CN116953262A - 基于电活性聚合物和磁分离的电化学适体传感器及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于电活性聚合物和磁分离的电化学适体传感器、构建方法及应用，属于纳米材料、电化学分析与疾病诊断和传感技术领域。本发明的适体传感器通过电化学介导原子转移自由基聚合反应(eATRP)生成长链的电活性聚合物材料作为信号标签，结合适配体功能化的磁球作为特异性识别元件来实现心肌肌钙蛋白的检测，其具有线性范围宽，检出限低，特异性好，抗干扰能力强的优点。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料、电化学分析与疾病诊断和传感技术领域，更具体地说，本发明涉及基于电活性聚合物和磁分离的电化学适体传感器及其构建方法和应用，特别是在对心血管疾病标志物心肌肌钙蛋白检测中的应用。
背景技术
心血管病是全球范围内死亡率最高的疾病之一，被称为“人类健康的第一杀手”。据世界卫生组织报告统计，2019年约有1790万人死于心血管病，占全球总死亡人数的32％，到2030年，人数将超过2330万。《中国心血管健康与疾病报告2021》指出，我国心血管病现患人数约3.3亿，在人口老龄化和代谢危险因素持续流行的双重压力下，心血管病负担仍将持续增加。实现心血管病的早期诊断可以减少并发症和复发风险，有效缓解医疗保健系统经济负担，加快推动健康中国建设。心肌肌钙蛋白(cardiac troponin，cTn)作为心血管病临床诊断的黄金标志物，其含量的改变可以准确且快速地反映疾病的状态和进程。因此，对cTn的快速和精准检测是迫切需要的。但是，现有的检测方法在临床复杂样品检测中存在灵敏度和抗干扰能力不足等问题。
核酸适配体是通过指数配体富集进化技术(SELEX)筛选得到的对特定物质(小分子化合物、蛋白质、细胞、离子等)具有高度亲和性的一段单链DNA或者RNA。相对于免疫识别检测技术，适配体因具有易合成、化学性质稳定、易于修饰、无免疫原性、价格低廉等优势在生物传感领域得到快速发展。基于适配体建立的生物传感检测体系具有灵敏度高、特异性强等优点。与此同时，为了提高检测性能，各种信号放大技术，如聚合反应、杂交链式反应、滚环扩增反应、纳米材料技术等被应用于生物传感领域。其中，原子转移自由基聚合反应(Atom Transfer Radical Polymerization，ATRP)是以简单的有机卤化物为引发剂、过渡金属配合物为催化剂，通过原子转移机理，在活性种与休眠种之间建立可逆的动态平衡，通过快引发、慢增长、降低自由基浓度，从而实现了对自由基聚合反应的可控。ATRP具有反应进程可控、反应单体广泛等优点，该概念最早于1995年由Matyjaszewski教授提出后在短短二十几年的时间里迅速成为高分子合成领域的研究前沿，其在生物传感中的应用也得到科研工作者的青睐。
基于上述理由，提出本申请。
发明内容
基于上述理由，针对现有检测方法在临床复杂样品检测中灵敏度和抗干扰能力不足等问题，本发明的目的在于提供一种基于电活性聚合物和磁分离的电化学适体传感器及其构建方法和应用，用于心血管疾病标志物心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)的识别和检测。
为了实现本发明的上述第一个目的，本发明采用的技术方案如下：
一种基于电活性聚合物和磁分离的电化学适体传感器(体系)，所述适体传感器包括捕获载体、捕获探针修饰的电极、点击反应溶液和混合底液，其中：所述捕获载体为适配体功能化磁球MBs-A-DNA/T-DNA；所述捕获探针为单链C-DNA。
本发明的第二个目的在于提供上述所述基于电活性聚合物材料和磁分离的电化学适体传感器的构建方法，所述方法包括如下步骤：
(1)制备捕获载体(适配体功能化磁球MBs-A-DNA/T-DNA)
