WO2022119343A1 - 갑상선 안구 질환 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

갑상선 안구 질환 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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ncbi accession
protein
eye disease
gene
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PCT/KR2021/018095
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한정선
임동준
양석우
김성은
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가톨릭대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a biomarker composition for diagnosing thyroid eye disease and its use, and more particularly, to a GC vitamin D binding protein (VDB) (NCBI accession number: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) and CHI3L1 (chitinase 3 like 1) (NCBI accession number: NM_001276.4) to a biomarker composition for diagnosing thyroid eye disease, and use thereof.
  • VDB GC vitamin D binding protein
  • CHI3L1 chitinase 3 like 1
  • Thyroid eye disease also called Graves' eye disease
  • Graves' eye disease is a condition of the eye that occurs along with thyroid dysfunction when immune cells secrete excessive amounts of thyroid hormones and attack the thyroid gland. to be.
  • Thyroid eye disease is known as one of the most common extrathyroid symptoms in autoimmune thyroid disease, and it starts with mild symptoms of swelling of the eyelids and conjunctival conjunctiva in the initial stage, and then the extraocular muscles become enlarged such as the eyes protrude forward or the eyes wide open.
  • the extraocular muscle increases and the extraocular muscle movement is restricted due to the increase of fat and connective tissue, and in severe cases, it causes visual field loss or compressive optic neuropathy due to corneal destruction.
  • thyroid eye disease In order to treat thyroid eye disease, medical treatment to control thyroid dysfunction and ophthalmic treatment in parallel with drug treatment such as steroids for the eye can be performed. Surgical treatment such as plastic surgery may be performed.
  • early detection and treatment of thyroid eye disease is effective because it is difficult to recover if the optic nerve damage progresses because the treatment of thyroid eye disease is delayed.
  • exosomes are extracellular vesicles with a size of 30 to 150 nm and are present in body fluids such as plasma, urine, lymph, tissue fluid, synovial fluid, breast milk, saliva, and tears (tears). Exosomes are released by cells in a controlled manner and carry biological information. Contains most proteins, mRNAs, miRNAs, lncRNAs and lipids. Exosomes mediate intracellular and extracellular signaling, modulate immune responses, and manage cellular waste.
  • the present inventors collected tear fluid from normal people and patients with thyroid eye disease, and separated exosomes from them to analyze exosome proteins. As a result, compared to normal people, thyroid eye A protein whose expression is significantly increased only in exosomes derived from lacrimal fluid of disease patients was found, and the present invention was completed based on this.
  • the present invention is VDB (GC vitamin D binding protein) (NCBI accession number: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) and CHI3L1 (chitinase 3 like 1) (NCBI accession number: NM_001276.4) ), including a gene or a protein encoded by the gene, to provide a marker composition for diagnosing thyroid eye disease.
  • VDB GC vitamin D binding protein
  • CHI3L1 chitinase 3 like 1
  • the present invention is VDB (GC vitamin D binding protein) (NCBI accession number: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) and CHI3L1 (chitinase 3 like 1) (NCBI accession number: NM_001276.4) )
  • a kit comprising a composition for diagnosing thyroid eye disease and a composition for diagnosing a thyroid eye disease, including an agent for measuring the level of mRNA or protein encoded by the gene, including .
  • the present invention provides VDB (GC vitamin D binding protein) (NCBI accession number: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) and CHI3L1 (chitinase 3 like 1) (NCBI) in a biological sample derived from a subject.
  • VDB GC vitamin D binding protein
  • CHI3L1 chitinase 3 like 1
  • VDB GC vitamin D binding protein
  • CHI3L1 chitinase 3 like 1
  • VDB GC vitamin D binding protein
  • the present invention provides VDB (GC vitamin D binding protein) (NCBI accession number: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) and CHI3L1 (chitinase 3 like 1) for use in the diagnosis of thyroid eye disease. ) (NCBI accession number: NM_001276.4), or to provide the use of a protein encoded by the gene.
  • VDB GC vitamin D binding protein
  • the present invention provides VDB (GC vitamin D binding protein) (NCBI accession number: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) and CHI3L1 (chitinase 3 like 1) for use in the diagnosis of thyroid eye disease. ) (NCBI accession number: NM_001276.4) (NCBI accession number: NM_001276.4) for the purpose of providing the use of a composition comprising a gene or a protein encoded by the gene as an active ingredient.
  • VDB GC vitamin D binding protein
  • the present invention is VDB (GC vitamin D binding protein) (NCBI accession number: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) and CHI3L1 (chitinase 3 like 1) (NCBI accession number: NM_001276.4) ) It provides a marker composition for diagnosing thyroid eye disease, including a gene or a protein encoded by the gene.
  • VDB GC vitamin D binding protein
  • the marker composition is Alix (programmed cell death 6 interacting protein) (NCBI accession number: NM_001162429.3; NM_001256192.2; NM_013374.6; XM_011533252.1; XM_011533253.1; XM_017005488.1) , Flotillin2 (NCBI accession number: NM_001330170.2; NM_004475.3; XM_005257953.2; XM_017024395.1; XM_024450666.1; XM_017024396.1; XM_024450667.1; XM_017024394.1), TSG101 (tumor susceptibility 101) (NCBI accession number 101) : NM_006292.4; XM_005253108.4), CD63 (CD63 molecule) (NCBI accession number: NM_001257389.2; NM_001257390.2;
  • CD81 CD81 molecule
  • CMP C-reactive protein
  • MMP-9 matrix metallopeptidase 9
  • VCAM-1 vascular cell adhesion molecule 1
  • VCAM-1 NCBI accession number: NM_001078.4; NM_001199834.2; NM_080682.3
  • IL-6 Interleukin 6
  • VDB GC vitamin D binding protein
  • CHI3L1 chitinase 3 like 1
  • the composition comprises Alix (programmed cell death 6 interacting protein) (NCBI accession number: NM_001162429.3; NM_001256192.2; NM_013374.6; XM_011533252.1; XM_011533253.1; XM_017005488.1); Flotillin2 (NCBI accession number: NM_001330170.2; NM_004475.3; XM_005257953.2; XM_017024395.1; XM_024450666.1; XM_017024396.1; XM_024450667.1; XM_017024394.1), TSG101 (tumor susceptibility 101) (NCBI accession number: 101) NM_006292.4; XM_005253108.4), CD63 (CD63 molecule) (NCBI accession number: NM_001257389.2; NM_001257390.2; NM_0012
  • the present invention provides VDB (GC vitamin D binding protein) (NCBI accession number: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) and CHI3L1 (chitinase 3 like 1) (NCBI) in a biological sample derived from a subject. Accession No.: NM_001276.4) provides an information providing method for diagnosing thyroid eye disease, including measuring the mRNA level of the gene or the protein encoded by the gene.
  • VDB GC vitamin D binding protein
  • the information providing method is Alix (programmed cell death 6 interacting protein) (NCBI accession number: NM_001162429.3; NM_001256192.2; NM_013374.6; XM_011533252.1; XM_011533253.1; XM_017005488.1) ), Flotillin2 (NCBI accession number: NM_001330170.2; NM_004475.3; XM_005257953.2; XM_017024395.1; XM_024450666.1; XM_017024396.1; XM_024450667.1; XM_017024394.1), TSG101 (tumor susceptibility 101) (NCBI accessibility 101) No.: NM_006292.4; XM_005253108.4), CD63 (CD63 molecule) (NCBI accession number: NM_001257389.2; NM_001257390.2;
  • the biological sample may be a tear-derived exosome.
  • the mRNA level is determined by next generation sequencing (NGS), polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time polymerase chain reaction ( Real-time PCR), RNase protection assay (RPA), microarray, and northern blotting (northern blotting) can be measured through one or more methods selected from the group consisting of.
  • NGS next generation sequencing
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • Real-time PCR real-time polymerase chain reaction
  • RNase protection assay RNase protection assay
  • microarray and northern blotting (northern blotting) can be measured through one or more methods selected from the group consisting of.
  • the protein level is determined by Western blotting, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation. , flow cytometry, immunofluorescence, ouchterlony, complement fixation assay, and at least one method selected from the group consisting of a protein chip can be measured through
  • the present invention provides a screening method for a therapeutic agent for thyroid eye disease, comprising the following steps.
  • VDB GC vitamin D binding protein
  • CHI3L1 chitinase 3 like 1
  • VDB GC vitamin D binding protein
  • the screening method comprises (d) Alix (programmed cell death 6 interacting protein) (NCBI accession number: NM_001162429.3; NM_001256192.2; NM_013374.6; XM_011533252) compared to the candidate substance untreated group.
  • Alix programmed cell death 6 interacting protein
  • the cell may be an orbital fibroblast.
  • the present inventors analyzed proteins in exosomes isolated from tear fluid of normal individuals and patients with thyroid eye disease, and discovered a protein with significantly increased expression in patients with thyroid eye disease compared to normal individuals as a marker for diagnosing thyroid eye disease. It is expected that the marker composition according to the present invention can be used efficiently because it can diagnose thyroid eye disease at an early stage.
  • Figure 1 shows the exosomes isolated from the tear fluid
  • Figure 1a shows the tear fluid collected through the eye sponge and the pellet obtained by centrifugation (black arrow)
  • Figure 1b is a thyroid eye disease patient through TEM Shows the results of microscopic analysis of the morphology of lacrimal exosomes isolated from
  • Figure 2 confirms the change in the characteristics of the tear exosomes in the thyroid eye disease patient compared to the tear exosomes of the control group
  • Figure 2a shows the NTA analysis showing the size distribution of the exosomes
  • Figure 2b is the concentration change of the exosome
  • Figure 2c shows the Western blot analysis of exosomes using antibodies against Alix, Flotillin 2, TSG101, CD63 and CD81
  • Figure 2d shows the result of confirming the expression of CD9 through ELISA analysis.
  • Figure 3 shows the protein analysis of exosomes by the Proteome Profiler Human XL Cytokine array
  • Figure 3a is the result of analyzing three thyroid eye disease tear exosomes and three control tear exosomes with the Proteome Profiler Human XL Cytokine array kit.
  • FIG. 3b shows that 23 significant proteins among 105 proteins were detected and displayed by sorting the results of FIG. 3a by heat map analysis. indicating an increase in level.
