CN115181809A - 利用发光细菌检测金属有机框架纳米材料毒性的方法及金属有机框架纳米材料分散介质溶液 - Google Patents

利用发光细菌检测金属有机框架纳米材料毒性的方法及金属有机框架纳米材料分散介质溶液 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用发光细菌检测金属有机框架纳米材料毒性的方法及金属有机框架纳米材料分散介质溶液；检测方法为：步骤(1)将活化好的发光细菌挑取单菌落接种于液体培养基中培养至对数生长期，收集培养物得到菌体；步骤(2)利用介质溶液溶解金属有机框架纳米材料逐级稀释超声处理后待用；步骤(3)将MOF材料溶液加入到菌体中充分接触后获取样品的发光度RLUt，获取空白对照的发光度RLU0，计算发光抑制率(％)＝1‑RLUt/RLU0×100％，发光抑制率越高，细菌毒性越大；本发明的毒性测试过程简单快捷，金属有机框架纳米材料分散均匀的介质溶液，使得MOF材料的粒径和形貌在毒性测试接触时间内未发生变化，避免了由于纳米材料团聚而带来的误差，检测准确率高。

Description

利用发光细菌检测金属有机框架纳米材料毒性的方法及金属 有机框架纳米材料分散介质溶液
技术领域
本发明属于毒性检测技术领域，具体涉及一种利用发光细菌检测金属有机框架纳米材料毒性的方法及金属有机框架纳米材料分散介质溶液。
背景技术
金属有机框架(MOFs)作为一种新兴的纳米材料，由于其高比表面积、高孔隙率和可表面功能化等独特的性能而被广泛的应用于各个领域，其应用主要包括气体储存、有毒气体(如砷、磷化氢和三氟化硼)的捕获、药物的传输，半导体掺杂等。随着MOF市场的快速发展，全球MOF市场预计将在2026年达到8.38亿美元。从微塑料、内分泌干扰素等新型人为合成的化学品目前所造成的不良环境影响这一事实中吸取教训，对MOF这类新型纳米材料的环境风险与危害应及早进行评估。
目前常见的用于测定毒性的受体生物中发光细菌以其灵敏度高，相关性好，反应速度快，重复性高等优点广泛的应用于对地下水，污水、土壤等的毒性测试实验中。主要应用于毒性测试的发光细菌有：费氏弧菌(Vibrio fischeri)；明亮发光杆菌(Photobacteriumphosphoreum)以及青海弧菌Q67(Vibrio qinghaiensissp.-Q67)。细菌生物发光与呼吸过程直接相关，光发射的衰减是细菌代谢的抑制表现，这与被测物质的毒性水平正相关，因此发光细菌作为受试菌，已应用于金属氧化物纳米材料(如Fe2O3、 Co3O4、Cr2O3、TiO2、CeO2和NiO)和金属纳米粒子(如Au Ag)的快速毒理学测定。但是利用发光细菌对金属有机框架纳米材料的毒性测定相关的研究并未见报道。
纳米材料毒性测定的一大难点在于对纳米材料储备液的选择。目前纳米材料的储备液主要为细菌培养基和纯水。其中细菌培养基中含有蛋白质、各种盐类及可溶性有机化合物，这些都易于和纳米材料产生相互作用，会造成毒性结果误差大，重复性差等问题。此外，由于纳米材料具有极高的比表面积，在纯水等介质中可能会出现团聚状态，很难分散，因此纯水也不是作为纳米材料储备液的最佳选择。因此选择更好的易于分散的储备液对于毒性测定极为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用发光细菌检测金属有机框架纳米材料毒性的方法及金属有机框架纳米材料分散介质溶液，检测速度快，准确率高。
一种用于金属有机框架纳米材料毒性检测的分散介质溶液，作为金属有机框架纳米材料分散溶液的介质溶液为DMSO水溶液。
进一步，DMSO溶液的体积百分浓度为0.5～5％。
一种利用发光细菌检测金属有机框架纳米材料毒性的方法，包括以下步骤：
