WO2020179954A1 - 나이관련황반변성 진단용 복합 마커 및 이의 용도 - Google Patents

나이관련황반변성 진단용 복합 마커 및 이의 용도 Download PDF

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WO2020179954A1
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macular degeneration
age
related macular
diagnosis
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박성준
이철주
우세준
주신영
이선정
정현교
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(주)레티마크
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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Definitions

  • the present invention relates to a composite marker for diagnosis of age-related macular degeneration (AMD) and a use thereof, and in more detail, it is composed of two or more blood markers specific for diagnosis of age-related macular degeneration, and diagnostic performance is increased. It relates to a complex marker for diagnosis of age-related macular degeneration. In addition, it relates to a composition for diagnosing age-related macular degeneration, a diagnostic kit, and a method of providing information necessary for diagnosing age-related macular degeneration using the composite marker.
  • AMD age-related macular degeneration
  • Age-related macular degeneration is a disease caused by various changes in the macular, the central part of the retina, that occurs mainly in adults over 50 years of age. It is the three major ophthalmology along with diabetic retinopathy and glaucoma. It is one of the diseases of blindness. It is the leading cause of adult blindness in developed countries, and the incidence rate increases with age.
  • AMD Age-related macular degeneration
  • the macula refers to the central part of the nervous tissue called the retina, and it is responsible for central vision because photoreceptor cells that respond to light stimuli are concentrated.
  • Age-related macular degeneration is a disease that causes visual impairment due to loss of photoreceptor cells in the macular region with age. AMD is a degenerative disease affecting the retina, retinal pigment epithelium (RPE), Bruch's membrane, and choroid.
  • AMD can be divided into a dry or non-exudative (dry) form and a wet or exudative (exudative) form.
  • the non-exudative form refers to a lesion in the retina, such as drusen or atrophy of the retinal pigment epithelium. It usually does not cause severe vision loss, but it can develop into a wet form.
  • the exudative form is when choroidal neovascularization grows under the retina. These new blood vessels cause exudate and bleeding in the macula, damaging the photoreceptors, thereby lowering central vision, and most of them lead to legal blindness of 0.1 or less if not treated.
  • the exudative form of macular degeneration is very rapid, and vision often deteriorates rapidly within a few weeks. Early detection of age-related macular degeneration is very important because, in general, once vision impairment begins, previous vision cannot be restored in many cases. Early detection is possible through regular ophthalmological examinations by an ophthalmologist.If age-related macular degeneration is suspected by ophthalmic examination including fundus examination, detailed ophthalmic examinations such as fluorescein angiography and optical coherence tomography should be performed to confirm the diagnosis. I can.
  • the present inventors discovered blood protein markers with high sensitivity and specificity, and used them in combination to improve early diagnosis of age-related macular degeneration.
  • IGFBP2 insulin like growth factor binding protein 2
  • LGALS3BP glycosyl- 3-binding protein
  • ADAMTSL2 ADAMTS-like protein 2
  • Another object of the present invention is to provide a composition or a diagnostic kit for diagnosing age-related macular degeneration using the composite marker for diagnosing age-related macular degeneration.
  • Another object of the present invention is to provide a method of providing information necessary for diagnosis of age-related macular degeneration using the composite marker for diagnosing age-related macular degeneration.
  • the present invention provides a composite marker for diagnosing age-related macular degeneration of a composite marker composed of IGFBP2 (insulin like growth factor binding protein 2), LGALS3BP (galectin-3-binding protein), and ADAMTSL2 (ADAMTS-like protein 2).
  • IGFBP2 insulin like growth factor binding protein 2
  • LGALS3BP glycosylase-3-binding protein
  • ADAMTSL2 ADAMTS-like protein 2
  • the complex marker is MBL2 (mannose-binding protein C), PNLIP (pancreatic triacylglycerol lipase), SELE (E-selectin), SIGLEC14 (Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), DDI2 (Protein DDI1 homolog2), ZG16B (Zymogen granule protein 16 homolog B), Cp (Ceruloplasmin) and FCN2 (Ficolin 2) It may further include at least one marker selected from the group consisting of.
  • the present invention measures the mRNA or protein level of a complex marker for diagnosis of age-related macular degeneration consisting of IGFBP2 (insulin like growth factor binding protein 2), LGALS3BP (galectin-3-binding protein) and ADAMTSL2 (ADAMTS-like protein 2). It provides a composition for diagnosing age-related macular degeneration comprising an agent.
  • the complex marker is MBL2 (mannose-binding protein C), PNLIP (pancreatic triacylglycerol lipase), SELE (E-selectin), SIGLEC14 (Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), DDI2 (Protein DDI1 homolog2), ZG16B (Zymogen granule protein 16 homolog B), Cp (Ceruloplasmin) and FCN2 (Ficolin 2) It may further include at least one marker selected from the group consisting of.
  • the agent for measuring the mRNA level of the complex marker may be a primer pair, a probe, or an antisense nucleotide that specifically binds to the gene of the marker.
  • the agent for measuring the protein level of the complex marker is an antibody, interacting protein, ligand, nanoparticles or aptamer that specifically binds to the protein or peptide fragment. (aptamer) may be included.
  • the present invention provides a kit for diagnosing age-related macular degeneration comprising the composition for diagnosing age-related macular degeneration.
  • the kit is a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) kit, a DNA chip kit, an ELISA (Enzymelinked immunosorbent assay) kit, a protein chip kit, a rapid kit, or a MRM (Multiple reaction monitoring) kit.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • DNA chip kit a DNA chip kit
  • ELISA Enzymelinked immunosorbent assay
  • protein chip kit a protein chip kit
  • a rapid kit or a MRM (Multiple reaction monitoring) kit.
  • MRM Multiple reaction monitoring
  • the present invention is a composite for diagnosis of age-related macular degeneration consisting of (a) IGFBP2 (insulin like growth factor binding protein 2), LGALS3BP (galectin-3-binding protein) and ADAMTSL2 (ADAMTS-like protein 2) from a biological sample of a patient Measuring the mRNA or protein level of the marker; And
  • It provides a method of providing information for diagnosis of age-related macular degeneration comprising; (b) comparing the mRNA or protein expression level with a control sample.
  • the complex marker is MBL2 (mannose-binding protein C), PNLIP (pancreatic triacylglycerol lipase), SELE (E-selectin), SIGLEC14 (Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), DDI2 (Protein DDI1 homolog2), ZG16B (Zymogen granule protein 16 homolog B), Cp (Ceruloplasmin) and FCN2 (Ficolin 2) It may further include at least one marker selected from the group consisting of.
  • the method of providing information for diagnosis of age-related macular degeneration is at least one selected from the group consisting of the age of the patient, high blood pressure, hyperlipidemia, smoking, diabetes, and cardiovascular disease. Additional clinical information can be included and compared with the control group.
  • the mRNA expression level is measured using reverse transcriptase polymerase reaction, competitive reverse transcriptase polymerase reaction, real-time reverse transcriptase polymerase reaction, RNase protection assay, Northern blotting or DNA chip. You can do it.
  • the measurement of the protein expression level is performed by using an antibody, interacting protein, ligand, nanoparticles, or aptamer that specifically binds to a protein or peptide fragment. Can be done.
  • the protein expression level measurement is protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, SELDITOF (Sulface Enhanced).
  • Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry analysis, radioimmunoassay, radioactive immunity diffusion method, octeroni immunity diffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation analysis method, 2D electrophoresis analysis, liquid chromatography- Liquid chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS), liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry (LCMS/MS), Western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), multiple reaction monitoring (MRM), Parallel reaction monitoring (PRM), sequential windowed data independent acquisition of the total high-resolution (SWATH), selected reaction monitoring (SRM), or immune multiple reaction monitoring (iMRM) It can be done using.
  • LC-MS liquid chromatography- Liquid chromatography-Mass Spectrometry
  • LCMS/MS liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry
  • Western blot enzyme linked immunosorbent assay
  • the method of providing information for diagnosis of age-related macular degeneration further includes the step of determining age-related macular degeneration when the gene expression level or protein expression level of the complex marker increases compared to the control group. Can be included as.
  • the analysis in step (b) may be performed by a statistical analysis method.
  • the statistical analysis method may include a linear or nonlinear regression analysis method, a linear or nonlinear classification analysis method, a logistic regression method, and an Analysis of Variance; ANOVA), neural network analysis method, genetic analysis method, support vector machine analysis method, hierarchical analysis or clustering analysis method, hierarchical algorithm using decision tree or kernel principal component analysis method, Markov Blanket analysis method , Recursive feature elimination or entropy-basic regression feature elimination analysis method, forward floating search or rear floating search analysis method, and a combination thereof.
  • ANOVA Analysis of Variance
  • the composite marker for diagnosis of age-related macular degeneration of the present invention has superior sensitivity and diagnostic performance compared to the combination of other markers, and when analyzed by combining the protein quantification value of the composite marker and basic clinical information, both early and late macular degeneration It was confirmed that both stages showed high diagnostic ability.
  • the complex marker of the present invention can be conveniently used for early diagnosis of age-related macular degeneration because it can be conveniently analyzed using patient plasma without using a biopsy as a blood protein.
