CN103018461B

CN103018461B - 一种尿液早期诊断膀胱癌的免疫试剂盒及其制备方法

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Publication number: CN103018461B
Application number: CN201210540815.XA
Authority: CN
Inventors: 范祖森; 杜颖; 李翀; 张倩云; 王彦英; 杨昭; 周鹏
Original assignee: Institute of Biophysics of CAS
Current assignee: Institute of Biophysics of CAS
Priority date: 2012-12-13
Filing date: 2012-12-13
Publication date: 2015-03-18
Anticipated expiration: 2032-12-13
Also published as: CN103018461A

Abstract

本发明涉及生物医学免疫分析领域，本发明利用微孔板化学发光免疫分析法，通过检测人尿液中的膀胱癌肿瘤标志物——异常糖基化的整合素AG-α3β1建立一种快速、灵敏、高特异性的早期诊断膀胱癌的检测试剂盒。本发明的试剂盒具有简便、快速、灵敏、高特异、稳定等优点，可用于常规体检中膀胱癌早期筛查及膀胱癌跟踪观察和预后评价，可满足目前膀胱癌体外诊断方面缺乏特异诊断方法的需要。

Description

一种尿液早期诊断膀胱癌的免疫试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种膀胱癌患者尿液中的肿瘤标志物的检测方法，该方法通过定量检测存在于尿液中异常糖基化的整合素AG-α3β1含量，无创性地实现膀胱癌的早期诊断。

背景技术

膀胱癌为泌尿系最常见的恶性肿瘤，发病率在美国被列为男性恶性肿瘤的第四位，女性为第八位，居恶性肿瘤的第七位。在我国发病率泌尿系肿瘤第一位。膀胱癌约95％来源于膀胱上皮，绝大多数为恶性，只有少数为良性，包括乳头状瘤、移行细胞癌、鳞状细胞癌和腺癌。其中以移行细胞癌最常见，占80％以上。目前手术治疗、放疗和化疗的疗效并不令人满意，患者5年存活率在40％-60％。预后较差和极易复发是膀胱癌的最大特点，有效的治疗很大程度上依赖于对膀胱癌的早期发现和早期治疗。然而，膀胱癌发病隐匿，大部分患者都是因为肉眼或镜下血尿怀疑膀胱癌才会到医院就诊，而出现肉眼血尿往往已是癌症晚期。所以寻找特异的膀胱癌早期诊断方法具有重要的临床应用价值。

目前，膀胱癌的早期诊断方法有以下几种：

1)尿液分析：血尿出现后首先便是进行尿液分析，以便排除是否是由于尿路炎症引起，并不能确定患者是否患膀胱癌；

2)尿脱落细胞分析：对尿沉渣中的尿脱落细胞进行显微镜下观察，可以鉴别并区分恶化的肿瘤细胞和正常细胞。但灵敏度不高，且差异较大，早期膀胱癌容易漏检；

3)超声、CT或者MRI成像观察：对肿瘤的大小和恶化程度可以直接进行图像观察，准确度较前面方法大大提高。尽管近年来成像技术的不断进步，灵敏度不断提高，但对较小的肿瘤观察仍然不够，易漏检；

4)膀胱镜观察：膀胱镜通过尿路进入膀胱，进行可视化的观察，从而发现早期的肿瘤并取活检。但该方法是一种有创性检查，不能用于膀胱癌早期筛查环节。

目前早期诊断膀胱癌细胞特异性最高的是通过膀胱镜的观察，荧光膀胱镜的应用提高了检测灵敏度。但患者一般需要经常性的跟踪观察，从而能及早发现肿瘤，或者跟踪治疗中的疗效及复发状况的观察。然而，膀胱镜观察会对患者造成身体不适。另外，目前荧光膀胱镜检测所需荧光染料特异性不高，且对人体有一定的负面影响。因此，在膀胱癌的早期诊断方面，人们一直在探索更特异和更灵敏的检测方法，尽可能的利用特异的肿瘤标志物实现方便、快速的检测。