  • Figure 4 shows an increase in the expression of inflammatory cytokines when the normal orbital fibroblasts are treated with exosomes derived from tear fluid of a patient with thyroid eye disease.
  • the present inventors collected tear fluid from normal people and patients with thyroid eye disease, and separated exosomes from them to analyze exosome proteins. As a result, compared to normal people, thyroid eye A protein whose expression is significantly increased only in exosomes derived from tear fluid of disease patients was identified, and the present invention was completed based on this.
  • the present invention is VDB (GC vitamin D binding protein) (NCBI accession number: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) and CHI3L1 (chitinase 3 like 1) (NCBI accession number: NM_001276.4) ) It provides a marker composition for diagnosing thyroid eye disease, including a gene or a protein encoded by the gene.
  • VDB GC vitamin D binding protein
  • the marker composition is Alix (programmed cell death 6 interacting protein) (NCBI accession number: NM_001162429.3; NM_001256192.2; NM_013374.6; XM_011533252.1; XM_011533253.1; XM_017005488.1), Flotillin2 ( NCBI accession number: NM_001330170.2; NM_004475.3; XM_005257953.2; XM_017024395.1; XM_024450666.1; XM_017024396.1; XM_024450667.1; XM_017024394.1), TSG101 (tumor susceptibility 101) (NCBI accession number: NM_006292.
  • CD63 molecule CD63
  • CD81 CD81 molecule
  • C-reactive protein NCBI accession number: NM_000567.3; NM_001329057.2; NM_001329058.2) ; NM_001382703.1
  • MMP-9 matrix metallopeptidase 9
  • VCAM-1 vascular cell adhesion molecule 1
  • thyroid eye disease refers to a disease in which the immune system attacks the tissues around the eye by secreting an excessive amount of thyroid hormone, and the eye muscle or fat is expanded. , refers to the general term for eye diseases accompanying thyroid dysfunction.
  • Diagnosis in a broad sense means judging the actual condition of a patient's disease in all aspects. The content of the judgment is the name of the disease, etiology, type, severity, detailed mode of the disease, and the presence or absence of complications. Diagnosis in the present invention is to determine whether or not the onset of thyroid eye disease and the level of progression.
  • the present inventors have identified the use of a specific protein according to the present invention as a novel marker for the diagnosis of thyroid eye disease through specific examples.
  • the expression level of the antibody protein against Alix, Flotillin 2, TSG101, CD63 and CD81 was significantly higher in the thyroid eye disease patient group than in the control group. It was confirmed that it appeared (see Example 3).
  • orbital fibroblasts were treated with control-derived exosomes and thyroid eye disease patient-derived exosomes, and as a result of analyzing the levels of IL-6, IL-8 and MCP-1 using ELISA, It was confirmed that the concentrations of IL-6, IL-8 and MCP-1 significantly increased in orbital fibroblasts administered with exosomes from thyroid eye disease patients (see Example 5).
  • the present invention is VDB (GC vitamin D binding protein) (NCBI accession number: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) and CHI3L1 (chitinase 3 like 1) ( NCBI Accession No.: NM_001276.4) provides a composition for diagnosing thyroid eye disease comprising an agent for measuring the level of mRNA of a gene or protein encoded by the gene, and a kit for diagnosing thyroid eye disease comprising the composition.
  • VDB GC vitamin D binding protein
  • the composition is Alix (programmed cell death 6 interacting protein) (NCBI accession number: NM_001162429.3; NM_001256192.2; NM_013374.6; XM_011533252.1; XM_011533253.1; XM_017005488.1), Flotillin2 (NCBI) Accession number: NM_001330170.2; NM_004475.3; XM_005257953.2; XM_017024395.1; XM_024450666.1; XM_017024396.1; XM_024450667.1; XM_017024394.1), TSG101 (tumor susceptibility 101) (NCBI accession number: NM_006292.4 ; XM_005253108.4), CD63 molecule (CD63) (NCBI accession number: NM_001257389.2; NM_001257390.2; NM_00125739
  • CD81 CD81 molecule
  • CRP C-reactive protein
  • MMP matrix metallopeptidase 9
  • VCAM-1 vascular cell adhesion molecule 1
  • IL-6 Interleukin 6
  • the kit for prediction of the present invention consists of one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the analysis method.
  • the kit of the present invention contains genomic DNA derived from a sample to be analyzed, a primer set specific for the marker gene of the present invention, an appropriate amount of a DNA polymerase, a dNTP mixture, a PCR buffer, and water to perform PCR. It may be a kit comprising
  • the PCR buffer solution may contain KCl, Tris-HCl and MgCl 2 .
  • components necessary for performing electrophoresis that can confirm whether or not the PCR product is amplified may be additionally included in the kit of the present invention.
  • the kit of the present invention may be a kit including essential elements necessary for performing RT-PCR.
  • the RT-PCR kit includes a test tube or other suitable container, reaction buffer, deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors, DEPC -Water (DEPC-water), sterile water, etc. may be included.
  • dNTPs deoxynucleotides
  • enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase
  • DNase DNase
  • RNase inhibitors DEPC -Water
  • sterile water etc.
  • a primer pair specific for a gene used as a quantitative control may be included.
  • the kit of the present invention may be a kit including essential elements necessary for performing a DNA chip.
  • the DNA chip kit may include a substrate to which cDNA corresponding to a gene or fragment thereof is attached as a probe, and the substrate may include cDNA corresponding to a quantitative structural gene or fragment thereof.
  • the kit of the present invention may be in the form of a microarray having a substrate on which the marker gene of the present invention is immobilized.
  • the kit of the present invention may be a kit characterized in that it includes essential elements necessary for performing ELISA.
  • the ELISA kit includes an antibody specific for a marker protein, and an agent for measuring the protein level.
  • the ELISA kit may include a reagent capable of detecting an antibody that has formed an "antigen-antibody complex", for example, a labeled secondary antibody, chromopores, an enzyme, and a substrate thereof.
  • an antibody specific for the quantitative control protein may be included.
  • the present invention provides VDB (GC vitamin D binding protein) (NCBI accession number: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) and CHI3L1 (chitinase) in a subject-derived biological sample 3 like 1) (NCBI accession number: NM_001276.4) provides an information providing method for diagnosing thyroid eye diseases, including measuring the level of mRNA or protein encoded by the gene.
  • VDB GC vitamin D binding protein
  • the information providing method is Alix (programmed cell death 6 interacting protein) (NCBI accession number: NM_001162429.3; NM_001256192.2; NM_013374.6; XM_011533252.1; XM_011533253.1; XM_017005488.1), Flotillin2 (NCBI accession number: NM_001330170.2; NM_004475.3; XM_005257953.2; XM_017024395.1; XM_024450666.1; XM_017024396.1; XM_024450667.1; XM_017024394.1), TSG101 (tumor susceptibility 101) (NCBI accession number: NM_006292 .4; XM_005253108.4), CD63 (CD63 molecule) (NCBI accession number: NM_001257389.2; NM_001257390.2; NM_0012
  • MMP-9 matrix metallopeptidase 9
  • VCAM-1 vascular cell adhesion molecule 1
  • the method may further include measuring the mRNA level of one or more genes selected from the group or a protein encoded by the gene.
  • the term “information providing method for diagnosing thyroid eye disease” used in the present invention provides objective basic information necessary for the diagnosis of thyroid eye disease as a preliminary step for diagnosis, and the clinical judgment or opinion of the doctor is excluded. .
  • the information providing method is VDB (GC vitamin D binding protein) (NCBI accession number: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3), CHI3L1 (chitinase 3 like 1) (NCBI accession number: NM_001276.4), Alix (programmed cell death 6 interacting protein) (NCBI accession number: NM_001162429.3; NM_001256192.2; NM_013374.6; XM_011533252.1; XM_011533253.1; XM_017005488.1), Flotillin2 (NCBI accession number: NM_001330170.2; NM_004475.3; XM_005257953.2; XM_017024395.1; XM_024450666.1; XM_017024396.1; XM_024450667.1; XM_017024394.1),
  • CD63 CD63 molecule
  • CD81 CD81 molecule
  • C-reactive protein NCBI accession number: NM_000567.3 ; NM_001329057.2; NM_001329058.2; NM_001382703.1
  • MMP-9 matrix metallopeptidase 9
  • MMP-9 matrix metallopeptidase 9
  • MMP-9 matrix metallopeptidase 9
  • MMP-9 matrix metallopeptidase 9
  • MMP-9 NCBI accession number: NM_004994.3
  • VCAM-1 olecule 1 NCBI accession number: NM_001078.4
  • the biological sample derived from the subject may include tissue, cells, whole blood, blood, saliva, sputum, lacrimal fluid, cerebrospinal fluid and urine, etc.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the mRNA level is next generation sequencing (NGS), polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR) ), RNase protection assay (RPA), microarray, and Northern blotting (northern blotting) may be measured through one or more methods selected from the group consisting of, but is not limited thereto. .
  • the protein level is western blotting (western blotting), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion (radioimmunodiffusion), enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation (immunoprecipitation), flow cytometry ( Flow cytometry), immunofluorescence staining (immunofluorescence), ouchterlony, complement fixation assay, and protein chip (protein chip) to be measured through one or more methods selected from the group consisting of However, the present invention is not limited thereto.
  • the present invention provides VDB (GC vitamin D binding protein) (NCBI accession number: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) and CHI3L1 (chitinase) in a subject-derived biological sample 3 like 1) (NCBI accession number: NM_001276.4) provides a method for diagnosing thyroid eye disease, comprising measuring the level of mRNA or protein encoded by the gene.
  • VDB GC vitamin D binding protein
  • the content of the method for diagnosing thyroid eye disease applies mutatis mutandis to the information provision method for diagnosing the thyroid eye disease.
  • the present invention provides a method for screening a therapeutic agent for thyroid eye disease, comprising the following steps.
