KR101880554B1 - 콧물 시료를 이용한 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝 방법 - Google Patents

콧물 시료를 이용한 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머(beta amyloid oligomer) 및 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝용 조성물, 키트 및 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머 및 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머 및 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 경도 알츠하이머 질환 치료제의 스크리닝 방법 및 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머 및 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 경도 알츠하이머 질환 치료제의 스크리닝 키트에 관한 것이다.

Description

콧물 시료를 이용한 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝 방법 {Method for screening stage of Alzheimer's disease progression using nasal fluid}
본 발명은 콧물 시료를 이용한 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝용 조성물 및 이를 이용한 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머(beta amyloid oligomer) 및 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝용 조성물, 키트 및 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머 및 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머 및 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 경도 알츠하이머 질환 치료제의 스크리닝 방법 및 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머 및 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 경도 알츠하이머 질환 치료제의 스크리닝 키트에 관한 것이다.
퇴행성 뇌질환(degenerative brain disease)은 나이가 들어감에 따라 뇌에서 발생하는 질환을 뜻한다. 현재까지 잘 알려지지 않은 원인으로 뇌에서 특정 뇌세포군이 서서히 그 기능을 잃고 뇌신경계의 정보전달에 가장 중요한 뇌신경세포의 사멸, 뇌신경세포와 뇌신경세포 사이의 정보를 전달하는 시냅스의 형성이나 기능상의 문제 또는 뇌신경의 전기적 활동성의 이상적 증가나 감소로 인하여 야기되는 것으로 알려져 있다. 퇴행성 뇌질환은 나타나는 주요 증상과 침범되는 뇌부위를 고려하여 구분할 수 있으며, 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD)은 다른 뇌질환과 비교하여 질환 특이적 단백질 발현, 특이적 세포군의 사멸과 이를 통한 특이적 증상으로 확인될 수 있다.
최근 알츠하이머 질환이 급속하게 증가하는 추세에 있어, 조기진단, 예방 및 치료에 대한 필요성이 시급한 실정이나, 현재까지 알츠하이머 질환의 진단은 신경 심리학적인 검사, 예를 들어, 단축형 노인 우울 척도(Short Form of Geriatric Depression Scale; GDS) 또는 간이 정신 상태 검사(mini-mental state examination; MMSE)나 특화된 MRI 촬영과 같은 많은 시간과 경비가 소요되는 방법들만이 가능하였다.
예를 들어, 기존의 알츠하이머병 진단 방법으로, 고해상도 뇌영상 촬영장치를 이용한 뇌영상 촬영 기법이 있다. 뇌영상 촬영 기법을 이용한 알츠하이머병의 조기 진단 방법은 알츠하이머병 의심환자를 대상으로 뇌 촬영을 실시하여 베타 아밀로이드 단백질의 이상축적 정도를 측정하고 환자들의 사후 뇌조직 검사 결과와의 비교분석을 통해 뇌영상 촬영장치의 정밀도를 연구한다. 하지만 이러한 영상기반 진단 방법은 환자에게 고비용을 요구할 뿐만 아니라, 이미 뇌수축 또는 손상이 진행된 상태에서 판별이 이루어지므로 병의 탐지가 늦게 된다.
또 다른 대표적 진단 방법으로는 척수액을 진단하는 것으로서 뇌척수 내의 베타 아밀로이드 단백질 양의 변화를 측정한다. 하지만 뇌척수 검사방법 자체가 환자에게는 너무나 고통스러운 방법이라고 알려져 있으며, 검사시 위험성이 동반된다는 점이 단점으로 지적되고 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 비침습적인 방법으로 채취한 콧물 시료를 이용하여 뇌신경 질환을 진단하는 방법을 개발하여 대한민국 공개특허 제10-2015-0144283호로 공개한 바 있다. 구체적으로, 상기 특허에서는 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머(beta amyloid oligomer)의 발현 수준을 측정하여 뇌신경 질환을 진단하는 방법을 개시하였다.
