CN105400789B - 一种定量检测赭曲霉毒素a的方法 - Google Patents

一种定量检测赭曲霉毒素a的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种定量检测赭曲霉毒素A的方法，属于赭曲霉毒素A的定量检测领域。本发明首先公开了赭曲霉毒素A的适配体及其互补DNA的核苷酸序列。本发明进一步公开了一种定量检测赭曲霉毒素A的方法，包括以下步骤：(1)制备适配体生物传感器；(2)提取待测样品中的赭曲霉毒素A，得到样品提取液，加入到所述适配体生物传感器中，混匀，孵育；(3)分离上清液，加入过量蔗糖溶液进行反应；(4)用血糖仪进行定量检测。本发明适配体生物传感器结合血糖仪定量检测食品或饲料中赭曲霉毒素A的方法，特异性好，灵敏度高，重复再现性好，快速、低成本，为赭曲霉毒素A的定量检测提供了一种新方法。

Description

一种定量检测赭曲霉毒素A的方法
技术领域
本发明涉及定量检测赭曲霉毒素A的方法，尤其涉及一种适配体生物传感器结合血糖仪定量检测赭曲霉毒素A的方法，属于赭曲霉毒素A的定量检测领域。
背景技术
霉菌毒素(mycotoxins)主要是指霉菌或真菌在其所污染的食品中产生的有毒代谢产物，它们可通过饲料或食品进入人和动物体内，引起人和动物的急性或慢性毒性，损害机体的肝脏、肾脏、神经组织、造血组织及皮肤组织等。常见的霉菌毒素有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2、HT-2毒素、伏马菌素等。其中赭曲霉毒素A(OTA)主要侵害动物肝脏与肾脏，主要是引起肾脏损伤，大量的毒素也可能引起动物的肠黏膜炎症和坏死。国际癌症研究机构(IARC)将OTA列为ⅡB类致癌物。因此，世界各国都很重视赭曲霉毒素的检测和控制，相应的制定出了赭曲霉毒素的限量标准。
适配体与抗体的性质相似，但适配体特异性更强，对目标靶分子具有更高的亲和力，更容易获得，在体外可以大量快速的合成，制备方法也更为简单，可以针对不同种类的目标物进行筛选。目前，基于适配体检测赭曲霉毒素A的方法有已有报道。但是，很多检测方法存在所需试剂多，操作繁琐，检测周期长，重现性差，设备昂贵，前处理复杂等缺点，不利于进行现场检测。
血糖仪是一种测量血糖水平的电子仪器，由于其体积小，成本低，操作简单，能够得到准确的定量结果，已经得到广泛应用。然而，血糖仪只能检测葡萄糖这一种物质，并且检测范围是0.6～33mmol/l(10～600mg/dl)。因此，开发一种便携式适配体生物传感器结合血糖仪定量检测赭曲霉毒素A这种非葡萄糖物质的方法，将具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种定量检测赭曲霉毒素A的方法，该方法利用适配体生物传感器结合血糖仪定量检测赭曲霉毒素A，具有操作简便，检出限低，特异性好，重复再现性好等优点。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明首先公开了赭曲霉毒素A的适配体，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
所述适配体的互补DNA，其核苷酸序列为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。
本发明进一步公开了一种定量检测赭曲霉毒素A的方法，包括以下步骤：(1)制备适配体生物传感器；(2)提取待测样品中的赭曲霉毒素A，得到样品提取液，加入到所述适配体生物传感器中，混匀，孵育；(3)分离上清液，加入过量蔗糖溶液进行反应；(4)用血糖仪进行定量检测。
其中，步骤(1)所述适配体生物传感器按照以下方法制备：(a)活化蔗糖酶；(b)活化所述互补DNA；(c)将步骤(a)活化后的蔗糖酶与步骤(b)活化后的互补DNA分别洗涤，然后混匀，反应合成DNA-蔗糖酶聚合物；(d)将链霉亲和素修饰的磁球链接所述赭曲霉毒素A的适配体；(e)将步骤(c)合成的DNA-蔗糖酶聚合物洗涤后固定在步骤(d)处理的磁球上，即得。
步骤(b)所述互补DNA的3’端进行巯基修饰；步骤(d)所述赭曲霉毒素A的适配体的3’端进行生物素修饰。
步骤(a)所述活化蔗糖酶是将蔗糖酶与sulfo-SMCC(sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)反应；其中，所述反应的体系包括：300-500μl 20mg/ml蔗糖酶，0.5-2mg sulfo-SMCC；所述反应的条件为：先涡旋震荡5min，然后在恒温混匀仪上室温反应1-3h；
