5min；
5、血清封闭：移去TBS，10％山羊血清孵育30rmin；
6、抗原免疫反应：移去血清，滴加500μl的CD133抗体(1∶20，Miltenyi Biotec)，4℃过夜反应，TBS冲洗3次，每次5min；
7、二抗反应：移去TBS，每张切片滴加500μl HRP标记的羊抗IgG抗体，室温孵育30min；
8、移去二抗：TBS冲洗3次，每次5min；
9、显色反应：移去TBS，每张切片滴加500μl新鲜配制的DAB，镜下观察控制；
10、苏木精染色20sec；
11、切片梯度酒精脱水干燥：组织切片依次使用50％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、100％乙醇、二甲苯/乙醇、二甲苯进行脱水透明处理；
12、使用中性树脂封片，显微镜下观察；
免疫组化的结果显示(如图1所示)，CD133蛋白在肝癌组织中有细胞膜定位表达和细胞浆定位表达的情况；
根据染色的着色强度和阳性率对染色结果进行打分评估，染色强度打分标准为：阴性为0分，弱阳性为1分，中等阳性为2分，强阳性为3分；染色阳性率打分标准为：0％为0分，1-11％为1分，11-50％为2分，多于50％为3分，将染色强度的得分与阳性率的得分相乘，获得组织切片的综合得分，得分小于或等于1的评判为染色阴性，大于1的评判为阳性，将CD133染色阳性的组织在高倍显微镜下观察，将细胞浆表达CD133与细胞膜表达CD133的肝癌组织进行区分；
根据打分评估，在256例标本中，78例标本为CD133阳性，其中，57例标本具有细胞浆表达的CD133，21例标本CD133只在细胞膜表达(CD133表达示意图如图1所示，图A代表CD133染色阴性的标本，图B代表细胞膜表达CD133的标本，图C代表细胞浆表达CD133的标本)；如图2所示的K-M曲线，存在细胞浆表达CD133的病人(细胞浆表达、细胞膜和细胞浆同时表达)总的生存和无病生存时间更短，患者的预后更差，且差异具有统计学意义(P＜0.05)，图A为患者总生存时间的K-M曲线，图B为患者无病生存时间的K-M曲线。
实施例2 CD133在肝癌细胞系Huh7中亚细胞结构定位的免疫荧光分析
二、细胞免疫荧光实验过程和结果分析
本实验采用人的肝癌细胞系Huh7，细胞培养采用含10％胎牛血清(BiologicalIndustries)、100μg/ml青霉素及50μg/ml链霉素(Gibco)的DMEM培养液(Gibco)，在5％CO2-95％空气、饱和湿度以及37℃的培养条件下培养。
1、细胞爬片培养：Huh7细胞胰酶(Gibco)消化并吹打悬浮，加入放有盖玻片的6孔板中培养24hour，待细胞贴壁于盖玻片上；
2、细胞爬片固定：用4℃预冷的PBS洗涤细胞3次，4％的多聚甲醛室温下固定40min，固定完成后PBS洗3次；
3、血清封闭：用含有5％的驴血清和0.3％Triton X-100的PBS常温封闭细胞2hour；
4、一抗反应：用鼠源性的CD133单克隆抗体(Miltenyi Biotec)以1∶30的稀释比例孵育Huh7细胞，4℃孵育过夜。PBS洗涤细胞3次，每次10min；
5、二抗反应：用偶联了红色荧光Alexa 594的驴抗鼠IgG抗体(Invitrogen)染色，稀释比例1∶400，常温孵育1hour。在避光条件下，PBS洗涤细胞3次，每次10min；
6、细胞核染色：用Hoechst33258染色10min，在避光条件下，PBS洗涤细胞3次，每次10min；
7、用封片剂封片，激光共聚焦(Leica)观察CD133蛋白的亚细胞定位；
如图3所示，在肝癌细胞系Huh7中可以明显观察到定位在细胞浆中的CD133蛋白，图(A)红光代表CD133在Huh7细胞中的表达分布，图(B)蓝光代表Huh7细胞的细胞核染色，图(C)为第一和第二幅图的合并图。
实施例3
肝癌细胞系Huh7中敲低CD133的表达后，western杂交检测CD133的敲低效果、细胞成球实验检测细胞的增殖和自我更新能力
三、肝癌细胞系Huh7中敲低CD133的表达，检测细胞成球能力
1、肝癌细胞系Huh7中敲低CD133的表达和结果分析
