CN117586923A - 磁性纳米粒子、生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了磁性纳米粒子、生物传感器及其制备方法和在检测污染土壤生物毒性中的应用。磁性纳米粒子的制备方法包括：①配置反应溶液：②在连续鼓泡氮气的条件下，将反应溶液在室温下培养；然后在搅拌条件下将交联剂加入反应溶液中进行交联后，再继续搅拌；③在氮气条件下，将步骤②的反应体系在水浴中浸泡，然后再培养，在培养过程中，间隔固定时间进行搅拌，培养完成后，得到含有磁性纳米粒子的粗产品；④使用钕硼磁铁收集磁性纳米粒子，清洗，干燥，得到所述磁性纳米粒子。本发明的生物传感器是通过制备的形貌大小可控且生物友好型的磁性纳米粒子与发光细菌共组装得到，能够实现原状污染土壤检测，精准测定污染土壤的生物毒性。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器的技术领域，尤其涉及一种磁性纳米粒子、生物传感器及其制备方法和在检测污染土壤生物毒性中的应用。
背景技术
污染土壤中的重金属、有机物等呈现出的综合生物毒性，会引发人体健康风险、导致人体中毒，甚至影响整个生态系统。随着对土壤生物毒性的关注，精准检测多种类、多形态污染物存在下的复合污染土壤生物毒性成为研究焦点[8]。精准检测土壤生物毒性是污染土壤评价、修复工作的起点，更是终点。近年来，学者们利用分析化学检测技术测定污染物含量并通过模型计算其生物毒性的方法存在问题，无法真实量化污染土壤生物毒性。相比于分析化学方法，微生物检测法是对污染土壤中转移到液相中的有害元素生物毒性的直接检测，被认为是非常有前景的污染土壤生物毒性检测技术。但该方法仍需先从土壤中分离污染物，因此存在改变微生物活性，土壤理化性质等问题。这些问题严重影响微生物检测复合污染土壤综合生物毒性的灵敏性和重现性，严重影响了该方法的推广和应用。最新研究通过制备磁性纳米细菌传感器，利用磁性纳米细菌传感器原位检测土壤生物毒性，可充分反映土壤的生物毒性，并不会改变土壤的理化性质，且具有原位检测、操作简单、响应快速、灵敏度高等优点。
磁性纳米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs）是构建磁性纳米细菌传感器制备成功与否的关键，其形貌大小、生物友好性直接决定了传感器的灵敏性、稳定性和可推广性。当下制备 MNPs 的常用方法（如化学沉淀法）存在不能精准调控MNPs形貌大小，产物结晶性差易发生团聚，制备时需添加化学助剂等问题。而且制备传感器需要直径低于一定尺寸（一般需要低于25-30nm）具有磁性的 MNPs，能有效实现传感器与污染土壤接触后定向移动与分离。同时，MNPs 须具有良好分散性，否则难以均匀分散，影响其与细菌表面的结合。
因此需要进一步改进现有磁性纳米粒子的合成方法，制备形貌大小可控、生物友好、磁性效果更优的 MNPs。
发明内容
针对上述现有技术存在的局限性，本发明提供一种磁性纳米粒子、生物传感器及其制备方法和在检测污染土壤生物毒性中的应用。本发明的生物传感器是通过制备的形貌大小可控且生物友好型的磁性纳米粒子与发光细菌共组装得到，能够实现原状污染土壤检测，精准测定污染土壤的生物毒性。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面是提供一种磁性纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
①配置反应溶液：所述反应溶液中含有 FeSO4、KOH、KNO3和Mms6蛋白；
②在连续鼓泡氮气的条件下，将反应溶液在室温下培养；然后在搅拌条件下将交联剂加入反应溶液中进行交联后，再继续搅拌；
③在氮气条件下，将步骤②的反应体系在水浴中浸泡，然后再培养，在培养过程中，间隔固定时间进行搅拌，培养完成后，得到含有磁性纳米粒子的粗产品；
④使用钕硼磁铁收集磁性纳米粒子，清洗，干燥，得到所述磁性纳米粒子。
作为一种优选的实施方式，步骤①，1 mL反应溶液含有25-35 mM FeSO4·7H2O、95-105 mM KOH和380-420 mM KNO3和40-60 µg/mL的Mms6蛋白。
优选地，
步骤①，1 mL反应溶液含有30 mM FeSO4·7H2O、100 mM KOH和400 mM KNO3和50 µg/mL 的Mms6蛋白。