优选的，所述反应的体系包括：400μl 20mg/ml蔗糖酶，1mg sulfo-SMCC；所述反应的条件为：先涡旋震荡5min，然后在恒温混匀仪上室温反应2h。
步骤(b)所述活化互补DNA是将所述互补DNA与TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)反应；其中，所述反应的体系包括：80-120μl 100μM互补DNA，1-3μl 0.1M缓冲液B，1-3μl 30mM TCEP；所述反应的条件为：恒温混匀仪上室温反应0.5-2h；
优选的，所述反应的体系包括：100μl 100μM互补DNA，2μl 0.1M缓冲液B，2μl 30mMTCEP；所述反应的条件为：恒温混匀仪上室温反应1h；所述缓冲液B包括：0.1M氯化钠，0.1M磷酸钠，质量比为0.05％的吐温-20，pH＝7.3。
步骤(c)所述洗涤包括：将步骤(a)反应后的溶液离心，取上清液，加入到超滤管Amicon-100K，25℃、12000rcf离心10min，用缓冲液A洗涤；将步骤(b)反应后的溶液离心，取上清液，加入到超滤管Amicon-3K中，25℃、12000rcf离心10min，用缓冲液A洗涤；其中，所述缓冲液A包括：0.1M氯化钠，0.1M磷酸钠，pH＝7.3；步骤(c)所述反应合成DNA-蔗糖酶聚合物的条件是恒温混匀仪上室温反应24-60h，优选为48h。
步骤(d)所述链接的体系包括：0.5-2ml 1mg/ml链霉亲和素修饰的磁球，40-80μl0.1mM所述赭曲霉毒素A的适配体；所述链接的条件为：恒温混匀仪上室温反应1-2h；
优选的，所述链接的体系包括：1ml 1mg/ml链霉亲和素修饰的磁球，60μl 0.1mM所述赭曲霉毒素A的适配体；所述链接的条件为：恒温混匀仪上室温反应1h；
步骤(e)所述洗涤是将步骤(c)合成的DNA-蔗糖酶聚合物用超滤管Amicon-100K于25℃、12000rcf离心10min，用缓冲液A洗涤(所述缓冲液A包括：0.1M氯化钠，0.1M磷酸钠，pH＝7.3)；步骤(e)所述固定是将洗涤后的DNA-蔗糖酶聚合物与步骤(d)处理的磁球混合，在恒温混匀仪上室温反应1-3h，优选为1h。
本发明定量检测赭曲霉毒素A的方法中，步骤(2)将样品提取液加入适配体生物传感器中，使适配体生物传感器的终浓度为3mg/ml；所述孵育的条件为：室温孵育60min；步骤(3)所述反应的条件为：室温反应30min；所述分离上清液是将反应后的溶液用磁分离器分离，然后吸取上清液；步骤(4)所述定量检测是根据血糖仪的读数与赭曲霉毒素A标准品的浓度作回归方程，将待测样品的血糖仪读数带入回归方程，计算待测样品中赭曲霉毒素A的浓度；其中，所述待测样品包括食品或饲料。
本发明针对赭曲霉毒素A分别合成了5条适配体序列及不同适配体序列相对应的互补DNA序列(适配体序列SEQ ID NO.1，其对应的互补DNA核苷酸序列为SEQ ID NO.6；适配体序列SEQ ID NO.2，其对应的互补DNA核苷酸序列为SEQ ID NO.7；依此类推。)；其中，SEQID NO.5所示适配体序列与SEQ ID NO.4所示序列的差异在于SEQ ID NO.5所示序列后多加12个A碱基。
本发明分别用不同适配体序列及其互补DNA序列合成适配体生物传感器，比较不同适配体序列的血糖仪信号值。结果表明，当OTA的浓度为25μM，SEQ ID NO.1-4所示适配体序列所产生的血糖仪信号值分别为13mg/dl、15mg/dl、16mg/dl、19mg/dl；SEQ ID NO.5所示适配体序列加了12个A碱基以后血糖仪的信号值为65mg/dl。可能是由于添加12个A碱基以后，适配体序列的3’端与磁球结合，增大了适配体与磁球之间的空间位置，适配体能更好的与OTA分子结合，释放下来更多的蔗糖酶分子，血糖仪的信号值明显增加。因此，本发明赭曲霉毒素A适配体的核苷酸序列优选为SEQ ID NO.5所示，其互补DNA的核苷酸序列为SEQ IDNO.10所示。
本发明适配体生物传感器检测赭曲霉毒素A的原理包括，链霉亲和素包被的磁球与生物素修饰的适配体相结合，蔗糖酶和互补DNA相结合；将DNA-蔗糖酶聚合物通过互补DNA与适配体碱基互补配对的原则固定到磁球表面；当溶液中含有所需检测目标分子时，目标分子与适配体特异性结合，从而将DNA-蔗糖酶聚合物从磁球上释放到溶液中；用磁分离器分离溶液，释放到溶液中的DNA-蔗糖酶聚合物能够高效水解蔗糖为葡萄糖，从而通过血糖仪进行定量检测。由于被释放到溶液中的DNA-蔗糖酶聚合物的量能够通过葡萄糖的量来表示，并且蔗糖酶的量与样品中目标分子的量存在一定的比例关系。因此，血糖仪的读数能够被用来定量目标分子的浓度。本发明适配体生物传感器4℃条件下能有效保存10天以上。