  • ASD age-related macular degeneration
  • Non AMD non-macular degeneration patients
  • Early AMD early macular degeneration Sex
  • Late AMD Late macular degeneration
  • the present invention relates to a composite marker for age-related diagnosis consisting of insulin like growth factor binding protein 2 (IGFBP2), galectin-3-binding protein (LGALS3BP), and ADAMTSL2 (ADAMTS-like protein 2).
  • IGFBP2 insulin like growth factor binding protein 2
  • LGALS3BP galectin-3-binding protein
  • ADAMTSL2 ADAMTS-like protein 2
  • diagnosis means identifying the presence or characteristics of a pathological condition. For the purposes of the present invention, the diagnosis is to determine whether the onset of age-related macular degeneration.
  • diagnostic marker refers to a polypeptide or nucleic acid (eg, a polypeptide or nucleic acid showing a significant increase or decrease in the gene expression level or protein expression level in an individual with macular degeneration compared to a normal control group (non-macular degeneration)).
  • mRNA, etc. lipids, glycolipids, glycoproteins, sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.), and the like.
  • macular degeneration is classified into early AMD and late AMD. Since early macular degeneration does not develop blood vessels, and late macular degeneration is different in its mechanisms, such as blood vessel development, even a marker known as a late macular degeneration diagnostic marker cannot necessarily be used as an early macular degeneration diagnostic marker.
  • the composite marker of the present invention can specifically diagnose both early and late macular degeneration.
  • the complex markers are MBL2 (mannose-binding protein C), PNLIP (pancreatic triacylglycerol lipase), SELE (E-selectin), SIGLEC14 (Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), DDI2 (Protein DDI1 homolog2). ), ZG16B (Zymogen granule protein 16 homolog B), Cp (Ceruloplasmin), and FCN2 (Ficolin 2) may be characterized in that it further comprises at least one marker selected from the group consisting of.
  • IGFBP2 insulin like growth factor binding protein 2
  • IGFBP2 insulin like growth factor binding protein 2
  • LGALS3BP (galectin-3-binding protein) is a protein encoded by the LGALS3BP gene, and specifically binds to Mac-2 (human macrophage-associated lectin) and galactin 1 (galectin 1). LGALS3BP is known to increase in serum of cancer patients and HIV-infected patients, and is involved in immune responses associated with natural killer (NK) cells and lymphokine-activated killer (LAK) cytotoxicity.
  • NK natural killer
  • LAK lymphokine-activated killer
  • ADAMTSL2 (ADAMTS-like protein 2) is a subfamily member of a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS)-like protein, and is a glycoprotein that binds to the cell surface and extracellular matrix.
  • ADAMTSL2 interacts with LTBP1 (latent transforming growth factor beta binding protein 1), and LTBP1 protein is involved in the storage of TGF- ⁇ 1, an important growth factor that regulates cell growth and division, so ADAMTSL2 has the possibility of using TGF- ⁇ 1. Adjust.
  • ADAMTSL2 is expressed in cancer tissues, it is used as a marker for cancer diagnosis.
  • Mannose-binding protein C is also referred to as mannose-binding lectin (MBL) or mannan-binding protein (MBP).
  • MBL2 has an oligomer structure (400-700 kDa) and is composed of subunits containing three identical peptide chains consisting of approximately 30 kDa. It is produced by the liver in response to infection and is part of a number of other factors called acute stage proteins.
  • PNLIP pancreatic triacylglycerol lipase
  • PNLIP pancreatic triacylglycerol lipase
  • PNLIP is known to have a low serum concentration because it is secreted into the duodenum through the pancreatic duct system.However, when pancreatic functions such as pancreatitis or pancreatic adenocarcinoma are extremely destroyed, pancreatic enzymes including PNLIP are secreted into the serum. It is known that acute pancreatitis can be diagnosed by measuring.
  • SELE E-selectin
  • CD62E CD62 antigen-like family member E
  • LECAM2 leukocyte-endothelial cell adhesion molecule 2
  • interleukin 1 ⁇ tumor necrosis factor
  • lipopolysaccharide a cell adhesion molecule that is transiently expressed and induced in the vascular endothelial cells activated by 4-12 hours as the peak.
  • SELE is strongly expressed in vascular endothelial cells in inflammatory tissues and promotes invasion of these cells into the inflammatory site by mediating the phenomenon that neutrophils and monocytes roll over vascular endothelial cells. It is known to be involved in adhesion of cancer cells to vascular endothelial cells.
  • SIGLEC14 (Sialic acid-binding Ig-like lectin 14) is one of the subfamily of SIGLEC (Sialic acid-binding immunoglobulin-type lectins), and SIGLEC is a cell surface protein that binds to sialic acid and is mainly expressed on the surface of immune cells.
  • the protein interaction between SIGLEC and sialic acid acts as a switch to turn on and off the immune system, and cancer cells are also known to acquire resistance to the immune response by using the SIGLEC-sialic acid reaction.
  • DDI2 Protein DDI1 homolog2 is an internal peptide cleavage enzyme that activates nuclear respiratory factor 1 (Nrf1), which is involved in regulating cell growth and DNA replication, and compensates for protein degradation caused by proteasome abnormalities.
  • Nrf1 nuclear respiratory factor 1
  • ZG16B Zymogen granule protein 16 homolog B
  • PAUF pancreatic adenocarcinoma upregulated factor
  • Cp is the main protein that carries copper in the blood and plays an important role in iron metabolism. More than 95% of copper is present in the plasma of healthy people in the form of ceruloplasmin.
  • FCN2 (Ficolin 2) is a type of oligolectin and is composed of a short N-terminal partial-collagen-like domain and a fibrinogen-like domain. It is mainly expressed in the liver and is known to play an important role in the lectin pathway of the complement system by binding to N-acetylglucosamin in the bacterial cell wall and acting as an opsonin like a mannose binding protein.
  • the prior art that disclosed that the markers can be used for the diagnosis of age-related macular degeneration is not known, and in particular, it is disclosed that the diagnostic performance of age-related macular degeneration can be increased by using a complex marker of IGFBP2, ADAMTSL2 and LGALS3BP. None is known about one technology.
  • the present invention relates to a composition for diagnosing macular degeneration
  • a composition for diagnosing macular degeneration comprising an agent for measuring the mRNA or protein level of a complex marker for macular degeneration diagnosis consisting of IGFBP2 (insulin like growth factor binding protein 2) and ADAMTSL2 (ADAMTS-like protein 2).
  • IGFBP2 insulin like growth factor binding protein 2
  • ADAMTSL2 ADAMTS-like protein 2
  • the complex markers are LGALS3BP (galectin-3-binding protein), MBL2 (mannose-binding protein C), PNLIP (pancreatic triacylglycerol lipase), SELE (E-selectin), SIGLEC14 (Sialic acid-binding Ig- like lectin 14), DDI2 (Protein DDI1 homolog2), ZG16B (Zymogen granule protein 16 homolog B), Cp (Ceruloplasmin) and FCN2 (Ficolin 2), characterized in that it further comprises at least one marker selected from the group consisting of From a different point of view, it includes an agent that measures the mRNA or protein level of a complex marker for macular degeneration diagnosis consisting of IGFBP2 (insulin like growth factor binding protein 2), LGALS3BP (galectin-3-binding protein) and ADAMTSL2 (ADAMTS-like protein 2). It relates to a composition for diagnosing macular degeneration.
  • IGFBP2
  • the complex markers are MBL2 (mannose-binding protein C), PNLIP (pancreatic triacylglycerol lipase), SELE (E-selectin), SIGLEC14 (Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), DDI2 (Protein DDI1 homolog2). ), ZG16B (Zymogen granule protein 16 homolog B), Cp (Ceruloplasmin), and FCN2 (Ficolin 2) It may be characterized in that it further comprises at least one marker selected from the group consisting of.
  • the term "measurement of mRNA expression level" used in the present invention is a process of confirming the presence and expression of mRNA of genes for age-related macular degeneration in a biological sample isolated from a patient suspected of age-related macular degeneration in order to diagnose age-related macular degeneration. Measure the amount of mRNA. Analysis methods for this include reverse transcription polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcription polymerase reaction (Competitive RT-PCR), real-time reverse transcription polymerase reaction (Real-time RT-PCR), and RNase protection assay (RPA; RNaseprotection assay). ), Northern blotting, DNA chip, etc., but are not limited thereto.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase reaction
  • Competitive RT-PCR competitive reverse transcription polymerase reaction
  • Real-time RT-PCR real-time reverse transcription polymerase reaction
  • RNase protection assay RNase protection assay
  • Northern blotting DNA chip, etc., but are not limited thereto.
  • the agent for measuring the mRNA level of the complex marker is characterized in that it is a primer pair, probe or antisense nucleotide that specifically binds to the gene of the marker, and the nucleic acid information of the genes is known in GeneBank, etc. These primer pairs, probes or antisense nucleotides can be designed.
  • primer as used in the present invention is a fragment that recognizes a target gene sequence, and includes forward and reverse primer pairs, preferably, a primer pair that provides an analysis result having specificity and sensitivity.
  • a primer that amplifies only the target gene sequence containing the complementary primer binding site and does not induce non-specific amplification can give high specificity. .
  • probe used in the present invention refers to a substance capable of specifically binding to a target substance to be detected in a sample, and refers to a substance capable of specifically confirming the presence of a target substance in a sample through the binding. do.