  • VDB GC vitamin D binding protein
  • CHI3L1 chitinase 3 like 1
  • VDB GC vitamin D binding protein
  • the screening method (d) Alix (programmed cell death 6 interacting protein) (NCBI accession number: NM_001162429.3; NM_001256192.2; NM_013374.6; XM_011533252.1; XM_011533253) compared to the untreated group with the candidate substance .1; XM_017005488.1), Flotillin2 (NCBI accession number: NM_001330170.2; NM_004475.3; XM_005257953.2; XM_017024395.1; XM_024450666.1; XM_017024396.1; XM_024450667.1; XM_017024394.1), TSG101 (tumor) susceptibility 101) (NCBI accession number: NM_006292.4; XM_005253108.4), CD63 (CD63 molecule) (NCBI accession number: NM_001257389.2;
  • the cell may be an orbital fibroblast.
  • the present invention provides a GC vitamin D binding protein (VDB) (NCBI accession number: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) for use in the diagnosis of thyroid eye disease; and
  • VDB GC vitamin D binding protein
  • An object of the present invention is to provide the use of a gene comprising CHI3L1 (chitinase 3 like 1) (NCBI accession number: NM_001276.4) or a protein encoded by the gene.
  • the present invention provides a GC vitamin D binding protein (VDB) (NCBI accession number: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) for use in the diagnosis of thyroid eye disease; and
  • VDB GC vitamin D binding protein
  • An object of the present invention is to provide the use of a composition comprising a gene or a protein encoded by the gene including CHI3L1 (chitinase 3 like 1) (NCBI accession number: NM_001276.4) as an active ingredient.
  • Lacrimal fluid was collected from 8 patients with thyroid eye disease (mean age 49 years (range 29-73 years)) and 8 controls (mean age 66 years (range 58-79 years)).
  • Polyvinyl acetal spheres eye sponge (Merocel, BVI, Waltham, MA) was immersed for 20 to 30 minutes in the lower conjunctival sac under general anesthesia in the operating room, and then the eye sponge was immersed in a 0.2 ml PCR tube (Eppendorf, Hamburg, Germany). ) and centrifuged at 13,000 rpm and 4° C. for 30 minutes to obtain a tear fluid. Samples were stored in new tubes in a -80°C cryogenic freezer.
  • exosomes were isolated using an exosome kit (ExosomePlus inc., Seoul, Korea). The pellet was suspended in filtered phosphate buffered saline (PBS). Quantification of exosomes was determined using BCA assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass.). Plates were vortexed for 30 s and read at 540 nm using a microplate with control protein (Biotek, Winooski, VT, USA).
  • Normal human orbital fibroblasts were obtained from patients undergoing upper blepharoplasty. Orbital fat explants were added to T-25 flasks with medium containing Dulbecco's Modified Eagle's Medium (GIBCO BRL, NY, Grand Island) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; GIBCO BRL), 5% It was incubated at 37° C. in CO 2 . Orbital fat floated and adhered to the upper inner surface of the T-25 flask for one week. Next, the medium was removed and the flask with the added medium was inverted to move the cells to the bottom.
  • GIBCO BRL Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • exosome samples were arrayed in 4% paraformaldehyde at room temperature for 1 hour and 10 ⁇ l was spotted on a formvar-coated nickel grid (300 mesh).
  • the grids were rinsed 3 times during a 5 min wash with phosphate buffer (PB). Grids were blocked for 1 h in PBS 7.4 with 1% BSA (w/v). After incubation for 1 h at room temperature, the grids were washed with 5X wash buffer (PBS) for 10 min.
  • Grids were suspended in 1.4 nm anti-mouse nanogold (Nanoprobes, Inc. NY, USA) in PBS for 1 hour.
  • Silver enrichment was performed for 2 min using the HQ silver enrichment kit (Nanoprobes, Inc., NY, USA). Next, negative staining was performed rapidly in 1% aqueous Uranyl Acetate and all samples were dried and allowed to air dry. The pellets were examined with a transmission electron microscope (JEM-1010, Tokyo, Japan) at 100 kV.
  • Exosomes were analyzed using nanoparticle tracking analysis (ExoCope monoTM, Exosome plus, Inc. South Korea). Measurements were repeated 15 times at different sub-volume locations at 25°C. Analysis was performed with ExoCope Tracker software version 1.005. The intensity threshold was set at 20 levels (orthogonal noise levels of digital numbers per pixel). The minimum tracer particle size was set to 50 nm. The minimum separable particle distance was set to 5.7 pixels. The system was calibrated with 5 concentrations of 100 nm polystyrene beads. Each sample was diluted with 200 nm filtered PBS to a concentration of 1/500 to 1/2000, and the number of particles displayed in each image frame was set to 30 to 200.
  • Exo Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative analysis kit (EXOEL-CD9A-1, System Biosciences, CA, USA) was used to measure the expression level of exosomes.
  • the CD9 response of exosomes was measured at 450 nm using a microplate reader (Biotek, Winooski, VT, USA).
  • Exosomes (10 ⁇ g) were electrophoresed on a 4-15% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel and transferred to a polybinylidene difluoride (PVDF) membrane. After blocking with 5% bovine serum albumin (BSA), anti-Alix, anti-CD63 (Santa Cruz biotechnology, CA, USA), anti-Flotillin 2, anti-TSG101 and anti-CD81 (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) and incubated overnight at 4°C. Anti-mouse and anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibodies were obtained from Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Signals were visualized using an ECL Plus system (Amersham, Pittsburgh, PA).
  • Exosomes (100 ⁇ g) purified from the tear fluid of patients with thyroid eye disease or controls were obtained from the Proteome Profiler Human XL Cytokine array kit (ARY022, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) were analyzed according to the manufacturer's protocol. Immune-spots were captured with a Syngene PXi 4 digital imager and data were analyzed with a Fujifilm Multi Gage V3.0. Data presented represent fold change in relative protein levels (normalized to array references indicated by line boxes) in patients with thyroid eye disease compared to controls. All procedures were performed after obtaining prior consent from the donor in accordance with the doctrine of the Declaration of Helsinki and the Seoul St. Mary's Hospital Institutional Review Committee (KC19TES10673).
  • Thyroid eye disease patients and controls obtained in Example 1-1 were used, and the tears of thyroid eye disease patients were collected in orbital decompression surgery under general anesthesia. All thyroid eye disease patients were diagnosed with Graves' disease and were treated with methimazole. Five of these patients had previously been treated with prednisolone in the acute phase of the disease. It was confirmed that the duration of disease development in patients with thyroid eye disease was 6 to 72 months.
  • the mean value of the thyroid stimulating immunoglobulin (TSI) bioassay (normal; ⁇ 140%) was 372% (range 157 - 684), with a clinical activity score (CAS) of 1 to 4 and a NOSPECS score of 1 to 6 .
  • the control group consisted of patients with nasolacrimal duct obstruction, and tear fluid was collected during lacrimal cystectomy. In the control group, it was confirmed that there was no thyroid disease or other eye diseases such as dry eye syndrome, conjunctivitis, meibomian gland dysfunction, and glaucoma that could cause changes in the ocular surface.
  • the isolated exosome "pellet” obtained after centrifugation is as shown in Figure 1a.
  • a specific marker of exosomes as shown in FIG. It was confirmed that the exosomes were included.
  • FIG. 2a as a result of the nanoparticle tracking analysis, it was confirmed that there was no difference in the size of the exosomes, which was 120.75 ⁇ 6.0 nm in the thyroid eye disease group and 120.75 ⁇ 7.9 nm in the control group.
  • the average concentration of exosomes increased 4.2 times in the thyroid eye disease patient group (3.53 x 10 11 nanoparticles/ ⁇ g protein in TED patients vs. 1.48 x 10 10 ⁇ nanoparticles/ ⁇ g in the control group). ⁇ g protein; p ⁇ 0.05).
  • Vitamin D binding protein VDB 2.9 times, C-reactive protein (CRP) 2.1 times, Chitinase 3-like 1 (CHI3L1) 1.7 times, matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) 1.5 times, and vascular adhesion molecule- It was confirmed that the expression of 1 (VCAM-1) was increased by 1.4 times (p ⁇ 0.05), and the NCBI information of the corresponding protein is shown in Table 2 below.
  • Example 5 Confirmation of inflammatory activity of orbital fibroblasts according to stimulation of exosomes derived from tear fluid in patients with thyroid eye disease

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Abstract

본 발명은 갑상선 안구 질환 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 VDB 및 CHI3L1을 포함하는 갑상선 안구 질환 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명자들은 정상인 및 갑상선 안구 질환 환자의 누액에서 분리한 엑소좀 내 단백질을 분석하여, 정상인에 비해 갑상선 안구 질환 환자에서 유의적으로 발현이 증가한 유전자를 갑상선 안구 질환 진단용 마커로 발굴하였는바, 본 발명에 따른 마커 조성물은 갑상선 안구 질환을 조기에 진단할 수 있어 효율적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

갑상선 안구 질환 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도
본 출원은 2020년 12월 02일 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2020-0166914호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 갑상선 안구 질환 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)을 포함하는 갑상선 안구 질환 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
갑상선 안구 질환(Thyroid eye disease, TED)은 그레이브스 눈 질환(Graves' eye disease)으로도 불리며 면역 세포가 과도한 양의 갑상선 호르몬을 분비하는 경우 갑상선을 공격하면서 갑상선 기능 이상과 동반하여 나타나는 눈의 이상 병증이다. 갑상선 안구질환은 자가면역 갑상선 질환에서 갑상선 외 징후 중 가장 흔한 것으로 알려져 있으며, 초기에는 눈꺼풀이 붓고 결막이 충혈되는 경미한 증상으로 시작하여, 눈이 앞으로 돌출되거나 눈이 크게 떠지는 등 외안근이 비대해지는 외관상의 변화를 보일 수 있고, 지방 및 결합조직이 증가하여 안구 외근이 증가하고 외안근 운동이 제한되며, 중증의 경우 각막 파괴로 인한 시야 상실 또는 압박성 시신경 병증을 야기한다.
갑상선 안구 질환을 치료하기 위해서는 갑상선 기능 이상을 조절하기 위한 내과적 치료 및 안구에 스테로이드제 등의 약물 치료를 병행하는 안과적 치료가 수행될 수 있고, 수술적 치료로는 안와감압술, 사시교정술, 안검성형술 등의 외과적인 치료가 이루어질 수 있다. 단, 갑상선 안구 질환의 치료가 늦어 시신경 손상이 진행되는 경우 회복하기가 어렵기 때문에 갑상선 안구 질환을 조기에 발견하고 치료를 진행하는 것이 치료에 효과적이다.