本实验采用人的肝癌细胞系Huh7，细胞培养采用含10％胎牛血清(BiologicalIndustries)、100μg/ml青霉素及50μg/ml链霉素(Gibco)的DMEM培养液(Gibco)，在5％CO2-95％空气、饱和湿度以及37℃的培养条件下培养。在肝癌细胞系Huh7中，利用包装有针对CD133干扰RNA(shCD133-1和shCD133-2)的慢病毒敲低CD133的表达，以不针对任何人源基因的干扰RNA(shLacz)的病毒感染Huh7细胞作为对照，干扰RNA的序列如表1所示，CD133的敲低效果采用western杂交检测：具体操作方法包括：分别提取对照组细胞和CD133干扰组细胞的总蛋白并对蛋白定量，进行western杂交，杂交使用CD133抗体(Miltenyi Biotec)以1∶500稀释，检测CD133的蛋白量，使用的β-actin抗体(sigma)以1∶5000稀释，检测β-actin的蛋白量(作为内参)；
表1CD133干扰RNA的序列
结果如图4所示，用CD133的干扰RNA敲低CD133的表达后，CD133的蛋白量明显比对照组少；
2、检测CD133敲低Huh7细胞成球能力实验过程和结果分析
1)将上述DMEM培养液培养的对照组细胞和CD133敲低组细胞用胰酶消化，用DMEM培养液将细胞重悬为单个状态；2000rpm离心5分钟，吸去上清，
2)用含有20ng/mL EGF(Chemicon)、20ng/mL FGF-2(Chemicon)、2μg/mL heparin(Sigma)、1∶50的比例加入不含维生素A的B27(Gibco)、100μg/ml青霉素及50μg/ml链霉素的DMEM/F12培养基(Gibco)洗涤细胞，2000rpm离心5分钟，吸去上清，用DMEM/F12培养基重复洗涤细胞2次，用细胞计数仪计算细胞数量；
3)将对照组和CD133敲低组的细胞等量分到低吸附的96孔板(Coming)，每孔500个细胞悬浮于100μl DMEM/F12培养基中，每组9个重复孔，共10个孔；
4)每3天补充30μl DMEM/F12培养基，培养2周后，统计形成细胞球的数量和直径，以直径大于70μm的细胞球作为有效的结果；
结果如图5所示，CD133敲低后，Huh7细胞形成的细胞球直径明显比对照组小，细胞球数量也显著少于对照组，表明CD133的表达有利于肝癌细胞系Huh7的增殖和自我更新，A图是形成的细胞球示意图，B图是细胞球数量统计结果(***P＜0.001)，C图是细胞球直径统计结果(*P＜0.05，**P＜0.01)。
实施例4
肝癌细胞系Huh7中MGAT4A调控CD133的N-糖链修饰，MGAT4A对CD133的修饰促进CD133转位到细胞浆表达
四、肝癌细胞Huh7中MGAT4A的表达影响CD133的糖基化修饰
本实验采用人的肝癌细胞系Huh7，细胞培养采用含10％胎牛血清(BiologicalIndustries)、100μg/ml青霉素及50μg/ml链霉素(Gibco)的DMEM培养液(Gibco)，在5％CO2-95％空气、饱和湿度以及37℃的培养条件下培养；
1、在肝癌细胞系Huh7中，利用包装有针对MGAT4A干扰RNA(shMGAT4A)的慢病毒敲低MGAT4A的表达，以不针对任何人源基因的干扰RNA(shLacz)的病毒感染Huh7细胞作为对照，干扰RNA的序列如表2所示；
表2MGAT4A干扰RNA的序列
名称 干扰RNA名称 序列
对照组干扰RNA shLacz 5′-GTGACCAGCGAATACCTGT-3′
MGAT4A敲低组干扰RNA shMGAT4A 5′-CCGGATCTTACTCTGATTG-3′
2、分别裂解对照组(shLacz)和MGAT4A敲低组(shMGAT4A)的细胞(1×RIPA细胞裂解液：50mM Tris，150mM NaCl，EDTA·4Na 2mM，1％Triton X-100，1mM PMSF，1mMNaF，1mMNa3VO4，1mMβ-磷酸甘油，蛋白酶抑制剂cocktail(1∶100))；
3、收集细胞裂解后的总蛋白，剩余的裂解液则用于免疫沉淀实验，免疫沉淀的抗体为CD133(1∶30，Miltenyi Biotec)抗体；
4、将免疫沉淀下来的CD133蛋白用凝集素DSL和PHA-L(Vector，1∶1000)检测；
