CN106148320A - 一种可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶的制备方法 - Google Patents

一种可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶的制备方法，以磁性Fe3O4/P(St‑AA)纳米球或磁性Fe3O4/PS‑CH2Cl纳米球作为载体，通过共价结合将脂肪酶固定在磁性Fe3O4/P(St‑AA)纳米球表面或磁性Fe3O4/PS‑CH2Cl纳米球表面。该方法简单、温和，脂肪酶的固载量多，且磁性固定化脂肪酶酶活回收率高、稳定性好，可在有机介质中广泛使用，具有广泛的应用前景。

Description

一种可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶的制备方法
技术领域
本发明涉及一种可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶的制备方法。
背景技术
脂肪酶是一种重要的酯键水解酶，能够水解甘油和脂肪酸形成的酯键，故又称为三酰基甘油水解酶。研究发现脂肪酶除了能够催化甘油脂类化合物的水解和合成之外，在有机相中，还能催化酯化、转酯、醇解、酸解和氨解等反应，具有高度的区域、底物和立体选择性。然而，脂肪酶是水溶性蛋白酶，在有机介质中几乎不溶解，无法与酯、酸、醇、酸酐和酰胺等底物充分接触，制约了脂肪酶在有机催化领域中的应用。此外，脂肪酶对热、强酸、强碱、有机溶剂等均不稳定，且在反应中易失活，反应后不能被回收再利用。因此，需要对脂肪酶进行固定化修饰，提高脂肪酶的稳定性、可回收性和在有机介质中的分散性，以降低工业生产成本。
Fe3O4纳米粒子是一种重要的磁性分离材料，它具有特殊的磁响应性，可借助外磁场从反应体系中快速简便地富集、分离、回收Fe3O4纳米粒子，是一种重要的载体材料，在生物酶催化技术领域具有极大的应用价值。尽管已有文献报道磁性Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@C纳米载体可以提高脂肪酶的稳定性(Chem.Asian J.,2013,8,1447-1454；J.Mater.Chem.,2012,22,8385-8393；J.Mater.Chem.A,2014,2,18339-18344)，但目前文献报道的固定化脂肪酶都不适合在有机介质中使用。此外，迄今还没有关于磁性Fe3O4/P(St-AA)，Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球固定脂肪酶的制备方法。因此，发展一种制备磁性Fe3O4/P(St-AA)，Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球固定脂肪酶的方法并制备可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶具有重要的理论和现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶的制备方法，该方法简单、温和，脂肪酶的固载量多，且磁性固定化脂肪酶酶活回收率高、稳定性好，可在有机介质中广泛使用。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶的制备方法，以磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球或磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球作为载体，通过共价结合将脂肪酶固定在磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球表面或磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球表面。
Fe3O4/P(St-AA)中，P(St-AA)含义为聚(苯乙烯-丙烯酸)，PS-CH2Cl含义为氯甲基化聚苯乙烯。
为了提高脂肪酶的固载量和酶活回收率，作为本申请的一种改进方案，优选，通过共价结合将脂肪酶固定在磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球表面的方法为：先用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合物活化磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球表面的羧基官能团，再利用酰胺化反应在磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球表面共价固定脂肪酶。
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，分子式C8H17N3·HCl，简称EDC·HCl；N-羟基琥珀酰亚胺简称NHS。
为了进一步简化制备，提高环保型，同时确保产品质量，上述可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶的制备方法，具体包括以下步骤：
1)将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶解在吗啉乙磺酸缓冲溶液中，加入磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球，超声分散2±1min，然后于25～35℃条件下反应2～4h，再将所得产品经磁分离、洗涤；
2)将步骤1)所得的产品加入到脂肪酶溶液中，于30±5℃条件下反应1.5±0.2h，然后将所得产品经磁分离、洗涤，即得可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶。
上述，吗啉乙磺酸缓冲溶液优选浓度为0.1mol/L，pH为6.0。