将洗净后的磁球置于EDC/NHS混合液中振荡反应，以活化磁球表面的羧基；然后按配比将核酸适配体DNA(A-DNA)溶液和引发DNA(T-DNA)溶液在37℃下孵育，得到A-DNA/T-DNA复合物；再将所述A-DNA/T-DNA复合物加入到所述羧基活化的磁球中，继续在37℃下孵育，得到适配体功能化磁球(MBs-A-DNA/T-DNA)；
(2)制备捕获探针C-DNA修饰的电极
将裸金电极(GE)的表面打磨、清洗干净、活化后浸入C-DNA溶液中培养一段时间，最后用巯基己醇(MCH)封闭，得到所述的捕获探针C-DNA修饰的电极；
(3)制备点击反应溶液
将引发剂溴代异丁酸丙炔酯(PBIB)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得到PBIB溶液；然后按配比向所述PBIB溶液中依次加入硫酸铜(CuSO4)溶液、抗坏血酸(AA)溶液，得到所述点击反应溶液；
(4)制备混合底液
按配比将CuBr/Me6TREN配合物、单体二茂铁甲醇异丁烯酸酯(FMMA)、六氟磷酸钾(KPF6)、溴化钾(KBr)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)混匀即可。
进一步地，上述技术方案步骤(1)中，所述磁球是羧基化三氧化二铁微球和/或四氧化三铁微球。
进一步地，上述技术方案步骤(1)中，所述EDC/NHS混合液由1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)均匀混合而成，所述EDC/NHS混合液所起的作用是将羧基化三氧化二铁微球或四氧化三铁微球进行活化。
更进一步地，上述技术方案，在本发明的一个优选实施例中，所述EDC/NHS混合液中EDC与NHS的摩尔比为1：1。
进一步地，上述技术方案步骤(1)，在本发明的一个优选实施例中，所述核酸适配体DNA，其序列为：
5′-NH2-(CH2)6-CGTGCAGTACGCCAACCTTTCTCATGCGCTGCCCCTCTT A-3′，其主要作用为特异性识别复杂样品中的目标物。
具体地，上述技术方案，所述核酸适配体DNA包括能与心肌肌钙蛋白I(cTnI)特异性结合的人工合成核苷酸序列1(SEQ ID NO.1)以及修饰基团，其中：所述修饰基团为5′端修饰的NH2-(CH2)6-。
进一步地，上述技术方案步骤(1)，在本发明的一个优选实施例中，所述引发DNA，其序列具体如下：
5′-N3-TAAGAGGGGCAGCGCATGAGAAAGGTTGGCGTACTGCACG-3′。其主要作用是通过与捕获探针(简称C-DNA)杂交连接至电极表面，进一步通过点击反应将引发剂溴代异丁酸丙炔酯(PBIB)标记在其末端。
具体地，上述技术方案，所述引发DNA包括能与捕获探针结合的人工合成核苷酸序列2(SEQ ID NO.2)以及修饰基团，其中：所述修饰基团为5′端修饰的N3-。
更进一步地，上述技术方案，在本发明的一个优选实施例中，所述A-DNA与T-DNA的摩尔用量比为1：1。
进一步地，上述技术方案步骤(1)中，所述A-DNA与T-DNA在37℃下孵育的时间为10-60min。在本发明的一个优选实施例中，所述孵育的时间为30min。
进一步地，上述技术方案步骤(1)中，所述A-DNA/T-DNA复合物的序列具体如下：
5′-NH2-(CH2)6-CGTGCAGTACGCCAACCTTTCTCATGCGCTGCCCCTCTT A-3′/5′-N3-TAAGAGGGGCAGCGCATGAGAAAGGTTGGCGTACTGCACG-3′。
更进一步地，上述技术方案步骤(1)，在本发明的优选实施例中，所述A-DNA/T-DNA复合物与所述羧基活化的磁性微球在37℃下孵育的时间为1-2h。
进一步地，上述技术方案步骤(2)中，所述捕获探针C-DNA的序列如下：
5′-SH-(CH2)6-TTTTCGTGCAGTACGCCAACC-3′。
具体地，上述技术方案，所述C-DNA包括能与引发DNA结合的人工合成核苷酸序列3(SEQ ID NO.3)以及修饰基团，其中：所述修饰基团为5′端修饰的SH-(CH2)6-。