  • the type of probe is a material commonly used in the art and is not limited, but preferably PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), peptide, polypeptide, protein, RNA or DNA, and most preferred Hagi is PNA.
  • the probe is a biomaterial that includes an organism-derived or similar thing or a thing produced in vitro, for example, enzymes, proteins, antibodies, microorganisms, animal and plant cells and organs, neurons, DNA, and It may be RNA, DNA includes cDNA, genomic DNA, oligonucleotide, RNA includes genomic RNA, mRNA, oligonucleotide, and examples of proteins include antibodies, antigens, enzymes, peptides, and the like.
  • antisense refers to a nucleotide base in which an antisense oligomer is hybridized with a target sequence in RNA by Watson-Crick base pairing, typically allowing the formation of an mRNA and RNA: oligomeric heterodimer within the target sequence. It means an oligomer having a sequence of and a backbone between subunits. Oligomers may have exact sequence complementarity or approximate complementarity to the target sequence.
  • the agent for measuring the protein level of the complex marker is an antibody, interacting protein, ligand, nanoparticles, or aptamer that specifically binds to the protein or peptide fragment. can do.
  • protein expression level measurement is a process of confirming the presence and expression of a protein expressed from a gene for age-related macular degeneration diagnosis in a biological sample in order to diagnose age-related macular degeneration.
  • the amount of protein can be determined using antibodies, interacting proteins, ligands, nanoparticles, or aptamers that specifically bind to the protein or peptide fragment of the gene.
  • the protein expression level measurement or comparative analysis methods include protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, SELDI-TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time).
  • MALDI-TOF Microx Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry
  • SELDI-TOF Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time
  • Flight Mass Spectrometry analysis, radioimmunoassay, radioactive immunodiffusion method, octeroni immune diffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation method, two-dimensional electrophoresis analysis, liquid chromatography-liquid chromatography -Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), Western blot, and ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), multiple reaction monitoring (MRM), parallel reaction Monitoring (parallel reaction monitoring: PRM), sequential windowed data independent acquisition of the total high-resolution (SWATH), selected reaction monitoring (SRM), or immune multiple reaction monitoring (iMRM). It is not limited to this.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • PRM parallel reaction Monitoring
  • PRM sequential windowed data independent acquisition of the total high-resolution
  • SWATH total high-resolution
  • SRM selected reaction monitoring
  • iMRM immune multiple reaction monitoring
  • an antibody refers to a substance that specifically binds to an antigen and causes an antigen-antibody reaction.
  • an antibody refers to an antibody that specifically binds to the complex biomarker for diagnosis of age-related macular degeneration of the present invention.
  • the antibodies of the present invention include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies.
  • the antibody can be easily prepared using techniques well known in the art.
  • a polyclonal antibody can be produced by a method well known in the art, including the process of injecting the age-related macular degeneration marker protein antigen into an animal and collecting blood from the animal to obtain a serum containing the antibody. .
  • polyclonal antibodies can be prepared from any animal such as goat, rabbit, sheep, monkey, horse, pig, cow, dog.
  • the monoclonal antibody is a hybridoma method well known in the art (hybridoma method; see Kohler and Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519), or phage antibody library technology (Clackson et al, Nature, 352 :624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991).
  • the antibody prepared by the above method may be separated and purified using a method such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • the antibody of the present invention includes a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as functional fragments of antibody molecules.
  • the functional fragment of an antibody molecule means a fragment that has at least an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab') 2 and Fv.
  • the antibody of the present invention may be obtained commercially.
  • PNA Protein Nucleic Acid
  • DNA has a phosphate-ribose sugar backbone
  • PNA has a repeated N-(2-aminoethyl)-glycine backbone linked by a peptide bond, which greatly increases the binding power and stability to DNA or RNA, resulting in molecular biology. , Diagnostic analysis and antisense therapy.
  • PNA is described in Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254(5037): 1497-500.
  • aptamer is an oligonucleotide or a peptide molecule, and general information of the aptamer is described in Bock LC et al. , Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine”. J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library”. Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)].
  • the present invention relates to a kit for diagnosing age-related macular degeneration comprising the composition for diagnosing age-related macular degeneration.
  • the kit can be prepared by a conventional manufacturing method known in the art.
  • the kit may include, for example, an antibody in a freeze-dried form, a buffer, a stabilizer, an inactive protein, and the like.
  • the kit may further include a detectable label.
  • detectable label refers to an atom or molecule that specifically detects a molecule containing a label among molecules of the same type without a label.
  • the detectable label may be attached to an antibody, interacting protein, ligand, nanoparticle, or aptamer that specifically binds to the protein or fragment thereof.
  • the detectable label may include a radionuclide, a fluorophore, or an enzyme.
  • the kit can be used according to various immunoassays or immunostaining methods known in the art.
  • the immunoassay or immunostaining method may include radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, ELISA, capture-ELISA, inhibition or competition analysis, sandwich analysis, flow cytometry, immunofluorescence staining, and immunoaffinity purification.
  • the kit may be a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) kit, a DNA chip kit, an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) kit, a protein chip kit, a rapid kit, or a multiple reaction monitoring (MRM) kit.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the kit can be used for mass spectrometry.
  • the specific amino acid residues of the protein are myristoylation, isoprenylation, prenylation, glypiation, lipoylation, acylation, alkylation, methylation, demethylation, amidation, It may have modifications such as ubiquitination, phosphorylation, deamidation, glycosylation, oxidation, or acetylation.
  • age-related macular stool consisting of insulin like growth factor binding protein 2 (IGFBP2), galectin-3-binding protein (LGALS3BP) and ADAMTSL2 (ADAMTS-like protein 2) from a biological sample of a patient Measuring the mRNA or protein level of the complex marker for sex diagnosis;
  • IGFBP2 insulin like growth factor binding protein 2
  • LGALS3BP galectin-3-binding protein
  • ADAMTSL2 ADAMTS-like protein 2
  • It relates to a method for providing information for the diagnosis of age-related macular degeneration comprising; (b) comparing the mRNA or protein expression level with a control sample.
  • the complex marker in step (a) is MBL2 (mannose-binding protein C), PNLIP (pancreatic triacylglycerol lipase), SELE (E-selectin), SIGLEC14 (Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), It is characterized in that it further comprises at least one marker selected from the group consisting of DDI2 (Protein DDI1 homolog2), ZG16B (Zymogen granule protein 16 homolog B), Cp (Ceruloplasmin) and FCN2 (Ficolin 2).
  • biological sample refers to tissues, cells, blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid, or urine whose protein expression level or gene expression level differs due to age-related macular degeneration.
  • the method of providing information for the diagnosis of age-related macular degeneration may further include at least one clinical information selected from the group consisting of the age of the patient, hypertension, hyperlipidemia, smoking, diabetes, and cardiovascular disease.
  • the method of providing information for diagnosing age-related macular degeneration may further include determining that it is age-related macular degeneration when the gene expression level or protein expression level of the complex marker is increased compared to the control group.
  • the measurement of the mRNA expression level in step (a) is the measurement or comparison of the mRNA expression level: reverse transcriptase polymerase reaction, competitive reverse transcriptase polymerase reaction, real time reverse transcriptase polymerase reaction, RNase protection assay, Northern blotting or DNA chip, etc. Can be used, but the present invention is not limited thereto.
  • the mRNA expression level in the normal control group and the mRNA expression level in age-related macular degeneration patients can be confirmed, and the onset of age-related macular degeneration can be diagnosed or predicted by comparing the levels of these expression levels.
  • the measurement of the protein expression level in step (a) may be measured and compared using antibodies, interacting proteins, ligands, nanoparticles, or aptamers that specifically bind to proteins or peptide fragments.
  • the protein expression level measurement or comparison analysis method includes protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, SELDITOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, radioimmunoassay, radioactive immunodiffusion method, octeroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation method, two-dimensional electrophoresis analysis, liquid chromatography-mass spectrometry ( Liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LCMS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), Western blot, and ELISA (enzyme linked immunosorbentassay), but are not limited thereto.
  • MALDI-TOF Microx Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry
  • MRM multiple reaction monitoring
  • PRM parallel reaction monitoring
  • SWATH sequential windowed data independent acquisition of the total high-resolution
  • SRM selected reaction monitoring
  • iMRM immune multiple reaction monitoring
  • MRM is a method of determining an exact fragment of a substance, breaking it in a mass spectrometer, selecting a specific ion from the broken ions once more, and obtaining the number using a detector connected in series.
  • the protein or fragment thereof can be quantified using a mass spectrometer in blood samples of normal individuals and individuals suspected of age-related macular degeneration.
  • the analysis in step (b) can be analyzed using a statistical method or an algorithm to improve the accuracy of the diagnosis, and a linear or nonlinear regression analysis method, an preceding or nonlinear classification analysis method, and a logistic regression analysis method (logistic regression), Analysis of Variance (ANOVA), neural network analysis method, genetic analysis method, support vector machine analysis method, hierarchical analysis or clustering analysis method, hierarchical algorithm or kernel principal component analysis using decision trees Method, Markov Blanket analysis method, recursive feature elimination or entropy-basic regression feature elimination analysis method, forward floating search or rear floating search analysis method, and their An analysis method selected from the group consisting of combinations can be used.
  • the statistical method uses a logistic regression analysis method, but is not limited thereto.