为了进一步提高所得可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶的综合性能，脂肪酶溶液的浓度为0.9-1.1mg/ml；磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的质量比为1：(1.8-2)；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:(0.3～0.6)；磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球与脂肪酶的质量比为1:(0.2～0.4)。
更有选，磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的质量比为1：1.9。
作为本申请的另一种改进方案，上述通过共价结合将脂肪酶固定在磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球表面的方法为：在三乙胺的作用下，利用亲核反应使脂肪酶共价固定在磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球表面。
为了进一步简化制备，同时确保所得产品的性能，通过共价结合将脂肪酶固定在磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球表面的方法为：将磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球分散到丙酮中，再加入三乙胺和脂肪酶溶液，于25～35℃条件下反应1～3h，然后将所得产品经磁分离、洗涤，即得在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶。
为了进一步提高所得可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶的综合性能，脂肪酶溶液浓度为0.5～1.5mg/mL；丙酮与脂肪酶溶液的体积比为1：(0.2～2)；三乙胺与脂肪酶溶液的体积比为1：(25～200)；磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球与脂肪酶的质量比为1:(0.1～0.15)。
作为本申请的另一种改进方案，通过共价结合将脂肪酶固定在磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球表面的方法为：先利用亲核反应使氨基官能团与磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球相结合，再将所得产品与戊二醛的一端醛基反应，使得戊二醛连接在磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球表面，最后利用连接在磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球表面的戊二醛另一端的醛基将脂肪酶共价固定在磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球表面。
为了进一步简化制备，上述可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶的制备方法，具体包括以下步骤：
1)将磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球加入到碱溶液中，超声分散均匀，于25～40℃条件下反应4～8h，再将所得产品经磁分离、洗涤；
2)将步骤1)所得的产品加入到戊二醛溶液中，于25～40℃条件下反应4～12h，再将所得产品经磁分离、洗涤、真空干燥；
3)将步骤2)所得的产品加入到脂肪酶溶液中，于30±5℃条件下反应1.5±2h，再将所得产品经磁分离、洗涤，即得可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶。
为了进一步提高所得可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶的综合性能，肪酶溶液的浓度为0.9-1.1mg/ml；碱溶液为氨水或乙二胺溶液；磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球与乙二胺或氨水中氨的质量比为1:(1.2～1.4)；磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球与戊二醛的质量比为1:(2～4)；戊二醛溶液的浓度为50～100g/L；磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球与脂肪酶的质量比为1:(0.2～0.4)。
本发明提供的磁性固定化脂肪酶的制备方法中，所述的磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球由下列方法所合成：
步骤1.称取1059.5mg乙酰丙酮铁加入到20mL二苯醚中，再加入2mL油胺、1mL乙二醇、2mL油酸，搅拌均匀，在氮气气氛中，于200℃条件下，反应0.5h，再在250℃条件下回流2h后，停止加热，冷却至室温，磁分离出黑色产物，并用乙醇洗涤3次，获得油酸-油胺包裹的四氧化三铁纳米粒子；
步骤2.向步骤1所获得的油酸-油胺包裹的四氧化三铁纳米粒子中加入36mL十二烷基硫酸钠溶液(物质量浓度，0.1mol/L)，搅拌混合均匀后，再在超声条件下分散15min，制备出磁性四氧化三铁乳状液；
步骤3.向30mL水中依次加入90mg十二烷基硫酸钠、0.1mL苯乙烯和0.4mL丙烯酸，搅拌混合均匀后，再超声条件下分散20min，制备出苯乙烯-丙烯酸混合单体乳状液；
步骤4.将步骤2所获得的磁性四氧化三铁乳状液和步骤3所获得的苯乙烯-丙烯酸混合单体乳状液混合均匀，在氮气气氛、搅拌条件下加入45mg过硫酸钾引发剂，于80℃条件下反应24h，待反应结束后，自然冷却到室温，所得沉淀经磁分离、洗涤、干燥后为磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球。
本发明提供的磁性固定化脂肪酶的制备方法中，所述的磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球由下列方法所合成：