实现尿液中膀胱癌标志物或者细胞的检测，进行实时检测在临床诊断方面具有重要的应用价值。目前商业化的可用的膀胱癌的标志物有：人补体因子H相关蛋白(膀胱肿瘤抗原，BTA试剂盒)、高分子量的癌胚抗原和两个膀胱癌细胞相关的粘附分子(美国Scimedx Corp公司的Immunocyt试剂盒)、核基质蛋白22(NMP22)、3、7和17号染色体的异倍体以及P16肿瘤抑制因子9p21位点的缺失(UroVysion试剂盒)。BTA是指人补充因子H相关蛋白，BTA检测需要专业操作人员在标准实验室进行。灵敏度达到57-83％，特异性60-92％，血尿患者的特异性只能达到46％，另外良性前列腺增生、肾结石以及尿路感染等情况均影响BTA检测的特异性；Immunocyt试剂盒通过免疫荧光检测尿脱落细胞，尽管灵敏度以及特异性很高，但为了达到较高的准确性需要进行大量的尿脱落细胞检测，因此在膀胱癌患者的治疗以及预后观测方面具有很高的应用价值，但应用在早期诊断方面差强人意；其中NMP22是目前应用最广的膀胱癌标志物，ELISA试剂盒的市场化实现了膀胱癌早期诊断的方便、快捷检测，检测灵敏度和特异性也很高，但是在有病毒感染、肾/膀胱结石等情况下，仍会出现假阳性；UroVysion试剂盒采用的是多靶标的荧光原位杂交(FISH)技术，尽管灵敏度与特异性得到极大提高，美国FDA批准，但与Immunocyt试剂盒类似，需要进行大量的尿脱落细胞检测。

结合目前的膀胱癌标志物的应用以及膀胱癌的诊断现状，我们得出：一方面，新的特异的膀胱癌仍是研究的重点；制备早期诊断试剂盒，实现快速、高通量检测，在膀胱癌的早期筛查及预后方面具有重要的临床价值。

因此，选用高特异性、高灵敏性且无创伤性的检测方法对膀胱癌的早诊、早治有重要意义。

发明内容

根据本发明人之前的研究(参见中国专利申请号：201010251384.6)，发现了一种人膀胱癌肿瘤标志物AG-α3β1，其为异常糖基化的整合素α3β1，其特征在于带有作为抗原表位的糖结构[3OSO3]Galb1-4(Fuca1-3)[6OSO3]GlcNAc。在上述中国专利申请号：201010251384.6中，公开了所述整合素α3β1的α3亚单位的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，所述整合素α3β1的β1亚单位的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示，优选所述异常糖基化是处在α3亚单位的第740位的氨基酸T(苏氨酸)上。

在中国专利申请号：201010251384.6中，本发明人通过以人膀胱癌细胞系T24(ATCC：HTB-4)免疫Balb/C小鼠(商购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，将致敏的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，用ELISA方法筛选出针对人膀胱癌肿瘤标志物AG-α3β1的一株杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株于2010年5月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC No.3845。

通过同样的方法，本发明人还获得了单抗BCMab3，其为特异性识别人膀胱癌肿瘤标志物AG-α3β1蛋白C端的单克隆抗体，分泌单抗的杂交瘤细胞株于2012年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101)，保藏号为CGMCC No.6907。

(一)本发明解决的技术问题

本发明着眼于膀胱癌的早期诊断与膀胱癌患者的跟踪观察，拟解决现行的膀胱癌早期诊断方面的难题，即采用特异性识别膀胱癌肿瘤标志物AG-α3β1的两株单克隆抗体，利用双抗体夹心法实现对AG-α3β1的识别与捕获，结合高灵敏的化学发光免疫分析方法，提供了一种高灵敏、高特异、操作简便、价格适宜的定量检测AG-α3β1的化学发光免疫试剂盒。该试剂盒不需要昂贵的检测仪器，便于临床推广，具有良好的市场应用价值，将会弥补市场现有试剂盒的不足。

