JP2023505176A

JP2023505176A - エクソソーム単離法

Info

Publication number: JP2023505176A
Application number: JP2022533314A
Authority: JP
Inventors: ドゥギュエズ，ステファニー; ダディー，ウィリアム; コノリー，オーウェン
Original assignee: ユニバーシティオブアルスター
Priority date: 2019-12-04
Filing date: 2020-12-04
Publication date: 2023-02-08
Also published as: EP4069825A1; GB201917698D0; CA3160415A1; WO2021110920A1; US20230003726A1; CN115279894A

Abstract

本発明はエクソソームを単離する方法に関する。具体的には、本発明は、エクソソームを含む試料を提供する工程；エクソソーム上の細胞表面ポリペプチドを同定する工程；およびエクソソーム上の前記細胞表面ポリペプチドを用いて、エクソソームを単離する工程、を含む方法に関する。本発明の方法によって単離したエクソソームは、バイオマーカーの同定、生物学的機能および疾患の理解、および治療薬によってそれらを標的とする方法の探索を目的とした試験を行うことができる。【選択図】図４

Description

エクソソームは、多数の健康な細胞種および異常細胞種によって活発に分泌される細胞由来の細胞外小型膜小胞（直径５０～１００ｎｍ）の一種である。エクソソームは、正常および病的な条件下でシャトル蛋白質、ｍＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡにより、細胞、組織、および器官レベルのマイクロ通信を仲介することができる。

エクソソームは身体内で異なる細胞種の間の細胞間通信を仲介し、それによって正常および病的状態に影響を与えるのだと、現在では考えられている。エクソソーム内の複数の生物学的実体（蛋白質、ｍＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡなど）が、ほとんどのヒト悪性腫瘍の病因に密接に関連しており、それらは、疾病の診断、予後、および治療に関するすこぶる有益なバイオマーカーとして利用可能である。多くの異なる細胞種および組織がエクソソームを分泌し、エクソソームの内容物および特性は由来する細胞種または組織によって異なるのである。したがって、エクソソームの機能および特定の病理に対するその関連性も由来する組織によって異なり得る。このような理由で、エクソソームの組織特異的亜類型を単離することは、ますます重要になっている。

したがって、エクソソームの精製と分析は急速に成長を遂げつつある研究分野であるが、エクソソームの精製および分析法におけるいくつもの進歩にかかわらず、研究は依然として複数の難問に直面している。

バイオマーカーの同定、生物学的機能および疾患の理解、および治療薬によってそれらを標的とする方法の探索を目的としたエクソソームの研究を行うには、血液およびその他の生物流体中に存在する多量の他の分子および構造物からこれらの顕微鏡的構造物を単離することが、まず必要となる。

したがって、エクソソームを単離する方法を提供する必要がある。

本発明の第１の局面においては、エクソソームを単離する方法が提供されるが、前記方法は：
（ａ）エクソソームを含む試料を提供する工程；
（ｂ）エクソソーム上の細胞表面ポリペプチドを同定する工程；
および
（ｃ）エクソソーム上の前記細胞表面ポリペプチドを用いてエクソソームを単離する工程、
を含み、
ここで前記細胞表面ポリペプチドはジストログリカン（ＤＡＧ）である。

任意選択的に、前記方法は：
（ａ）エクソソームを含む試料を提供する工程；
（ｂ）エクソソーム上の細胞表面ポリペプチドを同定する工程；
（ｃ）前記細胞表面ポリペプチドの結合パートナーを提供する工程；
（ｄ）前記結合パートナーを前記試料に接触させる工程；
（ｅ）前記結合パートナーを単離する工程、
および
（ｆ）エクソソームを単離する工程、
を含み、
ここで前記細胞表面ポリペプチドはジストログリカン（ＤＡＧ）である。

任意選択的に、前記試料は生体試料である。さらに任意選択的に、前記試料はヒトの生体試料である。

任意選択的に、前記試料は生体液試料である。さらに任意選択的に、前記試料はヒトの生体液試料である。

任意選択的に、前記生体液試料は、脳脊髄液（ＣＳＦ）、腹水、胸水、羊水、間質液、血管内液、細胞間液、および細胞内液から選択される。任意選択的に、前記ヒトの生体液試料は、脳脊髄液（ＣＳＦ）、腹水、胸水、羊水、間質液、血管内液、細胞間液、および細胞内液から選択される。