  • 102 plasma samples were analyzed for quantitative verification of biomarkers for the diagnosis of age-related macular degeneration among plasma proteins (Table 1), IGFBP2 (insulin like growth factor binding protein 2), ADAMTSL2. (ADAMTS-like protein 2), MBL2 (mannose-binding protein C), PNLIP (pancreatic triacylglycerol lipase), SELE (E-selectin), SIGLEC14 (Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), DDI2 (Protein DDI1 homolog2) , ZG16B (Zymogen granule protein 16 homolog B), Cp (Ceruloplasmin) and FCN2 (Ficolin 2) consisting of 11 target markers were analyzed using multiple reaction monitoring (MRM). As shown in Table 2, for quantitative analysis, peptides for each marker were selected and MRM-MS analysis was performed using SIS.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the biomarker expression level conversion information and the clinical information conversion level are input using a logistic regression model to confirm the diagnostic ability improvement effect.
  • the probability value classified as age-related macular degeneration was estimated.
  • Table 3 as a result of adding and analyzing the expression levels for Cp, DDI2, FCN2, MBL2, SELE, SIGLEC14, PNLIP and ZG16B one by one based on clinical information + IGFBP2 + ADAMTSL2 + LGALS3BP, the number of biomarkers increased. According to the results, it was confirmed that the diagnostic ability of age-related macular degeneration increased.
  • Plasma samples from patients with age-related macular degeneration were collected with the approval of the Institutional Review Board of Seoul National University Bundang Hospital. A total of 102 plasma samples were analyzed for the quantitative detection of biomarkers using plasma proteins, and the clinical characteristics of the analyzed normal group (Non AMD) and age-related macular degeneration (AMD) disease group are shown in Table 1 below.
  • MBL2 mannose-binding protein C
  • PNLIP pancreatic triacylglycerol lipase
  • LGALS3BP galectin-3-binding protein
  • SELE E-selectin
  • SIGLEC14 Sialic acid-binding Ig-like lectin 14
  • ADAMTSL2 ADAMTS-like protein 2
  • IGFBP2 insulin like growth factor binding protein 2
  • DDI2 Protein DDI1 homolog2
  • ZG16B Zymogen granule protein 16 homolog B
  • Cp Ceruloplasmin
  • 11 of FCN2 Fecolin 2
  • a representative peptide having a specific charge-to-mass ratio (m/z) for the proteins of 11 biomarkers is selected (Q1), and the peptide is broken by electric shock.
  • the ion (Q3) with the highest strength was selected.
  • At least one peptide with high sensitivity per protein was measured and injected into a mass spectrometer based on this to obtain an optimum value of fragmentation energy per transition, and three or more upper fragmented ions were selected based on the intensity (Table 2).
  • Top fragmentation ions for 11 biomarkers Gene name Trypsin fragment Target ion Target m/z ADAMTSL2 NFNIAGTVVK (SEQ ID NO: 1) 2y8 531.8007/801.4829 LGALS3BP SDLAVPSELALLK (SEQ ID NO: 2) 2y8 678.3927/870.5295 MBL2 WLTFSLGK (SEQ ID NO: 3) 2y6 476.2686/652.3665 SELE NWAPGEPNNR (SEQ ID NO: 4) 2y8 577.7705/854.4115 SIGLEC14 EGGEFTCR (SEQ ID NO: 5) 2y3 478.2005/436.1973 PNLIP TGYTQASQNIR (SEQ ID NO: 6) 2y5 619.8098/617.3365 IGFBP2 LIQGAPTIR (SEQ ID NO: 7) 2y7 484.798/742.4206 DDI2 DGDVVILR (SEQ ID NO: 8) 2y4 443.7533/
  • SIS Stable-isotope labeled standard
  • SIS peptide is a peptide obtained by substituting 13C and 15N for 12C and 14N in the amino acids of lysine (Lys, K) or arginine (Arg, R) at the C-terminus of the peptide. This has a difference in mass value from the endogenous peptide present in the blood, but since it has the same sequence, the peptide hydrophobicity is the same, so it elutes at the same retention time (RT) on the chromatogram.
  • RT retention time
  • 2-carboxylethyltrisphosphine Tris(2-carboxyethyl)-phosphine, TECP
  • 2-chloro 2-chloroacetamide
  • Acetamide (2-chloroacetamide) was added and reacted at 25° C. for 1 hour to reduce and alkylate disulfide bonds.
  • Rice seed enzyme was added so that the mass ratio of plasma protein to rice seed (wako) enzyme was 100:1, and reacted at room temperature for 4 hours.
  • Example 2-1 a heavy-labeled peptide was added (spiking) as an internal standard material (SIS peptide) determined in Example 2-1 to perform MRM analysis.
  • SIS peptide an internal standard material
  • Nano ultra 2D plus (Eksigent), a triple quadrupole mass spectrometer, QTarp 5500 (SCIEX) was used to monitor the transition of each selected protein in a scheduled MRM mode.
  • the peak area of the transition was calculated by processing raw data using Skyline (Mccoss lab, University of Washington, USA). Relative concentrations were compared for the endogenous/heavy labeled peptide using the peak area. Using the measured results, T-test and AUROC (Area under the receiver operating characteristic) values were generated to measure the predictive ability of each protein peptide. In order to confirm the predictive power combined with clinical information, a logistic regression model was used to input the expression level conversion information and the clinical record conversion degree to estimate a probability value classified as age-related macular degeneration. All statistical analyzes were performed using MedCal ver 17.1 (MedCalc).
  • a clinical information
  • b quantitative protein information
  • c integrated clinical information and protein quantitative information
  • d Delong et al. , 1988
  • the composite marker for diagnosis of age-related macular degeneration provided by the present invention not only has superior sensitivity and diagnostic performance compared to the combination of other markers, but also combines the protein quantification value of the composite marker with basic clinical information to analyze both early and late macular degeneration Since both stages show high diagnostic ability, it can be usefully used for early diagnosis of age-related macular degeneration.

Abstract

본 발명은 나이관련황반변성(age related macular degeneration) 진단용 복합 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 나이관련황반변성 진단에 특이적인 2개 이상의 혈액 마커로 구성되어, 진단 성능이 증가된 나이관련황반변성 진단용 복합 마커에 관한 것이다. 또한, 상기 복합 마커를 이용한 나이관련황반변성 진단용 조성물, 진단 키트 및 나이관련황반변성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 나이관련황반변성 진단용 복합 마커는 다른 마커의 조합에 비해 민감도 및 진단 성능이 우수한 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 복합바이오마커는 혈액 단백질로 생검을 이용하지 않고 환자 혈장을 이용하여 간편하게 분석할 수 있어 나이관련황반변성의 조기 진단에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

나이관련황반변성 진단용 복합 마커 및 이의 용도
본 발명은 나이관련황반변성(Age related macular degeneration, AMD) 진단용 복합 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 나이관련황반변성 진단에 특이적인 2개 이상의 혈액 마커로 구성되어, 진단 성능이 증가된 나이관련황반변성 진단용 복합 마커에 관한 것이다. 또한, 상기 복합 마커를 이용한 나이관련황반변성 진단용 조성물, 진단 키트 및 나이관련황반변성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
나이관련황반변성(age-related macular degeneration: AMD)은 50세 이상의 성인에서 주로 발생하는 망막의 중심부인 황반(macular)에 여러 가지 변화가 동반되어 생기는 질병으로써 당뇨망막병증 및 녹내장과 함께 안과 3대 실명질환 중 하나이다. 선진국에서는 성인 실명의 가장 주된 원인이며 나이가 증가함에 따라 발생율이 증가한다. 국민건강영양조사를 근거로 국내 나이관련 황반변성의 유병률을 살펴보면 한국인에서 60-69세 인구의 11.7%, 70세 이상 인구의 18%가 나이관련 황반변성에 이환되어 있다. 황반은 망막이라고 하는 신경 조직의 중심 부위를 말하는데, 빛 자극에 반응하는 광수용체 세포가 밀집되어 있어서 중심 시력을 담당한다. 나이가 들어감에 따라 황반부 광수용체 세포가 소실되어 시력 장애를 일으키는 질환을 나이관련황반변성이라 한다. AMD는 망막, 망막색소상피층(RPE), 부르크막(Bruch's membrane), 맥락막에 영향을 미치는 퇴행성 질병이다.