本发明的目的是提供一种定量检测AG-α3β1化学发光免疫分析试剂盒，很好的解决了检测灵敏度和特异性低而影响膀胱癌早期诊断的问题。

本发明的另一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。

(二)技术方案

1.本发明试剂盒组分

本发明定量检测AG-α3β1化学发光免疫分析试剂盒，其组分包括如下：

A.标准品。其是化学发光值很高的膀胱癌患者尿液样本的逐级稀释物。冻存备用。

B.捕获抗体BCMab3包被的微孔板。BCMab3为单克隆抗体，能特异地识别尿液中的AG-α3β1，将该抗体包被在微孔板上，用于特异性捕获尿液中的AG-α3β1。

C.用于检测的标记抗体。该抗体为酶标记的针对AG-α3β1的单克隆抗体BCMab1，能特异地识别尿液中的AG-α3β1。此单抗可用碱性磷酸酶或者辣根过氧化物酶偶联形成酶联单抗结合物。用其识别样品中的AG-α3β1，释放信号。其释放信号能被转换成为AG-α3β1的浓度，用于定量分析。

D.配置碱性磷酸酶或者辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物液。

E.10×浓缩洗涤液。本发明所述试剂盒为了便于用户使用，配制了浓缩洗涤液。使用时，用去离子水稀释10倍至1x使用。该浓缩洗液为含有2％Tween-20的磷酸盐缓冲洗涤液。

F.阴性对照，为正常男性尿液，不含有AG-α3β1。

G.阳性对照，为膀胱癌患者尿液，含有一定量的AG-α3β1。

2.本发明试剂盒的制备方法

制备上述定量检测AG-α3β1化学发光免疫分析试剂盒的方法包括以下步骤：

1)配制标准品。选取化学发光值很高的膀胱癌患者尿液样本，逐级稀释，冻存备用，用作制备定量分析的标准曲线。本方法中将化学发光值为6685的样本(即本方法选取的Cut off值)中包含AG-α3β1的量定义为1U/mL。标准品的浓度梯度为0、1、2、4、8、16、32、64、128U/mL，用其标准曲线计算出样本中AG-α3β1浓度。

2)配制含单克隆抗体BCMab3的包被液，将其包被于96孔微孔板上。包被微孔板的步骤为：a)包被：采用0.05M、pH值为9.6的碳酸盐缓冲液或0.046M、pH值为4.6的柠檬酸缓冲液与适当浓度的BCMab3抗体混合制成包被液，并将其加载于微孔板上，室温过夜；b)封闭：配制复合封闭液：1000mL磷酸缓冲液，包含0.2g NaH₂PO₄·2H₂O、2.9g NaH₂PO₄·12H₂O、10g BSA、1g水解明胶和1mL生物防腐剂(例如Proclin300)，调pH值为7.0～7.6，然后将该封闭液加载于包被好抗体的微孔板上，室温过夜；c)洗板：稀释10×浓缩洗液至原倍(1x)，用原倍洗涤液洗板，干燥、封板后，于4℃封存备用。

3)制备辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体BCMab1。采用碳二亚胺(EDC)偶联法，即采用碳二亚胺基团可以与酶分子上的羧基反应，洗去多余的EDC后，再加入抗体，实现抗体上的氨基与酶分子上的羧基结合，形成酶标记抗体。选取合适的酶浓度溶解于新配置的酶稀释液中，冻存备用。