任意選択的に、前記試料は血液試料である。さらに任意選択的に、前記試料はヒトの血液試料である。任意選択的に、前記試料は全血試料である。さらに任意選択的に、前記試料はヒトの全血試料である。任意選択的に、前記試料は血清試料である。さらに任意選択的に、前記試料はヒトの血清試料である。好ましくは、前記試料はヒトの血清試料である。

任意選択的に、前記試料は生体組織試料である。さらに任意選択的に、前記試料はヒトの生体組織試料である。任意選択的に、前記試料は生体組織を含む。さらに任意選択的に、前記試料はヒトの生体組織を含む。

任意選択的に、前記試料は生体軟組織試料である。さらに任意選択的に、前記試料はヒトの生体軟組織試料である。任意選択的に、前記試料は生体軟組織を含む。さらに任意選択的に、前記試料はヒトの生体軟組織を含む。

任意選択的に、前記生体組織は、内胚葉組織、中胚葉組織、および外胚葉組織から選択される。任意選択的に、前記試料は、内胚葉組織、中胚葉組織、および外胚葉組織から選択される生体組織を含む。さらに任意選択的に、前記試料は、内胚葉組織、中胚葉組織、および外胚葉組織から選択されるヒトの生体組織を含む。

任意選択的に、前記中胚葉組織は沿軸中胚葉組織である。

任意選択的に、前記中胚葉組織は筋肉組織である。

任意選択的に、前記筋肉組織は、骨格（横紋）筋組織；平滑（非横紋）筋組織；および心（半横紋）筋組織から選択される。

任意選択的に、前記筋肉組織は、骨格（横紋）筋細胞；平滑（非横紋）筋細胞；および心（半横紋）筋細胞から選択される細胞を含む。

任意選択的に、前記筋肉組織は、骨格（横紋）筋芽細胞；平滑（非横紋）筋芽細胞；および心（半横紋）筋芽細胞から選択される細胞を含む。

任意選択的に、前記筋肉組織は、骨格（横紋）筋管；平滑（非横紋）筋管；および心（半横紋）筋管から選択される細胞を含む。好ましくは、前記筋肉組織は平滑（非横紋）筋管を含む。

任意選択的に、前記細胞表面ポリペプチドはヒト・ジストログリカン（ＤＡＧ）である。

任意選択的に、前記細胞表面ポリペプチドは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１４１１８によって定義されるヒト・ジストログリカン（ＤＡＧ）である。

任意選択的に、前記細胞表面ポリペプチドは、αジストログリカンおよびβジストログリカンから選択される。

任意選択的に、前記細胞表面ポリペプチドは、ヒトαジストログリカンおよびヒトβジストログリカンから選択される。好ましくは、前記細胞表面ポリペプチドはヒトαジストログリカンである。

任意選択的に、前記細胞表面ポリペプチドの結合パートナーは、前記細胞表面ポリペプチドに結合することができる。

任意選択的に、前記細胞表面ポリペプチドの結合パートナーは、前記細胞表面ポリペプチドに結合することのできる抗体である。

任意選択的に、前記抗体は、前記細胞表面ポリペプチドに結合することのできるモノクローナル抗体および前記細胞表面ポリペプチドに結合することのできるポリクローナル抗体から選択される。好ましくは、前記抗体は前記細胞表面ポリペプチドに結合することのできるモノクローナル抗体である。

任意選択的に、前記抗体はＩｇＧイソ型である。さらに任意選択的に、前記抗体はＩｇＧ２イソ型である。またさらに任意選択的に、前記抗体はＩｇＧ２ａイソ型である。またさらに任意選択的に、前記抗体はＭＩｇＧ２ａイソ型である。好ましくは、前記抗体はＭＩｇＧ２ａイソ型である。