그러나, 뇌신경 질환의 발병 여부를 확인할 수 있을 뿐만 아니라 뇌신경 질환의 진행단계를 구분하여 정밀하게 진단할 수 있는 비침습적 진단 방법이 여전히 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 콧물 시료에서 알츠하이머 질환의 초기 단계에 해당하는 경도 알츠하이머 질환(Mild Alzheimer's disease; Mild AD)에만 특이적으로 발현하는 단백질을 확인하고, 이를 이용하여 알츠하이머 질환의 진행 단계를 스크리닝하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머(beta amyloid oligomer)의 발현 수준을 측정하는 제제; 및 분리된 콧물 시료에서 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제;를 포함하는 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머 및 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 a) 경도 알츠하이머 질환(Mild Alzheimer's disease)을 앓고 있는 환자로부터 분리된 콧물 시료에 경도 알츠하이머 질환 치료제 후보물질을 처리하는 단계; b) 상기 a) 단계의 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 시료에서 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 경도 알츠하이머 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머(beta amyloid oligomer) 및 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 경도 알츠하이머 질환 치료제의 스크리닝 키트를 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 분리된 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머(beta amyloid oligomer)의 발현 수준을 측정하는 제제; 및 분리된 콧물 시료에서 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제;를 포함하는 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준을 측정하는 제제는 베타 아밀로이드 올리고머에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머일 수 있고, 상기 S100A9 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 S100A9 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝용 조성물은 분리된 콧물 시료에서 HYOU1 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 HYOU1 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 HYOU1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머일 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 조성물을 포함하는 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, a) 분리된 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 b) 상기 a) 단계의 시료에서 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 a) 단계에서 베타 아밀로이드 올리고머가 발현되고, 상기 b) 단계에서 S100A9 단백질이 발현되는 것으로 확인되는 경우 경도 알츠하이머 질환(Mild Alzheimer's disease)으로 진단하고; 상기 a) 단계에서 베타 아밀로이드 올리고머가 발현되고, 상기 b) 단계에서 S100A9 단백질이 발현되지 않는 것으로 확인되는 경우 중도 알츠하이머 질환(Moderate Alzheimer's disease)으로 진단할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝 방법은 c) 상기 b) 단계의 시료에서 HYOU1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 a) 단계에서 베타 아밀로이드 올리고머가 발현되고, 상기 b) 단계에서 S100A9 단백질이 발현되며, 상기 c) 단계에서 HYOU1 단백질이 발현되는 것으로 확인되는 경우 경도 알츠하이머 질환(Mild Alzheimer's disease)으로 진단하고; 상기 a) 단계에서 베타 아밀로이드 올리고머가 발현되고, 상기 b) 단계에서 S100A9 단백질이 발현되지 않으며, 상기 c) 단계에서 HYOU1 단백질이 발현되지 않는 것으로 확인되는 경우 중도 알츠하이머 질환(Moderate Alzheimer's disease)으로 진단할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 a), b) 및 c) 단계의 측정은 웨스턴 블롯(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorecence Activated Cell Sorter, FACS), 또는 단백질 칩(protein chip)을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명은 또한, a) 경도 알츠하이머 질환(Mild Alzheimer's disease)을 앓고 있는 환자로부터 분리된 콧물 시료에 경도 알츠하이머 질환 치료제 후보물질을 처리하는 단계; b) 상기 a) 단계의 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 시료에서 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 경도 알츠하이머 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 b) 단계에서 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준이 상기 후보물질을 처리하기 전보다 감소하고, 상기 c) 단계에서 S100A9 단백질의 발현 수준이 상기 후보물질을 처리하기 전보다 감소하는 경우 경도 알츠하이머 질환 치료제로 선택할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 경도 알츠하이머 질환 치료제의 스크리닝 방법은 d) 상기 c) 단계의 시료에서 HYOU1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 b) 단계에서 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준이 상기 후보물질을 처리하기 전보다 감소하고, 상기 c) 단계에서 S100A9 단백질의 발현 수준이 상기 후보물질을 처리하기 전보다 감소하며, 상기 d) 단계에서 HYOU1 단백질의 발현 수준이 상기 후보물질을 처리하기 전보다 감소하는 경우 경도 알츠하이머 질환 치료제로 선택할 수 있다.
본 발명은 또한, 분리된 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머(beta amyloid oligomer)의 발현 수준을 측정하는 제제; 및 분리된 콧물 시료에서 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제;를 포함하는 경도 알츠하이머 질환 치료제의 스크리닝 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 경도 알츠하이머 질환 치료제의 스크리닝 키트는 분리된 콧물 시료에서 HYOU1 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝 방법은 2가지 이상의 서로 다른 단계를 대표하는 단백질을 동시에 콧물 시료에서 확인함으로써 알츠하이머 진행 단계를 정확하고 신속하게 비침습적 방법으로 스크리닝할 수 있다. 기존의 알츠하이머 질환의 진단 방법은 2가지 이상의 방법을 함께 사용하여 진단의 정확성을 확보하고자 하였으나, 이는 비용적 측면 및 접근성 측면에서 문제가 있고 진단 방법들 사이에 유기적 연계성의 문제로 확진에 문제점이 있었다. 그러나, 본 발명의 방법은 다른 진단 방법과 함께 사용하지 않더라도 한번에 알츠하이머 질환의 진단 및 진행 단계를 스크리닝할 수 있어 기존의 알츠하이머 진단 방법의 문제점을 극복할 수 있다.
도 1은 프로테오믹스를 통한 바이오마커 검증 확인 절차를 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 경도 알츠하이머 질환 환자군과 정상군의 콧물 시료를 이용한 프로테오믹스 결과를 비교한 것으로, (A)는 콧물 단백질의 겔 이미지이고 (B)는 겔 밴드의 농도를 분석하여 그래프로 나타낸 것이다. 바(bar)는 평균의 표준오차를 포함하는 평균값을 나타내고, 회색 바는 대조군(control), 붉은색 바(red bar)는 경도 알츠하이머 환자군을 의미한다 (*P < 0.05).
도 3은 경도 알츠하이머 질환 환자군과 정상군의 콧물 시료를 통해 검출한 프로테옴 변화를 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 경도 알츠하이머 질환 환자군과 정상군의 콧물 시료를 통해 선별된 바이오마커 단백질 S100A9, HYOU1 및 SAA2를 정상군, 경도 알츠하이머 환자군 및 중도 알츠하이머 환자군으로부터 채취한 콧물 시료에서 각각 정량 분석한 결과로, (A)는 면역블롯팅을 통해 각각 S100A9, HYOU1 및 SAA2 항체를 이용하여 단백질 발현량을 확인한 것이고, (B)는 각 단백질의 발현 수준을 정량화하여 그래프로 나타낸 것이다 (***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05, a = 0.0622 ).