本发明的反应溶液在实际应用中，可按此比例放大或缩小均可。
本发明所用的Mms6蛋白是按常规方法制备的Mms6蛋白。
作为一种优选的实施方式，步骤②，
将反应溶液在室温下培养5-10分钟，再加交联剂；和/或，
所述交联剂选自1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺、双琥珀酰亚胺辛二酸酯、二硫双（琥珀酰亚胺丙酸酯）或磺基琥珀酰亚胺 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐中的至少一种；和/或，
所述反应溶液和所述交联剂的体积质量比为1 mL:0.4~0.6 mg；和/或，
所述继续搅拌的时间为2~4 h。
作为一种优选的实施方式，所述交联剂选自1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和双琥珀酰亚胺辛二酸酯或者1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和二硫双（琥珀酰亚胺丙酸酯）中的至少一种；
优选地，其中，1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和双琥珀酰亚胺辛二酸酯的质量比为1:0.5-1；和/或，
1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和二硫双（琥珀酰亚胺丙酸酯）的质量比为1:1-2。
作为一种优选的实施方式，步骤③，
将步骤②的反应体系在80-90℃的水浴中浸泡5-10分钟；和/或，
在80-90℃温度下再培养4-6小时，在培养过程中，每间隔30分钟搅拌一次；和/或，
步骤④，用超纯水清洗三次；并在真空烘箱中干燥过夜。
本发明的第二个方面是提供一种如本发明的第一个方面所述的方法制备的磁性纳米粒子；优选地，所述磁性纳米粒子的粒径为5-40nm，其中粒径为20-30nm的磁性纳米粒子的占比≥80%。
本发明的第三个方面是提供一种生物传感器，所述生物传感器包括磁性纳米粒子和明亮发光杆菌；所述明亮发光杆菌负载在所述磁性纳米粒子上；
所述磁性纳米粒子选自本发明的第一个方面所述的方法制备的磁性纳米粒子或者本发明的第二个方面所述的磁性纳米粒子。
作为一种优选的实施方式，将磁性纳米粒子的水悬浮液和明亮发光杆菌的复苏菌液在振荡条件下混合并组装，得到所述生物传感器。
本发明的第四个方面是提供一种如本发明的第三个方面所述的生物传感器的制备方法，将磁性纳米粒子的水悬浮液和明亮发光杆菌的复苏菌液在振荡条件下混合并组装，得到所述生物传感器。
作为一种优选的实施方式，所述磁性纳米粒子的水悬浮液的浓度为0.3-0.6mg/mL；和/或，
所述明亮发光杆菌的复苏菌液和所述磁性纳米粒子的水悬浮液的体积比为0.2-0.4:1；
所述混合的温度为室温，所述组装的时间为30-45分钟；和/或，
所述振荡的速度140-160rpm。
本发明所用的明亮发光杆菌的复苏菌液是按常规复苏方法制备的复苏菌液。
本发明的第五个方面是提供一种如本发明的第三个方面所述的生物传感器在检测污染土壤生物毒性中的应用。
本发明利用静电自组装法进行细菌传感器制备，将磁性纳米粒子（MNPs）和明亮发光杆菌通过静电吸附结合以获得细菌传感器。将稳定的MNPs悬浊液引入至其中进行振荡混合均匀，使细菌表面与MNPs充分结合。利用永磁体将被MNPs包覆的细菌从混合液中分离出来，得到磁化细菌传感器（即生物传感器），用水冲洗三次后在3%NaCl溶液中保存。
本发明的生物传感器通过形貌大小可控且生物友好型的磁性纳米粒子与发光细菌共组装得到，能够实现原状污染土壤检测，精准测定污染土壤的生物毒性。可以检测土壤污染中常见的Pb2+、Cd2+、Cr6+、Zn2+等重金属，苯并a芘、萘、菲等多环芳烃有毒有机物。发光细菌在正常生存环境下，体内荧光素在荧光酶的催化作用下可释放出肉眼可见的蓝绿荧光，当受到外界不良刺激时，发光菌的发光强度会减弱，而减弱程度与污染物剂量或毒性强度呈线性关系；相对发光强度反映了待测土样中可被磁性纳米细菌传感器有效利用部分的急性毒性水平。相对发光强度越低，表明待测样品急性毒性越强。在毒性水平相同条件下，相对发光强度越低，则说明传感细胞越灵敏
与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