한편, 엑소좀은 30 ~ 150 nm 크기의 세포 외 소포로 혈장, 소변, 림프, 조직액, 활액, 모유, 타액 및 누액(눈물)과 같은 체액에 존재한다. 엑소좀은 통제된 방식으로 세포에 의해 방출되며 생물학적 정보를 전달한다. 대부분의 단백질, mRNA, miRNA, lncRNA 및 지질을 포함한다. 엑소좀은 세포 내 및 세포 외 신호 전달을 매개하고 면역반응을 조절하며 세포 폐기물을 관리한다.
엑소좀에 대한 연구는 주로 암 분야에서 연구가 활발히 진행되고 있으며 갑상선 암종 등의 연구도 진행된 바 있으나(Int J Mol Sci. 2019 Mar; 20(5): 1114.), 현재 안구 질환에서의 역할에 대해 알려진 바는 거의 없어 갑상선 안구 질환의 빠른 진단을 위한 엑소좀 기반 신규 바이오마커의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명자들은 갑상선 안구 질환을 진단하기 위한 바이오마커를 발굴하기 위해 정상인 및 갑상선 안구 질환 환자의 누액을 채취하고 이로부터 엑소좀(exosome)을 분리하여 엑소좀 단백질을 분석한 결과, 정상인에 비해 갑상선 안구 질환 환자의 누액 유래 엑소좀에서만 유의하게 발현이 증가하는 단백질을 발견하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)을 포함하는 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 갑상선 안구 질환 진단용 마커 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)을 포함하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 갑상선 안구 질환 진단용 조성물 및 상기 진단용 조성물을 포함하는 키트를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 피검체 유래 생물학적 시료에서 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)을 포함하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 갑상선 안구 질환 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 갑상선 안구 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
(a) 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 세포에서 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
(c) 후보물질 비처리군에 비해 상기 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)의 발현수준을 감소시키는 물질을 갑상선 안구 질환 치료제로 선별하는 단계.
또한, 본 발명은 갑상선 안구 질환의 진단에 사용하기 위한 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)을 포함하는 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 갑상선 안구 질환의 진단에 사용하기 위한 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)을 포함하는 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이에, 본 발명은 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)을 포함하는 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 갑상선 안구 질환 진단용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 마커 조성물은 Alix(programmed cell death 6 interacting protein)(NCBI 접근 번호: NM_001162429.3; NM_001256192.2; NM_013374.6; XM_011533252.1; XM_011533253.1; XM_017005488.1), Flotillin2(NCBI 접근 번호: NM_001330170.2; NM_004475.3; XM_005257953.2; XM_017024395.1; XM_024450666.1; XM_017024396.1; XM_024450667.1; XM_017024394.1), TSG101(tumor susceptibility 101)(NCBI 접근 번호: NM_006292.4; XM_005253108.4), CD63(CD63 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001257389.2; NM_001257390.2; NM_001257391.2; NM_001257392.1; NM_001257400.2; NM_001257401.2; NM_001267698.2; NM_001780.6; XM_024449283.1), CD81(CD81 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001297649.2; NM_004356.4; XM_011520492.2), CRP(C-reactive protein)(NCBI 접근 번호:　NM_000567.3 ; NM_001329057.2; NM_001329058.2; NM_001382703.1), MMP-9(matrix metallopeptidase 9)(NCBI 접근 번호: NM_004994.3), VCAM-1(vascular cell adhesion molecule 1)(NCBI 접근 번호: NM_001078.4; NM_001199834.2; NM_080682.3), IL-6(Interleukin 6)(NCBI 접근 번호: NM_000600.5; NM_001318095.2; NM_001371096.1; XM_011515390.2; XM_005249745.5), IL-8(C-X-C motif chemokine ligand 8)(NCBI 접근 번호: NM_000584.4; NM_001354840.3) 및 MCP-1(C-C motif chemokine ligand 2)(NCBI 접근 번호: NM_002982.4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)을 포함하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 갑상선 안구 질환 진단용 조성물 및 상기 진단용 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 조성물은 Alix(programmed cell death 6 interacting protein)(NCBI 접근 번호: NM_001162429.3; NM_001256192.2; NM_013374.6; XM_011533252.1; XM_011533253.1; XM_017005488.1), Flotillin2(NCBI 접근 번호: NM_001330170.2; NM_004475.3; XM_005257953.2; XM_017024395.1; XM_024450666.1; XM_017024396.1; XM_024450667.1; XM_017024394.1), TSG101(tumor susceptibility 101)(NCBI 접근 번호: NM_006292.4; XM_005253108.4), CD63(CD63 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001257389.2; NM_001257390.2; NM_001257391.2; NM_001257392.1; NM_001257400.2; NM_001257401.2; NM_001267698.2; NM_001780.6; XM_024449283.1), CD81(CD81 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001297649.2; NM_004356.4; XM_011520492.2), CRP(C-reactive protein)(NCBI 접근 번호:　NM_000567.3 ; NM_001329057.2; NM_001329058.2; NM_001382703.1), MMP-9(matrix metallopeptidase 9)(NCBI 접근 번호: NM_004994.3), VCAM-1(vascular cell adhesion molecule 1)(NCBI 접근 번호: NM_001078.4; NM_001199834.2; NM_080682.3), IL-6(Interleukin 6)(NCBI 접근 번호: NM_000600.5; NM_001318095.2; NM_001371096.1; XM_011515390.2; XM_005249745.5), IL-8(C-X-C motif chemokine ligand 8)(NCBI 접근 번호: NM_000584.4; NM_001354840.3) 및 MCP-1(C-C motif chemokine ligand 2)(NCBI 접근 번호: NM_002982.4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 피검체 유래 생물학적 시료에서 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)을 포함하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 갑상선 안구 질환 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 정보제공방법은 Alix(programmed cell death 6 interacting protein)(NCBI 접근 번호: NM_001162429.3; NM_001256192.2; NM_013374.6; XM_011533252.1; XM_011533253.1; XM_017005488.1), Flotillin2(NCBI 접근 번호: NM_001330170.2; NM_004475.3; XM_005257953.2; XM_017024395.1; XM_024450666.1; XM_017024396.1; XM_024450667.1; XM_017024394.1), TSG101(tumor susceptibility 101)(NCBI 접근 번호: NM_006292.4; XM_005253108.4), CD63(CD63 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001257389.2; NM_001257390.2; NM_001257391.2; NM_001257392.1; NM_001257400.2; NM_001257401.2; NM_001267698.2; NM_001780.6; XM_024449283.1), CD81(CD81 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001297649.2; NM_004356.4; XM_011520492.2), CRP(C-reactive protein)(NCBI 접근 번호:　NM_000567.3 ; NM_001329057.2; NM_001329058.2; NM_001382703.1), MMP-9(matrix metallopeptidase 9)(NCBI 접근 번호: NM_004994.3), VCAM-1(vascular cell adhesion molecule 1)(NCBI 접근 번호: NM_001078.4; NM_001199834.2; NM_080682.3), IL-6(Interleukin 6)(NCBI 접근 번호: NM_000600.5; NM_001318095.2; NM_001371096.1; XM_011515390.2; XM_005249745.5), IL-8(C-X-C motif chemokine ligand 8)(NCBI 접근 번호: NM_000584.4; NM_001354840.3) 및 MCP-1(C-C motif chemokine ligand 2)(NCBI 접근 번호: NM_002982.4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 생물학적 시료는 누액 유래 엑소좀일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 mRNA 수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단백질 수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 갑상선 안구 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
(a) 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 세포에서 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
(c) 후보물질 비처리군에 비해 상기 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)의 발현수준을 감소시키는 물질을 갑상선 안구 질환 치료제로 선별하는 단계.
본 발명의 일구현예로, 상기 스크리닝 방법은 (d) 후보물질 비처리군에 비해 Alix(programmed cell death 6 interacting protein)(NCBI 접근 번호: NM_001162429.3; NM_001256192.2; NM_013374.6; XM_011533252.1; XM_011533253.1; XM_017005488.1), Flotillin2(NCBI 접근 번호: NM_001330170.2; NM_004475.3; XM_005257953.2; XM_017024395.1; XM_024450666.1; XM_017024396.1; XM_024450667.1; XM_017024394.1), TSG101(tumor susceptibility 101)(NCBI 접근 번호: NM_006292.4; XM_005253108.4), CD63(CD63 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001257389.2; NM_001257390.2; NM_001257391.2; NM_001257392.1; NM_001257400.2; NM_001257401.2; NM_001267698.2; NM_001780.6; XM_024449283.1), CD81(CD81 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001297649.2; NM_004356.4; XM_011520492.2), CRP(C-reactive protein)(NCBI 접근 번호:　NM_000567.3 ; NM_001329057.2; NM_001329058.2; NM_001382703.1), MMP-9(matrix metallopeptidase 9)(NCBI 접근 번호: NM_004994.3), VCAM-1(vascular cell adhesion molecule 1)(NCBI 접근 번호: NM_001078.4; NM_001199834.2; NM_080682.3), IL-6(Interleukin 6)(NCBI 접근 번호: NM_000600.5; NM_001318095.2; NM_001371096.1; XM_011515390.2; XM_005249745.5), IL-8(C-X-C motif chemokine ligand 8)(NCBI 접근 번호: NM_000584.4; NM_001354840.3) 및 MCP-1(C-C motif chemokine ligand 2)(NCBI 접근 번호: NM_002982.4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질의 발현수준이 감소하면 갑상선 안구질환 치료제로 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 세포는 안와 섬유아세포일 수 있다.