本发明对定量检测赭曲霉毒素A的方法中步骤(2)的孵育时间和步骤(3)的反应时间进行了优化，结果表明，适配体生物传感器与OTA分子的孵育时间在60min时，蔗糖酶已经基本全部释放，为了保证蔗糖酶完全释放，选择60min作为孵育时间；为了保证血糖仪有一个明显的检测信号，采用30min作为与蔗糖溶液的反应时间。
检出限测定结果表明，本发明方法检测赭曲霉毒素A的最低检出限为6.7×10-9M(2.69μg/kg)。中国所采用的GB 2715-2005《粮食卫生标准》中谷类和豆类中赭曲霉毒素A的最高限量为5μg/kg，CAC(国际食品法典委员会)中规定的小麦、大麦、黑麦中的赭曲霉毒素A的最高限量为5μg/kg，EC(欧盟委员会)中规定的速溶咖啡和葡萄干中赭曲霉毒素A的最高限量为10μg/kg，婴幼儿食品中赭曲霉毒素A的最高限量为0.5μg/kg。因此，本发明方法的检出限除了婴幼儿食品基本能满足检测要求。
重复实验结果表明，本发明适配体生物传感器检测赭曲霉毒素A具有良好的再现性。特异性分析结果表明，OTA适配体能特异性识别OTA分子，不与其他干扰因子(AFB1、AFG1、AFM1、ZEA)结合，说明本发明适配体生物传感器具有很好的特异性。
应用本发明方法检测婴幼儿米粉和羊草中赭曲霉毒素A，结果赭曲霉毒素A的回收率保持在84％-122％之间。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明开发了一种适配体生物传感器结合血糖仪定量检测赭曲霉毒素A的方法。本发明适配体生物传感器通过其适配体特异性的识别赭曲霉毒素A，释放生物传感器上结合的蔗糖酶分子到溶液中，蔗糖酶能够高效的水解蔗糖为葡萄糖，从而通过血糖仪进行定量检测。该方法具有操作简便，检出限低，特异性好，重复再现性好等优点，为食品和饲料中赭曲霉毒素A的定量检测提供了一种新方法，具有良好的应用前景。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“适配体”意指一种经体外筛选技术得到的寡核苷酸序列(RNA或DNA)，与相应的配体有严格的识别能力和高度的亲和力，大小一般约6-40kDa。
附图说明
图1为适配体生物传感器的原理图；
图2为血糖仪检测缓冲液中赭曲霉毒素A以及血糖仪信号值与赭曲霉毒素A浓度的线性关系；
图3为血糖仪检测不同类型的霉菌毒素；其中，对照组：没有霉菌毒素；MIX1组：AFB1、AFG1、AFM1和ZEA；MIX2组：AFB1、AFG1、AFM1、OTA和ZEA；
图4为DNA-蔗糖酶固定的磁球与赭曲霉毒素A不同孵育时间对应的血糖仪信号值；
图5为释放出的DNA-蔗糖酶与蔗糖溶液不同反应时间对应的血糖仪信号值。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1、材料与仪器
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride(TCEP)、Invertase(蔗糖酶)、Sucrose(蔗糖)，来自Sigma公司；Amicon-3K、Amicon-100K，来自Millipore公司；sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(sulfo-SMCC)，来自Thermofisher公司；链霉亲和素修饰的磁球(直径1μm)、磁分离器，来自BangsLaboratories,Inc.公司；赭曲霉毒素A(OTA)标准品，来自国家标准物质中心；血糖仪及试纸条，来自罗氏ACCU-CHEK Avia；超纯水，来自Millipore Advantage A10纯水系统；恒温混匀仪，来自爱本德Thermomixer comfort型号；基因漩涡混匀器，来自IKA品牌；落地高速冷冻离心机，来自HITACHI CR22G111型号；
缓冲液A(0.1M氯化钠，0.1M磷酸钠，pH＝7.3)；
缓冲液B(0.1M氯化钠，0.1M磷酸钠，pH＝7.3，0.05％吐温-20(质量比))；
OTA aptamer及互补DNA，生工生物工程(上海)有限公司合成。所述互补DNA的3’端进行巯基修饰；所述赭曲霉毒素A的适配体的3’端进行生物素修饰。
实施例1适配体生物传感器的合成以及结合血糖仪检测赭曲霉毒素A
1、实验方法
1.1DNA-蔗糖酶聚合物的合成
1.1.1蔗糖酶分子的活化