도 5는 모든 알츠하이머 환자가 발현하는 단백질인 베타 아밀로이드 올리고머와 경도 알츠하이머 질환 환자군과 정상군의 콧물 시료를 통해 선별된 바이오마커 단백질 S100A9를 정상군, 경도 알츠하이머 환자군 및 중도 알츠하이머 환자군으로부터 채취한 콧물 시료에서 각각 정량 분석한 결과로, (A)는 면역블롯팅을 통해 각각 A11 및 S100A9 항체를 이용하여 단백질 발현량을 확인한 것이고, (B)는 각 단백질의 발현 수준을 정량화하여 그래프로 나타낸 것이다 ( **P < 0.01, ***P < 0.001 ).
도 6은 콧물 시료에서 알츠하이머 질환의 진단 및 진행 단계를 스크리닝 할 수 있는 진단 키트의 도식을 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 뇌신경 질환의 발병 여부를 확인할 수 있을 뿐만 아니라 뇌신경 질환의 진행단계를 구분하여 정밀하게 진단할 수 있는 비침습적 진단 방법이 여전히 요구되고 있다. 이에, 본 발명자들은 콧물 시료에서 알츠하이머 질환의 초기 단계에 해당하는 경도 알츠하이머 질환(Mild Alzheimer's disease; AD)에만 특이적으로 발현하는 단백질을 확인하고, 이를 이용하여 알츠하이머 질환의 진행 단계를 스크리닝하는 방법을 개발함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다.
본 발명의 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝 방법은 2가지 이상의 서로 다른 단계를 대표하는 단백질을 동시에 콧물 시료에서 확인함으로써 알츠하이머 진행 단계를 정확하고 신속하게 비침습적 방법으로 스크리닝할 수 있다.
따라서, 본 발명은 분리된 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머(beta amyloid oligomer)의 발현 수준을 측정하는 제제; 및 분리된 콧물 시료에서 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제;를 포함하는 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "콧물 시료"는 코 세척액, 예를 들어, 식염수를 콧속에 스프레이한 후 콧물 흡입기로 채취한 시료, 식염수를 코에 흘려 보낸 후 흐르는 콧물을 채취한 시료 등을 포함할 수 있다.
앞서 언급한 바와 같이 본 발명자들은 대한민국 공개특허 제10-2015-0144283호를 통해 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준을 측정하여 뇌신경 질환을 진단할 수 있음을 입증한 바 있다. 따라서, 본 발명자들은 먼저 알츠하이머 환자의 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머(beta amyloid oligomer)의 발현 수준을 알츠하이머 진행단계에 따라 샘플링하여 확인하였고, 각 시료들에서 프로테오믹스 방법을 통해 알츠하이머 진행 단계에 특이적인 단백질을 확인하였다.
도 2(A)는 콧물 시료의 단백질을 겔에서 동량 전기영동하여 단백질 염색을 통해 사이즈에 따른 단백질 분포를 확인한 것이고, 도 2(B)는 이를 정량화하여 그래프로 나타낸 것으로, 단백질의 사이즈대로 정렬했을 때 밴드 번호 7번 및 20번에서 유의성 있는 차이를 나타냄을 확인하였다. 상기 타겟 밴드를 비롯하여 유의성 있는 차이에 근접한 밴드 번호 8번을 추가한 7번, 8번 및 20번 밴드에서 단백질을 추출하여 LC-MS/MS 분석을 통해 후보 단백질 군을 확인하였고, 이를 기능별로 분석하여 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이 경도 알츠하이머 환자의 콧물에서 면역체계 과정(Immune system process)에 관여하는 것으로 분류되는, 분비된 단백질 개수가 두 번째로 많이 증가하였고, 이 그룹의 단백질이 알츠하이머 질환에 특이적으로 발현하는 것으로 확인되었다. 이러한 결과를 바탕으로, 알츠하이머 환자의 콧물 시료에 존재하는 면역체계 과정과 관련된 그룹의 대표 단백질을 표 1과 같이 분류하였으며, 이들 단백질을 바이오마커 후보로 선택하였다. 구체적으로, 후보 바이오마커로 선별된 단백질은 다음과 같다: S100A9, HYOU1, SAA2, S100A8, DAPK1, LACRT 및 LF.
다음으로, 정상군, 경도 알츠하이머 환자군 및 중도 알츠하이머 환자군으로부터 콧물 시료를 채취하여 알츠하이머 질환의 진행 단계를 대표하는 단백질을 면역블롯팅을 통해 정량하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 이전 연구에서 밝혀낸 결과를 바탕으로 모든 알츠하이머 환자가 발현하는 단백질인 베타 아밀로이드 올리고머를 선택하고, A11 항체를 사용하여 정량 분석을 실시하였다. 또한, 본 발명에서 프로테오믹스를 통해 선별된 경도 알츠하이머 질환에 특이적인 후보 바이오마커 단백질에 대해서도 각 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 정량 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 S100A9는 중도 알츠하이머 환자군에서는 발현되지 않지만 경도 알츠하이머 환자군에서는 특이적으로 발현되었으며, 이를 통해 알츠하이머 질환의 진행 단계에 있어서 S100A9 단백질은 경도 알츠하이머를 대표하는 바이오마커 단백질로 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한, HYOU1 단백질은 일부 정상 대조군에서는 발현하고 다른 정상 대조군에서는 발현하지 않는 불규칙적인 패턴을 나타냈으나, 경도 알츠하이머 질환에서는 모두 일정 수준의 발현량이 확인된바, HYOU1 단백질 또한 경도 알츠하이머를 대표하는 추가의 바이오마커 단백질로 사용될 수 있음을 확인하였다.