본 발명자들은 정상인 및 갑상선 안구 질환 환자의 누액에서 분리한 엑소좀 내 단백질을 분석하여, 정상인에 비해 갑상선 안구 질환 환자에서 유의적으로 발현이 증가된 단백질을 갑상선 안구 질환 진단용 마커로 발굴하였는바, 본 발명에 따른 마커 조성물은 갑상선 안구 질환을 조기에 진단할 수 있어 효율적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 누액에서 분리된 엑소좀을 나타낸 것으로, 도 1a는 안구 스폰지를 통해 채취한 누액 및 이를 원심분리하여 수득한 펠릿(검은색 화살표)을 나타낸 것이고, 도 1b는 TEM을 통해 갑상선 안구 질환 환자로부터 분리된 누액 엑소좀의 형태에 대한 현미경 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 대조군의 누액 엑소좀에 대비하여 갑상선 안구 질환 환자에서 누액 엑소좀 특성의 변화를 확인한 것으로, 도 2a는 엑소좀의 크기 분포를 보여주는 NTA 분석을 나타낸 것이고, 도 2b는 엑소좀의 농도 변화를 나타낸 것이고, 도 2c는 Alix, Flotillin 2, TSG101, CD63 및 CD81에 대한 항체를 사용한 엑소좀의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이고, 도 2d는 ELISA 분석을 통해 CD9의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Proteome Profiler Human XL Cytokine array에 의한 엑소좀의 단백질 분석을 나타낸 것으로, 도 3a는 3개의 갑상선 안구 질환 누액 엑소좀 및 3개의 대조군 누액 엑소좀을 Proteome Profiler Human XL Cytokine array kit로 분석한 결과를 나타낸 것이고, 도 3b는 도 3a의 결과를 히트맵 분석으로 정렬한 것으로 105개의 단백질 중 23개의 유의미한 단백질을 검출하여 나타내고 있으며, 도 3c는 대조군과 비교하여 갑상선 안구질환 환자 누액 엑소좀 내 특정 단백질 수준의 증가를 나타낸 것이다.
도 4는 정상 안와 섬유아세포에 갑상선 안구 질환 환자의 누액 유래 엑소좀을 처리하는 경우에 염증성 사이토카인의 발현의 증가를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 갑상선 안구 질환을 진단하기 위한 바이오마커를 발굴하기 위해 정상인 및 갑상선 안구 질환 환자의 누액을 채취하고 이로부터 엑소좀(exosome)을 분리하여 엑소좀 단백질을 분석한 결과, 정상인에 비해 갑상선 안구 질환 환자의 누액 유래 엑소좀에서만 유의하게 발현이 증가하는 단백질을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)을 포함하는 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 갑상선 안구 질환 진단용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 마커 조성물은 Alix(programmed cell death 6 interacting protein)(NCBI 접근 번호: NM_001162429.3; NM_001256192.2; NM_013374.6; XM_011533252.1; XM_011533253.1; XM_017005488.1), Flotillin2(NCBI 접근 번호: NM_001330170.2; NM_004475.3; XM_005257953.2; XM_017024395.1; XM_024450666.1; XM_017024396.1; XM_024450667.1; XM_017024394.1), TSG101(tumor susceptibility 101)(NCBI 접근 번호: NM_006292.4; XM_005253108.4), CD63(CD63 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001257389.2; NM_001257390.2; NM_001257391.2; NM_001257392.1; NM_001257400.2; NM_001257401.2; NM_001267698.2; NM_001780.6; XM_024449283.1), CD81(CD81 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001297649.2; NM_004356.4; XM_011520492.2), CRP(C-reactive protein)(NCBI 접근 번호:　NM_000567.3 ; NM_001329057.2; NM_001329058.2; NM_001382703.1), MMP-9(matrix metallopeptidase 9)(NCBI 접근 번호: NM_004994.3), VCAM-1(vascular cell adhesion molecule 1)(NCBI 접근 번호: NM_001078.4; NM_001199834.2; NM_080682.3), IL-6(Interleukin 6)(NCBI 접근 번호: NM_000600.5; NM_001318095.2; NM_001371096.1; XM_011515390.2; XM_005249745.5), IL-8(C-X-C motif chemokine ligand 8)(NCBI 접근 번호: NM_000584.4; NM_001354840.3) 및 MCP-1(C-C motif chemokine ligand 2)(NCBI 접근 번호: NM_002982.4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “갑상선 안구 질환(Thyroid eye disease, TED)”은 과도한 양의 갑상선 호르몬을 분비에 의해 면역 체계가 눈 주변 조직을 공격하여 눈 근육 또는 지방이 확장되는 증상을 나타내는 질환으로, 갑상선 기능 이상과 동반하여 나타나는 안 질환을 총칭하는 의미이다.
본 발명에서 사용되는 용어 “진단(diagnosis)”이란 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태 및 합병증의 유무 등이다. 본 발명에서 진단은 갑상선 안구 질환의 발병 여부 및 진행단계 수준 등을 판단하는 것이다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 갑상선 안구 질환의 진단을 위한 신규 마커로써 본 발명에 따른 특정 단백질의 용도를 규명하였다.
본 발명의 일실시예에서는 웨스턴 블랏을 통해 엑소좀의 마커에 대한 항체를 분석한 결과, Alix, Flotillin 2, TSG101, CD63 및 CD81에 대한 항체 단백질 발현 수준은 갑상선 안구 질환 환자군이 대조군에 비해 현저히 높게 나타나는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는 갑상선 안구 질환 환자의 누액 유래 엑소좀에서 유의적으로 발현이 증진된 단백질을 분석한 결과, VDB, CRP, CHI3L1, MMP-9 및 VCAM-1의 발현이 증가되는 것을 확인하였으며, 구체적으로 대조군에 비해 VDB이 2.9배, CRP이 2.1배, CHI3L1이 1.7배, MMP-9 1.5배 및 VCAM-1이 1.4배 증가된 것을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 안와 섬유아세포에 대조군 유래 엑소좀 및 갑상선 안구 질환 환자 유래 엑소좀을 처리하고, ELISA를 사용하여 IL-6, IL-8 및 MCP-1의 수준을 분석한 결과, 갑상선 안구 질환 환자의 엑소좀을 투여한 안와 섬유아세포에서 IL-6, IL-8 및 MCP-1의 농도가 현저하게 증가하는 것을 확인하였다(실시예 5 참조).
상기 실시예로부터 Alix, Flotillin 2, TSG101, CD63, CD81, VDB, CRP, CHI3L1, MMP-9, VCAM-1, IL-6, IL-8 또는 MCP-1이 갑상선 안구 질환 진단을 위한 마커로 이용될 수 있음을 유추할 수 있다.
이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)을 포함하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 갑상선 안구 질환 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 갑상선 안구 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 Alix(programmed cell death 6 interacting protein)(NCBI 접근 번호: NM_001162429.3; NM_001256192.2; NM_013374.6; XM_011533252.1; XM_011533253.1; XM_017005488.1), Flotillin2(NCBI 접근 번호: NM_001330170.2; NM_004475.3; XM_005257953.2; XM_017024395.1; XM_024450666.1; XM_017024396.1; XM_024450667.1; XM_017024394.1), TSG101(tumor susceptibility 101)(NCBI 접근 번호: NM_006292.4; XM_005253108.4), CD63(CD63 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001257389.2; NM_001257390.2; NM_001257391.2; NM_001257392.1; NM_001257400.2; NM_001257401.2; NM_001267698.2; NM_001780.6; XM_024449283.1), CD81(CD81 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001297649.2; NM_004356.4; XM_011520492.2), CRP(C-reactive protein)(NCBI 접근 번호:　NM_000567.3 ; NM_001329057.2; NM_001329058.2; NM_001382703.1), MMP-9(matrix metallopeptidase 9)(NCBI 접근 번호: NM_004994.3), VCAM-1(vascular cell adhesion molecule 1)(NCBI 접근 번호: NM_001078.4; NM_001199834.2; NM_080682.3), IL-6(Interleukin 6)(NCBI 접근 번호: NM_000600.5; NM_001318095.2; NM_001371096.1; XM_011515390.2; XM_005249745.5), IL-8(C-X-C motif chemokine ligand 8)(NCBI 접근 번호: NM_000584.4; NM_001354840.3) 및 MCP-1(C-C motif chemokine ligand 2)(NCBI 접근 번호: NM_002982.4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 예측용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.
예컨대, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량구조 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 마커 유전자가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이 형태일 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함하며, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함한다. 상기 ELISA 키트는 "항원-항체 복합체"를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소, 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 피검체 유래 생물학적 시료에서 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)을 포함하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 갑상선 안구 질환 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 정보제공방법은 Alix(programmed cell death 6 interacting protein)(NCBI 접근 번호: NM_001162429.3; NM_001256192.2; NM_013374.6; XM_011533252.1; XM_011533253.1; XM_017005488.1), Flotillin2(NCBI 접근 번호: NM_001330170.2; NM_004475.3; XM_005257953.2; XM_017024395.1; XM_024450666.1; XM_017024396.1; XM_024450667.1; XM_017024394.1), TSG101(tumor susceptibility 101)(NCBI 접근 번호: NM_006292.4; XM_005253108.4), CD63(CD63 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001257389.2; NM_001257390.2; NM_001257391.2; NM_001257392.1; NM_001257400.2; NM_001257401.2; NM_001267698.2; NM_001780.6; XM_024449283.1), CD81(CD81 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001297649.2; NM_004356.4; XM_011520492.2), CRP(C-reactive protein)(NCBI 접근 번호:　NM_000567.3 ; NM_001329057.2; NM_001329058.2; NM_001382703.1), MMP-9(matrix metallopeptidase 9)(NCBI 접근 번호: NM_004994.3), VCAM-1(vascular cell adhesion molecule 1)(NCBI 접근 번호: NM_001078.4; NM_001199834.2; NM_080682.3), IL-6(Interleukin 6)(NCBI 접근 번호: NM_000600.5; NM_001318095.2; NM_001371096.1; XM_011515390.2; XM_005249745.5), IL-8(C-X-C motif chemokine ligand 8)(NCBI 접근 번호: NM_000584.4; NM_001354840.3) 및 MCP-1(C-C motif chemokine ligand 2)(NCBI 접근 번호: NM_002982.4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “갑상선 안구 질환 진단을 위한 정보제공방법”은 진단을 위한 예비적 단계로써 갑상선 안구 질환의 진단을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.