任意選択的に、前記細胞表面ポリペプチドの結合パートナーは、前記細胞表面ポリペプチドおよび固体支持体に結合可能な抗体を含む。

任意選択的に、前記固体支持体はビーズである。

任意選択的に、前記固体支持体は親水性ビーズである。

任意選択的に、またはさらに、前記固体支持体はｐＨ中性のビーズである。

任意選択的に、前記固体支持体はエポキシビーズである。さらに任意選択的に、前記固体支持体はエポキシをコーティングしたビーズである。またさらに任意選択的に、前記固体支持体はエポキシ基を有するビーズである。

任意選択的に、前記固体支持体は磁気ビーズである。さらに任意選択的に、前記固体支持体は常磁性ビーズである。またさらに任意選択的に、前記固体支持体は超常磁性ビーズである。好ましくは、前記固体支持体は超常磁性ビーズである。

任意選択的に、前記ビーズの直径は１．０～４．５μｍである。好ましくは、前記ビーズの直径は２．８μｍである。
以下に添付図面を参照しながら本発明の実施態様を説明する。

健常ヒト対象に由来する筋芽細胞の培地をウェスタンブロット分析したものである。培養によって筋管に分化させた。細胞培養エクソソームを血清から免疫捕捉したウェスタンブロット分析である。筋肉エクソソームの単離に関する概要図である。細胞表面ポリペプチド（筋肉膜蛋白質）に結合可能な抗体によってプルダウン（沈降）した循環小胞のウェスタンブロット分析である。健常対象（Ｈ）由来の循環筋肉エクソソームを免疫捕捉したウェスタンブロット分析である。

材料と方法
参加者および倫理審査による承認
健常対象の三角筋生検は、欧州勧告およびフランス法にしたがうＢＴＲ（研究のための組織バンク（ＢａｎｋｏｆＴｉｓｓｕｅｓｆｏｒＲｅｓｅａｒｃｈ）、ＥＵネットワークＥｕｒｏＢｉｏＢａｎｋのパートナー）から取得した。

血清試料は、パーキンソン病の患者および年齢と性別の一致した健常対象から取得した。本プロトコル（ＮＣＴ０２３０５１４７）は、当前記地の倫理委員会の承認、および施設内指針にしたがうインフォームド・コンセントに署名した対象全員の承認を得たものである。

筋肉幹細胞の抽出と培養
簡単に説明すると、既報（Ｂｉｇｏｔら、２０１５）のように、筋肉生検を機械的に分離して、プレート中の増殖培地（１容のＭ１９９、４容のダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、２０％ウシ胎仔血清（ｖ：ｖ）、２５μｇ／ｍｌのフェチュイン、０．５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、５μｇ／ｍｌのインスリン）に播種した。既報（Ｂｉｇｏｔら、２０１５）のように、ＣＤ５６磁気ビーズを用いて筋原細胞集団を濃縮し、それらの筋原性に関しては抗デスミン抗体を用いて濃縮を行った。最少でも８０％の細胞集団がデスミンに対して陽性であった。次いで、既報（Ｔｈｏｒｌｅｙら、２０１６）にしたがい、筋芽細胞を不死化した。その後、不死化筋芽細胞を筋管に分化させて、それらをＤＭＥＭで３回すすいだ後、残存するＦＢＳ全てを除去してからＤＭＥＭで３日間培養した。

血清試料
簡単に説明すると、赤色トップの採血用チューブを用いて、静脈穿刺により血液試料を採取し、室温で３０分間凝固させた。４℃、４，０００ｇで１０分間遠心分離した後、血清をドライアイス上で瞬間凍結し、処理まで－８０℃で保存した。

実施例
以下に、非限定的実施例を参照しながら本発明の実施態様について説明する。

実施例１
筋肉エクソソームの単離
ポリペプチドジストログリカン（ＤＡＧ）が、筋肉エクソソームの内部に存在するか、あるいは表面に存在するのか（膜に埋め込まれており、そのため抗体に接触可能）を判定するために、市販の抗ＤＡＧ抗体（前記ポリペプチドの異なる形態を標的とする抗ＤＡＧ抗体）が細胞培養培地から抽出した筋肉エクソソームに結合可能であるか否かを調べた。