本发明制备的生物友好型的磁性纳米粒子，与发光细菌结合后制备磁性纳米细菌传感器，传感器的磁性和生物活性得到提升，能够实现原状污染土壤检测，能够更精准的检测污染土壤生物毒性。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的磁性纳米粒子的SEM图。
具体实施方式
下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
本发明所用的Mms6蛋白采用以下方法制备：
1.趋磁细菌 AMB-1的培养
①趋磁细菌 AMB-1 保存方法。配置50%甘油（甘油与超纯水 1:1 混合），121℃高压灭菌 30 min 后，常温保存。将培养至对数生长期的趋磁细菌 AMB-1 菌液与 50%甘油以1:1 的比例混合于 5 ml 冻存管中，置于-80℃冰箱中长期保存。
② 趋磁细菌 AMB-1培养方法。菌株活化：取-80℃冰箱中 AMB-1 冻存管 2 根（共10ml），待其融化后倒入装有 45ml 培养基的盐水瓶中，塞上塞子，封口膜封住瓶口，放入摇床中，调节摇床温度为 30℃，转速为 100 rpm。趋磁细菌 AMB-1细胞活化大约需要 36-48h。传代培养：将活化好的AMB-1菌液以 10%的接种量进行第一次传代培养，即取 5 ml 活化后菌液加入 45 ml 新鲜培养基中，30℃、100 rpm 摇床培养 24 h。如此同样方法进行第二次传代培养 24 h 后的菌液即可用于下一步实验研究。第二次传代培养至对数生长期（约16 h）的菌液可取出用于存菌。
2.Mms6蛋白的提纯
①收集AMB-1趋磁细菌细胞并在变性缓冲液（6 M盐酸胍，10 mM Tris，pH 10）中超声破碎。
②使用快速蛋白质液相色谱（FPLC）系统和superdex7510/300 GL柱对上清液进行尺寸排阻色谱。
③然后将纯化蛋白在相同体积的复性缓冲液中稀释。复性缓冲剂包含50 mMTris–HCl、1 mM EDTA、0.1 mM L-精氨酸、1 mM谷胱甘肽（还原）、10%（v/v）甘油、0.8 mM谷胱甘肽（氧化）、pH 8.0，并通过在磷酸盐缓冲盐（PBS）（pH 7.4）中透析重新性质。
④GST-Mms6用凝血酶消化，然后应用于FPLC系统以纯化Mms6。
本发明所用的明亮发光杆菌的复苏菌液的制备方法如下：
将明亮发光杆菌冻干粉在适宜的条件下复苏，制成菌悬液，然后接种到培养基恒温培养，观察细菌生长状况良好即可放于4℃冰箱中保存备用，具体地：将明亮发光杆菌冻干粉从-80℃冰箱取出，在４℃冷藏解冻，在超净工作台内，用砂轮将安额瓶切开小口，缓慢加入冷藏后1mL3%的NaCl，轻微震动，复苏约10min后，接种至固体培养基上，20℃下生长24小时，至黑暗处可见蓝绿色光。再用接种环挑取一个较亮单菌落，于50mL的液体培养基中，20℃下振荡培养20小时。菌种保藏：选取生长较好的菌体，离心去除上清液，重悬于含有3%的NaCl的灭菌甘油中（20%甘油），分装于1.5mL EP管中，于-80℃下保存。
实施例1
磁性纳米粒子的制备方法：
①配置反应溶液：1 mL反应溶液含有30 mM FeSO4·7H2O、100 mM KOH和400 mMKNO3和50 µg/ml 的Mms6蛋白。
②将上述混合后的反应溶液取10mL在室温下培养5分钟，并连续鼓泡氮气。然后将5 mg EDC（1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺）加入反应溶液进行交联，以此稳定溶液中存在的不稳定颗粒继续搅拌2 h。
③在氮气条件下，将小瓶在90℃水浴中浸泡5分钟，然后在90°C温度下再培养4小时，在培养过程中，每隔30分钟手动搅拌试管，以确保均匀分散。
④使用钕硼磁铁收集产品，并用超纯水清洗三次。并在真空烘箱中干燥过夜。本发明实施例1制备的磁性纳米粒子的SEM图如图1所示。
一种生物传感器的制备方法：
将1mL磁性纳米粒子的水悬浮液0.4mg/mL、0.2mL明亮发光杆菌的复苏菌液在振荡条件下(振荡150rpm 40分钟)混合并组装，利用永磁体将被 MNPs 包覆的细菌从未结合MNPs 的细菌中分离出来，即得到磁化细菌（即生物传感器）。将磁化后的明亮发光杆菌再次用水冲洗三次，重新悬浮在3%的 NaCl 溶液中保存备用。