본 발명에서 상기 정보제공방법은 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3), CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4), Alix(programmed cell death 6 interacting protein)(NCBI 접근 번호: NM_001162429.3; NM_001256192.2; NM_013374.6; XM_011533252.1; XM_011533253.1; XM_017005488.1), Flotillin2(NCBI 접근 번호: NM_001330170.2; NM_004475.3; XM_005257953.2; XM_017024395.1; XM_024450666.1; XM_017024396.1; XM_024450667.1; XM_017024394.1), TSG101(tumor susceptibility 101)(NCBI 접근 번호: NM_006292.4; XM_005253108.4), CD63(CD63 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001257389.2; NM_001257390.2; NM_001257391.2; NM_001257392.1; NM_001257400.2; NM_001257401.2; NM_001267698.2; NM_001780.6; XM_024449283.1), CD81(CD81 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001297649.2; NM_004356.4; XM_011520492.2), CRP(C-reactive protein)(NCBI 접근 번호:　NM_000567.3 ; NM_001329057.2; NM_001329058.2; NM_001382703.1), MMP-9(matrix metallopeptidase 9)(NCBI 접근 번호: NM_004994.3), VCAM-1(vascular cell adhesion molecule 1)(NCBI 접근 번호: NM_001078.4; NM_001199834.2; NM_080682.3), IL-6(Interleukin 6)(NCBI 접근 번호: NM_000600.5; NM_001318095.2; NM_001371096.1; XM_011515390.2; XM_005249745.5), IL-8(C-X-C motif chemokine ligand 8)(NCBI 접근 번호: NM_000584.4; NM_001354840.3) 및 MCP-1(C-C motif chemokine ligand 2)(NCBI 접근 번호: NM_002982.4)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준이 높게 나타나는 경우 갑상선 안구 질환으로 진단할 수 있다.
상기 피검체 유래의 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 누액, 뇌척수액 및 뇨 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 누액일 수 있고, 더욱 바람직하게는 누액 유래 엑소좀일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 mRNA 수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 피검체 유래 생물학적 시료에서 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)을 포함하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 갑상선 안구 질환 진단 방법을 제공한다.
상기 갑상선 안구 질환 진단 방법에 대한 내용은 상기 갑상선 안구 질환 진단을 위한 정보제공방법에 대한 내용을 준용한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 갑상선 안구 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
(a) 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 세포에서 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
(c) 후보물질 비처리군에 비해 상기 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)의 발현수준을 감소시키는 물질을 갑상선 안구 질환 치료제로 선별하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 (d) 후보물질 비처리군에 비해 Alix(programmed cell death 6 interacting protein)(NCBI 접근 번호: NM_001162429.3; NM_001256192.2; NM_013374.6; XM_011533252.1; XM_011533253.1; XM_017005488.1), Flotillin2(NCBI 접근 번호: NM_001330170.2; NM_004475.3; XM_005257953.2; XM_017024395.1; XM_024450666.1; XM_017024396.1; XM_024450667.1; XM_017024394.1), TSG101(tumor susceptibility 101)(NCBI 접근 번호: NM_006292.4; XM_005253108.4), CD63(CD63 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001257389.2; NM_001257390.2; NM_001257391.2; NM_001257392.1; NM_001257400.2; NM_001257401.2; NM_001267698.2; NM_001780.6; XM_024449283.1), CD81(CD81 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001297649.2; NM_004356.4; XM_011520492.2), CRP(C-reactive protein)(NCBI 접근 번호:　NM_000567.3 ; NM_001329057.2; NM_001329058.2; NM_001382703.1), MMP-9(matrix metallopeptidase 9)(NCBI 접근 번호: NM_004994.3), VCAM-1(vascular cell adhesion molecule 1)(NCBI 접근 번호: NM_001078.4; NM_001199834.2; NM_080682.3), IL-6(Interleukin 6)(NCBI 접근 번호: NM_000600.5; NM_001318095.2; NM_001371096.1; XM_011515390.2; XM_005249745.5), IL-8(C-X-C motif chemokine ligand 8)(NCBI 접근 번호: NM_000584.4; NM_001354840.3) 및 MCP-1(C-C motif chemokine ligand 2)(NCBI 접근 번호: NM_002982.4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질의 발현수준이 감소하면 갑상선 안구질환 치료제로 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 세포는 안와 섬유아세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 갑상선 안구 질환의 진단에 사용하기 위한 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)을 포함하는 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 갑상선 안구 질환의 진단에 사용하기 위한 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)을 포함하는 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 재료 및 방법
1-1. 누액 유래 엑소좀 분리 및 정량화
누액은 갑상선 안구 질환 환자 8명(평균 연령 49세(범위 29-73세)) 및 8명의 대조군(평균 연령 66 세 (범위 58-79 세))에서 채취하였다. 수술실에서 전신 마취 하에 하 결막 낭에 폴리 비닐 아세탈 스피어스 안구(eye) 스펀지 (Merocel, BVI, Waltham, MA)를 20분 내지 30분 침지한 후, 안구 스폰지를 0.2ml PCR 튜브 (Eppendorf, Hamburg, Germany)에 넣고 13,000rpm, 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 누액을 수득하였다. 샘플은 -80℃ 초저온 냉동고에서 새 튜브에 보관하였다. 이후, 엑소좀 키트(ExosomePlus inc., Seoul, Korea)를 사용하여 엑소좀을 분리하였다. 펠릿을 여과된 인산염 완충 식염수(PBS)에 현탁시켰다. 엑소좀의 정량화는 BCA 분석 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 사용하여 결정되었다. 플레이트를 30 초 동안 볼 텍싱하고 대조군 단백질 (Biotek, Winooski, VT, USA)이있는 마이크로 플레이트를 사용하여 540nm에서 판독하였다.
1-2. 안와(orbital) 섬유아세포의 배양
인간의 정상 안와 섬유아세포는 상부 안검 성형술을 받은 환자로부터 수득하였다. 안와 지방 외식 편은 T-25 플라스크에 10 % 소태아혈청(FBS; GIBCO BRL)이 보충된 Dulbecco의 수정된 Eagle's 배지(GIBCO BRL, NY, Grand Island)가 포함된 배지와 함께 첨가되었고, 5 % CO2에서 37℃ 조건에서 배양되었다. 안와 지방은 1주일 동안 T-25 플라스크의 상단 내부 표면에 떠서 부착되었다. 다음으로, 배지를 제거하고 추가된 배지 플라스크를 뒤집어 세포가 바닥으로 이동시켰다. 대략 80 %의 융합성(confluent) 안와 섬유아세포에 트립신/EDTA(GIBCO BRL, Invitrogen, USA)를 처리하고 계대하였다. 안와 섬유아세포(10,000cell/well)를 24시간 동안 24 well 플레이트에서 갑상선 안구 질환 환자 및 대조군의 두 가지 유형의 엑소좀(5μg/well)과 함께 공동 배양하였다. ELISA(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)에 의해 IL-8, IL-6 및 Monocytic chemotactic protein-1(MCP-1)의 수준이 분석될 때까지 상층 액을 수집하고 -20℃에서 보관하였다.
1-3. 투과전자 현미경 및 면역-금(immune-gold) 라벨링
항-CD81을 이용한 면역 라벨링을 위해, 엑소좀 샘플을 실온에서 1시간 동안 4% 파라포름알데히드에 배열하고 10μl를 폼바(formvar)가 코팅된 니켈 그리드 (300 mesh)에 스팟팅(spotting)하였다. 인산염 완충액(PB)으로 5분 세척하는 동안 그리드를 3회 헹궈주었다. 그리드는 1% BSA (w/v)를 포함하는 PBS 7.4에서 1시간 동안 차단되었다. 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 그리드를 세척 완충액(PBS) 5X로 10분 동안 세척하였다. 그리드는 PBS에서 1.4 nm anti-mouse nanogold(Nanoprobes, Inc. NY, USA)에 1시간 동안 부유시켰다. 실버 강화는 HQ 실버 강화 키트(Nanoprobes, Inc., NY, USA)를 사용하여 2분 동안 수행되었다. 다음으로, 1% 수성 Uranyl Acetate에서 음성 염색을 신속하게 수행하고 모든 샘플을 건조하였으며, 자연 건조를 허용하였다. 펠릿은 100kV에서 투과 전자 현미경 (JEM-1010, Tokyo, Japan)으로 검사하였다.
1-4. 나노 입자 추적 분석
나노 입자 추적 분석(ExoCope monoTM, Exosome plus, Inc. South Korea)을 사용하여 엑소좀을 분석하였다. 측정은 25℃에서 서로 다른 하위 부피 위치에서 15 회 반복하였다. 분석은 ExoCope 추적기 소프트웨어 버전 1.005로 수행되었다. 강도 임계 값은 20 레벨로 설정되었다(픽셀 당 디지털 숫자의 직교 노이즈 레벨). 최소 추적 입자 크기는 50nm로 설정되었다. 분리 가능한 최소 입자 거리는 5.7 픽셀로 설정되었다. 이 시스템은 5 가지 농도의 100nm 폴리스티렌 비드로 보정되었다. 각 샘플은 200 nm 여과된 PBS로 1/500 ~ 1/2000 농도로 희석하여 각 이미지 프레임에 표시되는 입자 수가 30 ~ 200 개가 되도록 설정하였다.
1-5. 효소 면역 분석법
Exo Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 정량 분석 키트(EXOEL-CD9A-1, System Biosciences, CA, USA)를 사용하여 엑소좀의 발현 수준을 측정하였다. 엑소좀의 CD9 반응은 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 측정하였다(Biotek, Winooski, VT, 미국).
1-6. 웨스턴 블롯 분석
엑소좀(10μg)을 4-15% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide 겔에서 전기영동하고 polybinylidene difluoride(PVDF) 막으로 이동시켰다. 5 % 소혈청알부민 (BSA)으로 블록킹(bolcking)한 다음 anti-Alix, anti-CD63 (Santa Cruz biotechnology, CA, USA), anti-Flotillin 2, anti-TSG101 및 항-CD81 (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 항-마우스 및 항-토끼 HRP-접합 2차 항체는 세포 신호 전달 기술 (Danvers, MA, USA)에서 수득하였다. 신호는 ECL Plus 시스템(Amersham, Pittsburgh, PA)을 사용하여 시각화하였다. 모든 이미지는 Syngene PXi 4 digital imager(Syngene, Fredrick, MD, USA)를 사용하여 감지되었다. 단백질 밴드의 정량화는 Fujifilm Multi Gage V3.0을 사용하여 수행되었다. 재-프로빙(re-probing)을 위해, 각 막을 웨스턴 블롯 스트리핑 버퍼(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 배양하였다.