进一步地，上述技术方案步骤(2)中，所述活化采用的底液是稀硫酸溶液。
进一步地，上述技术方案步骤(2)中，所述封闭的时间为30-90min。
进一步地，上述技术方案步骤(3)中，所述溴代异丁酸丙炔酯、硫酸铜与抗坏血酸的用量比为1：1：2。在本发明的一个优选实施例中，所述点击反应溶液中PBIB的浓度为0.1mmol/L，所述CuSO4的浓度为0.1mmol/L，所述AA的浓度为0.2mmol/L。
进一步地，上述技术方案步骤(4)中，所述CuBr/Me6TREN配合物采用下述方法配制而成：称取一定量的溴化铜(CuBr2)和三(2-二甲氨基乙基)胺(Me6TREN)分别用超纯水溶解，得到CuBr2溶液和Me6TREN溶液；然后将二者等体积混合均匀得到蓝色的溴化铜/三(2-二甲氨基乙基)胺(CuBr/Me6TREN)配合物溶液。
更进一步地，上述技术方案，在本发明的一个优选实施例中，所述CuBr2溶液的浓度为20mmol/L，所述Me6TREN溶液的浓度为22mmol/L，制备得到的CuBr/Me6TREN配合物溶液中CuBr/Me6TREN配合物的浓度为10mmol/L。
进一步地，上述技术方案步骤(4)中，所述混合底液中CuBr/Me6TREN配合物与FMMA、KPF6、KBr的用量比为1：1：(5-10)：1。在本发明的一个优选实施例中，所述混合底液中CuBr/Me6TREN配合物的浓度为0.02～0.2mmol/L、单体FMMA的浓度为0.02～0.2mmol/L、KPF6的浓度为0.1-2mol/L、KBr的浓度为0.02～0.2mol/L。例如，所述单体FMMA的浓度可以为0.02mmol/L、0.04mmol/L、0.06mmol/L、0.08mmol/L、0.10mmol/L、0.12mmol/L、0.16mmol/L等等。
本发明上述采用的各原料在本发明中所起的作用以及本发明涉及的反应原理如下：CuBr/Me6TREN配合物为催化剂，在恒电位下，得到电子生成CuⅠ/Me6TREN，它可以催化PBIB中C-Br键的断裂产生自由基，该自由基可以进一步与电活性单体FMMA的C＝C双键发生加成反应产生新的自由基，新的自由基不断与单体FMMA聚合从而产生电活性聚合物长链作为信号探针。
本发明的第四个目的在于提供上述所述基于高性能电活性聚合物材料和磁分离的电化学适体传感器在心血管疾病标志物心肌肌钙蛋白检测中的应用。
上述所述电化学适体传感器在心血管疾病标志物心肌肌钙蛋白检测中的应用，具体应用方法如下：
(A)将捕获载体适配体功能化磁球MBs-A-DNA/T-DNA与目标物心肌肌钙(cTn)蛋白进行培养，释放出引发DNA(T-DNA)作为次级目标物，经过磁分离后收集T-DNA溶液；然后将捕获探针(C-DNA)修饰的电极浸入所述T-DNA溶液中，所述T-DNA杂交C-DNA连接至电极表面；进一步与点击反应溶液反应在电极表面连接PBIB，最后将表面连接PBIB的电极置于混合底液中在恒电位下进行电化学介导的原子转移自由基聚合反应生成电活性聚合物材料；
(B)将经过聚合反应的电极放入含有高氯酸锂(LiClO4)的电解质溶液中通过方波伏安技术(SWV)进行电流-电位扫描得到电流信号变化情况。
进一步地，上述技术方案步骤(A)中，所述恒电位为-0.1～-1.0V，例如可以为-0.45V、-0.5V、-0.55V、-0.6V、-0.65V等等；所述聚合时间为5-60min，以为5min，10min，20min，30min，40min，50min，60min等等。在本发明的一个优选实施例中，所述恒电位为-0.55V，聚合时间为30min。
进一步地，上述技术方案步骤(A)，在本发明的一个优选实施例中，所述点击反应是在37℃条件下进行，点击反应的时间为1h。
具体地，上述技术方案，步骤(A)中电活性聚合物材料的性能调控：改变步骤(A)中所施加电位的大小，聚合反应的时间长短及单体的浓度来调控聚合反应的过程和进行的程度，实现电活性聚合物材料的可控生长，改变其电化学性能。