经上述方法得到的生物传感器包括磁性纳米粒子和明亮发光杆菌；所述明亮发光杆菌负载在所述磁性纳米粒子上。
实施例2
磁性纳米粒子的制备方法：
①配置反应溶液：1 mL反应溶液含有30 mM FeSO4·7H2O、100 mM KOH和400 mMKNO3和50 µg/ml 的Mms6蛋白。
②将上述混合后的反应溶液取10mL在室温下培养5分钟，并连续鼓泡氮气。然后将5 mgDSS（双琥珀酰亚胺辛二酸酯）加入反应溶液进行交联，以此稳定溶液中存在的不稳定颗粒继续搅拌2 h。
③在氮气条件下，将小瓶在90℃水浴中浸泡5分钟，然后在90°C温度下再培养4小时，在培养过程中，每隔30分钟手动搅拌试管，以确保均匀分散。
④使用钕硼磁铁收集产品，并用超纯水清洗三次。并在真空烘箱中干燥过夜。
一种生物传感器的制备方法：
将1mL磁性纳米粒子的水悬浮液0.4mg/mL、0.2mL明亮发光杆菌的复苏菌液在振荡条件下(振荡150rpm 40分钟)混合并组装，利用永磁体将被 MNPs 包覆的细菌从未结合MNPs 的细菌中分离出来，即得到磁化细菌（即生物传感器）。将磁化后的明亮发光杆菌再次用水冲洗三次，重新悬浮在3%的 NaCl 溶液中保存备用。
经上述方法得到的生物传感器包括磁性纳米粒子和明亮发光杆菌；所述明亮发光杆菌负载在所述磁性纳米粒子上。
实施例3
磁性纳米粒子的制备方法：
①配置反应溶液：1 mL反应溶液含有30 mM FeSO4·7H2O、100 mM KOH和400 mMKNO3和50 µg/ml 的Mms6蛋白。
②将上述混合后的反应溶液取10mL在室温下培养5分钟，并连续鼓泡氮气。然后将5 mgDSP（二硫双（琥珀酰亚胺丙酸酯）加入反应溶液进行交联，以此稳定溶液中存在的不稳定颗粒继续搅拌2 h。
③在氮气条件下，将小瓶在90℃水浴中浸泡5分钟，然后在90°C温度下再培养4小时，在培养过程中，每隔30分钟手动搅拌试管，以确保均匀分散。
④使用钕硼磁铁收集产品，并用超纯水清洗三次。并在真空烘箱中干燥过夜。
一种生物传感器的制备方法：
将1mL磁性纳米粒子的水悬浮液0.4mg/mL、0.2mL明亮发光杆菌的复苏菌液在振荡条件下(振荡150rpm 40分钟)混合并组装，利用永磁体将被 MNPs 包覆的细菌从未结合MNPs 的细菌中分离出来，即得到磁化细菌（即生物传感器）。将磁化后的明亮发光杆菌再次用水冲洗三次，重新悬浮在3%的 NaCl 溶液中保存备用。
经上述方法得到的生物传感器包括磁性纳米粒子和明亮发光杆菌；所述明亮发光杆菌负载在所述磁性纳米粒子上。
实施例4
磁性纳米粒子的制备方法：
①配置反应溶液：1 mL反应溶液含有30 mM FeSO4·7H2O、100 mM KOH和400 mMKNO3和50 µg/ml 的Mms6蛋白。
②将上述混合后的反应溶液取10mL在室温下培养5分钟，并连续鼓泡氮气。然后将5 mgSulfo-SMCC（磺基琥珀酰亚胺 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐）加入反应溶液进行交联，以此稳定溶液中存在的不稳定颗粒继续搅拌2 h。
③在氮气条件下，将小瓶在90℃水浴中浸泡5分钟，然后在90°C温度下再培养4小时，在培养过程中，每隔30分钟手动搅拌试管，以确保均匀分散。
④使用钕硼磁铁收集产品，并用超纯水清洗三次。并在真空烘箱中干燥过夜。
一种生物传感器的制备方法：
将1mL磁性纳米粒子的水悬浮液0.4mg/mL、0.2mL明亮发光杆菌的复苏菌液在振荡条件下(振荡150rpm 40分钟)混合并组装，利用永磁体将被 MNPs 包覆的细菌从未结合MNPs 的细菌中分离出来，即得到磁化细菌（即生物传感器）。将磁化后的明亮发光杆菌再次用水冲洗三次，重新悬浮在3%的 NaCl 溶液中保存备用。
经上述方法得到的生物传感器包括磁性纳米粒子和明亮发光杆菌；所述明亮发光杆菌负载在所述磁性纳米粒子上。
实施例5
磁性纳米粒子的制备方法：
①配置反应溶液：1 mL反应溶液含有30 mM FeSO4·7H2O、100 mM KOH和400 mMKNO3和50 µg/ml 的Mms6蛋白。
②将上述混合后的反应溶液取10mL在室温下培养5分钟，并连续鼓泡氮气。然后将5 mg的 1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和双琥珀酰亚胺辛二酸酯（其中，1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和双琥珀酰亚胺辛二酸酯的质量比为1:0.6）加入反应溶液进行交联，以此稳定溶液中存在的不稳定颗粒继续搅拌2 h。