取400μl 20mg/ml蔗糖酶(buffer B)与1mg sulfo-SMCC混合，涡旋震荡5min，放置恒温混匀仪上，室温反应2h。
1.1.2DNA分子的活化
取100μl 100μM互补DNA(thiol-DNA，5’-CCCACACCCGATCAAAAAAAAAAAA-SH-3’)，2μl 0.1M buffer B，2μl30mM TCEP(超纯水)加入到1.5ml离心管中，涡旋混匀，放置恒温混匀仪上，室温反应1h(其中，①互补DNA的处理：将合成的固体DNA(4℃，12000rcf，5min)离心，按要求加入345μl超纯水，轻微涡旋混匀，得到345μl 100μM的DNA溶液；②TCEP的配制：TCEP分子量286.65，称量8.59mg，溶于1ml的超纯水，得到1ml 30mM TCEP溶液)。
1.1.3DNA-蔗糖酶聚合物的合成
将蔗糖酶-SMCC和thiol-DNA的反应溶液离心(25℃、12000rcf、5min)，吸取上清液，分别加入到超滤管中(蔗糖酶-SMCC用Amicon-100K；thiol-DNA用Amicon-3K)，离心(25℃、12000rcf、10min)，用buffer A洗涤8次；将8次离心洗涤后的thiol-DNA和蔗糖酶-SMCC分别从超滤管中吸出，转移到1.5ml的离心管中，涡旋混匀，室温放置恒温混匀仪上反应48h。
1.2DNA-蔗糖酶在磁球上的固定
1.2.1磁球和OTA aptamer的链接
取1ml 1mg/ml链霉亲和素修饰的磁球(MBs)放置磁分离器上至完全澄清，吸除上清液，用buffer B洗涤2次；取60μl 0.1mM OTA aptamer(5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGAAAAAAAAA AAA-biotin-3’)(超纯水)加入到磁球溶液中，轻微涡旋混匀，放置恒温混匀仪上，室温反应1h，用buffer B洗涤3次。
1.2.2DNA-蔗糖酶的洗涤
将48h反应后的DNA-蔗糖酶用超过滤器Amicon-100K(25℃、12000rcf、10min)离心，用buffer A洗涤8次。
1.2.3DNA-蔗糖酶在磁球上的固定
将洗涤后的DNA-蔗糖酶溶液转移到磁球-aptamer溶液中，涡旋混匀，放置恒温混匀仪上，室温反应1h，用buffer B洗涤3-4次；得到DNA-磁球-蔗糖酶聚合物(Invertase-DNA-apt-MBs)，即合成的适配体生物传感器系统。将合成的Invertase-DNA-apt-MBs均匀分散在1ml buffer B中，每份取60μl用于下一步的检测。
1.3结合血糖仪检测缓冲液中的赭曲霉毒素A
取20μl不同浓度(0、1、2、4、6.25、12.5、25、50、100、200μM)的OTA(buffer B)溶液加入到一份Invertase-DNA-apt-MBs溶液中(用磁分离器去除buffer)，轻微涡旋混匀，充分反应1h(MBs的浓度约3mg/ml)；将上述反应后的MBs溶液，用磁分离器分离，吸取10μl上清液，加入到5μl 2M Sucrose(buffer B)离心管中，涡旋混匀，室温反应30min；取5μl反应后溶液用血糖仪检测。
1.4检出限的测定
用缓冲液B将OTA的浓度稀释为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、4μM，分别与一份Invertase-DNA-apt-MBs反应(用磁分离器去除buffer)，轻微涡旋混匀，充分反应1h。将上述反应后的MBs溶液，用磁分离器分离，吸取10μl上清液，加入到5μl 2M Sucrose(bufferB)离心管中，涡旋混匀，室温反应30min。取5μl反应后溶液用血糖仪检测。
1.5特异性分析
为了评价所开发的适配体生物传感器的选择性，选择了一个对照组和4种霉菌毒素(AFB1、AFM1、AFG1、ZEA)进行了检测。所有实验的霉菌毒素浓度为1ppm。检测步骤与上述缓冲液中OTA的检测步骤相同。对照组：没有霉菌毒素；MIX1组：AFB1、AFG1、AFM1和ZEA；MIX2组：AFB1、AFG1、AFM1、OTA和ZEA；通过三次平行样品的检测获得误差线。
1.6数据分析
实验数据采用Excel进行标准化处理，图表采用Adobe Illustrator CS5和Origin8.0进行作图分析。
2、实验结果
2.1适配体生物传感器的原理
适配体生物传感器的原理如图1。