进一步地，上述技术方案步骤(B)中，所述含有高氯酸锂的电解质溶液中LiClO4的浓度为0.1～1.0mol/L，在本发明的一个优选实施例中，所述LiClO4的浓度为0.5mol/L。
进一步地，上述技术方案步骤(B)，在本发明的一个优选实施例中，扫描的起始电位为-0.2V，终止电位为0.6V，增长电位为0.004V，振幅为0.025V，频率为15HZ。
相比于传统的检测方法，电化学检测方法有灵敏度高和选择性好的突出优点，且成本较低，仪器操作简单，因此在传感检测领域显示出巨大的潜力。为了提高传感器的质量，一方面，本发明通过制备高性能的电活性材料提供快的信号转换效率，产生稳定的电流信号；另一方面，本发明将磁分离技术与电化学检测相结合，提高传感器在复杂体系中的抗干扰能力，从而实现高灵敏度和高准确性的检测。因此本发明制备了基于电活性聚合物材料和磁分离的电化学适体传感器用于心血管疾病标志物心肌肌钙蛋白的检测。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)采用电化学介导的原子转移自由基聚合反应制备高性能电活性聚合物材料作为信号探针，相比传统的纳米材料标签和酶标签，具有更简单的制备过程和更低的成本。
(2)仅仅通过调控施加电位的大小和施加电位时间即可调控电活性聚合物的生长，从而调控其电化学性能。
(3)将磁分离技术与电化学分析方法相结合，借助磁球高效的分离富集能力，不仅提高了适配体与目标物的识别效率，还提高了传感器在复杂基质的抗干扰能力。
(4)集成高性能的电活性聚合物材料和磁分离技术构建电化学适体传感器，同时确保了检测结果的灵敏度和准确性。
(5)本发明的电化学分析方法实现了对心肌肌钙蛋白的检测，采用的仪器廉价便携，传感器的制备方法简单易行，信号响应快速和具有较高的灵敏度，检测限低至74.4fg·mL-1。
(6)本发明的电化学分析方法可以用于实际样品检测，并且该传感器的制备方法的设计思路为开发相似类型的传感器用于识别其他目标分析物的检测提供了巨大帮助，具有很好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明制备传感器的过程及应用检测过程；
图2中A图和B图分别为本发明实施例1采用的磁球和适配体功能化磁球MBs-A-DNA/T-DNA的Zeta电势和水合粒径分布图；
图3为本发明实施例2的聚合反应可行性和不同扫速下的循环伏安图及对应的峰电流线性图；
图4为其他物质对传感器检测cTnI的干扰。其中cTnI分析物的浓度为1.0ng·mL-1，其他物质的浓度为10ng·mL-1。
图5为传感器检测cTnI的重现性。其中分析物cTnI的浓度为1.0ng·mL-1。
图6为传感器检测cTnI的电流响应图和相应的线性图；其中：cTnI的浓度a-f分别为0.1,1,10,100,1000,10000pg·mL-1。
具体实施方式
本发明公开了一种基于电活性聚合物材料和磁分离的电化学适体传感器及其构建方法和在检测心血管疾病标志物心肌肌钙蛋白中的应用。本发明的适体传感器通过电化学介导原子转移自由基聚合反应(eATRP)生成长链的电活性聚合物材料作为信号标签，结合适配体功能化的磁球作为特异性识别元件来实现心肌肌钙蛋白的检测，其具有线性范围宽，检出限低，特异性好，抗干扰能力强的优点，在对心肌肌钙蛋白的检测中，检出限低至74.4fg·mL-1，且在复杂体系中仍具有良好的检测能力。
参见本申请图1可知，本发明通过结合电活性聚合物材料和磁分离技术构建电化学适体传感器用于心血管疾病标志物灵敏检测。适配体功能化的磁球对目标物心肌肌钙蛋白的识别具有高度特异性，可实现复杂样品中心肌肌钙蛋白的高效分离和富集，减少共存组分的干扰，确保了检测结果的准确性。电化学介导的自由基聚合反应可实现电活性聚合物材料的可控生长，通过施加电位、聚合时间、单体浓度调控聚合物材料电化学性能，以此作为信号探针实现心肌肌钙蛋白灵敏检测。