4)配制辣根过氧化物酶作用的化学发光底物液，化学发光底物液包含A液和B液，其中，基于1000mL所述化学发光底物A液，包括1.7716g鲁米诺、0.051g4-羟基联苯、0.012g4-碘苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂，其pH值为8.0～10.0；基于1000mL所述化学发光底物B液，包括0.329g过氧化脲、1ml Tween20、51.58gNa2HPO4·12H2O、8.74g NaH2PO4·2H2O，其pH值为7.0～7.6。

5)配制浓缩洗涤液：1000mL10×浓缩洗液，包含5.93g NaH₂PO₄·12H₂O、58gNaH₂PO₄·2H₂O、9g NaCl、10mL Tween-20和10mL生物防腐剂(例如Proclin300)。

6)分装上述各组分，并组装为成品。

(三)技术效果

本发明采用“双抗体夹心一步法”反应模式，即载体上包被的抗体与酶标记的抗体和被测样品的AG-α3β1形成“包被抗体-抗原-抗体-酶”的夹心复合物结构。另外，本发明有效地利用了化学发光技术原理，实现了检测的高灵敏度。

本发明一方面可以灵敏、快速测定尿液中膀胱癌肿瘤标志物AG-α3β1的含量，对于膀胱癌患者早期诊断、早期治疗提供可靠的临床参考价值，能够实现无创性地早期筛查膀胱癌的目标；另一方面由于使用特异性提高的单克隆抗体作为包被固相，大大提高了AG-α3β1检测的线性范围，可以根据AG-α3β1含量的变化情况判断膀胱癌治疗效果及其病情的变化。本方法可以排除正常、炎症上皮细胞，以及其它血细胞的干扰，特异性的识别膀胱癌肿瘤标志物。

本发明具有使用简便、检测快速、灵敏、稳定、可使用范围宽等优点。操作简便适用性广，既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量系统，可实现大批量快检测，使用成本低，更易推广应用，特别适合广大中、小医院推广使用。

附图说明

图1.本发明所制备的试剂盒中标准品的线性标准曲线(实施例1制备的试剂盒的标准曲线)。

图2.为实施例1制备的试剂盒特异性试验。

图3.采用实施例2所述的方法对早期膀胱癌患者及正常人尿液检测的散点图。

图4.膀胱癌及正常人样本尿液检测的接收者操作特征曲线(receiver operatingcharacteristic，ROC)。

具体实施方式

实施例1制备本发明的人尿液膀胱癌肿瘤标志物AG-α3β1的化学发光免疫分析试剂盒

一、标准品的配制

本方法采用辣根过氧化物酶催化鲁米诺和过氧化氢化学发光体系，用化学发光仪检测发光值为6685的样本(即本方法选取的Cut off值)中包含AG-α3β1的量定义为1U/mL。该发光值也与浓度为1000cell/mL的人膀胱癌细胞系(EJ细胞)的化学发光值相等。

收集大量的化学发光值很高的膀胱癌患者尿液样本以及正常人尿液样本(正常人尿液中不含AG-α3β1)，用正常人尿液样本逐级稀释膀胱癌患者尿液样本，标准品的浓度梯度为0、1、2、4、8、16、32、64、128U/mL，冻存备用，用作制备定量分析的标准曲线，用其标准曲线计算出样本中AG-α3β1浓度。

二、单克隆抗体BCMab1和BCMab3的制备

已具备两株单克隆抗体杂交瘤细胞株：保藏号为CGMCC No.3845的杂交瘤细胞株分泌BCMab1抗体(中国专利申请号：201010251384.6)；保藏号为CGMCCNo.6907的杂交瘤细胞株分泌BCMab3抗体。对于BCMab1和BCMab3各自的制备，取5×10⁷个正处于对数生长期的杂交瘤细胞，以1×10⁷的细胞浓度注射于BALB/c小鼠(购自北京维通利华实验动物公司)腹腔，10天后收集腹水。通过以下步骤纯化腹水中的单克隆抗体：