步骤(1)、细菌的培养：将活化好的发光细菌挑取单菌落接种于液体培养基中，经连续多次接种得到发酵种子液，得到的发酵种子液接种于液体培养基中，培养至对数生长期，收集培养物，菌体经离心后去除液体保藏待用；
步骤(2)、MOF材料的预处理：利用介质溶液溶解金属有机框架纳米材料，并逐级稀释到一定的浓度，超声处理后待用；
步骤(3)、细菌毒性测定：将经步骤(2)处理后的MOF材料溶液加入到步骤(1)的菌体中，震荡使得细菌与MOF纳米材料能充分接触后置于多功能检测仪获取样品的发光度RLUt，获取空白对照的发光度RLU0，计算发光抑制率(％) ＝1-RLUt/RLU0×100％，发光抑制率越高，细菌毒性越大。
进一步，所述步骤(1)中液体培养基按质量百分比包括以下组分：氯化钠1.5～4.5％，胰蛋白胨0.12～0.42％，酵母浸出液0.2～0.5％，甘油0.1～0.4％，磷酸氢二钠0.2～0.5％，磷酸二氢钾0.05～0.1％，余量为水。
进一步，所述步骤(1)中将活化好的发光细菌挑取单菌落接种于液体培养基中在22～25℃条件下培养12～14小时，连续多次接种得到发酵种子液；得到的发酵种子液接种于液体培养基中，培养至对数生长期，在OD595不低于0.85，发光度不低于2.5×107RLU后收集培养物，用氯化钠溶液冲洗3次，最终细菌密度为1.5×106～1.2×107CFU/mL后，菌体离心后去除液体保藏待用。
进一步，所述步骤(3)中将经步骤(2)处理后的MOF材料溶液加入到步骤(1)的菌体中震荡接触15min后置于多功能检测仪获取样品的发光度RLUt。
进一步，所述步骤(3)中每个样品设置3组，取平均值作为样品发光度RLUt。
进一步，所述步骤(1)中选用的发光细菌为明亮发光杆菌T3，选用的氯化钠浓度为1.5～4％。
进一步，所述步骤(2)中选用MOF材料是由六水硝酸钴和2-甲基咪唑合成的钴基有机框架纳米材料，六水硝酸钴：2-甲基咪唑混合时摩尔比为1:(2～10)；合成的MOF材料为正十二面体结构，粒径分布为100～1200nm。
进一步，所述步骤(3)中采用的空白对照为以2％v/v DMSO为介质溶液的菌体、
本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：
1、本发明的毒性测试过程简单快捷，MOF材料对发光细菌进行15分钟的充分接触即可快速得到毒性结果，进行毒性评估，提供一种新纳米材料毒性检测方法，检测准确率高。
2、本发明提供一种金属有机框架纳米材料分散均匀的介质溶液，使得MOF材料的粒径和形貌在毒性测试接触时间内未发生变化，能在该介质溶液中保持分散状态，使得测试获得的毒性结果是原始的MOF材料与细菌直接相互作用的结果，避免了由于纳米材料团聚而带来的误差。
附图说明
图1是本实施例合成的不同粒径的ZIF-67NPs的表征；
图2是本实施例2v/v/％DMSO处理15分钟后的ZIF-67NPs的表征；
图3是本实施例ZIF-67NPs在2v/v/％DMSO中的粒径分布；
图4是本实验例对不同浓度的DMSO的毒性试验的结果；
图5是本实验例对不同粒径大小的ZIF-67s对T3菌株的毒性测试结果；
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
以下结合实施例对本发明的具体内容做进一步详细解释说明。
实施例不同尺寸钴基有机框架(ZIF-67)纳米材料的毒性测定
实施例所涉及的实验仪器如下：扫描电子显微镜(SEM，德国蔡司)，x射线衍射仪(XRD,XRD-6100，日本岛津)，动态光散射仪(DLS,美国nanobook90Plus Zeta)，紫外分光光度计(UV2600A，中国尤尼柯)。ModulusTM单管多模读取器(Turner Biosystems,美国)，电感应耦合等离子体光发射光谱仪(ICPE-9000，日本岛津)。