후보 바이오마커 중 하나인 SAA2 단백질의 발현량은 정상군, 경도 알츠하이머 환자군 및 중도 알츠하이머 환자군에서 유의적인 차이를 나타내지 않았다. SAA2 단백질과 같이 콧물 시료에서 검출된 후보 바이오마커가 모두 유의성을 나타내는 것은 아니므로, 후보 바이오마커마다 개별적으로 단백질 정량 분석을 실시하여 검증하는 작업이 반드시 요구된다.
도 5는 모든 알츠하이머 환자가 발현하는 단백질인 베타 아밀로이드 올리고머와 경도 알츠하이머 질환 환자군과 정상군의 콧물 시료를 통해 선별된 바이오마커 단백질 S100A9를 정상군, 경도 알츠하이머 환자군 및 중도 알츠하이머 환자군으로부터 채취한 콧물 시료에서 각각 정량 분석한 결과로, 베타 아밀로이드 올리고머는 알츠하이머 질환의 진행 단계에 따라 서로 다른 레인에서 특징적으로 나타나지만 모든 알츠하이머 환자군에서 발현되는 것을 확인하였다. 이에 비해, S100A9는 중도 알츠하이머 환자군에서는 발현되지 않지만 경도 알츠하이머 환자군에서는 특이적으로 발현됨을 확인하였다. 이를 통해, 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준을 측정하는 제제 및 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 사용하여 콧물 시료에서 해당 단백질의 발현 여부를 확인함으로써 알츠하이머 질환의 진단 및 진행 단계를 확인하는 것이 가능함을 알 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝용 조성물은 분리된 콧물 시료에서 HYOU1 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "단백질 발현 수준"은 세포 내에서 유전자로부터 단백질로 발현되는 수준을 말하며, 단백질의 발현 수준을 관찰함으로써 세포 내의 mRNA 수준과 세포 내에서 발현되는 단백질 수준의 직접적인 상관관계를 나타내지 못하는 mRNA를 표적으로 하는 연구의 한계를 보완할 수 있다. 본 발명에서는 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머의 단백질 발현 수준을 관찰함으로써 알츠하이머 질환의 발병 여부를 진단함과 동시에 S100A9 및/또는 HYOU1의 단백질 발현 수준을 확인함으로써 알츠하이머 질환의 진행 단계를 스크리닝할 수 있도록 하였다.
본 발명의 용어 "단백질 발현 수준을 측정하는 제제"는 타겟 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머 등을 포함하나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 용어 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 베타 아밀로이드 올리고머, S100a9 및/또는 HYOU1 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 타겟 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
다클론 항체는 상기 타겟 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
상기 항체를 이용하여 이와 결합한 표적 단백질의 양을 확인하기 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서, “앱타머”란 특정 물질에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA(ssDNA) 또는 RNA 를 말한다. 앱타머는 특정 물질에 대한 친화도가 매우 높고 안정하고, 비교적 단순한 방법으로 합성할 수 있으며, 결합력을 높이기 위해 다양한 변형이 가능하고, 세포, 단백질, 및 작은 유기물질까지도 표적물질이 될 수 있기 때문에, 그 특이성 및 안정성이 이미 개발되어 있는 항체에 비해 매우 높은 특징이 있다.
본 발명의 앱타머는 베타 아밀로이드 올리고머에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 제한되지 않으며, 앱타머에 사용되는 염기는 특별한 언급이 없는 한, A, G, C, U 이들의 deoxy 형태의 염기들로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
또한, 상기 앱타머는, 안정성 증진을 위하여, 5' 말단 부위, 중간 부위, 3' 말단 부위, 또는 양 말단 부위에 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG), idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시 뉴클레오사이드, 2'-아미노 뉴클레오사이드, 2'F-뉴클레오사이드, 아민 링커, 티올 링커 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것이 결합되어 변형된 것일 수 있다.
상기 idT(inverted deoxythymidine)는 일반적으로 뉴클레아제에 대한 내성이 약한 앱타머의 뉴클레아제에 의한 분해를 막기 위하여 사용되는 분자 중 하나로서, 핵산단위체는 앞 단위체의 3’-OH와 다음 단위체의 5’-OH와 결합하여 사슬을 이루지만, idT는 앞 단위체의 3’-OH와 다음 단위체의 3’-OH를 결합하여 3’-OH가 아닌 5’-OH가 노출이 되도록 인위적인 변화를 가함으로써 뉴클레아제의 일종인 3’엑소뉴클레아제(3’exonuclease)에 의한 분해를 억제하는 효과를 일으키는 분자이다.
본 발명은 또한, 전술한 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝용 조성물을 포함하는 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머 및 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제뿐만 아니라, HYOU1 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제, 발현 수준 분석에 적합한 한 종류 이상의 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 검출 라벨로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다.