これを行うために、逆の関係にある２種類の試験を用いた、すなわち：
（１）市販の抗ＤＡＧ抗体でプルダウン（沈降）したエクソソームは、エクソソームマーカーに陽性であるか？；
および
（２）エクソソームマーカーでプルダウン（沈降）したエクソソームは、ポリペプチド・ジストログリカン（ＤＡＧ）に陽性であるか？
このような方法で、市販の抗ＤＡＧ抗体が標的とするポリペプチド・ジストログリカン（ＤＡＧ）の形態がエクソソーム表面に存在するときのみ、これら両方の試験で陽性の結果が得られるはずである。αジストログリカン（ＤＡＧ１遺伝子によってコードされる）が抗体に接触可能であって、そのため免疫親和性プルダウン（沈降）に適していることを、本発明者らが判定可能であることがこのアプローチを用いて示された（図１を参照のこと）。

手短に説明すれば、健常ヒト対象の筋肉生検から筋芽細胞を単離し、上記のように培養して筋管に分化させた。３日間の培養後に、全エクソソーム単離試薬を用いて製造元の指示にしたがい、８００，０００筋肉細胞の培地からエクソソームを単離した。

細胞培養培地からエクソソームを単離するために、全エクソソーム単離試薬（細胞培養培地からの分離用；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））を１：２の容量比で細胞培養培地に加えて４℃で一晩インキュベートした。次に、エクソソームを１０，０００ｘｇで６０分間遠心分離して沈殿させ、エクソソームを含まない培地を捨てた。エクソソーム沈殿物を２００μｌのＰＢＳに再懸濁して、必要になるまで－８０℃で保存した。

次いで、培地から単離したエクソソームを、抗ＣＤ６３抗体、抗ＤＡＧ抗体ＶＩＡ４１、または抗ＤＡＧ抗体ＤＡＧ－６Ｆ４のいずれかを用いた免疫親和性によって精製した。細胞培養培地から単離した筋肉エクソソームの免疫共沈降法（Ｃｏ－ＩＰ）においては、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）抗体カップリングキット（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））を用いて製造元の指示にしたがい、α－ＤＡＧ抗体（ＤＡＧ－６Ｆ４；ＤＳＨＢ）をＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ－２７０エポキシビーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））に結合させた。

簡単に説明すると、５μｇの抗体を１ｍｇのビーズに結合させて、穏やかに振盪しながら室温（ＲＴ）で１６～２４時間インキュベートした。次に、ビーズを添付の洗浄緩衝液で洗浄し、必要になるまで指示にしたがって保存した。

次いで、α－ＤＡＧをコーティングしたビーズを個々の免疫沈降条件に１ｍｇで分注し、１００ｍＭのＮａＣｌを含む９００μｌの１ｘＩＰ緩衝液（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））で洗浄した。次に、ＰｕｒｅＰｒｏｔｅｏｍｅ（商標）磁気スタンドでビーズを捕捉し、上記のように調製したエクソソーム懸濁液を４００μｌに希釈してα－ＤＡＧ結合ビーズに加え、上下反転させながら室温で３時間インキュベートした。

次いで、ビーズを磁気的に捕捉し、上清はエクソソーム枯渇分析用に保存した。次に、１ｍｌのＰＢＳ－ＢＳＡ（０．１％）でビーズを２回洗浄し、エクソソームは、その後の用途に応じて、ビーズから直接溶解させるか、あるいはビーズから溶出した。

ウェスタンブロット法、ならびにＣＤ６３およびＣＤ８１テトラスパニン蛋白質の検出のために、１５μｌの４ｘＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ緩衝液をビーズに加え、氷上で３０分間インキュベートすることにより、非還元性条件下でエクソソームを溶解した。次いで、ビーズを磁気的に捕捉し、蛋白質を新しいチューブに移して７０℃で１０分間加熱した。次に、４５μｌの蛋白質をＮｕＰＡＧＥ（商標）４～１２％Ｂｉｓ－ｔｒｉｓＭｉｄｉｇｅｌ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））に載せ、ｉｂｌｏｔ（登録商標）ＤｒｙＢｌｏｔｔｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））を用いてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写する前に、１ｘＮｕＰＡＧＥ（商標）ＭＯＰＳＳＤＳ泳動緩衝液（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））中、２００ｖで５０分間泳動した。