a)收集所得的腹水以2500r/min离心，取上清，以0.01M pH7.4PBS对倍稀释腹水上清。

b)向上述腹水中加入等体积的饱和硫酸铵，室温搅拌1小时；

c)以11000r/min，4℃离心20分钟，弃上清。重悬于适量0.01M pH7.4PBS中，并加入1/2体积的饱和硫酸铵，4℃搅拌过夜。

d)上述腹水以11000r/min，4℃离心20分钟，弃上清。将沉淀溶于0.01M pH7.4PBS中，再用0.01M pH7.4PBS透析，即得抗体粗球。

e)Protein-G凝胶柱安装到AKTA蛋白纯化仪(GE Healthcare公司)；

f)将抗体粗球11000r/min，4℃离心20分钟，取上清。上清以0.5mL/min流速通过预先以0.02M pH7.0含0.15M的NaCl的PBS平衡过的Protein-G凝胶柱，上样完毕后孵育1小时；

g)0.02M pH7.0含0.15M的NaCl的PBS洗脱杂蛋白；

h)0.2M pH2.8甘氨酸缓冲液，并收集洗脱液；

i)清洗Protein-G凝胶柱，并将柱子保存在20％的乙醇中；

j)洗脱的抗体溶液经超滤浓缩，测抗体浓度，即完成抗体的纯化。

三、制备单克隆抗体BCMab3包被的微孔板

采用0.05M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液与适当浓度的单克隆抗体BCMab3混合制成包被液，并将其加载于固相载体上；

具体地，所述包被方法为：

a)包被：采用0.05M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液与适当浓度的单克隆抗体BCMab3混合配制成包被液。1000mL的碳酸盐缓冲液包含2.93g的NaHCO₃、1.59g的Na₂CO₃、和9g NaCl，与适当浓度的单克隆抗体BCMab3混合制成包被液。

具体的碳酸盐缓冲液见下：

试剂

分子式

终浓度

分子量

1000mL用量

碳酸氢钠	NaHCO3	35mM	84.01	2.94g
					碳酸钠	Na₂CO3	15mM	105.99	1.59g
氯化钠	NaCl	0.15M	58.44	9.0g
					水	H₂O		18.02	加至1000mL

上述物质溶解混匀后，加双蒸水定容，调整pH至9.6，加入适量单克隆抗体BCMab3混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔120μL，室温过夜。

b)封闭液配制及封闭：

试剂	分子式	终浓度	分子量	1000mL用量
					磷酸二氢钠	NaH₂PO₄·2H₂O	1.28mM	156.01	0.2g
磷酸氢二钠	Na₂HPO₄·12H₂O	8.10mM	358.14	2.9g
					牛血清白蛋白	BSA	1.0％	66.430kDa	10.0g
水解明胶		1.0％		10.0g
					生物防腐剂	Proclin300	0.1％		1.0ml
水	H₂O			加至1000mL

Proclin300(商购自美国SUPELCO公司)

将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水定容，溶解混匀，调pH值为7.0，即得本发明所述的复合封闭液。每孔分别加入封闭液250μL，室温过夜。

c)洗板：稀释10×浓缩洗液至原倍浓度，用原倍洗涤液洗板四次，干燥、封板用铅萡袋包装，进行真空封袋，贴签后置4℃保存。

10×浓缩洗液配方见下：

试剂	分子式	终浓度	分子量	1000mL用量
					磷酸二氢钠	NaH₂PO₄·2H₂O	1.28mM	156.01	5.93g
磷酸氢二钠	Na₂HPO₄·12H₂O	8.10mM	358.14	58g
					氯化钠	NaCl	0.15M	58.44	9.0g
吐温20	Tween-20	1.0％		10.0ml
					生物防腐剂	Proclin300	1.0％		10.0ml
水	H₂O			加至1000mL

调整pH至7.2-7.4，使用时稀释10倍使用。

四、酶标记单克隆抗体BCMab1的制备、酶稀释液及酶浓度的确定

1、碳二亚胺(EDC)偶联法标记辣根过氧化物酶(HRP)