实验用品如下：六水硝酸钴、2-甲基咪唑、聚乙烯吡咯烷酮，氯化钠购自上海泰坦有限公司。氯化钾、磷酸二钾、磷酸氢二钠、二甲亚砜、硝酸、三乙胺、甲醇购于中国国药化学试剂有限公司。酵母提取物、胰蛋白胨、甘油购自上海生工生物技术有限公司。
(1)ZIF-67s的合成：本实施例中用到了五种ZIF-67s：直径分别为100，200， 400，700，1200nm，西安交通大学，分别记作Z100，Z200，Z400，Z700，Z1200。参考文献(Zhang,W.；Jiang,X.；Wang,X et al.,Spontaneous Weaving of Graphitic Carbon NetworksSynthesized by Pyrolysis of ZIF-67Crystals.AngewChemInt Ed Engl 2017,56(29),8435-8440和Xia,W.；Zhu,J.；Guo,W et al.Well-defined carbon polyhedrons preparedfrom nano metal–organic frameworks for oxygen reduction.Journal of MaterialsChemistry A 2014,2(30),11606-11613)方法合成，具体过程如下：将六水硝酸钴(2mmol)和PVP(0.3mol)溶解在500mL的甲醇中，之后将2-甲基咪唑(0.2mmol) 和三乙胺(0.4mL)溶解在另500mL的甲醇中。两种溶液在磁力搅拌下混合10分钟，室温静置24小时。之后离心，甲醇洗涤三次，60℃下干燥，收集最终产物Z100。 Z1200的合成过程与Z100的基本一致，合成配方中没有三乙胺。其他粒径的ZIF-67 (Z200,Z400,Z700)是根据Xia等人的方法合成的。通常，在60℃下将六水硝酸钴 (1.436g)和2-甲基咪唑(3.244g)分别溶解在100mL的甲醇，将钴盐溶液加入到配体溶液中，充分搅拌反应后离心，甲醇洗涤，120℃下真空干燥12小时得到Z400。将反应温度调到25℃，Z200的合成过程与Z400的相似。Z700的合成过程如下，六水硝酸钴(4.0mmol)和2-甲基咪唑(8.0mmol)分别溶解在50mL甲醇中，室温条件下剧烈搅拌，钴盐溶液加入到配体溶液，搅拌20分钟，并静置放置一天。离心收集沉淀物，用乙醇洗涤，60℃下真空干燥，得到Z400。合成的不同粒径的ZIF-67NPs 的表征如图1所示。
(2)ZIF-67在2％DMSO中的稳定性试验
将上述合成的五种ZIF-67s材料溶解于2％v/v二甲基亚砜(DMSO)中，逐级稀释到一定的浓度(0.5～20mg/L)备用，毒性测试之前采用超声处理(30KHz，30分钟)。ZIF-67材料在2％v/v DMSO介质中接触1小时之后的物理化学表征如图2和图 3所示。
(3)细菌的培养
明亮发光杆菌T3(Photobacteriumphosphorem T3),购自中国微生菌种保藏中心。种子培养基：NaCl 30.0g，酵母浸出液5.0g，胰蛋白胨5.0g，Na2HPO4 5.0g，KH2PO4 1.0g，甘油3.0g，将其溶解于1000mL超纯水中，调节pH为6.8，121℃高温灭菌 25min后备用。无菌条件下，固体培养基上挑单菌置于液体培养基，培养至对数期，连续多次接种，待细菌生长状态稳定后扩大培养。扩大培养12h后(22±1℃，150rpm)， T3的OD595达到0.85±0.05，发光度达到6.5×107RLU，利用该时期的菌体进行毒性测定。