상기 "베타 아밀로이드 올리고머 및 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제"와 "HYOU1 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제"는 전술한 바와 같이 상기 타겟 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 앱타머 등이 사용될 수 있으며, 상기 제제를 포함하는 단백질 칩의 형태로 상기 키트에 포함될 수 있다.
아울러, 상기 항체 또는 앱타머를 검출할 수 있는 2차 항체를 추가로 포함할 수도 있는데, 상기 2차 항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 단백질 칩에 결합할 수 있는 베타 아밀로이드 올리고머, S100A9 단백질 및/또는 HYOU1 단백질과 결합할 수 있고 형광물질, 방사선 동위원소 등으로 표지되어 사용될 수 있다.
구체적으로, 뇌신경 질환 진단용 키트는 ELISA 키트, 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 구현하기 위하여, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질들에 대한 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함할 수 있다. 항체는 베타 아밀로이드 올리고머, S100A9 단백질 및 HYOU1 단백질에 대해 각각 특이성 및 친화성이 높고 이외 다른 단백질에는 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론항체, 다클론항체 또는 재조합 항체일 수 있다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
이 외에도, 상기 키트는 웨스턴블롯(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorecence Activated Cell Sorter, FACS), 또는 단백질 칩(protein chip) 등을 구현하기 위한 키트일 수 있으며, 각 분석방법에 적합한 부가적인 구성을 추가로 포함할 수 있다. 이 분석 방법들을 통하여, 항원-항체 복합체 형성량을 비교함으로써 알츠하이머 질환 진단 및 진행 단계를 정확하게 스크리닝할 수 있으며, 진행 단계에 따라 환자 맞춤형 치료방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 도 6에 나타난 바와 같이 분리된 콧물 시료로부터 베타 아밀로이드 올리고머 및 S100A9 단백질을 검출할 수 있는 단백질 칩을 구현한 키트를 제공한다. 앞서 설명한 바와 같이, 상기 단백질 칩을 구현한 키트는 HYOU1 단백질을 검출할 수 있도록 추가의 구성을 포함할 수 있으며, 이를 통해 진단의 정확성을 향상시킬 수 있다. 또한, 알츠하이머의 진행단계 (경도에서 중도)의 진행과정도 확인할 수 있다. 도 5에서의 내용을 바탕으로, 도 6의 단백질 칩을 구현한 키트의 스크리닝 결과를 해석하면 다음과 같다. 먼저, 정상인(normal)의 콧물 시료를 단백질 칩 키트에 투여하는 경우 A11 및 S100A9 단백질이 발현되어 있지 않기 때문에 A 및 B 레인에서 모두 시그날이 나타나지 않고, 경도 알츠하이머 환자의 경우에는 콧물 시료에 A11, S100A9 및 HYOU1 단백질이 모두 발현되어 있기 때문에 A, B 및 C 레인에서 모두 시그날이 나타나게 된다. 마지막으로, 중도 알츠하이머 환자의 경우에는 콧물 시료에 A11 단백질만 발현되어 있기 때문에 A 레인에서만 시그날이 나타나게 된다.
이와 같이, 본 발명은 상기 2가지 이상의 마커들을 교차 확인함으로써 알츠하이머 진단의 정확성을 높임과 동시에 진행단계를 지속적으로 간편하게 확인할 수 있는 진단방법 및 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 분리된 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 b) 상기 a) 단계의 시료에서 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 a) 단계에서 베타 아밀로이드 올리고머가 발현되고, 상기 b) 단계에서 S100A9 단백질이 발현되는 것으로 확인되는 경우 경도 알츠하이머 질환(Mild Alzheimer's disease)으로 진단하고; 상기 a) 단계에서 베타 아밀로이드 올리고머가 발현되고, 상기 b) 단계에서 S100A9 단백질이 발현되지 않는 것으로 확인되는 경우 중도 알츠하이머 질환(Moderate Alzheimer's disease)으로 진단할 수 있다.
본 발명의 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝 방법은 상기 b) 단계의 시료에서 c) HYOU1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 a) 단계에서 베타 아밀로이드 올리고머가 발현되고, 상기 b) 단계에서 S100A9 단백질이 발현되며, 상기 c) 단계에서 HYOU1 단백질이 발현되는 것으로 확인되는 경우 경도 알츠하이머 질환(Mild Alzheimer's disease)으로 진단하고; 상기 a) 단계에서 베타 아밀로이드 올리고머가 발현되고, 상기 b) 단계에서 S100A9 단백질이 발현되지 않으며, 상기 c) 단계에서 HYOU1 단백질이 발현되지 않는 것으로 확인되는 경우 중도 알츠하이머 질환(Moderate Alzheimer's disease)으로 진단할 수 있다.
본 발명의 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝 방법에 있어서, 상기 콧물 시료는 알츠하이머 질환의 진단 또는 진행 단계를 확인하고자 하는 개체로부터 분리될 수 있고, 콧물 시료에서 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, 단백질 수준은 앞서 언급한 다양한 항원-항체 복합체 측정 방법으로 측정할 수 있다.