下面通过实施案例对本发明作进一步详细说明。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
本发明中所采用的设备和原料等均可从市场购得，或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
下述实施例中采用的核酸适配体DNA，简称A-DNA，其序列为：5′-NH2-(CH2)6-CGTGCAGTACGCCAACCTTTCTCATGCGCTGCCCCTCTTA-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并经高效液相色谱纯化，其主要作用为特异性识别复杂样品中的目标物。
下述实施例中采用的引发DNA，简称T-DNA，其序列具体为5′-N3-TAAGAGGGGCAGCGCATGAGAAAGGTTGGCGTACTGCACG-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并经高效液相色谱纯化。
下述实施例中采用的捕获探针C-DNA的序列如下：
5′-SH-(CH2)6-TTTTCGTGCAGTACGCCAACC-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并经高效液相色谱纯化。
下述实施例中采用的磁性微球，又名羧基磁珠，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号是L1916010。
实施例1
本实施例的一种适配体功能化磁球MBs-A-DNA/T-DNA的制备，制备过程如下：
本发明中使用的适配体功能化磁球是参照了Luo Fanwei等在文献(Single-Particle Electrochemical Biosensor with DNA Walker Amplification forUltrasensitive HIV-DNACounting，Luo Fanwei et al，Analytical Chemistry,2021,93,4506-4512)中报道的方法并做了稍微的改动。具体方法是：首先将40μL磁性微球在磁力架上用0.01M磷酸盐缓冲溶液清洗几遍，然后向其中加入浓度均为50mmol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合液进行羧基活化；同时，将50μL 20μmol/L的适配体DNA(简称A-DNA，序列为5′-NH2-(CH2)6-CGTGCAGTACGCCAACCT)TTCTCATGCGCTGCCCCTCTTA-3′)与50μL 20μmol/L的另一引发DNA(简称T-DNA，序列为5′-N3-TAAGAGGGGCAGCGCATGAGAAAGGTTGGCGTACTGC ACG-3′)在37℃恒温培养箱中反应一小时得到A-DNA/T-DNA复合物(序列为5′-NH2-(CH2)6-CGTGCAGTACGCCAACCTTTCTCATGCGCTGCCCCTCTTA-3′/5′-N3-TAAGAGGGGCAGCGCATGAGAAAGGTTGGCGTACTGCACG-3′)；然后将100μL的A-DNA/T-DNA复合物加入到活化后的磁球溶液中37℃反应一小时得到适配体功能化磁球(MBs-A-DNA/T-DNA)。图2中A图和B图分别为本发明实施例1采用的磁球和适配体功能化磁球MBs-A-DNA/T-DNA的Zeta电势和水合粒径分布图。由Zeta电势和水合粒径分布测试可知，磁球(MBs)的Zeta电势和水合粒径分别为-30.5mV和380.3nm，当其表面连接A-DNA/T-DNA后，Zeta电势和水合粒径分别变为-35.6mV和420nm，表明MBs大的表面积为A-DNA/T-DNA的连接提供了丰富的结合位点，证实MBs-A-DNA/T-DNA复合物的成功制备。
实施例2电活性聚合物材料制备，制备过程如下：