ｉｂｉｎｄ（商標）Ｆｌｅｘウェスタンシステムおよび１次抗体（ＣＤ８１、クローンＭ３８＆ＣＤ６３、クローンＴｓ６３；１：１，０００希釈；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））を適切な２次抗体（ヤギ抗マウスＨＲＰ、１：４，０００希釈）と共に用いて、免疫ブロティングを行った。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＥＣＬウェスタンブロティング基質およびＵＶＰＣｈｅｍｉＤｏｃ－Ｉｔ２ｉｍａｇｅｒを用いて、化学発光シグナルを検出した。

いずれの場合にも、沈降物はＣＤ６３エクソソームマーカーに陽性であり、このことは抗ＤＡＧが筋肉エクソソームを沈降可能であることを示している。

実施例２
血清中の細胞培養エクソソームの免疫捕捉
血清のような複合出発材料からの筋肉エクソソームの免疫捕捉が内因性血清ＩｇＧの競合により妨害されるか否かを試験するために、細胞培養培地の筋肉エクソソームを、パーキンソン病の患者および年齢と性別の一致した健常対象（上記のプロトコルＮＣＴ０２３０５１４７）から取得したヒト血清試料に注入し、上記のように免疫共沈降（Ｃｏ－ＩＰ）を行った。

手短に説明すると、筋管に分化させた８００，０００筋芽細胞が３日間の培養中に培地に分泌した筋肉エクソソームを２００μｌの健常対象（Ｈ）血清に注入した。次いで、抗ＤＡＧ１抗体（ＤＡＧ－６Ｆ４：Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｅ．によって発生研究ハイブリドーマバンク（ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＳｔｕｄｉｅｓＨｙｂｒｉｄｏｍａＢａｎｋ）（ＤＳＨＢ）に、ＤＳＨＢハイブリドーマＰｒｏｄｕｃｔＤＡＧ－６Ｆ４として登録されたもの）をコーティングした、おおよそ６．７ｘ１０^７個の磁気ビーズと共に、エクソソーム注入血清を３時間インキュベートした。上記のように、ビーズを捕捉し洗浄するために磁気スタンドを用いた。次いで、捕捉した筋肉エクソソームをＮｕＰＡＧＥ緩衝液で溶解させ、上記のようにゲルに載せて、エクソソームマーカーＣＤ６３およびＣＤ８１に特異的な抗体を用いたウェスタンブロット分析を行った。

細胞培養培地のエクソソームは、ヒト血清試料から良好に単離され、このことによって、抗ＤＡＧ１ビーズが、内因性抗原による顕著な妨害なしに生物流体からエクソソームを捕捉可能であることが確認された（図２を参照のこと）。

実施例３
循環筋肉エクソソームの抽出
抗ＤＡＧ１免疫親和性アプローチを用いて、循環筋肉エクソソームを血清から単離可能か否かを調べるために、ヒト対象の血清を用いた。

手短に説明すれば、ヒト血清試料からエクソソームを単離するために、まず、２０００ｘｇで３０分間の遠心分離によって、２００μｌの血清から細胞破片を取り除いた。次いで、全エクソソーム単離試薬（血清からの分離用；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））を用いて、製造元の指示にしたがい、ただし容量は変更して、エクソソームを単離した。具体的には、推奨される４０μｌの代わりに、２０μｌの単離試薬を血清試料に添加し、試料をボルテックス撹拌し氷上で３０分間インキュベートしてから、１０，０００ｘｇで１０分間の遠心分離を行った。次に、上清を分離して、その後のエクソソーム枯渇分析のために保存した。一方、沈殿は２００μｌのＰＢＳに再懸濁して、必要になるまで－８０℃で保存した。