酶标记抗体采用常规的碳二亚胺(EDC)偶联法，具体流程如下：10mg HRP(Sigma)溶解于柠檬酸盐缓冲溶液中，加入EDC(溶解于吗啉基乙磺酸，MES)与酶分子上的羧基反应；10min后加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，将取代EDC分子，酶分子与NHS分子间形成活化的羧基基团；1mg单克隆抗体与活化的酶分子反应，实现抗体上的氨基与酶分子活化羧基反应，室温2小时，即得HRP标记单克隆抗体；完成标记的抗体溶液中逐滴加入饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，直至饱和硫酸铵浓度降低至原始浓度的1/3；4℃静置1h，8000rpm离心10min，将上清液移至新管，沉淀用等体积PBS重新悬浮；重复上述操作3次，收集上清即得提纯的酶标记抗体，加入等体积甘油，-20℃保存备用。

2、酶标抗体浓度选定

采用方阵法选择酶标抗体的工作浓度为1∶5000。

3、酶标记抗体稀释液的配方如下：

试剂	分子式	终浓度	分子量	1000mL用量
					磷酸二氢钠	NaH₂PO₄·2H₂O	1mM	156.01	0.156g
磷酸氢二钠	Na₂HPO₄·12H₂O	1.9mM	358.14	6.783g
					明胶		1‰		1g
Tween-20		0.5‰		0.5ml
					牛血清白蛋白	BSA	1.0％		10g
生物防腐剂	Proclin300	1.0％		10.0ml
					食品红		0.005‰		0.1ml

六、分装半成品并组装成品试剂盒

上述四步即完成本发明试剂盒的制备，成为半成品。分装半成品组装成试剂盒。作为成品试剂盒需满足临床检验的标准要求，即精密度、灵敏度、特异性及稳定性。对半成品抽查检验，检验合格，贴签后置4℃保存。

实施例2本发明的膀胱癌肿瘤标志物AG-α3β1化学法光免疫分析测定试剂盒的使用方法

一、样品前处理

留取人的尿液，无需其它特殊处理，直接进行分析。

二、检测步骤

使用本试剂盒进行检测前，需先取出本实施例1中所制备的标准品、包被微孔板、酶标记单克隆抗体溶液以及各缓冲溶液，室温静置，平衡至室温后即可使用；将恒温箱或者水浴锅调至37℃；准备好合适的微量加样器及对应吸头并且检查化学发光仪是否正常工作。

使用本试剂盒的具体操作步骤如下：

1)取出试剂盒内各组分平衡至室温；

2)将实验需要的板条放置在空板架上；

3)反应孔中加入50μL尿液样品、阴性对照、阳性对照和标准品溶液，每次试验设空白对照孔，然后除空白孔外，每孔加酶标抗体(工作浓度为1∶5000)50μl；

4)微量振荡器上振荡30秒混匀；

5)37℃恒温温育60分钟；

6)弃去孔中溶液，用原倍洗液经自动洗板机或者手工洗板5次，在吸水纸上拍干；

7)每孔加发光底物100μl，振荡混匀；

8)用化学发光仪(北京滨松光子有限公司，BHP9504)测相对发光值(RLU)，测量时间1秒/孔；

9)分别对校准品浓度和对应RLU取对数，在建立的双对数曲线上建立标准曲线，以各待测尿液RLU值在标准曲线上查出该尿液的AG-α3β1的浓度，计算检测结果；

10)打印检测结果报告。

实施例3本发明的试剂盒的方法学指标

按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，结果如下：

1.本试剂盒的标准曲线

本试剂盒采用辣根过氧化物酶催化鲁米诺和过氧化氢化学发光体系，用化学发光仪检测发光值并绘制标准曲线见附图1，其中，I为发光强度，C为标准品细胞裂解液浓度(单位为U/mL)，相关系数R²＝1，Y＝1240.5+5439.54X。