1-7. Proteome Profiler Human XL Cytokine array
갑상선 안구 질환 환자 또는 대조군의 누액에서 정제된 엑소좀(100μg)은 니트로 셀룰로스에서 막에서 발견된 105개의 서로 다른 포획 항체를 포함하는 Proteome Profiler Human XL Cytokine array kit(ARY022, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)로 제조업체의 프로토콜에 따라 분석되었다. 면역-점(Immune-spots)은 Syngene PXi 4 digital imager로 캡처하고 데이터는 Fujifilm Multi Gage V3.0으로 분석하였다. 제시된 데이터는 대조군과 비교하여 갑상선 안구 질환 환자에서 상대적인 단백질 수준(선 상자로 표시된 어레이 참조로 정규화)의 배수 변화를 나타낸 것이다. 모든 절차는 서울 성모 병원 기관 심의위원회 (KC19TES10673)와 헬싱키 선언의 교리에 따라 기증자로부터 사전 동의를 얻은 후 수행하였다.
1-8. 통계 분석
GraphPad Prism (버전 7.0, GraphPad Software Inc., San Diego, CA)을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 결과는 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표현하였다. 계산된 모든 통계 평가는 student's two-tailed t-검정을 사용하여 수행되었다. ** p 값 <0.01 또는 * p- 값 <0.05는 통계적으로 유의 한 것으로 간주하였다.
실시예 2. 갑상선 안구 질환 환자의 특성 확인
실시예 1-1에서 수득한 갑상선 안구 질환 환자 및 대조군의 누액을 사용하였으며, 갑상선 안구 질환 환자의 누액은 전신 마취하에 안와 감압 수술에서 채취되었다. 모든 갑상선 안구 질환 환자는 그레이브스 병 진단을 받았으며 메티마졸(methimazole) 치료를 수행하였다. 그 중 5 명의 환자는 이전에 질병의 급성기에 프레드니솔론(prednisolone) 치료를 받았다. 갑상선 안구 질환 환자의 질환 발생 기간은 6 개월에서 72 개월인 것을 확인하였다. 갑상선 자극 면역 글로불린 (TSI) 생물 검정 (정상; <140 %)의 평균 값은 372 % (범위 157 - 684)였으며, 임상 활동 점수 (CAS)는 1 ~ 4이었고 NOSPECS 점수는 1 ~ 6으로 확인되었다.
대조군은 비루관 폐쇄 환자로 구성되었으며 누낭 비강 절개술시 누액을 채취하였다. 대조군은 안구 표면 변화를 유발할 수있는 갑상선 질환이나 안구 건조증, 결막염, 마이 봄샘 기능 장애, 녹내장 등과 같은 다른 안 질환이 없는 것을 확인하였다.
실시예 3. 갑상선 안구 질환 환자 및 대조군의 누액에서 얻은 엑소좀의 특성 확인
원심 분리 후 얻은 분리된 엑소좀 "펠릿"은 도 1a에 도시한 바와 같다. 또한, 엑소좀의 특정 마커인 CD81로 면역 금 라벨링을 통해 투과 전자 현미경으로 엑소좀의 현미경 형태를 확인한 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이 두 그룹 모두에서 펠릿은 CD81 수용체에 양성인 마이크로 입자와 원형 또는 난형 엑소좀을 포함하는 것을 확인하였다. 또한, 도 2a에 나타낸 바와 같이 나노 입자 추적 분석 결과 갑상선 안구 질환 그룹에서 120.75 ± 6.0 nm이고, 대조군에서 120.75 ± 7.9 nm으로 엑소좀의 크기에 차이가 없는 것을 확인하였다. 그러나, 도 2b에 나타낸 바와 같이 엑소좀의 농도의 경우 평균 농도가 갑상선 안구 질환 환자군에서 4.2 배 증가하였다(TED 환자에서 3.53 x 1011 나노 입자/μg 단백질 대 대조군에서 1.48 x 1010 ± 나노 입자/μg 단백질; p <0.05).
이에 더하여, 엑소좀의 마커에 대한 항체를 분석한 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이 Alix, Flotillin 2, TSG101, CD63 및 CD81에 대한 항체는 두 그룹 모두에서 웨스턴 블랏 분석을 통해 쉽게 검출되었으며 단백질 발현 수준은 갑상선 안구 질환 환자군이 대조군에 비해 현저히 높게 나타나는 것을 확인하였으며, 해당 단백질의 NCBI 정보를 하기 표 1에 도시하였다.
NCBI /Gene ID Description Location Aliases MIM
1 PDCD6IP/ID: 10015 programmed cell death 6 interacting protein [Homo sapiens (human)] Chromosome 3, NC_000003.12 (33798630..33869703) AIP1, ALIX, DRIP4, HP95 608074
2 FLOT2/ID:2319 flotillin 2 [Homo sapiens (human)] Chromosome 17, NC_000017.11 (28879339..28897733, complement) ECS-1, ECS1, ESA, ESA1, M17S1 131560
3 TSG101/ID: 7251 tumor susceptibility 101 [Homo sapiens (human)] Chromosome 11, NC_000011.10 (18480311..18526942, complement) TSG10, VPS23 601387
4 CD63/ID: 967 CD63 molecule [Homo sapiens (human)] Chromosome 12, NC_000012.12 (55725323..55729673, complement) LAMP-3, ME491, MLA1, OMA81H, TSPAN30 155740
5 CD81/ID: 975 CD81 molecule [Homo sapiens (human)] Chromosome 11, NC_000011.10 (2376180..2397402) CVID6, S5.7, TAPA1, TSPAN28 186845
또한, 항-CD 9 항체가 있는 ELISA에 의해 엑소좀을 추가로 특성화한 결과, 도 2d에 나타낸 바와 같이 CD 9의 광학 밀도는 대조군과 비교하여 갑상선 안구 질환 환자의 엑소좀에서 유의하게 증가된 것을 확인하였다(p <0.05).
실시예 4. 갑상선 안구 질환 환자의 누액 엑소좀 처리에 따른 단백질 발현 변화 확인
Proteome Profiler Human XL Cytokine array kit를 사용하여 누액의 엑소좀에서 특정 염증 관련 단백질 및 발현 수준을 감지하였다. 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이, 키트에 포함된 105개의 인간 단백질 중 23개의 단백질이 검출되었다. 그 중에서도, 도 3c에 나타낸 바와 같이 대조군에 비해 갑상선 안구 질환 환자의 엑소좀에서 유의적으로 VDB, CRP, CHI3L1, MMP-9 및 VCAM-1의 발현이 증진된 것을 확인할 수 있었으며, 각각 대조군에 비해 Vitamin D binding protein (VDB)이 2.9배, C-reactive protein (CRP)이 2.1배, Chitinase 3-like 1 (CHI3L1)이 1.7배, matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) 1.5배 및 vascular adhesion molecule-1 (VCAM-1)이 1.4배 발현이 증가된 것을 확인하였으며(p <0.05), 해당 단백질의 NCBI 정보를 하기 표 2에 도시하였다.
NCBI /Gene ID Description Location Aliases MIM
1 GC/ID:2638 GC vitamin D binding protein [Homo sapiens (human)] Chromosome 4, NC_000004.12 (71741693..71805520, complement) DBP, DBP-maf, DBP/GC, GRD3, Gc-MAF, GcMAF, HEL-S-51, VDB, VDBG, VDBP 139200
2 CRP/ID:1401 C-reactive protein [Homo sapiens (human)] Chromosome 1, NC_000001.11 (159712289..159714589, complement) PTX1 123260
3 CHI3L1/ID: 1116 chitinase 3 like 1 [Homo sapiens (human)] Chromosome 1, NC_000001.11 (203178931..203186704, complement) ASRT7, CGP-39, GP-39, GP39, HC-gp39, HCGP-3P, YK-40, YKL-40, YKL40, YYL-40, hCGP-39 601525
4 MMP-9/ID:4318 matrix metallopeptidase 9 [Homo sapiens (human)] Chromosome 20, NC_000020.11 (46008908..46016561) CLG4B, GELB, MANDP2, MMP-9 120361
5 VCAM-1/ID:7412 vascular cell adhesion molecule 1 [Homo sapiens (human)] Chromosome 1, NC_000001.11 (100719742..100739045) CD106, INCAM-100 192225
실시예 5. 갑상선 안구 질환 환자 누액 유래 엑소좀 자극에 따른 안와 섬유아세포의 염증 활성 확인
갑상선 안구 질환 환자의 안와 조직에서는 IL-6, IL-8, IL-10, IL-16, TNF-α, RANTES 및 MCP-1과 같은 수많은 강력한 자극제 역할을 하는 사이토카인이 검출되고 그 발현이 증가하는 것으로 알려져있다. 이에, 안와 섬유아세포에 대한 엑소좀의 염증 효과를 확인하기 위해 건강한 안와 섬유아세포를 갑상선 안구 질환 환자의 엑소좀 및 대조군의 엑소좀, 두 유형의 엑소좀으로 자극하고, 염증성 사이토카인의 발현을 확인하기 위해, 시험관 내 ELISA를 사용하여 IL-6, IL-8 및 MCP-1의 수준을 분석하였으며, 해당 단백질의 NCBI 정보를 하기 표 3에 도시하였다. 이때, 정상 안와 섬유아세포는 24시간 동안 5μg 엑소좀과 함께(CON exosomes treated) 또는 엑소좀 없이(Untreated) 배양하였다.