AMD는 건성 또는 비삼출성(dry) 형태와 습성 또는 삼출성(exudative) 형태로 나눌 수 있다. 비삼출성 형태는 망막에 드루젠(drugen)이나 망막색소 상피의 위축과 같은 병변이 생긴 경우를 말한다. 이는 보통 심한 시력상실을 유발하지는 않지만 습성 형태로 발전할 수 있다. 삼출성 형태는 망막 밑에 맥락막 신생혈관이 자라는 경우이다. 이러한 신생혈관은 황반부에 삼출물, 출혈 등을 일으켜서 광수용체를 손상시키고 그에 따라 중심시력을 저하시켜, 치료를 하지 않을 경우 대부분 0.1 이하의 법적 실명을 초래한다. 삼출성 형태의 황반변성은 진행속도가 매우 빨라서 수 주 안에 시력이 급속히 나빠지는 경우가 많다. 나이관련 황반변성은 일반적으로 일단 시력장애가 시작되면 이전의 시력을 회복할 수 없는 경우가 많으므로 조기 발견이 매우 중요하다. 조기 발견은 안과의사에 의한 정기적인 안과검진을 통해서 가능하며 안저검사를 포함한 안과적 검진으로 나이관련 황반변성이 의심되면, 형광안저혈관조영술, 빛간섭단층촬영 등의 안과 정밀검사들을 시행하여 확진할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 민감도 및 특이성이 높은 혈액 단백질 마커를 발굴하고, 이를 복합적으로 사용하여 나이관련황반변성 조기 진단능을 높이고자 노력한 결과, IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2), LGALS3BP(galectin-3-binding protein) 및 ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2)로 구성된 복합 마커의 나이관련 황반변성 진단 효율이 우수한 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 나이관련황반변성 진단에 특이적인 혈액 마커로 구성된 나이관련황반변성 진단용 복합 마커를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 나이관련황반변성 진단용 복합 마커를 이용한 나이관련황반변성 진단용 조성물 또는 진단 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나이관련황반변성 진단용 복합 마커를 이용한 나이관련황반변성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2), LGALS3BP(galectin-3-binding protein) 및 ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2)로 구성된 복합 마커의 나이관련황반변성 진단용 복합 마커를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 복합 마커는 MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), SELE(E-selectin), SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), DDI2(Protein DDI1 homolog2), ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B), Cp(Ceruloplasmin) 및 FCN2(Ficolin 2)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 마커를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2), LGALS3BP(galectin-3-binding protein) 및 ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2)로 구성된 나이관련 황반변성 진단용 복합 마커의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 나이관련 황반변성 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 복합 마커는 MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), SELE(E-selectin), SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), DDI2(Protein DDI1 homolog2), ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B), Cp(Ceruloplasmin) 및 FCN2(Ficolin 2)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 마커를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 복합 마커의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 마커의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 복합 마커의 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 나이관련 황반변성 진단용 조성물을 포함하는 나이관련 황반변성 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA (Enzymelinked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM (Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 환자의 생물학적 시료로부터 IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2), LGALS3BP(galectin-3-binding protein) 및 ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2)로 구성된 나이관련황반변성 진단용 복합 마커의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계;를 포함하는 나이관련 황반변성 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 복합 마커는 MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), SELE(E-selectin), SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), DDI2(Protein DDI1 homolog2), ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B), Cp(Ceruloplasmin) 및 FCN2(Ficolin 2)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 마커를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 나이관련황반변성 진단을 위한 정보제공 방법은 환자의 나이, 고혈압 여부, 고지혈증 여부, 흡연 여부, 당뇨 여부 및 심혈관 질환 여부로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 임상정보를 추가로 포함하여 대조군과 비교할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준 측정은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정은 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDITOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LCMS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring: MRM), 병행 반응 모니터링(parallel reaction monitoring: PRM), sequential windowed data independent acquisition of the total high-resolution(SWATH), 선택 반응 모니터링(selected reaction monitoring: SRM) 또는 면역 다중 반응 모니터링(immuno multiple reaction monitoring: iMRM)을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 나이관련 황반변성 진단을 위한 정보제공 방법은 복합 마커의 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준이 대조군에 비해 증가하면 나이관련 황반변성이라고 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 분석은 통계적 분석 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 통계적 분석 방법은 선형 또는 비선형 회귀 분석방법, 선형 또는 비선형 분류(classification) 분석방법, 로지스틱 회귀 분석방법(logistic regression), 분산분석(Analysis of Variance; ANOVA), 신경망 분석방법, 유전적 분석방법, 서포트 벡터 머신 분석방법, 계층 분석 또는 클러스터링 분석방법, 결정 트리를 이용한 계층 알고리즘 또는 커널 주성분(Kernel principal component) 분석방법, 마르코프 블랭킷(Markov Blanket) 분석방법, 회귀 특성 소거(recursive feature elimination) 또는 엔트로피-기본 회귀 특성 소거 분석방법, 전방 플로팅 서치(floating search) 또는 후방 플로팅 서치(floating search) 분석방법, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 나이관련 황반변성 진단용 복합 마커는 다른 마커의 조합에 비해 민감도 및 진단 성능이 우수한 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 복합 마커의 단백질 정량값과 기본적인 임상정보를 결합하여 분석하면 초기 및 후기 황반변성 두 단계 모두 높은 진단능을 보이는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 복합마커는 혈액 단백질로 생검을 이용하지 않고 환자 혈장을 이용하여 간편하게 분석할 수 있어 나이관련 황반변성의 조기 진단에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 복합 마커의 단백질 정량값 및 환자의 기본적인 임상정보를 결합하여 로지스틱회기 모델로 통계처리하여 분석한 데이터이다 (AMD: 나이관련 황반변성, Non AMD: 비황반변성 환자, Early AMD : 초기 황반변성, Late AMD : 후기 황반변성).
도 2는 본 발명에서 확인한 11 개의 마커 중, IGFBP2, LGALS3BP 및 ADAMTSL2 조합(1) 및 CP, DDI, FCN2, MBL2, SIGLEC14, SELE, PNLIP, ZG16B 조합(2)에 따른 단백질 정량값 및 환자의 기본적인 임상정보를 결합하여 로지스틱회기 모델로 통계처리하여 분석한 데이터이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 일 관점에서, IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2), LGALS3BP(galectin-3-binding protein) 및 ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2)로 구성된 나이관련 진단용 복합 마커에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 나이관련황반변성 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "진단용 마커"란 정상 대조군(황반변성이 아닌 개체)에 비하여 황반변성을 가진 개체에서 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준의 유의적인 증가 또는 감소 양상을 보이는 폴리펩티드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.
황반변성은 진행 정도에 따라 초기 황반변성(early AMD)와 후기 황반변성(Late AMD)로 구분한다. 초기 황반변성은 혈관이 발달하지 않으며, 후기 황반변성은 혈관이 발달하는 등 그 기전에 있어서 상이하기에, 후기 황반변성 진단용 마커로 알려진 마커라도 반드시 초기 황반변성 진단용 마커로 사용될 수는 없다.
본 발명의 복합 마커는 초기 황반변성 및 후기 황반변성을 모두 특이적으로 진단할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 복합 마커는 MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), SELE(E-selectin), SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), DDI2(Protein DDI1 homolog2), ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B), Cp(Ceruloplasmin) 및 FCN2(Ficolin 2)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2)는 인슐린유사생장인자(Insulin like growth factor; IGF)와 결합하여 세포 내 다양한 프로세스를 조절하며 그에 의해 혈관생성(angiogenesis)를 조절한다. 또한 다양한 암에서(전립선 및 유방암 등)에서 암세포의 생장을 촉진한다고 알려져 있다.
LGALS3BP(galectin-3-binding protein)는 LGALS3BP 유전자에 의해 암호와 되는 단백질로, Mac-2(human macrophage-associated lectin) 및 갈락틴 1(galectin 1)에 특이적으로 결합한다. LGALS3BP는 암 환자 및 HIV에 감염된 환자 혈청에서 증가하는 것으로 알려져 있으며, NK(natural killer)세포 및 LAK(lymphokine-activated killer) 세포 독성과 연관된 면역반응에 관여한다.
ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2)는 ADAMTS(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs) 유사 단백질 서브 패밀리 구성원으로, 세포 표면과 세포외 기질을 바인딩 하는 당단백질이다. ADAMTSL2는 LTBP1(latent transforming growth factor beta binding protein 1)과 상호작용하며, LTBP1 단백질은 세포의 성장 및 분열을 조절하는 중요한 성장인자인 TGF-β1의 저장에 관여하므로, ADAMTSL2는 TGF-β1의 이용가능성을 조절한다. 또한, ADAMTSL2는 암 조직에서 발현되므로 암 진단을 위한 마커로 사용된다.
MBL2(mannose-binding protein C)는 만노오스 결합 렉틴(Mannose-binding lectin; MBL) 또는 만난 결합 단백질(mannan-binding protein; MBP)으로도 불리운다. MBL2는 올리머구조(400 ~ 700 kDa)를 가지며, 대략 30kDa으로 구성된 3개의 동일한 펩타이드 사슬을 포함하는 서브 유닛으로 구성된다. 감염에 대한 반응으로 간에서 생성되며 급성 단계 단백질이라고 불리는 다른 많은 요인 중 일부에 해당한다.
PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase)는 트리글리세라이드의 에스테르 결합을 가수분해하는 지방 분해 효소군으로, 췌장에서 분비되는 효소이다. PNLIP는 췌장 덕트 시스템을 통해 십이지장으로 분비되기 때문에 혈청 내 농도는 낮은 것으로 알려져 있으나, 췌장염이나 췌장 선암과 같은 췌장 기능이 극도로 파괴되면, PNLIP를 포함한 췌장 효소가 혈청으로 분비되기 때문에, PNLIP 혈청 농도를 측정하여 급성 췌장염을 진단할 수 있는 것으로 알려져 있다.