上記のように、２００μｌの血清からエクソソームを沈殿させた。次いで、全循環エクソソームを、上記のように抗ＤＡＧ１抗体でコーティングした磁気ビーズと共に３時間インキュベートした。次に、上記のように磁石を用いてビーズを単離および洗浄した。次いで、ＮｕＰＡＧＥ緩衝液を用いて筋肉エクソソームから蛋白質を抽出してウェスタンブロット分析用のゲルに載せた（図３Ａを参照のこと）。ウェスタンブロット分析によって、筋肉膜蛋白質を標的とする抗体によってプルダウン（沈降）した小胞がエクソソームマーカーＣＤ６３およびＣＤ８１に陽性であることが示され、このことは、血清から筋肉エクソソームを単離するために抗ＤＡＧ１を用いた免疫親和性アプローチが実際に利用可能であることを示すものである（図３Ｂを参照のこと）。

実施例４
健常対象の循環筋肉エクソソームの免疫捕捉
循環筋肉エクソソームを健常対照の血清から抗ＤＡＧ１ビーズによって単離可能か否かを判定するために、試料容積を５００μｌに増やして上記のように免疫沈降を行った。捕捉エクソソームを抗ＤＡＧ１単離ビーズから溶離させる溶離能についても、異なる溶出緩衝液を用いて試験した。

手短に説明すると、５００μｌの血清からエクソソームを沈殿させた。次いで、上記のように、抗ＤＡＧ１抗体をコーティングした磁気ビーズと共に、全循環エクソソームを３時間インキュベートした。上記のように、ビーズを捕捉し洗浄するために磁気スタンドを用いた。次いで、捕捉した筋肉エクソソームをＮｕＰＡＧＥ緩衝液（ＮＰ）、８Ｍ尿素緩衝液、または市販の溶出緩衝液（ＥＢ）のいずれかで溶離させて、上記のようにゲルに載せて、エクソソームマーカーＣＤ６３およびＣＤ８１に特異的な抗体を用いたウェスタンブロット分析を行った。

試料容積の増加後、ＣＤ６３およびＣＤ８１に陽性である筋肉エクソソームが、健常対照の血清から良好に捕捉された（図４を参照のこと）。さらに、低ｐＨ溶出緩衝液と比較してＮｕＰＡＧＥ緩衝液および８Ｍ尿素緩衝液が捕捉エクソソームの溶離に最も効果的であることが、異なる溶出緩衝液の試験によって示された。

Claims

エクソソームを単離する方法であって、前記方法が：
（ａ）エクソソームを含む試料を提供する工程；
（ｂ）エクソソーム上の細胞表面ポリペプチドを同定する工程；
（ｃ）前記細胞表面ポリペプチドの結合パートナーを提供する工程；
（ｄ）前記結合パートナーに前記試料を接触させる工程：
（ｅ）前記結合パートナーを単離する工程、
および
（ｆ）前記エクソソームを単離する工程、
を含み、
ここで前記細胞表面ポリペプチドはジストログリカン（ＤＡＧ）である、方法。
請求項１の方法であって、ここで前記試料が生体液試料である、方法。
請求項１または２の方法であって、ここで前記試料が血清試料である、方法。
請求項１～３のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記試料が生体組織を含む、方法。
請求項１～４のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記試料が内胚葉組織、中胚葉組織、および外胚葉組織から選択される生体組織を含む、方法。
請求項５の方法であって、ここで前記中胚葉組織が筋肉組織である、方法。
請求項６の方法であって、ここで前記筋肉組織が骨格（横紋）筋細胞；平滑（非横紋）筋細胞；および心（半横紋）筋細胞から選択される細胞を含む、方法。
請求項１～７のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記細胞表面ポリペプチドがαジストログリカンである、方法。
請求項１～８のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記細胞表面ポリペプチドの前記結合パートナーが、前記細胞表面ポリペプチドに結合可能な抗体である、方法。
請求項１～９のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記細胞表面ポリペプチドの前記結合パートナーが、前記細胞表面ポリペプチドおよび固体支持体に結合可能な抗体を含む、方法。
請求項１０の方法であって、ここで前記固体支持体が磁気ビーズである、方法。