链霉亲和素包被的磁球与生物素修饰的适配体相结合，蔗糖酶和互补DNA相结合；将DNA-蔗糖酶聚合物通过互补DNA与适配体碱基互补配对的原则固定到磁球表面；当溶液中含有所需检测目标分子时，目标分子与适配体特异性结合，从而将DNA-蔗糖酶聚合物从磁球上释放到溶液中；用磁分离器分离溶液，释放到溶液中的DNA-蔗糖酶聚合物能够高效水解蔗糖为葡萄糖，从而通过血糖仪进行定量检测。由于被释放到溶液中的DNA-蔗糖酶的量能够通过葡萄糖的量来表示，并且蔗糖酶的量与样品中目标分子的量存在一定的比例关系。因此，血糖仪的读数能够被用来定量目标分子的浓度。
2.2缓冲液中的赭曲霉毒素A的检测
如图2所示，室温条件下，随着缓冲液中OTA浓度的增加，血糖仪的读数显著增加，缓冲液中OTA的浓度在1×10-8M～4×10-6M时，血糖仪的读数与OTA的浓度存在一个良好的线性关系。回归方程可以表示如下：y＝0.4412x+0.1411，R2＝0.9924。其中x表示OTA的浓度；y表示血糖仪的示数，R是回归系数。最低检出限为6.7×10-9M(2.69μg/kg)。
中国所采用的GB 2715-2005《粮食卫生标准》中谷类和豆类中赭曲霉毒素A的最高限量为5μg/kg，CAC(国际食品法典委员会)中规定的小麦、大麦、黑麦中的赭曲霉毒素A的最高限量为5μg/kg，EC(欧盟委员会)中规定的速溶咖啡和葡萄干中赭曲霉毒素A的最高限量为10μg/kg，婴幼儿食品中赭曲霉毒素A的最高限量为0.5μg/kg。因此，本发明所开发的适配体生物传感的检出限除了婴幼儿食品基本能满足检测要求。
实验设定OTA浓度为12.5μM时，进行5次重复实验，相对标准偏差为1.5％，表明本发明所开发的方法有良好的再现性。
2.3特异性分析
为了研究所开发的生物传感器的特异性，选择了4种毒素(AFB1、AFG1、AFM1、ZEA)作为干扰因子。结果如图3所示，对照组与AFB1、AFG1、AFM1、ZEA、MIX1组的血糖仪读数基本一致，明显低于OTA组的血糖仪读数；MIX2组的血糖仪读数略低于OTA组，说明其他毒素分子不能和OTA的适配体特异性结合，几种毒素分子混合存在可能会影响OTA与其适配体的特异性结合，从而导致MIX2组的血糖仪读数略低于OTA组。实验结果表明，OTA适配体能特异性识别OTA分子，不与其他干扰因子结合，说明合成的适配体生物传感器具有很好的特异性。
实施例2适配体生物传感器的合成
1.1DNA-蔗糖酶聚合物的合成
1.1.1蔗糖酶分子的活化
取300μl 20mg/ml蔗糖酶(buffer B)与0.5mg sulfo-SMCC混合，涡旋震荡5min，放置恒温混匀仪上，室温反应1h。
1.1.2DNA分子的活化
取80μl 100μM互补DNA(thiol-DNA，5’-CCCACACCCGATCAAAAAAAAAAAA-SH-3’)，1μl0.1M buffer B，1μl30mM TCEP(超纯水)加入到1.5ml离心管中，涡旋混匀，放置恒温混匀仪上，室温反应0.5h。
1.1.3DNA-蔗糖酶聚合物的合成
将蔗糖酶-SMCC和thiol-DNA的反应溶液离心(25℃、12000rcf、5min)，吸取上清液，分别加入到超滤管中(蔗糖酶-SMCC用Amicon-100K；thiol-DNA用Amicon-3K)，离心(25℃、12000rcf、10min)，用buffer A洗涤8次；将8次离心洗涤后的thiol-DNA和蔗糖酶-SMCC分别从超滤管中吸出，转移到1.5ml的离心管中，涡旋混匀，室温放置恒温混匀仪上反应24h。
1.2DNA-蔗糖酶在磁球上的固定
1.2.1磁球和OTA aptamer的链接
取0.5ml 1mg/ml链霉亲和素修饰的磁球(MBs)放置磁分离器上至完全澄清，吸除上清液，用buffer B洗涤2次；取40μl 0.1mM OTA aptamer(5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGAAAAAAAAA AAA-biotin-3’)(超纯水)加入到磁球溶液中，轻微涡旋混匀，放置恒温混匀仪上，室温反应1h，用buffer B洗涤3次。
1.2.2DNA-蔗糖酶的洗涤
将反应后的DNA-蔗糖酶用超过滤器Amicon-100K(25℃、12000rcf、10min)离心，用buffer A洗涤8次。
1.2.3DNA-蔗糖酶在磁球上的固定
将洗涤后的DNA-蔗糖酶溶液转移到磁球-aptamer溶液中，涡旋混匀，放置恒温混匀仪上，室温反应1h，用buffer B洗涤3-4次；得到DNA-磁球-蔗糖酶聚合物(Invertase-DNA-apt-MBs)，即合成的适配体生物传感器系统。
实施例3适配体生物传感器的合成