구체적으로, 상기 단백질 발현 수준의 측정은 베타 아밀로이드 올리고머, S100A9 단백질 및/또는 HYOU1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 항체는 베타 아밀로이드 올리고머에 특이적인 단일클론항체 또는 다클론항체일 수 있으며, 나아가 항원결합활성을 보유하는 항체의 기능적 단편일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝 방법에 있어서, 콧물 시료로부터 베타 아밀로이드 올리고머, S100A9 단백질 및/또는 HYOU1 단백질을 검출하는 방법으로서 웨스턴블롯(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorecence Activated Cell Sorter, FACS), 또는 단백질 칩(protein chip) 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, a) 경도 알츠하이머 질환(Mild Alzheimer's disease)을 앓고 있는 환자로부터 분리된 콧물 시료에 경도 알츠하이머 질환 치료제 후보물질을 처리하는 단계; b) 상기 a) 단계의 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 시료에서 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 경도 알츠하이머 질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 b) 단계에서 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준이 상기 후보물질을 처리하기 전보다 감소하고, 상기 c) 단계에서 S100A9 단백질 발현 수준이 상기 후보물질을 처리하기 전보다 감소하는 경우 경도 알츠하이머 질환 치료제로 선택할 수 있다.
본 발명의 경도 알츠하이머 질환 치료제의 스크리닝 방법은 d) 상기 c) 단계의 시료에서 HYOU1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 b) 단계에서 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준이 상기 후보물질을 처리하기 전보다 감소하고, 상기 c) 단계에서 S100A9 단백질의 발현 수준이 상기 후보물질을 처리하기 전보다 감소하며, 상기 d) 단계에서 HYOU1 단백질의 발현 수준이 상기 후보물질을 처리하기 전보다 감소하는 경우 경도 알츠하이머 질환 치료제로 선택할 수 있다.
본 발명의 경도 알츠하이머 질환 치료제의 스크리닝 방법에 있어서, 타겟 단백질의 발현 수준 감소는 정상 대조군의 단백질 발현 수준으로 감소하거나 발현이 완전히 억제되는 것을 의미할 수 있다.
본 발명은 또한, 분리된 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머(beta amyloid oligomer)의 발현수준을 측정하는 제제; 및 분리된 콧물 시료에서 S100A9 단백질의 발현수준을 측정하는 제제;를 포함하는 경도 알츠하이머 질환 치료제의 스크리닝 키트에 관한 것이다.
본 발명의 경도 알츠하이머 질환 치료제의 스크리닝 키트는 분리된 콧물 시료에서의 HYOU1 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
1-1. 피험자 선정
정상 대조군은 신경심리검사(SNSB)상 정상 인지능력을 보유하고 있는, 기타 제외기준에 해당하지 않는 만 60세 이상의 사람을 선택하였고, 알츠하이머 치매 환자는 NINCDS/ADRDA 진단 기준에 따른 확실한 알츠하이머병 환자로, 기억력을 포함한 두 가지 이상의 인지영역에서의 저하가 있는 사람, 신경심리검사를 통해 다른 원인이 아닌, 인지기능저하로 일상생활에 지장이 있는 것으로 확인된 사람, 기타 제외기준에 해당하지 않는 사람을 선택하였다.
제외 기준은 뇌영상 (MRI나 CT) 검사를 통해 뇌의 구조적인 문제가 없는 것으로 확인된 사람, 다른 퇴행성 뇌질환이 없는 사람, 인지기능장애를 일으킬 수 있는 뇌혈관질환이 없는 사람, 갑상선 질환을 포함한 대사성 뇌질환이 없는 사람, 알코올이나 약물중독이 없는 사람 및 두부외상이나 정신과적 질환이 없는 사람이다.
1-2. 피험자의 체액 채취 프로토콜
외래 방문 시, 정상인과 환자를 대상으로 1회 내원 시 신경심리검사, 영상검사를 시행하였고, 검사결과를 확인한 후 선정된 피험자의 콧물을 채취하였다. 선정된 피험자는 총 2회 방문하였다. 또한, 피험자의 샘플을 채취하는 자 및 실험을 진행하는 자에게 정상인과 환자에 대한 정보가 노출되지 않도록 무작위배정과 눈 가림법으로 정보관리를 철저히 하면서 연구를 진행하였다.
피험자의 콧물은 다음과 같은 프로토콜로 채취하였따. 먼저, 식염수를 콧속에 스프레이한 후, 콧물 흡입기를 이용하여 콧물을 채취하고 이를 50ml 튜브에 저장하였다. 상기 방법으로 실패했을 시, 식염수를 눈에 흘려보낸 후, 흐르는 콧물을 채취 하여, 50ml 튜브에 저장하였다. 분석시까지 -20℃ 냉장고에 보관하였다.
실험 시, 시료 50 μl를 10초간 음파처리하고, 웨스턴 블롯 및 ELISA를 통하여 타겟하는 단백질을 검출하여 양적인 비교를 통해 진단하였다.
환자의 콧물을 이용한 바이오마커 발굴
프로테오믹스 기반 바이오마커 분석은 환자로부터 채취된 시료의 생리 상태를 보다 직접적으로 반영하여 바이오마커를 역학적, 진단학적, 예측 타입 등으로 구분하여 전략적으로 개발하는데 유리한 방법이다. 최근에는 단백질 바이오마커를 발굴하기 위한 더 정확하고 감도가 높은 신기술과 질량분석기들이 개발되고 있으며, 질환의 진정한 흔적으로 생각되는 저 풍부(low-abundance) 단백질들(질환 특이적 바이오마커의 확률이 높은 단백질)에 특화되어 확인하는 것이 가능해졌다.