5、检测提取的总蛋白中CD133(1∶500，Miltenyi Biotec)的表达和MGAT4A(1∶500，Santa cruz)的敲低效果；
结果如图6所示，转染了shMGAT4A的慢病毒后，MGAT4A基因的表达显著被敲低了，CD133总蛋白的表达不受影响，但是CD133蛋白上结合DSL和PHA-L的量减少，表明CD133的N-糖链上存在MGAT4A的修饰。
五、MGAT4A对CD133的修饰促进CD133转位到细胞浆表达
实验采用人的肝癌细胞系Huh7，细胞培养采用含10％胎牛血清(BiologicalIndustries)、100μg/ml青霉素及50μg/ml链霉素(Gibco)的DMEM培养液(Gibco)，在5％CO2-95％空气、饱和湿度以及37℃的培养条件下培养；
1、肝细胞系Huh7中，利用包装有针对MGAT4A干扰RNA(shMGAT4A)的慢病毒敲低MGAT4A的表达，以不针对任何人源基因的干扰RNA(shLacz)的病毒感染Huh7细胞作为对照，干扰RNA的序列如表2所示；
2、肝癌细胞系Huh7中，将融合了Flag标签的MGAT4A表达序列表达于Huh7细胞中，获得MGAT4A-Flag高表达的Huh7肝癌细胞株，以表达Flag标签的Huh7细胞作为对照；
3、将MGAT4A敲低和MGAT4A过表达的Huh7细胞利用生物素标记细胞膜表面蛋白，具体操作如下：
1)贴壁培养的细胞，用预冷的PBS(PH 8.0)洗涤细胞3次，去除培液中氨基酸和蛋白的影响；
2)将溶解在PBS中，浓度为2mM的生物素试剂(Sulfo-NHS-LC-Biotin)加入细胞中；
3)将细胞放在培养箱中培养45min，然后用100mM的Glycine溶液(溶解于PBS溶液中)洗涤细胞三次；
4、将生物素标记过的细胞抽提细胞总膜蛋白组分和细胞浆蛋白组分，具体操作如下：
1)将生物标记好的细胞用0.25％胰蛋白酶消化1-2min，用含10％胎牛血清的DMEM吹悬细胞；
2)4℃，2500rpm离心5min，去除培液，加入PBS洗涤细胞；
3)4℃，2500rpm离心5min，重复洗涤细胞一次；
4)细胞组分抽提Kit(Thermo)的细胞浆组分抽提buffer(CytoplasmicExtraction Buffer，CEB)里加入1％cocktail蛋白酶抑制剂，将配好的buffer加入细胞中。
5)于4℃下轮转，约6rpm，10min，500g离心5min，取出上清，为抽提的细胞浆组分；
6)在细胞膜抽提的buffer(Membrane Extraction Buffer，MEB)里加入1％cocktail蛋白酶抑制剂，将配好的buffer等量加入剩余的细胞沉淀中；
7)于4℃下轮转，约6rpm，10min，3000g离心5min，取出上清，为抽提的细胞膜组分；
5、Strep-Tactin亲和纯化生物素标记的蛋白，具体操作如下：
纯化buffer(10倍浓度，用时稀释10倍)：1.5M NaCl，1M Tris-HCl，10mM EDTApH8.0，5％TritonX-100；
1)将上述buffer稀释10倍，加入1mM PMSF，1mM NaF，1mM Na3VO4，1mMβ-磷酸甘油，蛋白酶抑制剂cocktail(1∶100)；
2)准备Strep·Tactin Agarose beads：将beads加入1.5ml离心管，用600μl上述buffer洗涤4次，每次8000g离心1min去上清；
3)在抽提的细胞膜和细胞浆组分中加入3倍体积的上述buffer，然后加入Strep·Tactin Agarose beads中，4℃下轮转过夜，转速约6rpm；
4)轮转结合结束后，用buffer将beads洗4遍，每次洗涤于4℃轮转5min，用8000g离心1min；
5)洗涤结束后，用少量的2×SDS Sample Buffer和5％的巯基乙醇将结合在beads上的蛋白裂解下来；
6)煮沸10min，常温，12000g离心10min，取上清Western Blot检测；
6、Western Blot检测抽提的总膜组分以及细胞将组分中CD133和MGAT4A的表达，检测β-Tubulin的表达作为细胞浆组分的标记蛋白，检测Na，K-ATPaseα1的表达作为细胞膜组分的标记蛋白；检测Strep-Tactin亲和纯化的生物素标记蛋白中CD133的表达，以β-Tubulin的表达作为细胞浆组分的标记蛋白；