SELE(E-selectin)는 CD62E(CD62 antigen-like family member E), (endothelial-leukocyte adhesion molecule 1) 또는 LECAM2(leukocyte-endothelial cell adhesion molecule 2)로 알려져 있으며, 인터류킨 1β, 종양괴사인자, 리포다당류에 의해 활성화된 혈관내피세포에 4~12시간을 정점으로 하여 일과성으로 발현, 유도하는 세포접착분자이다. SELE는 염증 조직내 혈관내피세포에 강하게 발현하고, 호중구와 단구가 혈관내피세포 위를 구르는 현상을 매개함으로써 이들 세포의 염증부위로의 침윤을 촉진한다. 암세포의 혈관내피세포와의 접착에도 관여하는 것으로 알려져 있다.
SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14)는 SIGLEC(Sialic acid-binding immunoglobulin-type lectins)의 서브패밀리 중 하나로, SIGLEC는 시알산과 결합하는 세포 표면 단백질이며 주로 면역세포의 표면에서 발현된다. SIGLEC과 시알산의 단백질 상호작용은 면역 시스템을 온, 오프 시키는 스위치 역할을 하며, 암세포 역시 SIGLEC-시알산 반응을 이용하여 면역반응에 대한 저항성을 획득하는 것으로 알려져 있다.
DDI2(Protein DDI1 homolog2)는 내부펩타이드 절단효소로써 세포 성장 및 DNA 복제 조절에 관여하는 Nrf1(nuclear respiratory factor 1)를 활성화 하여 프로테아좀 이상에 의한 단백질 분해 (degradation)을 보완한다.
ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B)는 PAUF(pancreatic adenocarcinoma upregulated factor)로 알려져 있으며 탄수화물과 결합하고 내부상피세포, 혈관생성 및 침투(permeability)를 활성화 시킨다고 알려져 있다.
Cp(Ceruloplasmin)는 혈액에서 구리를 운반하는 주단백질로서 철 대사에서 중요한 역할을 한다. 건강한 사람의 혈장에서 약 95% 이상의 구리가 세룰로플라스민(Ceruloplasmin) 형태로 존재한다.
FCN2(Ficolin 2)는 올리고렉틴의 한 종류로서 짧은 N말단 부분-콜라겐 (collagen) 유사 도메인과 피브리노겐(fibrinogen) 유사 도메인으로 구성되어 있다. 주로 간에서 발현되며 박테리아 세포벽의 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamin)과 결합하여, 만노오스 결합(mannose binding) 단백질처럼 옵소닌(opsonin) 역할을 함으로써 보체계의 렉틴 경로에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.
하지만, 상기 마커들은 나이관련황반변성 진단에 사용할 수 있음을 개시한 종래 기술은 알려진 바가 없으며, 특히, IGFBP2, ADAMTSL2 및 LGALS3BP의 복합 마커를 이용하여 나이관련황반변성의 진단 성능을 증가시킬 수 있음을 개시한 기술에 대해서는 전혀 알려진 바가 없다.
본 발명은 다른 관점에서 IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2) 및 ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2)로 구성된 황반변성 진단용 복합 마커의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 황반변성 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 복합 마커는 LGALS3BP(galectin-3-binding protein), MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), SELE(E-selectin), SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), DDI2(Protein DDI1 homolog2), ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B), Cp(Ceruloplasmin) 및 FCN2(Ficolin 2) 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 마커를 추가로 포함하는 것을 특징으본 발명은 다른 관점에서 IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2), LGALS3BP(galectin-3-binding protein) 및 ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2)로 구성된 황반변성 진단용 복합 마커의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 황반변성 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 복합 마커는 MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), SELE(E-selectin), SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), DDI2(Protein DDI1 homolog2), ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B), Cp(Ceruloplasmin) 및 FCN2(Ficolin 2) 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "mRNA 발현수준 측정"이란 나이관련황반변성을 진단하기 위하여 나이관련황반변성 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 나이관련황반변성 진단용 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNaseprotection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 복합 마커의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 마커의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하며, 상기 유전자들의 핵산 정보가 GeneBank 등에 알려져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드를 디자인할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 복합 마커의 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "단백질 발현수준 측정"이란 나이관련황반변성을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 나이관련황반변성 진단용 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다. 상기 유전자의 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자 (nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다.
상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring: MRM), 병행 반응 모니터링(parallel reaction monitoring: PRM), sequential windowed data independent acquisition of the total high-resolution(SWATH), 선택 반응 모니터링(selected reaction monitoring: SRM) 또는 면역 다중 반응 모니터링(immuno multiple reaction monitoring: iMRM) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 사용된 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 나이관련황반변성 진단용 복합 바이오 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 나이관련황반변성 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein(1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991 참조) 을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2및 Fv 등이 있다. 또한 본 발명의 항체는 상업적으로 입수한 것일 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리킨다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O(December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254(5037): 1497-500]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명에서 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 나이관련황반변성 진단용 조성물을 포함하는 나이관련황반변성 진단용 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 당업계에 알려져 있는 통상의 제조방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 키트는 예를 들면, 동결 건조 형태의 항체와 완충액, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함할 수 있다.
상기 키트는 검출가능한 표지를 더 포함할 수 있다. 용어 "검출가능한 표지"는 표지가 없는 동일한 종류의 분자들 중에서 표지를 포함하는 분자를 특이적으로 검출하도록 하는 원자 또는 분자를 의미한다. 상기 검출가능한 표지는 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자, 또는 압타머에 부착된 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 방사종(radionuclide), 형광원(fluorophore), 효소(enzyme)를 포함할 수 있다.
상기 키트는 당업계에 알려진 다양한 면역분석법 또는 면역염색법에 따라 이용될 수 있다. 상기 면역분석법 또는 면역염색법은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA, 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석, 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 키트는 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(multiple reaction monitoring)인 것일 수 있다.
또한, 상기 키트는 질량분석에 이용될 수 있다. 이 경우, 상기 단백질의 특정 아미노산 잔기는 미리스토일화(myristoylation), 이소프레닐화, 프레닐화, 글리피칸화(glypiation), 리포일화(lipoylation), 아실화, 알킬화, 메틸화, 탈메틸화, 아미드화, 유비퀴틴화, 인산화, 탈아미드화, 글리코실화, 산화, 또는 아세틸화 등과 같은 변형을 가질 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 환자의 생물학적 시료로부터 IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2), LGALS3BP(galectin-3-binding protein) 및 ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2)로 구성된 나이관련황반변성 진단용 복합 마커의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계;를 포함하는 나이관련황반변성 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 복합 마커는 MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), SELE(E-selectin), SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), DDI2(Protein DDI1 homolog2), ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B), Cp(Ceruloplasmin) 및 FCN2(Ficolin 2)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 방법에서 "생물학적 시료(biological sample)"란 나이관련황반변성 발병에 의해 단백질 발현 수준 또는 유전자 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 의미하며, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청을 의미한다.
상기 나이관련황반변성 진단을 위한 정보제공 방법은 환자의 나이, 고혈압 여부, 고지혈증 여부, 흡연여부, 당뇨여부 및 심혈관 질환 여부로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 임상정보를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 나이관련황반변성 진단을 위한 정보제공 방법은 복합 마커의 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준이 대조군에 비해 증가하면 나이관련황반변성 이라고 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 (a) 단계의 mRNA 발현 수준 측정은 상기 mRNA 발현 수준 측정 또는 비교는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등을 사용할 수 있으나, 본 발명은 이들에 제한되는 것이 아니다. 상기 측정 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 나이관련황반변성 환자의 mRNA 발현량을 확인할 수 있고, 이들 발현량 정도를 비교함으로써 나이관련황반변성 발병 여부를 진단 또는 예측할 수 있다.
상기 (a) 단계의 단백질 발현 수준 측정은 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 이용하여 측정 및 비교할 수 있다.
바람직하게, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는, 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDITOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LCMS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게, 본 발명에서는 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring: MRM), 병행 반응 모니터링(parallel reaction monitoring: PRM), sequential windowed data independent acquisition of the total high-resolution(SWATH), 선택 반응 모니터링(selected reaction monitoring: SRM) 또는 면역 다중 반응 모니터링(immuno multiple reaction monitoring: iMRM)을 이용하여 측정될 수도 있다.
MRM은 물질의 정확한 단편을 결정하여 이를 질량분석기에서 깬 후, 한 번 깨진 이온 중 특정 이온을 한 번 더 선택하여 연속적으로 연결된 검출기를 이용하여 그 수를 얻는 방법이다. MRM 방법을 이용하는 경우, 정상인 개체와 나이관련황반변성이 의심되는 개체의 혈액 시료에서 해당 단백질 또는 그의 단편을 질량분석기를 이용하여 정량할 수 있다.
상기 (b) 단계의 분석은 진단의 정확도를 향상시키기 위해 통계적 방법 또는 알고리즘을 사용하여 분석할 수 있으며, 선형 또는 비선형 회귀 분석방법, 선행 또는 비선형 분류(classification) 분석방법, 로지스틱 회귀 분석방법(logistic regression), 분산분석(Analysis of Variance; ANOVA), 신경망 분석방법, 유전적 분석방법, 서포트 벡터 머신 분석방법, 계층 분석 또는 클러스터링 분석방법, 결정 트리를 이용한 계층 알고리즘 또는 커널 주성분(Kernel principal component) 분석방법, 마르코프 블랭킷(Markov Blanket) 분석방법, 회귀 특성 소거(recursive feature elimination) 또는 엔트로피-기본 회귀 특성 소거 분석방법, 전방 플로팅 서치(floating search) 또는 후방 플로팅 서치(floating search) 분석방법, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 분석방법을 이용할 수 있다. 본 발명에서는 바람직하게, 상기 통계적 방법은 로지스틱회귀(logistic regression) 분석 방법을 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서는, 혈장 단백체 중 나이관련황반변성 진단을 위한 바이오 마커의 정량적 검증을 위하여 102개의 혈장 시료를 분석하였으며(표 1), IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2), ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2), MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), SELE(E-selectin), SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), DDI2(Protein DDI1 homolog2), ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B), Cp(Ceruloplasmin) 및 FCN2(Ficolin 2)로 구성된 11개의 타겟 마커를 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring: MRM)을 이용하여 분석하였다. 표 2에 나타난 바와 같이, 정량분석을 위해 각 마커에 대한 펩타이드를 선별하여 SIS를 이용하여 MRM-MS 분석을 수행하였다.