2.试剂盒灵敏度实验

灵敏度是可以与零剂量点可区分开的浓度。同时测定10个零标准点，得RLU的平均值与标准偏差。计算RLU平均值与两倍标准偏差的差值，由内插法，从工作曲线中得出其对应浓度值。实验中测定的灵敏度为0.0315U/mL。

3.试剂盒精密度检测

精密度是分析结果的重现性。选取高、中、低值三种膀胱癌患者尿液样本，分为10份，在同一次分析中同时检测每份样本，每种样本的标准偏差与平均值的比值，为批内变异系数；高中低三种样本在三批次不同分析中，测定值的标准偏差与平均值的比值，为批间变异系数，结果表明批内和批间变异系数在1.58％～3.59％之间。

表1试剂盒精密度测定(批内、批间变异)

4.试剂盒准确度测定

取两例膀胱癌患者尿液样本，分别加入等体积的标准品溶液20U/mL和50U/mL，按照实施例2的方法对每个浓度做3个平行检测。再根据工作曲线，实际检测该溶液中AG-α3β1含量，则样品的测定值减去尿液样本发光值，再除以AG-α3β1标准品浓度值，得到回收率。回收率在一定程度上，反应方法的准确性和分析灵敏度。回收率如表2所示，回收率在95.5-107％之间。

表2实际样本准确度测定

5.试剂盒稳定性实验

对实施例1的试剂盒中的试剂进行37℃、7天加速实验后，测定试剂盒的最大、最低发光强度、待测物的加标回收率等。结果表明实施例1的试剂盒指标均在正常范围之内。对实施例1的试剂盒主要组分进行2～8℃、8个月跟踪实验，结果表明各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况的发生，将实施例1的试剂盒放入-20℃冷冻7天，测定结果也表明试剂盒的各项指标完全正常。从以上结果可以看出试剂盒可以在2～8℃至少可以保存6个月以上。

6.试剂盒特异性试验

取正常尿路上皮细胞系HCV29⁽¹⁾和人膀胱癌细胞系T24(ATCC：HTB-4)、5637(ATCC：HTB-9)、EJ⁽²⁾、BIU-87⁽³⁾培养上清进行特异性试验。试验结果如图2所示，HCV29的检测值与阴性对照PBS缓冲液的化学发光值都很低；而四种人膀胱癌细胞系T24、5637、EJ、BIU-87的化学发光值显著高于对照样本检测值；且四种人膀胱癌细胞T24、5637、EJ、BIU-87的检测值高出阴性对照HCV29和PBS缓冲液的检测值的13倍以上，可得本方法的灵敏度很高。

经过上面所述大量实验，得出本发明试剂盒的方法学指标如下：

检测范围：0U/mL～140U/mL；

灵敏度：最小检出限为0.0315U/mL；

精密度：分析内精密度(高、中、低三个质量控制范围)均小于3.59％(n＝10)，

分析间精密度(高、中、低三个质量控制范围)均小于3.1％(n＝10)；

准确性：加标回收率在95.5-107％之间；

利用本发明方法进行检测，灵敏度级高，特异性强，检测范围宽，操作简单，无放射性污染，试剂盒成本低，临床适用性强，更适用于临床体检筛查实验。因此本发明为临床检测膀胱癌肿瘤标志物AG-α3β1，诊断早期膀胱癌以及对膀胱癌的早期预警和动态监测，提供了一种灵敏、准确、快捷、特异的方法。

实施例4本发明试剂盒在早期膀胱癌患者(病理分期为T1a期)临床样本测定方面的应用

应用本发明试剂盒进行早期膀胱癌患者尿液样本的检测。尿液样本(健康志愿者和膀胱癌患者的尿液均来自北京大学第三医院)不需要进行任何处理可直接进行检测，检测结果如图3，4所示。根据对103例早期膀胱癌样本和112例正常人对照样本的统计学分析，本发明试剂盒的灵敏度为95.15％，特异性为95.54％，ROC曲线下面积达到0.9872。

参考文献

(1)Lekka M，Gil D，W，Jaczewska J，Kulik AJ，Lekki J，Stachura Z，StachuraJ，Laidler P.Characterization of N-cadherin unbinding properties in non-malignant(HCV29)and malignant(T24)bladder cells.J Mol Recognit.2011；24(5)：833-42.