이에, 본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 채취한 환자의 콧물을 이용하여 프로테오믹스를 통한 바이오마커 검증을 실시하였다(도 1).
실시예 1-1에 기재된 프로토콜에 따라 3명의 정상인과 3명의 경도 알츠하이머 환자의 콧물 시료 50 μl를 채취하여 10초간 음파 처리한 후, SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 분리하고, SYPRO Ruby 염료(검출 한계 2~10 ng)를 사용하여 겔 안에서 구현된 단백질의 밴드를 염색하였다. 이후, 스캔한 겔 이미지를 분석하여 비교함으로써 발현의 증가 또는 감소를 확인하였고, 발현의 차이를 분석하였다. 이미지 분석을 통해 발현 양상의 차이가 있다고 판별한 단백질 밴드를 채취하여 트립신(Trypsin)을 이용하여 분해함으로써 펩타이드를 획득하였고, MALDI-TOF MS(Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry)를 통해 펩타이드의 질량을 확인함으로써 서열을 확보한 후, 웹 상의 데이터베이스(peptideSearch:http://www.mann.emblheidelberg.de/Services/ PeptideSearch/FR_sequenceOnlyForm.html)와 비교하여 단백질의 정체를 확인하였다.
도 2(A)는 겔 안에서 구현된 단백질의 밴드를 염색한 대표 그림이며, 도 2(B)는 이를 정량한 결과이다. 도 2(B)에 나타난 바와 같이, 단백질을 사이즈대로 정렬했을 때 밴드 번호 7번, 8번 및 20번에서 유의성 있는 차이를 나타냄을 확인하였다. 상기 타겟 밴드에서 단백질을 추출하여 LC-MS/MS 분석을 통해 후보 단백질군을 확인하였고, 이를 기능별로 분석하였다.
도 3은 겔 밴드 분석 결과를 통해 경도 알츠하이머 질환 환자군과 정상군의 콧물 시료에서 검출된 프로테옴 변화를 비교한 것으로, 경도 알츠하이머 환자군에서 세포 구성 성분 구조 또는 생체내 합성(Cellular component organization or biogenesis)과 관련된 것으로 분류되는 분비된 단백질 수가 가장 많이 증가하였으나, 이는 알츠하이머 질환 뿐 만 아니라 세포사에 의해 분비되는 단백질 개수가 증가하는 것이므로 바이오마커 후보에서 제외하였다. 다음으로, 경도 알츠하이머 환자의 콧물에서 면역체계 과정(Immune system process)에 관여하는 것으로 분류되는 분비된 단백질 개수가 두 번째로 많이 증가하였고, 이 그룹의 단백질이 알츠하이머 질환에 특이적으로 발현하는 것으로 확인되었다.
상기 결과를 바탕으로, 알츠하이머 환자의 콧물 시료에 존재하는 면역체계 과정과 관련된 그룹의 대표 단백질을 표 1에 나타내었다.
단백질 ID 특징
S100-A9
(protein S100-A9)		 칼슘 결합 단백질, 이동 억제 인자 관련 단백질, 염증 관련 단백질
HYOU1
(hypoxia up-regulated protein1)		 열 충격, 산화 스트레스, 화학적 제제, 저산소증, 바이러스 감염 및 염증과 같은 세포 독성 또는 단백질 독성에 의해 자극됨
SAA2
(anti-serum amyloid A)		 몇 가지 세포 반응을 조절하는 사이토카인과 유사한 특성을 나타내고, 급성 반응 동안 주로 간세포에 의해 합성됨
S100-A8
(protein S100-A8)		 칼슘 및 아연 결합 단백질, 염증 과정 및 면역 반응 조절, 호중구 주화성 및 부착 유도
DAPK1
(death-associated protein kinase1)		 Fas, γ-인터페론 및 TNF-α에 반응하여 어팝토시스를 촉진하는 액틴 필라멘트 관련, 칼슘/칼모둘린 의존 세린/트레오닌 키나아제
LACRT
(extracellular glycoprotein lacritin)		 골수 형성 또는 염증성 면역 반응의 조절자로서 역할을 하는 철을 조절하는데 중요한 역할을 함
LF
(lactotransferrin)		 면역 및 염증 과정과 병원균에 대한 방어에 관여함
후보 바이오마커 단백질 정량
2명의 정상인(CTL), 2명의 경도 알츠하이머 환자(Mild AD) 및 2명의 중도 알츠하이머 환자(Moderate AD)의 콧물 시료에서 상기 실시예 2에서 선별된 후보 바이오마커 단백질을 정량하였다.
단백질 정량은 공지된 BCA정량 방법을 이용하여 수행하였으며, 샘플의 1ul만을 이용해서 단백질 농도를 확인하고 이를 통해 동량 정량을 할 수 있도록 하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 S100A9는 중도 알츠하이머 환자군에서는 발현되지 않지만 경도 알츠하이머 환자군에서는 특이적으로 발현되었으며, 이를 통해 알츠하이머 질환의 진행 단계에 있어서 S100A9 단백질은 경도 알츠하이머를 대표하는 바이오마커 단백질로 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한, HYOU1 단백질은 일부 정상 대조군에서는 발현하고 다른 정상 대조군에서는 발현하지 않는 불규칙적인 패턴을 나타냈으나, 경도 알츠하이머 질환에서는 모두 일정 수준의 발현량이 확인된바, HYOU1 단백질 또한 경도 알츠하이머를 대표하는 추가의 바이오마커 단백질로 사용될 수 있음을 확인하였다.