本发明中使用的电活性聚合物材料是参照了Hu Qiong等在文献(Electrochemically Mediated Surface-Initiated de Novo Growth of Polymers forAmplified Electrochemical Detection of DNA，Hu Qiong et al,AnalyticalChemistry,2017,89,9253-9259)中报道的方法并做了稍微的改动。具体是将捕获探针(C-DNA)修饰的电极浸入T-DNA溶液中，将T-DNA连接至电极表面；进一步将电极浸入包含聚合反应引发剂溴代异丁酸丙炔酯(PBIB)的点击反应溶液中通过点击反应连接PBIB，随后将电极浸入聚合反应底液中在恒电位下进行电活性聚合物材料的制备。聚合反应底液的组成为0.1mmol/L空气稳定的CuIBr/Me6TREN，0.1mmol/L单体FMMA，0.1mol/L KBr，0.7mol/L KPF6和一定体积DMF。聚合反应的施加电位为-0.55V，聚合时间为30min。
设置四个对照实验验证聚合反应的成功发生，由图3A可以看到，仅当所有试剂均存在时，电活性聚合材料成功制备，产生一个较强的峰电流(约18.74μA)，而其它对照组的峰电流可忽略不计。在不同扫速下，对聚合材料修饰电极进行循环伏安扫描，如图3B，C所示，可以看到随着扫速从10mV/s增加到1000mV/s，峰电流逐渐增加，以氧化峰电流强度和还原峰电流强度分别对扫速作图，可以得到良好的线性关系，线性方程分别为I(μA)＝44.86U(V/s)+1.76和I(μA)＝-24.78U(V/s)-0.41，表明该过程是一个非扩散控制过程，证实电活性聚合材料成功连接在电极表面。
实施例3基于电活性聚合物材料和磁分离的电化学适体传感器的构建过程如下：
向MBs-A-DNA/T-DNA里面加入200μL包含不同浓度的cTnI溶液，37℃下反应一小时，在此过程中，MBs-A-DNA/T-DNA中的A-DNA与cTnI特异性结合，释放T-DNA到溶液中作为次级目标物，经过磁力架磁分离后收集T-DNA溶液。将捕获探针(C-DNA)修饰的金电极浸入T-DNA溶液，37℃下培养一小时得到T-DNA/C-DNA/GE。随后将修饰电极浸入200μL引发剂溶液(包含PBIB 0.1mmol/L，CuSO4 0.1mmol/L，AA0.2mmol/L)中37℃下反应一小时得到PBIB/T-DNA/C-DNA/GE。随后将电极浸入聚合反应底液(CuBr/Me6TREN 0.1mmol/L，FMMA0.1mmol/L，KPF6 0.7mol/L，KBr 0.1mol/L)中在恒电位-0.55V下聚合30min得到电活性聚合物材料作为信号探针，以此得到基于电活性聚合物材料和磁分离的电化学适体传感器。
实施例4电化学适体传感器对cTnI的特异性检测，检测过程如下：
通过实施案例1的过程制备MBs-A-DNA/T-DNA复合物，向其中加入200μL 10ng·mL-1的干扰蛋白人血清白蛋白(HSA)，37℃下反应一小时，经过磁力架磁分离后收集上溶液。将捕获探针(C-DNA)修饰的金电极浸入上清液中，37℃下培养一小时，随后浸入200μL引发剂溶液(包含PBIB 0.1mmol/L，CuSO4 0.1mmol/L，AA0.2mmol/L)中37℃下反应一小时，最后将电极浸入聚合反应底液(CuBr/Me6TREN 0.1mmol/L，FMMA0.1mmol/L，KPF6 0.7mol/L，KBr0.1mol/L)中在恒电位-0.55V下聚合30min，并通过方波伏安法采集电流信号。对于其它干扰蛋白的检测步骤同上，只是将人血清白蛋白(HSA)分别更换为人黏蛋白1(MUC1)、前列腺特异性抗原(PSA)、葡萄糖氧化酶(GOx)、凝血酶(TB)。结果如图4所示，干扰物质的电流强度分别为3.3μA、3.4μA、3.6μA、3.8μA、3.2μA，传感器对目标物组(12.1μA)有明显强于干扰组的电流响应，结果表明传感器对目标物组有明显强于干扰组的电流响应，结果表明传感器对cTnI检测有很好的选择性。