NCBI /Gene ID Description Location Aliases MIM
1 IL-6/ID:3569 interleukin 6 [Homo sapiens (human)] Chromosome 7, NC_000007.14 (22725889..22732002) BSF-2, BSF2, CDF, HGF, HSF, IFN-beta-2, IFNB2, IL-6 147620
2 CXCL8/ID:3576 C-X-C motif chemokine ligand 8 [Homo sapiens (human)] Chromosome 4, NC_000004.12 (73740569..73743716) GCP-1, GCP1, IL8, LECT, LUCT, LYNAP, MDNCF, MONAP, NAF, NAP-1, NAP1, SCYB8 146930
3 CCL2/ID:6347 C-C motif chemokine ligand 2 [Homo sapiens (human)] Chromosome 17, NC_000017.11 (34255285..34257203) GDCF-2, HC11, HSMCR30, MCAF, MCP-1, MCP1, SCYA2, SMC-CF 158105
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, IL-6, IL-8 및 MCP-1의 농도는 갑상선 안구 질환 환자의 엑소좀을 투여한 안와 섬유아세포에서 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 이에 더하여, 엑소좀을 처리하지 않은 무처리군과 갑상선 안구 질환 환자 또는 대조군의 엑소좀을 처리한 결과와 비교했을때 IL-6의 경우 갑상선 안구 질환 환자의 엑소좀을 처리한 경우 4.2 배 증가하였고 대조군 엑소좀을 처리한 경우 2.3 배 증가하였으며, IL-8의 경우 갑상선 안구 질환 환자의 엑소좀을 처리한 경우 7.2 배 증가하였고, 대조군 엑소좀을 처리한 경우 3.5 배 증가 하였으며, MCP-1의 경우 갑상선 안구질환 환자의 엑소좀을 처리한 경우 8.6 배 증가하였고, 대조군의 엑소좀을 처리한 경우 4.6 배 증가하는 것을 확인하였다(p < 0.05). 상기 결과로부터 갑상선 안구 질환 환자의 엑소좀을 처리하는 경우 정상 대조군의 엑소좀을 처리할 때와 비교하여 염증성 사이토카인의 발현이 약 2배 이상 증가되는 것을 확인할 수 있었으며 이로부터 갑상선 안구 질환 환자가 함유하는 엑소좀이 안와 섬유아세포에 염증을 활성화시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (16)

  1. VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)을 포함하는 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 갑상선 안구 질환 진단용 마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 마커 조성물은 Alix(programmed cell death 6 interacting protein)(NCBI 접근 번호: NM_001162429.3; NM_001256192.2; NM_013374.6; XM_011533252.1; XM_011533253.1; XM_017005488.1), Flotillin2(NCBI 접근 번호: NM_001330170.2; NM_004475.3; XM_005257953.2; XM_017024395.1; XM_024450666.1; XM_017024396.1; XM_024450667.1; XM_017024394.1), TSG101(tumor susceptibility 101)(NCBI 접근 번호: NM_006292.4; XM_005253108.4), CD63(CD63 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001257389.2; NM_001257390.2; NM_001257391.2; NM_001257392.1; NM_001257400.2; NM_001257401.2; NM_001267698.2; NM_001780.6; XM_024449283.1), CD81(CD81 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001297649.2; NM_004356.4; XM_011520492.2), CRP(C-reactive protein)(NCBI 접근 번호:　NM_000567.3 ; NM_001329057.2; NM_001329058.2; NM_001382703.1), MMP-9(matrix metallopeptidase 9)(NCBI 접근 번호: NM_004994.3), VCAM-1(vascular cell adhesion molecule 1)(NCBI 접근 번호: NM_001078.4; NM_001199834.2; NM_080682.3), IL-6(Interleukin 6)(NCBI 접근 번호: NM_000600.5; NM_001318095.2; NM_001371096.1; XM_011515390.2; XM_005249745.5), IL-8(C-X-C motif chemokine ligand 8)(NCBI 접근 번호: NM_000584.4; NM_001354840.3) 및 MCP-1(C-C motif chemokine ligand 2)(NCBI 접근 번호: NM_002982.4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 갑상선 안구 질환 진단용 마커 조성물.
  3. VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)을 포함하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 갑상선 안구 질환 진단용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 조성물은 Alix(programmed cell death 6 interacting protein)(NCBI 접근 번호: NM_001162429.3; NM_001256192.2; NM_013374.6; XM_011533252.1; XM_011533253.1; XM_017005488.1), Flotillin2(NCBI 접근 번호: NM_001330170.2; NM_004475.3; XM_005257953.2; XM_017024395.1; XM_024450666.1; XM_017024396.1; XM_024450667.1; XM_017024394.1), TSG101(tumor susceptibility 101)(NCBI 접근 번호: NM_006292.4; XM_005253108.4), CD63(CD63 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001257389.2; NM_001257390.2; NM_001257391.2; NM_001257392.1; NM_001257400.2; NM_001257401.2; NM_001267698.2; NM_001780.6; XM_024449283.1), CD81(CD81 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001297649.2; NM_004356.4; XM_011520492.2), CRP(C-reactive protein)(NCBI 접근 번호:　NM_000567.3 ; NM_001329057.2; NM_001329058.2; NM_001382703.1), MMP-9(matrix metallopeptidase 9)(NCBI 접근 번호: NM_004994.3), VCAM-1(vascular cell adhesion molecule 1)(NCBI 접근 번호: NM_001078.4; NM_001199834.2; NM_080682.3), IL-6(Interleukin 6)(NCBI 접근 번호: NM_000600.5; NM_001318095.2; NM_001371096.1; XM_011515390.2; XM_005249745.5), IL-8(C-X-C motif chemokine ligand 8)(NCBI 접근 번호: NM_000584.4; NM_001354840.3) 및 MCP-1(C-C motif chemokine ligand 2)(NCBI 접근 번호: NM_002982.4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 갑상선 안구 질환 진단용 조성물.
  5. 제3항 또는 제4항의 조성물을 포함하는, 갑상선 안구 질환 진단용 키트.
  6. 피검체 유래 생물학적 시료에서 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)을 포함하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 갑상선 안구 질환 진단을 위한 정보제공방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 정보제공방법은 Alix(programmed cell death 6 interacting protein)(NCBI 접근 번호: NM_001162429.3; NM_001256192.2; NM_013374.6; XM_011533252.1; XM_011533253.1; XM_017005488.1), Flotillin2(NCBI 접근 번호: NM_001330170.2; NM_004475.3; XM_005257953.2; XM_017024395.1; XM_024450666.1; XM_017024396.1; XM_024450667.1; XM_017024394.1), TSG101(tumor susceptibility 101)(NCBI 접근 번호: NM_006292.4; XM_005253108.4), CD63(CD63 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001257389.2; NM_001257390.2; NM_001257391.2; NM_001257392.1; NM_001257400.2; NM_001257401.2; NM_001267698.2; NM_001780.6; XM_024449283.1), CD81(CD81 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001297649.2; NM_004356.4; XM_011520492.2), CRP(C-reactive protein)(NCBI 접근 번호:　NM_000567.3 ; NM_001329057.2; NM_001329058.2; NM_001382703.1), MMP-9(matrix metallopeptidase 9)(NCBI 접근 번호: NM_004994.3), VCAM-1(vascular cell adhesion molecule 1)(NCBI 접근 번호: NM_001078.4; NM_001199834.2; NM_080682.3), IL-6(Interleukin 6)(NCBI 접근 번호: NM_000600.5; NM_001318095.2; NM_001371096.1; XM_011515390.2; XM_005249745.5), IL-8(C-X-C motif chemokine ligand 8)(NCBI 접근 번호: NM_000584.4; NM_001354840.3) 및 MCP-1(C-C motif chemokine ligand 2)(NCBI 접근 번호: NM_002982.4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 누액 유래 엑소좀인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 mRNA 수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 단백질 수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  11. 하기의 단계를 포함하는, 갑상선 안구 질환 치료제 스크리닝 방법:
    (a) 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 세포에서 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 후보물질 비처리군에 비해 상기 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)의 발현수준을 감소시키는 물질을 갑상선 안구 질환 치료제로 선별하는 단계.
  12. 제11항에 있어서,
    (d) 후보물질 비처리군에 비해 Alix(programmed cell death 6 interacting protein)(NCBI 접근 번호: NM_001162429.3; NM_001256192.2; NM_013374.6; XM_011533252.1; XM_011533253.1; XM_017005488.1), Flotillin2(NCBI 접근 번호: NM_001330170.2; NM_004475.3; XM_005257953.2; XM_017024395.1; XM_024450666.1; XM_017024396.1; XM_024450667.1; XM_017024394.1), TSG101(tumor susceptibility 101)(NCBI 접근 번호: NM_006292.4; XM_005253108.4), CD63(CD63 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001257389.2; NM_001257390.2; NM_001257391.2; NM_001257392.1; NM_001257400.2; NM_001257401.2; NM_001267698.2; NM_001780.6; XM_024449283.1), CD81(CD81 molecule)(NCBI 접근 번호: NM_001297649.2; NM_004356.4; XM_011520492.2), CRP(C-reactive protein)(NCBI 접근 번호:　NM_000567.3 ; NM_001329057.2; NM_001329058.2; NM_001382703.1), MMP-9(matrix metallopeptidase 9)(NCBI 접근 번호: NM_004994.3), VCAM-1(vascular cell adhesion molecule 1)(NCBI 접근 번호: NM_001078.4; NM_001199834.2; NM_080682.3), IL-6(Interleukin 6)(NCBI 접근 번호: NM_000600.5; NM_001318095.2; NM_001371096.1; XM_011515390.2; XM_005249745.5), IL-8(C-X-C motif chemokine ligand 8)(NCBI 접근 번호: NM_000584.4; NM_001354840.3) 및 MCP-1(C-C motif chemokine ligand 2)(NCBI 접근 번호: NM_002982.4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질의 발현수준이 감소하면 갑상선 안구질환 치료제로 선별하는 단계를 더 포함하는, 스크리닝 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 세포는 안와 섬유아세포인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  14. 피검체 유래 생물학적 시료에서 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)을 포함하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 갑상선 안구 질환 진단을 위한 정보제공방법.
  15. 갑상선 안구 질환의 진단에 사용하기 위한 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)을 포함하는 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 용도.
  16. 갑상선 안구 질환의 진단에 사용하기 위한 VDB(GC vitamin D binding protein)(NCBI 접근 번호: NM_000583.4; NM_001204306.1; NM_001204307.1; XM_006714177.3) 및 CHI3L1(chitinase 3 like 1)(NCBI 접근 번호: NM_001276.4)을 포함하는 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도.
PCT/KR2021/018095 2020-12-02 2021-12-02 갑상선 안구 질환 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도 WO2022119343A1 (ko)

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