结果如图7所示，由于生物素标记的是细胞表面蛋白，所以当Strep-Tactin亲和纯化的蛋白出现在细胞浆中时，说明细胞膜上的蛋白转位到了细胞浆中。A图显示MGAT4A在Huh7细胞中过表达后，总的细胞浆组分和Strep-Tactin亲和纯化的细胞浆蛋白中CD133表达都增加，表明MGAT4A高表达促进了CD133由细胞膜转位到细胞浆中，B图显示在Huh7细胞中敲低了MGAT4A的表达后，总的细胞浆组分和Strep-Tactin亲和纯化的细胞浆蛋白中CD133表达均减少，表明抑制MGAT4A的表达后，CD133转位到细胞浆的过程被抑制。

Claims (6)

1.细胞浆定位的CD133在用作肝癌预后标志物中的用途。
2.细胞浆定位的CD133作为肝癌预后标志物在制备肝癌的预后诊断的试剂或试剂盒中的用途。
3.按权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的细胞浆定位的CD133为CD133蛋白由细胞膜转位到细胞浆的亚细胞定位。
4.按权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的细胞浆定位的CD133促进肝癌细胞增殖和自我更新的能力。
5.按权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的细胞浆定位的CD133比细胞膜定位表达CD133的肝癌患者恶性程度更高。
6.一种预后评估肝癌患者的方法，其特征在于，采用含有细胞浆定位的CD133的诊断试剂或试剂盒，通过检测CD133蛋白的亚细胞结构定位评估诊断肝癌患者的预后。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109864994A (zh) * 2017-12-05 2019-06-11 复旦大学 干细胞标志物cd133干扰核酸在制备抑制肿瘤增殖制剂中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102041295A (zh) * 2009-10-19 2011-05-04 复旦大学 β-1,4半乳糖基转移酶I在制备肝癌诊断制剂中的应用
CN102692506A (zh) * 2011-03-21 2012-09-26 复旦大学 Cd133在制备肿瘤标志物中的用途及其试剂盒
CN102827813A (zh) * 2012-09-30 2012-12-19 苏州大学 抗人cd133单克隆抗体及其制备和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102041295A (zh) * 2009-10-19 2011-05-04 复旦大学 β-1,4半乳糖基转移酶I在制备肝癌诊断制剂中的应用
CN102692506A (zh) * 2011-03-21 2012-09-26 复旦大学 Cd133在制备肿瘤标志物中的用途及其试剂盒
CN102827813A (zh) * 2012-09-30 2012-12-19 苏州大学 抗人cd133单克隆抗体及其制备和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AYAMI SASAKI ET AL.: "Cytoplasmic expression of CD133 is an important risk factor for overall survival in hepatocellular carcinoma", 《ONCOLOGY REPORTS》 *
赵明彦: "肝细胞癌组织检测肿瘤干细胞标记物CD133和CD90的临床表达意义", 《医学检验》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109864994A (zh) * 2017-12-05 2019-06-11 复旦大学 干细胞标志物cd133干扰核酸在制备抑制肿瘤增殖制剂中的应用

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