③在氮气条件下，将小瓶在90℃水浴中浸泡5分钟，然后在90°C温度下再培养4小时，在培养过程中，每隔30分钟手动搅拌试管，以确保均匀分散。
④使用钕硼磁铁收集产品，并用超纯水清洗三次。并在真空烘箱中干燥过夜。
一种生物传感器的制备方法：
将1mL磁性纳米粒子的水悬浮液0.4mg/mL、0.2mL明亮发光杆菌的复苏菌液在振荡条件下(振荡150rpm 40分钟)混合并组装，利用永磁体将被 MNPs 包覆的细菌从未结合MNPs 的细菌中分离出来，即得到磁化细菌（即生物传感器）。将磁化后的明亮发光杆菌再次用水冲洗三次，重新悬浮在3%的 NaCl 溶液中保存备用。经上述方法得到的生物传感器包括磁性纳米粒子和明亮发光杆菌；所述明亮发光杆菌负载在所述磁性纳米粒子上。
实施例6
磁性纳米粒子的制备方法：
①配置反应溶液：1 mL反应溶液含有30 mM FeSO4·7H2O、100 mM KOH和400 mMKNO3和50 µg/ml 的Mms6蛋白。
②将上述混合后的反应溶液取10mL在室温下培养5分钟，并连续鼓泡氮气。然后将5 mg的1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和二硫双（琥珀酰亚胺丙酸酯）（其中，1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和二硫双（琥珀酰亚胺丙酸酯）的质量比为1:1.5）加入反应溶液进行交联，以此稳定溶液中存在的不稳定颗粒继续搅拌2 h。
③在氮气条件下，将小瓶在90℃水浴中浸泡5分钟，然后在90°C温度下再培养4小时，在培养过程中，每隔30分钟手动搅拌试管，以确保均匀分散。
④使用钕硼磁铁收集产品，并用超纯水清洗三次。并在真空烘箱中干燥过夜。
一种生物传感器的制备方法：
将1mL磁性纳米粒子的水悬浮液0.4mg/mL、0.2mL明亮发光杆菌的复苏菌液在振荡条件下(振荡150rpm 40分钟)混合并组装，利用永磁体将被 MNPs 包覆的细菌从未结合MNPs 的细菌中分离出来，即得到磁化细菌（即生物传感器）。将磁化后的明亮发光杆菌再次用水冲洗三次，重新悬浮在3%的NaCl 溶液中保存备用。
经上述方法得到的生物传感器包括磁性纳米粒子和明亮发光杆菌；所述明亮发光杆菌负载在所述磁性纳米粒子上。
对比例1
其采用和实施例1基本相同的制备方法，区别仅在于，不进行实施例1步骤②加入交联剂的步骤。
上述实施例制备的磁性纳米粒子的粒径分布均在5-40nm左右，上述对比例制备的磁性纳米粒子的粒径分布均在2-60nm左右，从粒径分布上可以看出本发明制备的磁性纳米粒子的粒径分布更窄。进一步地，经上述实施例和对比例制备的磁性纳米粒子的更详细参数如下表1所示。
磁响应性测试：
采用振动磁强计(VSM)测定实施例和对比例的饱和磁化强度。
表1
从表1的结果可以看出，本发明制备的磁性纳米粒子的粒径分布更窄，粒径尺寸更稳定，且具有更好的磁性，能有效实现传感器与污染土壤接触后定向移动与分离，提高检测的灵敏度。
利用上述制备出磁性与生物活性良好的磁性纳米细菌传感器，进行土壤生物毒性检测实验。磁性纳米细菌传感器发光检测在DXY-3生物毒性检测仪上进行。测量各孔样品发光值，计算样品的发光抑制率K（%）。
土壤来源：配置污染土壤，向未污染土壤中分别加入污染源，比如每1kg土壤家中，分别加入10mL浓度均为5mg/g的Cd2+溶液、Cr3+溶液、Pb2+溶液、Cu2+溶液；每个样品平行制备七份；然后分别采用依次测试，计算每个样品的发光抑制率K（%）。
经上述实施例和对比例制备的生物传感器检测污染土壤生物毒性的结果如下表2所示。
表2
相对发光强度反映了待测土样中可被磁性纳米细菌传感器有效利用部分的急性毒性水平。相对发光强度越低，表明待测样品急性毒性越强。在毒性水平相同条件下，相对发光强度越低（即发光抑制率K（%）越高），则说明传感细胞越灵敏。从表2的结果可以看出，本发明制备的生物传感器比对比例1制备的生物传感器的相对发光强度更低，相应地传感细胞越灵敏，测试精度更高。
可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