본 발명의 구체적인 다른 일구현예에서는, 복합 바이오 마커군 결과 및 임상정보를 결합하였을 때, 진단능 향상효과를 확인하기 위해 로지스틱회귀 모델을 이용하여 바이오마커 발현량 변환정보 및 임상정보 변환정도를 입력하여 나이관련황반변성으로 분류되는 확률값을 추정하였다. 표 3에 나타난 바와 같이, 임상정보 + IGFBP2 + ADAMTSL2 + LGALS3BP 기본으로 하여 Cp, DDI2, FCN2, MBL2, SELE, SIGLEC14, PNLIP 및 ZG16B 에 대한 발현 정도를 하나씩 추가하여 분석한 결과, 바이오마커의 수가 증가됨에 따라 나이관련황반변성의 진단능이 증가함을 확인하였다.
또한, 도 1 및 표 4에 나타난 바와 같이, 로지스틱회기 모델을 이용하여 상기 11개의 마커에 대한 단백질 정량값과 기본적인 임상정보를 결합하여 통계처리한 결과, 정상군과 초기 나이관련황반변성(stage 1) 및 후기 나이관련황반변성(stage 2) 모두에서 대한 진단능이 우수함을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일구현예에서는, 바이오마커의 조합에 따라 진단성능의 차이가 보이는지 확인하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 11개의 타겟 중 IGFBP2, LGALS3BP 및 ADAMTSL2 조합(조합 1; AUC= 0.822)이 다른 8개의 단백질인 Cp, DDI2, FCN2, MBL2, SIGLEC14, SELE, SIGLEC14 및 ZG16B의 조합(조합 2; AUC=0.731)에 비해 높은 진단능을 가짐을 확인 하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 나이관련황반변성 환자 선정 및 혈장 채취
나이관련황반변성 환자의 혈장 시료는 분당서울대학교병원의 임상시험심사위원회의 승인을 받아 채취하였다. 혈장 단백체 이용하여 바이오마커의 정량적 검출을 위해 총 102개의 혈장 시료를 분석하였으며, 분석대상인 정상군(Non AMD) 및 나이관련황반변성(AMD) 질환군의 임상적 특징은 하기 표 1에 나타내었다.
시료 임상 정보
시료 (n=102)
Non AMD(n=30) AMD(n=72) Early AMD(n=29) Late AMD(n=25)
나이 59.8±6.6 71.7±8.1 71.8±6.5 71.6±9.2
성별(여/남) 14/16 34/38 23/6 11/32
Systemic risk factors
흡연 11 (36.7) 34 (47.2) 8 (27.6) 26 (60.5)
당뇨 2 (6.7) 12 (16.7) 2 (6.9) 10 (23.3)
고혈압(%) 10 (33.3) 32 (44.4) 9 (31.0) 23 (53.5)
고지혈증(%) 7 (23.3) 23 (31.9) 12 (41.4) 11 (25.6)
심혈관질환(%) 3 (10.0) 7 (9.7) 2 (6.9) 5 (11.6)
실시예 2. 펩타이드 선정 및 MRM-MS를 이용한 펩타이드 분석
2-1 : 펩타이드 선정 및 합성 펩타이드 설계
본 발명에서는 나이관련황반변성을 진단하기 위한 바이오 마커로 MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), LGALS3BP(galectin-3-binding protein), SELE(E-selectin), SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2), IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2), DDI2(Protein DDI1 homolog2), ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B), Cp(Ceruloplasmin) 및 FCN2(Ficolin 2)의 11개를 선별하였다.
상기 바이오마커에 대한 MRM 분석을 수행하기 위해 11 개의 바이오마커의 단백질에 대해 특정적인 전하 대 질량비(m/z)를 갖는 대표 펩타이드를 선정하고(Q1), 이 펩타이드를 전기적인 충격으로 깨서 발생하는 단편화 이온 (fragmentation ion)중 가장 강도가 높은 이온(Q3)를 선정하였다.
단백질 당 감도 높은 1개 이상의 펩티드를 측정하고 이를 기초로 질량분석기에 주입하여 각 트랜지션 당 파편화 에너지 최적값을 얻고, 강도를 기준으로 3개 이상의 상위 단편화 이온을 선택하였다 (표 2).
11개 바이오마커에 대한 상위단편화 이온
유전자명 트립신절편 표적이온 표적m/z
ADAMTSL2 NFNIAGTVVK (서열번호 1) 2y8 531.8007/801.4829
LGALS3BP SDLAVPSELALLK (서열번호 2) 2y8 678.3927/870.5295
MBL2 WLTFSLGK (서열번호 3) 2y6 476.2686/652.3665
SELE NWAPGEPNNR (서열번호 4) 2y8 577.7705/854.4115
SIGLEC14 EGGEFTCR (서열번호 5) 2y3 478.2005/436.1973
PNLIP TGYTQASQNIR (서열번호 6) 2y5 619.8098/617.3365
IGFBP2 LIQGAPTIR (서열번호 7) 2y7 484.798/742.4206
DDI2 DGDVVILR (서열번호 8) 2y4 443.7533/500.3555
ZG16B YFSTTEDYDHEITGLR (서열번호 9) 3y14+2 649.6304/818.8761
Cp AEVGDTIR (서열번호 10) 2y6 430.7272/660.3675
FCN2 LQAADTCPEVK (서열번호 11) 2y9 616.303/990.4561
정량성을 확인하기 위하여 11개의 단백질에 해당하는 SIS (Stable-isotope labeled standard) 펩타이드를 이용하였으며, 칼리브레이션을 통하여 선형성을 확인하는 실험을 이용하여 spiked heavy peptide 농도를 정하였다. SIS 펩타이드는 펩타이드 C-말단의 라이신 (Lys, K)이나 아르기닌 (Arg, R) 아미노산에 있는 12C와 14N을 13C와 15N으로 치환한 펩타이드이다. 이는 혈액내에 존재하는 내인성 펩타이드 (endogenous peptide)와는 질량값이 차이가 나지만, 동일한 서열을 갖기 때문에 펩타이드 소수성(hydrophobicity)이 동일하므로, 크로마토그램 상에서 동일한 머무름 시간(retention time, RT)에 용출된다.
2-2 :혈장시료의 전처리 및 MRM-MS 분석
상기 실시예 1에서 수득한 각 혈장에서 고량(high abundant)으로 존재하는 단백질 14종(Albumin, IgG, Antitrypsin, IgA, Transferrin, Haptoglobin, Fibrinogen, Alpha2-Macroglobulin, Alpha1-Acid glycoprotein, IgM, Apolipoprotein AI, Apolipoprotein AII, Complement C3, Transthyretin)을 제거하는 감손과정(depletion)을 실시하였다. 감손은 MARS(Multiple affinity removal system, Agilent, 미국) 컬럼을 제조사의 방법대로 이용하여 14종의 단백질을 제거하고, 나머지 소량으로 존재하는 단백질을 용출시켜 분석에 사용하였다. 이 용출된 감손시료에 8 M이 되도록 요소(urea)를 첨가한 후 80 mM이 되도록 2-카르보실에틸트리스포스파인(Tris(2-carboxyethyl)-phosphine, TECP) 및 320 mM이 되도록 2-클로로아세타마이드(2-chloroacetamide)을 첨가하고 25℃에서 1시간 동안 반응시켜 이황화결합을 환원 및 알킬화를 하였다. 여기에 혈장 단백질과 라이스씨(wako) 효소의 질량 비율이 100:1이 되도록 라이스씨 효소를 넣고 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 그 후, 50 mM 트리스(Tris, pH8.0) 용액으로 10배 희석하고 시퀀싱이 가능한 수준의 트립신(Promega)을 단백질과 트립신의 질량 비율이 50:1이 되도록 첨가하여 37℃에서 12시간 이상 반응시켜 펩티드 절편으로 분해하였다. 0.3%가 되도록 포름산 (formic acid) 용액을 가하여 pH 2.0 이하로 산성화시키고 트립신 반응을 멈추게 하였다.
여기에 탈염화를 진행하고 상기 실시예 2-1에서 정한 내부 표준 물질(SIS 펩타이드)로 heavy-labeled 펩타이드를 첨가(spiking)하여 MRM 분석을 시행했다. Nano ultra 2D plus(Eksigent)에 결합되어 있고, 삼중 사극자 질량분석기인 QTarp 5500(SCIEX) 장비를 이용하여 각 선정 단백질의 트랜지션에 대한 scheduled MRM 모드로 모니터링 하였다.