1.1DNA-蔗糖酶聚合物的合成
1.1.1蔗糖酶分子的活化
取500μl 20mg/ml蔗糖酶(buffer B)与2mg sulfo-SMCC混合，涡旋震荡5min，放置恒温混匀仪上，室温反应3h。
1.1.2DNA分子的活化
取120μl 100μM互补DNA(thiol-DNA，5’-CCCACACCCGATCAAAAAAAAAAAA-SH-3’)，3μl 0.1M buffer B，3μl30mM TCEP(超纯水)加入到1.5ml离心管中，涡旋混匀，放置恒温混匀仪上，室温反应2h。
1.1.3DNA-蔗糖酶聚合物的合成
将蔗糖酶-SMCC和thiol-DNA的反应溶液离心(25℃、12000rcf、5min)，吸取上清液，分别加入到超滤管中(蔗糖酶-SMCC用Amicon-100K；thiol-DNA用Amicon-3K)，离心(25℃、12000rcf、10min)，用buffer A洗涤8次；将8次离心洗涤后的thiol-DNA和蔗糖酶-SMCC分别从超滤管中吸出，转移到1.5ml的离心管中，涡旋混匀，室温放置恒温混匀仪上反应60h。
1.2DNA-蔗糖酶在磁球上的固定
1.2.1磁球和OTA aptamer的链接
取2ml 1mg/ml链霉亲和素修饰的磁球(MBs)放置磁分离器上至完全澄清，吸除上清液，用buffer B洗涤2次；取80μl 0.1mM OTA aptamer(5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGAAAAAAAAA AAA-biotin-3’)(超纯水)加入到磁球溶液中，轻微涡旋混匀，放置恒温混匀仪上，室温反应2h，用buffer B洗涤3次。
1.2.2DNA-蔗糖酶的洗涤
将反应后的DNA-蔗糖酶用超过滤器Amicon-100K(25℃、12000rcf、10min)离心，用buffer A洗涤8次。
1.2.3DNA-蔗糖酶在磁球上的固定
将洗涤后的DNA-蔗糖酶溶液转移到磁球-aptamer溶液中，涡旋混匀，放置恒温混匀仪上，室温反应3h，用buffer B洗涤3-4次；得到DNA-磁球-蔗糖酶聚合物(Invertase-DNA-apt-MBs)，即合成的适配体生物传感器系统。
实验例1适配体生物传感器反应条件的优化
1、实验方法
1.1孵育时间的优化
孵育时间对于实验是一个重要的因素，因此对其进行了优化。将实施例1开发的适配体生物传感器分别与含有50和100μM的赭曲霉毒素A的溶液反应，分别在孵育0、5、15、30、60、100min的时候进行磁性分离。然后吸取10μl上清液，加入到5μl 2M蔗糖溶液(buffer B)离心管中，涡旋混匀，室温反应30min。取5μl反应后溶液用血糖仪检测。
1.2反应时间的优化
实验对传感器与目标分子反应从而释放出的蔗糖酶与蔗糖的反应时间进行了优化。将实施例1开发的适配体生物传感器分别与含有50和100μM的赭曲霉毒素A的溶液反应，1h以后利用磁分离器进行磁性分离，然后吸取10μl上清液，加入到5μl 2M Sucrose(bufferB)离心管中，涡旋混匀，室温条件下，分别在反应0、5、15、30、45min时候，吸取5μl反应后溶液用血糖仪检测。
1.3适配体传感器存储时间的研究
为了适配体生物传感器能够更好的被开发利用，对其存储时间进行了研究。实验设定OTA浓度为12.5μM时，将实施例1合成的适配体生物传感器系统在4℃条件下，分别保存1d、3d、7d、10d，然后按照上述的实验步骤与蔗糖溶液反应，通过血糖仪进行检测。
2、实验结果
2.1孵育时间的选择
结果如图4所示，室温条件下，选择50μM和100μM的OTA溶液与合成的适配体生物传感器系统结合，相隔不同的时间采用磁分离器分离，取上清液与蔗糖溶液反应，运用血糖仪进行检测。当孵育时间在5min时，血糖仪读数迅速增加，当孵育时间达到60min时，血糖仪读数基本稳定。如图4中结果显示，传感器与OTA分子的孵育时间在60min时，蔗糖酶已经基本全部释放，为了保证蔗糖酶完全释放，选择60min作为孵育时间。
2.2反应时间的选择
如图5所示，室温条件下，选择50μM和100μM的OTA溶液与合成的适配体生物传感器系统结合，孵育时间为1h，采用磁分离器分离溶液，取上清液与蔗糖溶液反应，相隔不同的时间运用血糖仪进行检测。如图5显示，反应所产生的葡萄糖的浓度与反应时间成线性关系，为了保证血糖仪有一个明显的检测信号，采用30min作为反应时间。
2.3适配体传感器存储时间