①配置反应溶液：所述反应溶液中含有 FeSO4、KOH、KNO3和Mms6蛋白；
②在连续鼓泡氮气的条件下，将反应溶液在室温下培养；然后在搅拌条件下将交联剂加入反应溶液中进行交联后，再继续搅拌；
③在氮气条件下，将步骤②的反应体系在水浴中浸泡，然后再培养，在培养过程中，间隔固定时间进行搅拌，培养完成后，得到含有磁性纳米粒子的粗产品；
④使用钕硼磁铁收集磁性纳米粒子，清洗，干燥，得到所述磁性纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于：
步骤①，1 mL反应溶液含有25-35 mM FeSO4·7H2O、95-105 mM KOH和380-420 mM KNO3和40-60 µg/mL的Mms6蛋白。
3.根据权利要求1所述的磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于：
步骤②，
将反应溶液在室温下培养5-10分钟，再加交联剂；和/或，
所述交联剂选自1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺、双琥珀酰亚胺辛二酸酯、二硫双（琥珀酰亚胺丙酸酯）或磺基琥珀酰亚胺 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐中的至少一种；和/或，
所述反应溶液和所述交联剂的体积质量比为1 mL:0.4~0.6 mg；和/或，
所述继续搅拌的时间为2~4 h。
4.根据权利要求1所述的磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于：
所述交联剂选自1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和双琥珀酰亚胺辛二酸酯或者1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和二硫双（琥珀酰亚胺丙酸酯）中的至少一种；
其中，1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和双琥珀酰亚胺辛二酸酯的质量比为1:0.5-1；和/或，
1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和二硫双（琥珀酰亚胺丙酸酯）的质量比为1:1-2。
5.根据权利要求1所述的磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于：
步骤③，
将步骤②的反应体系在80-90℃的水浴中浸泡5-10分钟；和/或，
在80-90℃温度下再培养4-6小时，在培养过程中，每间隔30分钟搅拌一次；和/或，
步骤④，用超纯水清洗三次；并在真空烘箱中干燥过夜。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的方法制备的磁性纳米粒子，其特征在于：所述磁性纳米粒子的粒径为5-40nm，其中粒径为20-30nm的磁性纳米粒子的占比≥80%。
7.一种生物传感器，其特征在于：
所述生物传感器包括磁性纳米粒子和明亮发光杆菌；所述明亮发光杆菌负载在所述磁性纳米粒子上；
所述磁性纳米粒子选自权利要求1-5任一项所述的方法制备的磁性纳米粒子或者权利要求6所述的磁性纳米粒子。
8.一种如权利要求7所述的生物传感器的制备方法，其特征在于：
将磁性纳米粒子的水悬浮液和明亮发光杆菌的复苏菌液在振荡条件下混合并组装，得到所述生物传感器。
9.根据权利要求8所述的生物传感器的制备方法，其特征在于：
所述磁性纳米粒子的水悬浮液的浓度为0.3-0.6mg/mL；和/或，
所述明亮发光杆菌的复苏菌液和所述磁性纳米粒子的水悬浮液的体积比为0.2-0.4:1；
所述混合的温度为室温，所述组装的时间为30-45分钟；和/或，
所述振荡的速度140-160rpm。
10.一种如权利要求7所述生物传感器在检测污染土壤生物毒性中的应用。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117586923B (zh) | 2024-04-30 |
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