(4)DMSO的毒性检测：首先测定了不同浓度DMSO(1％-50％)溶液的毒性，震荡使得细菌与DMSO充分接触。二者接触15min后置于ModulusTM单管型多功能检测仪，读数。每个样品3组平行，取平均值作为样品发光度(RLUt)，无菌水溶液为空白对照，发光度记作RLU0，并计算发光抑制率(％)＝1-RLUt/RLU0×100％。毒性测试结果如图4所示。
(5)ZIF-67纳米材料的毒性检测：将含有一定ZIF-67s的2％v/v DMSO溶液加入到菌体中，多次重悬使得细菌与ZIF-67纳米材料能充分接触。二者接触15min 后置于ModulusTM单管型多功能检测仪，读数。每个样品3组平行，取平均值作为样品发光度(RLUt)，2％v/v DMSO溶液为空白对照，发光度记作RLU0，并计算发光抑制率(％)＝1-RLUt/RLU0×100％。毒性测试结果如图5所示。
实验结果分析：
如图1所示，合成的ZIF-67NPs的表征。不同粒径的ZIF-67s的SEM图像，Z100 (A)、Z200(B)、Z400(C)、Z700(D)和Z1200(E)。合成的ZIF-67NPs的XRD 图谱与ZIF-67的标准模拟谱图的比对(F)。
如图2所示，2v/v/％DMSO处理15分钟后的ZIF-67NPs的特征。不同粒径的 ZIF-67NPs的SEM图像，(A)Z100，(B)Z200，(C)Z400，(D)Z700和(E)Z1200。 (F)ZIF-67s的紫外-可见吸收光谱，(G)ZIF-67s的XRD光谱，(H)ZIF-67s在2％DMSO 介质中15分钟后，释放的Co2+占总钴含量的百分比。2％DMSO介质中钴离子的释放量分别为1.64％、1.58％、1.31％、0.87％和1.23％，均低于2％。ZIF-67s在2％v/v DMSO 溶液中接触1小时之后所得到的粒径形貌与图1并没有明显的差别，ZIF-67NPs的胶体稳定性证实了在2％DMSO中ZIF-67s的晶体大小与图1所示并无差别。
如图3所示，ZIF-67NPs在2v/v/％DMSO中的粒径分布，分散性好
如图4所示,本发明引入DMSO作为介质溶液帮助ZIF-67NPs的溶解。不同浓度的DMSO的毒性试验的结果。当DMSO浓度低于10％v/v时并不会产生明显的细菌毒性，考虑最终的ZIF-67s的浓度，选择2％DMSO作为储备液。
如图5所示，不同粒径大小的ZIF-67s对T3菌株表现出浓度依赖性的毒性效应。ZIF-67NPs(Z100、Z200、Z400、Z700和Z1200)在5mg/L的浓度时发光抑制率分别为63.62％，49.95％，42.27％，41.64％，41.08％。低浓度下(<10mg/L)，粒径较小的ZIF-67s(D100和D200)对T3菌株表现出更大的毒性，而当粒径大于400nm时，毒性没有明显变化。所有的ZIF-67s在20mg/L的浓度下都表现出强烈的毒性，发光抑制率高达80％。
由以上实施例的结果发现，本实验所采用的方法以2％v/v DMSO为介质溶液，将不同粒径的ZIF-67的毒性进行了确定。2％v/v DMSO与ZIF-67s接触15～60分钟后，100-1200nm粒径区间的ZIF-67s都可以维持粒径形貌基本没有变化，可以保证毒性测定的结果是ZIF-67s自身原形和细菌相互作用的结果，而不是ZIF-67s团聚之后得到的结果，从而更能体现出不同粒径对细菌的生物毒性。上述具体实施例详细说明了本发明的技术方案与优势，但该发明并不局限于钴基有机框架纳米材料 (ZIF-67)，此技术方案的实现也包括其余的MOF材料，如ZIF-8等。所选的发光细菌也不仅限于明亮发光杆菌T3，也包括费氏弧菌，青海弧菌等发光细菌。因此，以上所述仅为本发明的其中一实施例，并不用以限制本发明。