후보 바이오마커 중 하나인 SAA2 단백질의 발현량은 정상군, 경도 알츠하이머 환자군 및 중도 알츠하이머 환자군에서 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
상기 결과를 통해, S100A9 단백질 및 HYOU1 단백질은 경도 알츠하이머를 대표하는 단백질이므로 알츠하이머 질환의 진행 단계를 스크리닝하는데 활용될 수 있음을 도출할 수 있다.
알츠하이머 질환의 진행 단계를 대표하는 단백질의 확인
본 실시예에서는 상기 실시예 3의 정상 대조군, 경도 알츠하이머 환자군 및 중도 알츠하이머 환자군의 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머를 추가로 정량 분석 하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 베타 아밀로이드 올리고머는 알츠하이머 질환의 진행 단계에 따라 서로 다른 레인에서 특징적으로 나타나지만 모든 알츠하이머 환자군에서 발현되는 것을 확인하였다. 이를 통해, 베타 아밀로이드 올리고머는 알츠하이머 질환의 진행 단계에 상관없이 모든 알츠하이머 환자에서 발현되므로, 알츠하이머를 진단하는 바이오마커로 활용될 수 있음을 도출할 수 있다.
따라서, 상기 실시예 3에서 검증된 S100A9 및 HYOU1 단백질의 발현 수준과 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준을 함께 측정하는 경우, 알츠하이머 질환의 진단 뿐만 아니라 질환의 진행 단계까지 정밀하게 진단할 수 있다.

Claims (16)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. a) 분리된 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준을 측정하는 단계;
    b) 상기 a) 단계의 시료에서 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    c) 상기 a) 단계에서 베타 아밀로이드 올리고머가 발현되고 상기 b) 단계에서 S100A9 단백질이 발현되는 경우 경도 알츠하이머 질환(Mild Alzheimer's disease)으로 진단하고, 상기 a) 단계에서 베타 아밀로이드 올리고머가 발현되고 상기 b) 단계에서 S100A9 단백질이 발현되지 않는 경우 중도 알츠하이머 질환(Moderate Alzheimer's disease)으로 진단하는 단계;
    를 포함하는 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝 방법.
  7. 삭제
  8. a) 분리된 콧물 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준을 측정하는 단계;
    b) 상기 a) 단계의 시료에서 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
    c) 상기 b) 단계의 시료에서 HYOU1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    d) 상기 a) 단계에서 베타 아밀로이드 올리고머가 발현되고 상기 b) 단계에서 S100A9 단백질이 발현되며 상기 c) 단계에서 HYOU1 단백질이 발현되는 경우 경도 알츠하이머 질환(Mild Alzheimer's disease)으로 진단하고, 상기 a) 단계에서 베타 아밀로이드 올리고머가 발현되고 상기 b) 단계에서 S100A9 단백질이 발현되지 않으며 상기 c) 단계에서 HYOU1 단백질이 발현되지 않는 경우 중도 알츠하이머 질환(Moderate Alzheimer's disease)으로 진단하는 단계;
    를 포함하는 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝 방법.
  9. 삭제
  10. 제6항 또는 제8항에 있어서, 상기 발현 수준의 측정은 웨스턴 블롯(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorecence Activated Cell Sorter, FACS), 또는 단백질 칩(protein chip)을 이용하여 수행되는 것인 알츠하이머 질환의 진행 단계 스크리닝 방법.
  11. a) 경도 알츠하이머 질환(Mild Alzheimer's disease)을 앓고 있는 환자로부터 분리된 콧물 시료에 경도 알츠하이머 질환 치료제 후보물질을 처리하는 단계;
    b) 상기 a) 단계의 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준을 측정하는 단계;
    c) 상기 b) 단계의 시료에서 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    d) 상기 b) 단계에서 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준이 상기 후보물질을 처리하기 전보다 감소하고 상기 c) 단계에서 S100A9 단백질 발현 수준이 상기 후보물질을 처리하기 전보다 감소하는 경우 경도 알츠하이머 질환 치료제로 선택하는 단계;
    를 포함하는 경도 알츠하이머 질환 치료제의 스크리닝 방법.
  12. 삭제
  13. a) 경도 알츠하이머 질환(Mild Alzheimer's disease)을 앓고 있는 환자로부터 분리된 콧물 시료에 경도 알츠하이머 질환 치료제 후보물질을 처리하는 단계;
    b) 상기 a) 단계의 시료에서 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준을 측정하는 단계;
    c) 상기 b) 단계의 시료에서 S100A9 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
    d) 상기 c) 단계의 시료에서 HYOU1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    e) 상기 b) 단계에서 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 수준이 상기 후보물질을 처리하기 전보다 감소하고 상기 c) 단계에서 S100A9 단백질의 발현 수준이 상기 후보물질을 처리하기 전보다 감소하며 상기 d) 단계에서 HYOU1 단백질의 발현 수준이 상기 후보물질을 처리하기 전보다 감소하는 경우 경도 알츠하이머 질환 치료제로 선택하는 단계;
    를 포함하는 경도 알츠하이머 질환 치료제의 스크리닝 방법.
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