구체적으로, 5500 볼트의 이온 전압을 사용하고 및 Q1(Quadruple 1)과 Q3(Quadruple 3)에서의 해상능을 유닛(unit)으로 설정하였다. 트랜지션에 총 사이클 시간이 1.5초가 되도록 설정하였다. 20 유닛(unit)의 분무 가스(nebulizing gas)를 사용하고 히터 온도를 350℃로 설정하였다. 배치(batch) 간 변이를 보정하기 위해 각 시료에 내부 표준 물질을 스파이킹 하고 동시에 모니터링 하였다.
2-3: 데이터 분석
스카이라인(Skyline; McCoss lab, University of Washington, 미국)를 이용하여 로우 데이터(raw data)를 프로세싱하여 트랜지션의 피크면적을 계산하였다. 내부표준물질 펩타이드(endogenous/heavy labeled peptide)에 대하여 피크면적을 사용하여 상대적 농도를 비교하였다. 이렇게 측정된 결과값을 이용하여 각 단백질 펩타이드의 질환 예측력(predictive ability)를 측정하고자 T-검정(T-test) 및 AUROC(Area under the receiver operating characteristic) 수치를 생성하였으며, 복합 바이오 마커군 결과와 임상정보가 결합된 예측력을 확인하고자, 로지스틱 회귀분석(logistic regression) 모델을 이용하여 상기 발현량 변환정보 및 임상기록 변환정도를 입력받아 나이관련황반변성으로 분류되는 확률값을 추정하였다. MedCal ver 17.1(MedCalc)를 사용하여 모든 통계 분석을 수행하였다.
실시예 3. 복합 바이오 마커군 결과 및 임상정보 결합에 따른 진단능 향상 확인
본 발명에서는 11개의 복합 바이오 마커군 결과 및 임상정보를 결합하였을 때, 진단능 향상효과를 확인하기 위해 로지스틱회귀 모델을 이용하여 바이오마커 발현량 변환정보 및 임상정보 변환정도를 입력하여 나이관련황반변성으로 분류되는 확률값을 추정하였다.
복합 바이오 마커 결합 수에 따른 나이관련황반변성 진단 성능 확인
기본(STAGE1) C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 AUC
1 2 3 4 0.822
1 2 3 4 5 0.820
1 2 3 4 5 6 0.824
1 2 3 4 5 6 7 0.826
1 2 3 4 5 6 7 8 0.826
1 2 3 4 5 6 7 8 9 0.836
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0.841
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0.865
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0.882
1.임상정보, 2. IGFBP2, 3. ADAMTSL2, 4. LGALS3BP, 5. FCN2. 6. Cp, 7. DDI2, 8. MBL2, 9. SIGLEC14, 10. SELE, 11. PNLIP, 12. ZG16B
복합 바이오 마커군 및 임상 정보 결합에 따른 진단능 확인
STAGE1 STAGE2
AUC SEd 95% CI AUC SEd 95% CI
Ca 0.653 0.0664 0.523~0.738 0,725 0.0569 0.613~0.836
Pb 0.867 0.0414 0.786~0.948 0.801 0.0512 0.700~0.901
Comc 0.891 0.0356 0.821~0.960 0.844 0.0451 0.756~0.933
a: 임상정보, b: 단백질 정량정보, c: 임상정보 및 단백질 정량정보 통합, d: Delong et al., 1988
표 3에 나타난 바와 같이, 임상정보 + IGFBP2 + LGALS3BP + ADAMTSL2 기본으로 하여 Cp, DDI2, FCN2, MBL2, SIGLEC14, SELE, SIGLEC14 및 ZG16B에 대한 정량값을 하나씩 추가하여 분석한 결과, 바이오마커의 수가 증가됨에 따라 나이관련황반변성의 진단능 (AUC)이 증가함을 확인하였다.
또한, 도 1 및 표 4에 나타난 바와 같이, 로지스틱회기 모델을 이용하여 상기 11개의 마커에 대한 단백질 정량값과 기본적인 임상정보를 결합하여 통계처리한 결과, 정상군과 나이관련황반변성(stage 1; 정상군 vs AMD)에 대한 진단능 (AUC=0.891) 및 정상군 및 초기 황반변성(stage 2; 정상군 및 early AMD vs late AMD에 대한 진단능 (AUC=0.844) 모두 우수함을 확인하였다.
실시예 4. 바이오마커의 조합에 따른 나이관련황반변성 진단 성능 확인
본 발명에서는 11개의 바이오마커의 조합에 따라 나이관련황반변성의 진단 성능의 차이가 보이는지 확인하였다. 11개의 타겟 중 IGFBP2, LGALS3BP, ADAMTSL2 조합과 Cp, DDI2, FCN2, MBL2, SELE, SIGLEC14 및 ZG16B 조합으로 나누어 분석을 수행하였으며, 상기 실시예 3의 stage 1에 따라 임상정보와 함께 분석을 수행하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 11개의 타겟 중 IGFBP2, LGALS3BP 및 ADAMTSL2(조합1, AUC= 0.822) 이 다른 9개의 단백질인 LGALS3BP, Cp, DDI2, FCN2, MBL2, SIGLEC14, SELE, SIGLEC14 및 ZG16B(조합2, AUC=0.731) 높은 진단능을 가짐을 확인 하였다.
본 발명에서 제공하는 나이관련 황반변성 진단용 복합 마커는 다른 마커의 조합에 비해 민감도 및 진단 성능이 우수할 뿐만 아니라, 복합 마커의 단백질 정량값과 기본적인 임상정보를 결합하여 분석하면 초기 및 후기 황반변성 두 단계 모두 높은 진단능을 보이므로, 나이관련 황반변성의 조기 진단에 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (15)

  1. IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2), LGALS3BP(galectin-3-binding protein) 및 ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2)로 구성된, 나이관련황반변성 진단용 복합 마커.
  2. 제1항에 있어서, 상기 복합 마커는 MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), SELE(E-selectin), SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), DDI2(Protein DDI1 homolog2), ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B), Cp(Ceruloplasmin) 및 FCN2(Ficolin 2)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 나이관련황반변성 진단용 복합 마커.
  3. IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2), LGALS3BP(galectin-3-binding protein) 및 ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2)로 구성된 나이관련황반변성 진단용 복합 마커의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 나이관련황반변성 진단용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), SELE(E-selectin), SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), DDI2(Protein DDI1 homolog2), ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B), Cp(Ceruloplasmin) 및 FCN2(Ficolin 2)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 마커에 대한 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 나이관련황반변성 진단용 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 복합 마커의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 마커의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는, 나이관련황반변성 진단용 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 복합 마커의 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 마커의 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)인 것을 특징으로 하는, 나이관련황반변성 진단용 조성물.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 나이관련황반변성 진단용 조성물을 포함하는, 나이관련황반변성 진단용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것을 특징으로 하는, 나이관련황반변성 진단용 키트.
  9. (a) 환자의 생물학적 시료로부터 IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2), LGALS3BP(galectin-3-binding protein) 및 ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2)로 구성된 나이관련황반변성 진단용 복합 마커의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계;
    를 포함하는, 나이관련황반변성 진단을 위한 정보제공 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 복합 마커는 MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), SELE(E-selectin), SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), DDI2(Protein DDI1 homolog2), ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B), Cp(Ceruloplasmin) 및 FCN2(Ficolin 2)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 나이관련황반변성 진단을 위한 정보제공 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 나이관련황반변성 진단을 위한 정보제공 방법은 환자의 나이, 고혈압 여부, 고지혈증 여부, 흡연여부, 당뇨여부 및 심혈관 질환 여부로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 임상정보를 추가로 제공하는 것을 특징으로 하는, 나이관련황반변성 진단을 위한 정보제공 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준 측정은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩을 이용하는 것을 특징으로 하는, 나이관련황반변성 진단을 위한 정보제공 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDITOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LCMS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring: MRM), 병행 반응 모니터링(parallel reaction monitoring: PRM), sequential windowed data independent acquisition of the total high-resolution(SWATH), 선택 반응 모니터링(selected reaction monitoring: SRM) 또는 면역 다중 반응 모니터링(immuno multiple reaction monitoring: iMRM)을 이용하는 것을 특징으로 하는, 나이관련황반변성 진단을 위한 정보제공 방법.
  14. 제9항에 있어서, 상기 (b) 단계의 분석은 통계적 분석 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 나이관련황반변성 진단을 위한 정보제공 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 통계적 분석 방법은 선형 또는 비선형 회귀 분석방법, 선행 또는 비선형 분류(classification) 분석방법, 로지스틱 회귀 분석방법(logistic regression), 분산분석(Analysis of Variance; ANOVA), 신경망 분석방법, 유전적 분석방법, 서포트 벡터 머신 분석방법, 계층 분석 또는 클러스터링 분석방법, 결정 트리를 이용한 계층 알고리즘 또는 커널 주성분(Kernel principal component) 분석방법, 마르코프 블랭킷(Markov Blanket) 분석방법, 회귀 특성 소거(recursive feature elimination) 또는 엔트로피-기본 회귀 특성 소거 분석방법, 전방 플로팅 서치(floating search) 또는 후방 플로팅 서치(floating search) 분석방법, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 나이관련황반변성 진단을 위한 정보제공 방법.
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