实验设定OTA浓度为12.5μM时，合成后的适配体传感器系统在4℃条件下保存1d、3d、7d、10d时，血糖仪示数分别为2.4mmol/l、2.4mmol/l、2.3mmol/l、2.2mmol/l，与刚合成的适配体传感器的反应示数基本一致。
实验例2适配体序列的筛选
本发明针对赭曲霉毒素A合成了以下适配体序列及其相对应的互补DNA序列：
序列1：5’-GCATCTGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGG-biotin-3’；
序列2：5’-CAGGTGGCAGATCGGGTGTGGGTGGCCTGG-biotin-3’；
序列3：5’-ACATGCGACTGAGGCTCGGTTTATTGAGGG-biotin-3’；
序列4：
5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGG-biotin-3’；
序列5：
5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGAAAAAAAAAA AA-biotin-3’；
互补DNA序列：
互补序列1：5’-CCCGATCAGATGC-3’；
互补序列2：5’-GATCTGCCACCTG-3’；
互补序列3：5’-CTCAGTCGCATGT-3’；
互补序列4：5’-CCCACACCCGATC-3’；
互补序列5：5’-CCCACACCCGATCAAAAAAAAAAAA-3’。
适配体序列1的互补DNA序列对应互补序列1；适配体序列2的互补DNA序列对应互补序列2；依此类推，互补DNA的3’端进行巯基修饰。
分别按照实施例1相同的实验操作合成适配体生物传感器，用血糖仪检测含有25μM的赭曲霉毒素A的溶液，比较不同适配体序列的血糖仪信号值。
结果表明，适配体序列1-4没有添加12个A碱基，当OTA的浓度为25μM，适配体1-4所产生的血糖仪信号值分别为13mg/dl、15mg/dl、16mg/dl、19mg/dl，序列5加了12个A碱基以后血糖仪的信号值为65mg/dl。可能是由于添加12个A碱基以后，适配体序列的3’端与磁球结合，增大了适配体与磁球之间的空间位置，适配体能更好的与OTA分子结合，释放下来更多的蔗糖酶分子，血糖仪的信号值明显增加。所以，实验选择添加12个A碱基，来增强血糖仪的信号值。
实验例3实际样品的检测
将实施例1开发的适配体生物传感器应用于中国羊草样品(天津今日健康乳业有限公司)和婴幼儿配方米粉中赭曲霉毒素A的检测。
1、实验方法
1.1样品前处理
称取3份羊草，每份0.5g，分别添加500μl(0ppb、20ppb、100ppb)的OTA，再加入2.5ml的甲醇水(甲醇含量为70％)。将整个混合物进行涡旋震荡5min，然后离心(10000rcf、10min、4℃)。取上清液，进行氮吹浓缩至0.5ml，最后将残留物用2.5ml的甲醇水(甲醇5％)进行重新溶解后检测。
婴幼儿配方米粉的前处理方法与羊草一致。
1.2数据分析
实验数据采用Excel进行标准化处理，图表采用Adobe Illustrator CS5和Origin8.0进行作图分析。
2、实验结果
将20μg/kg、100μg/kg OTA标准溶液分别加入到婴幼儿米粉和羊草中，通过实施例1的适配体生物传感器进行检测，以添加0ppb OTA作为本底值。结果如表1所示，OTA的回收率分别为84％-98％和94％-122％。实验结果表明，本发明所开发的适配体生物传感器可用于食品和饲料中赭曲霉毒素A的检测。
表1生物传感器结合血糖仪检测婴幼儿米粉和羊草中的赭曲霉毒素A
婴幼儿米粉和羊草样品稀释10倍后进行检测。

Claims (13)

1.赭曲霉毒素A的适配体，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。
2.权利要求1所述适配体的互补DNA，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO.10所示。
3.一种定量检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备适配体生物传感器；(2)提取待测样品中的赭曲霉毒素A，得到样品提取液，加入到所述适配体生物传感器中，混匀，孵育；(3)分离上清液，加入过量蔗糖溶液进行反应；(4)用血糖仪进行定量检测；