(2)Yang J，Wang J，Zuo Y，Zhan H.Molecularly modified VP3(30-121)inducesapoptosis in human bladder cancer(EJ)cells but not in normal(3T3)cells.Cell Biol Int.2012；36(11)：1037-42.

(3)Xu B，He Y，Wu X，Luo C，Liu A，Zhang J.Exploration of the correlationsbetween interferon-γ in patient serum and HEPACAM in bladder transitional cellcarcinoma，and the interferon-γ mechanism inhibiting BIU-87 proliferation.JUrol.2012；188(4)：1346-53.

Claims

1.一种检测人尿液中膀胱癌肿瘤标志物异常糖基化的整合素AG-α3β1的化学发光免疫分析试剂盒，其包括：

特异性识别膀胱癌肿瘤标志物AG-α3β1的两种单克隆抗体，所述两种单克隆抗体是用作捕获抗体的BCMab3和酶标记的单克隆抗体BCMab1，其中所述捕获抗体BCMab3为特异性识别人膀胱癌AG-α3β1蛋白C端的单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.6907的杂交瘤细胞株分泌，并且其中所述单克隆抗体BCMab1为抗人膀胱癌AG-α3β1的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.3845的杂交瘤细胞株分泌。

2.如权利要求1所述的化学发光免疫分析试剂盒，其包括：

1)标准品；

2)捕获抗体BCMab3包被的微孔板；

3)酶标记的单克隆抗体BCMab1；

4)上述酶所作用的化学发光底物；

5)浓缩洗涤液；

6)阴性对照，为不含膀胱癌肿瘤标志物AG-α3β1的正常人全尿样本；和

7)阳性对照，为含有膀胱癌肿瘤标志物AG-α3β1的膀胱癌患者全尿样本。

3.如权利要求2所述的化学发光免疫分析试剂盒，其中所述标准品为膀胱癌患者尿液样本的逐级稀释液。

4.如权利要求2所述的化学发光免疫分析试剂盒，其中所述微孔板为适用于化学发光反应的检测的96孔微孔板。

5.如权利要求4所述的化学发光免疫分析试剂盒，其中所述96孔微孔板是96孔白色微孔板。

6.如权利要求1所述的化学发光免疫分析试剂盒，其中所述酶为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶。

7.如权利要求2所述的化学发光免疫分析试剂盒，其中所述浓缩洗涤液使用前需用去离子水稀释至原倍浓度后使用。

8.如权利要求1所述的化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)配制标准品；

2)将捕获抗体BCMab3包被固相载体；

3)制备酶标记的单克隆抗体BCMab1；

4)配制酶所作用的化学发光底物液；

5)配制浓缩洗涤液；和

6)分装上述各组分，并组装为试剂盒。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述固相载体是微孔板。

10.如权利要求9所述的方法，其中，所述包被固相载体的步骤2)包括以下步骤：将纯化后的BCMab3抗体配制成包被缓冲液；将BCMab3抗体包被缓冲液过夜包被微孔板；将封闭液封闭微孔板后，用洗涤液洗涤微孔板；再干燥、封板，于4℃保存。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述封闭液为复合封闭液：1000mL磷酸缓冲液，其中含0.2g NaH₂PO₄·2H₂O和2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，加入10gBSA、1g水解明胶和1mL生物防腐剂，所述封闭液的pH值为7.0～7.6，然后将所得封闭液加载于微孔板上。