Claims (10)

1.一种用于金属有机框架纳米材料毒性检测的分散介质溶液，其特征在于：作为金属有机框架纳米材料分散溶液的介质溶液为DMSO水溶液。
2.根据权利要求1所述的用于金属有机框架纳米材料毒性检测的分散介质溶液，其特征在于：DMSO溶液的体积百分浓度为0.5～5％。
3.一种利用发光细菌检测金属有机框架纳米材料毒性的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤(1)、细菌的培养：将活化好的发光细菌挑取单菌落接种于液体培养基中，经连续多次接种得到发酵种子液，得到的发酵种子液接种于液体培养基中，培养至对数生长期，收集培养物，菌体经离心后去除液体保藏待用；
步骤(2)、MOF材料的预处理：利用权利要求1或2所述的介质溶液溶解金属有机框架纳米材料，并逐级稀释到一定的浓度，超声处理后待用；
步骤(3)、细菌毒性测定：将经步骤(2)处理后的MOF材料溶液加入到步骤(1)的菌体中，震荡使得细菌与MOF纳米材料能充分接触后置于多功能检测仪获取样品的发光度RLUt，获取空白对照的发光度RLU0，计算发光抑制率(％)＝1-RLUt/RLU0×100％，发光抑制率越高，细菌毒性越大。
4.根据权利要求3所述的利用发光细菌检测金属有机框架纳米材料毒性的方法，其特征在于：所述步骤(1)中液体培养基按质量百分比包括以下组分：氯化钠1.5～4.5％，胰蛋白胨0.12～0.42％，酵母浸出液0.2～0.5％，甘油0.1～0.4％，磷酸氢二钠0.2～0.5％，磷酸二氢钾0.05～0.1％，余量为水。
5.根据权利要求4所述的利用发光细菌检测金属有机框架纳米材料毒性的方法，其特征在于：所述步骤(1)中将活化好的发光细菌挑取单菌落接种于液体培养基中在22～25℃条件下培养12～14小时，连续多次接种得到发酵种子液；得到的发酵种子液接种于液体培养基中，培养至对数生长期，在OD595不低于0.85，发光度不低于2.5×107RLU后收集培养物，用氯化钠溶液冲洗3次，最终细菌密度为1.5×106～1.2×107CFU/mL后，菌体离心后去除液体保藏待用。
6.根据权利要求3所述的利用发光细菌检测金属有机框架纳米材料毒性的方法，其特征在于：所述步骤(3)中将经步骤(2)处理后的MOF材料溶液加入到步骤(1)的菌体中震荡接触15min后置于多功能检测仪获取样品的发光度RLUt。
7.根据权利要求3所述的利用发光细菌检测金属有机框架纳米材料毒性的方法，其特征在于：所述步骤(3)中每个样品设置3组，取平均值作为样品发光度RLUt。
8.根据权利要求3所述的利用发光细菌检测金属有机框架纳米材料毒性的方法，其特征在于：所述步骤(1)中选用的发光细菌为明亮发光杆菌T3，选用的氯化钠浓度为1.5～4％。
9.根据权利要求3所述的利用发光细菌检测金属有机框架纳米材料毒性的方法，其特征在于：所述步骤(2)中选用MOF材料是由六水硝酸钴和2-甲基咪唑合成的钴基有机框架纳米材料，六水硝酸钴：2-甲基咪唑混合时摩尔比为1:(2～10)；合成的MOF材料为正十二面体结构，粒径分布为100～1200nm。
10.根据权利要求3所述的利用发光细菌检测金属有机框架纳米材料毒性的方法，其特征在于：所述步骤(3)中采用的空白对照为以2％v/v DMSO为介质溶液的菌体。
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CN113583909A (zh) * 2021-07-29 2021-11-02 西安交通大学 一种用于重金属毒性测定的明亮发光杆菌培养基及其应用

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