实施例5电化学适体传感器对cTnI的重现性检测，检测过程如下：
通过实施案例1的过程制备MBs-A-DNA/T-DNA复合物，向其中加入200μL1.0ng·mL-1的目标蛋白心肌肌钙蛋白(cTnI)，37℃下反应一小时，经过磁力架磁分离后收集上溶液。将捕获探针(C-DNA)修饰的金电极浸入上清液中，37℃下培养一小时，随后浸入200μL引发剂溶液(包含PBIB 0.1mmol/L，CuSO4 0.1mmol/L，AA0.2mmol/L)中37℃下反应一小时，最后将电极浸入聚合反应底液(CuBr/Me6TREN 0.1mmol/L，FMMA0.1mmol/L，KPF6 0.7mol/L，KBr 0.1mol/L)中在恒电位-0.55V下聚合30min，并通过方波伏安法采集电流信号。在六根不同的电极上重复上述步骤，得到六个独立的传感器，对比其电流信号。
图5是分别采用六根不同电极对1.0ng·mL-1心肌肌钙蛋白检测结果，验证方法的重现性。由图可知六根电极的电流强度分别为12.07，11.96，12.47，12.75，12.58和12.19μA，计算可得六根不同电极的相对标准偏差不超过2.5％，表明构建的传感器的方法具有很好的重现性。
实施例6电化学适体传感器对不同浓度cTnI的检测，检测过程如下：
通过实施案例1的过程制备MBs-A-DNA/T-DNA复合物，向其中加入200μL0.1pg·mL-1的目标蛋白心肌肌钙蛋白(cTnI)，37℃下反应一小时，经过磁力架磁分离后收集上溶液。将捕获探针(C-DNA)修饰的金电极浸入上清液中，37℃下培养一小时，随后浸入200μL引发剂溶液(包含PBIB 0.1mmol/L，CuSO4 0.1mmol/L，AA0.2mmol/L)中37℃下反应一小时，最后将电极浸入聚合反应底液(CuBr/Me6TREN 0.1mmol/L，FMMA0.1mmol/L，KPF6 0.7mol/L，KBr 0.1mol/L)中在恒电位-0.55V下聚合30min，并通过方波伏安法采集电流信号。重复上述实验，将目标蛋白心肌肌钙蛋白(cTnI)的浓度分别替换为1,10,100,1000,10000pg·mL-1，采集相应电流信号。如图6所示，电流响应随着cTnI浓度的增加而增加，六个浓度对应的电流强度分别为6.48μA，7.60μA，9.34μA，10.83μA，12.07μA和13.6μA。以电流强度对浓度的对数作图，其相应线性关系为I＝1.44lg(c,pg·mL-1)+7.82，且其检测限低至74.4fg·mL-1，表明构建的传感器对心肌肌钙蛋白检测具有好的灵敏度。
综上所述，本实施例设计的基于电活性聚合物材料和磁分离的电化学适体传感器，具有灵敏度高、选择性好的优点，并且对其他相关的物质具有较强的抗干扰能力，最重要是其可以用来检测心血管疾病标志物心肌肌钙蛋白。因此，本发明提供的设计思路可能为开发识别其他目标分析物的超灵敏电化学适体传感器提供了巨大帮助。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (10)
1.一种基于高性能电活性聚合物材料和磁分离的电化学适体传感器，其特征在于：所述适体传感器包括捕获载体、捕获探针修饰的电极、点击反应溶液和混合底液，其中：所述捕获载体为适配体功能化磁球MBs-A-DNA/T-DNA；所述捕获探针为单链C-DNA。
2.权利要求1所述的电化学适体传感器的构建方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)制备捕获载体(适配体功能化磁球MBs-A-DNA/T-DNA)
将洗净后的磁球置于EDC/NHS混合液中振荡反应，以活化磁球表面的羧基；然后按配比将核酸适配体DNA(A-DNA)溶液和引发DNA(T-DNA)溶液在37℃下孵育，得到A-DNA/T-DNA复合物；再将所述A-DNA/T-DNA复合物加入到所述羧基活化的磁球中，继续在37℃下孵育，得到适配体功能化磁球(MBs-A-DNA/T-DNA)；