其中，步骤(1)所述适配体生物传感器按照以下方法制备：(a)活化蔗糖酶；(b)活化权利要求2所述互补DNA；(c)将步骤(a)活化后的蔗糖酶与步骤(b)活化后的互补DNA分别洗涤，然后混匀，反应合成DNA-蔗糖酶聚合物；(d)将链霉亲和素修饰的磁球链接权利要求1所述赭曲霉毒素A的适配体；(e)将步骤(c)合成的DNA-蔗糖酶聚合物洗涤后固定在步骤(d)处理的磁球上，即得。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(b)所述互补DNA的3’端进行巯基修饰；步骤(d)所述赭曲霉毒素A的适配体的3’端进行生物素修饰。
5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(a)所述活化蔗糖酶是将蔗糖酶与sulfo-SMCC反应；其中，所述反应的体系包括：300-500μl 20mg/ml蔗糖酶，0.5-2mg sulfo-SMCC；所述反应的条件为：先涡旋震荡5min，然后在恒温混匀仪上室温反应1-3h。
6.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：所述反应的体系包括：400μl 20mg/ml蔗糖酶，1mg sulfo-SMCC；所述反应的条件为：先涡旋震荡5min，然后在恒温混匀仪上室温反应2h。
7.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(b)所述活化互补DNA是将权利要求2所述互补DNA与TCEP反应；其中，所述反应的体系包括：80-120μl 100μM权利要求2所述互补DNA，1-3μl0.1M缓冲液B，1-3μl 30mM TCEP；所述反应的条件为：恒温混匀仪上室温反应0.5-2h所述缓冲液B包括：0.1M氯化钠，0.1M磷酸钠，质量比为0.05％的吐温-20，pH＝7.3。
8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于：所述反应的体系包括：100μl 100μM权利要求2所述互补DNA，2μl 0.1M缓冲液B，2μl30mM TCEP；所述反应的条件为：恒温混匀仪上室温反应1h。
9.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(c)所述洗涤包括：将步骤(a)反应后的溶液离心，取上清液，加入到超滤管Amicon-100K，25℃、12000rcf离心10min，用缓冲液A洗涤；将步骤(b)反应后的溶液离心，取上清液，加入到超滤管Amicon-3K中，25℃、12000rcf离心10min，用缓冲液A洗涤；其中，所述缓冲液A包括：0.1M氯化钠，0.1M磷酸钠，pH＝7.3；步骤(c)所述反应合成DNA-蔗糖酶聚合物的条件是恒温混匀仪上室温反应24-60h。
10.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(c)所述反应合成DNA-蔗糖酶聚合物的条件是恒温混匀仪上室温反应48h。
11.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(d)所述链接的体系包括：0.5-2ml1mg/ml链霉亲和素修饰的磁球，40-80μl 0.1mM权利要求1所述赭曲霉毒素A的适配体；所述链接的条件为：恒温混匀仪上室温反应1-2h；
步骤(e)所述洗涤是将步骤(c)合成的DNA-蔗糖酶聚合物用超滤管Amicon-100K于25℃、12000rcf离心10min，用缓冲液A洗涤；
步骤(e)所述固定是将洗涤后的DNA-蔗糖酶聚合物与步骤(d)处理的磁球混合，在恒温混匀仪上室温反应1-3h。
12.按照权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤(d)所述链接的体系包括：1ml 1mg/ml链霉亲和素修饰的磁球，60μl0.1mM权利要求1所述赭曲霉毒素A的适配体；所述链接的条件为：恒温混匀仪上室温反应1h；步骤(e)所述固定是将洗涤后的DNA-蔗糖酶聚合物与步骤(d)处理的磁球混合，在恒温混匀仪上室温反应1h。
13.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(2)将样品提取液加入适配体生物传感器中，使适配体生物传感器的终浓度为3mg/ml；所述孵育的条件为：室温孵育60min；步骤(3)所述反应的条件为：室温反应30min；步骤(4)所述定量检测是根据血糖仪的读数与赭曲霉毒素A标准品的浓度作回归方程，将待测样品的血糖仪读数带入回归方程，计算待测样品中赭曲霉毒素A的浓度；所述待测样品包括食品或饲料。
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