(2)制备捕获探针C-DNA修饰的电极
将裸金电极(GE)的表面打磨、清洗干净、活化后浸入C-DNA溶液中培养一段时间，最后用巯基-己醇(MCH)封闭，得到所述的捕获探针C-DNA修饰的电极；
(3)制备点击反应溶液
将引发剂溴代异丁酸丙炔酯(PBIB)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得到PBIB溶液；然后按配比向所述PBIB溶液中依次加入硫酸铜(CuSO4)溶液、抗坏血酸(AA)溶液，得到所述点击反应溶液；
(4)制备混合底液
按配比将CuBr/Me6TREN配合物、单体二茂铁甲醇异丁烯酸酯(FMMA)、六氟磷酸钾(KPF6)、溴化钾(KBr)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)混匀即可。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述A-DNA的序列如下：
5′-NH2-(CH2)6-CGTGCAGTACGCCAACCTTTCTCATGCGCTGCCCCTCTT A-3′。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述T-DNA的序列具体如下：
5′-N3-TAAGAGGGGCAGCGCATGAGAAAGGTTGGCGTACTGCACG-3′。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述A-DNA与T-DNA的摩尔用量比为1：1。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述A-DNA/T-DNA复合物的序列具体如下：
5′-NH2-(CH2)6-CGTGCAGTACGCCAACCTTTCTCATGCGCTGCCCCTCTT A-3′/5′-N3-TAAGAGGGGCAGCGCATGAGAAAGGTTGGCGTACTGCACG-3′。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述捕获探针C-DNA的序列如下：
5′-SH-(CH2)6-TTTTCGTGCAGTACGCCAACC-3′。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述CuBr/Me6TREN配合物采用下述方法配制而成：称取一定量的溴化铜(CuBr2)和三(2-二甲氨基乙基)胺(Me6TREN)分别用超纯水溶解，得到CuBr2溶液和Me6TREN溶液；然后将二者等体积混合均匀得到蓝色的溴化铜/三(2-二甲氨基乙基)胺(CuBr/Me6TREN)配合物溶液。
9.权利要求1所述基于高性能电活性聚合物材料和磁分离的电化学适体传感器或权利要求2-8方法构建的基于高性能电活性聚合物材料和磁分离的电化学适体传感器在心血管疾病标志物心肌肌钙蛋白检测中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：具体应用方法如下：
(A)将捕获载体适配体功能化磁球MBs-A-DNA/T-DNA与目标物心肌肌钙(cTn)蛋白进行培养，释放出引发DNA(T-DNA)作为次级目标物，经过磁分离后收集T-DNA溶液；然后将捕获探针(C-DNA)修饰的电极浸入所述T-DNA溶液中，所述T-DNA杂交C-DNA连接至电极表面；进一步与点击反应溶液反应在电极表面连接PBIB，最后将表面连接PBIB的电极置于混合底液中在恒电位下进行电化学介导的原子转移自由基聚合反应生成电活性聚合物材料；
(B)将经过聚合反应的电极放入含有高氯酸锂(LiClO4)的电解质溶液中通过方波伏安技术(SWV)进行电流-电位扫描得到电流信号变化情况。
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