步骤1.称取1059.5mg乙酰丙酮铁加入到20mL二苯醚中，再加入2mL油胺、1mL乙二醇、2mL油酸，搅拌均匀，在氮气气氛中，于200℃条件下，反应0.5h，再在250℃条件下回流2h后，停止加热，冷却至室温，磁分离出黑色产物，并用乙醇洗涤3次，获得油酸-油胺包裹的四氧化三铁纳米粒子；
步骤2.向步骤1所获得的油酸-油胺包裹的四氧化三铁纳米粒子中加入36mL十二烷基硫酸钠溶液(物质量浓度，0.1mol/L)，搅拌混合均匀后，再在超声条件下分散15min，制备出磁性四氧化三铁乳状液；
步骤3.向24mL水中依次加入72mg十二烷基硫酸钠、5mL对氯甲基苯乙烯，搅拌混合均匀后，再超声条件下分散20min，制备出对氯甲基苯乙烯单体乳状液；
步骤4.将步骤2所获得的磁性四氧化三铁乳状液和步骤3所获得的对氯甲基苯乙烯单体乳状液混合均匀，在氮气气氛、搅拌条件下加入30mg过硫酸钾引发剂，于80℃条件下反应2h后，再加入30mg过硫酸钾引发剂，并于80℃条件下再反应20h，待反应结束后，自然冷却到室温，所得沉淀经磁分离、洗涤、干燥后为磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球。
本发明未提及的技术均参照现有技术。
本发明有益效果：
1.使用磁性Fe3O4/P(St-AA)，Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球作为载体材料，制备磁性固定化脂肪酶的方法简单，条件温和，经济环保；
2.磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球和磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球在固定化过程中能稳定脂肪酶的活性结构，因而所得到的磁性固定化脂肪酶的活性高，酶活回收率可达88％～105％；
3.磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球和磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球有大量活性基团，可固载大量脂肪酶，脂肪酶的固载量高达84～187mg/g；
4.脂肪酶共价固定在磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球和磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球表面，因此磁性固定化脂肪酶的稳定性好，在50℃条件下放置10h后，仍能保持较高的活性；
5.磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球和磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球是疏水材料，容易分散到各种有机介质中，因此所得磁性固定化脂肪酶可在有机介质中使用，能够在有机介质中催化酯化多种底物；
6.磁性固定化脂肪酶具有磁响应性，可借助外磁场从反应体系中快速简便地富集、分离、回收磁性固定化脂肪酶，可有效降低实际生产成本，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为实施例1所制备的磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球的扫描电子显微镜检测图。
图2为实施例1所制备的磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球的X-射线粉末衍射检测图。在图2中，横坐标为衍射角2-Theta(degree)，纵坐标为强度Intensity(a.u.)；经过与标准图谱(JCPDS:77-1545)进行对照，产物衍射峰位于30.1°、35.5°、43.1°、53.4°、57.0°、62.6°、70.9°、74.0°，分别对应于立方相四氧化三铁的衍射峰(220)，(311)，(400)，(422)，(511)，(440)，(620)，(533)。
图3为实施例1所制备的磁性固定化脂肪酶与游离脂肪酶的热稳定性图。在图3中，横坐标为时间Time(h)，纵坐标为相对活性Relative activity(％)；磁性固定化脂肪酶和游离脂肪酶均在50℃环境中保持相同时间(0～10h)。
图4为实施例3所制备的磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球的扫描电子显微镜检测图。
图5为实施例3所制备的磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球的X-射线粉末衍射检测图。在图5中，横坐标为衍射角2-Theta(degree)，纵坐标为强度Intensity(a.u.)；经过与标准图谱(JCPDS:77-1545)进行对照，产物衍射峰位于18.3°、30.0°、35.4°、43.1°、53.4°、56.9°、62.5°、70.9°、73.9°，分别对应于立方相四氧化三铁的衍射峰(111)，(220)，(311)，(400)，(422)，(511)，(440)，(620)，(533)。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
本发明提供的磁性固定化脂肪酶的制备方法中，所述的磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球由下列方法所合成：
步骤1.称取1059.5mg乙酰丙酮铁加入到20mL二苯醚中，再加入2mL油胺、1mL乙二醇、2mL油酸，搅拌均匀，在氮气气氛中，于200℃条件下，反应0.5h，再在250℃条件下回流2h后，停止加热，冷却至室温，磁分离出黑色产物，并用乙醇洗涤3次，获得油酸-油胺包裹的四氧化三铁纳米粒子；
步骤2.向步骤1所获得的油酸-油胺包裹的四氧化三铁纳米粒子中加入36mL十二烷基硫酸钠溶液(物质量浓度，0.1mol/L)，搅拌混合均匀后，再在超声条件下分散15min，制备出磁性四氧化三铁乳状液；
步骤3.向30mL水中依次加入90mg十二烷基硫酸钠、0.1mL苯乙烯和0.4mL丙烯酸，搅拌混合均匀后，再超声条件下分散20min，制备出苯乙烯-丙烯酸混合单体乳状液；
步骤4.将步骤2所获得的磁性四氧化三铁乳状液和步骤3所获得的苯乙烯-丙烯酸混合单体乳状液混合均匀，在氮气气氛、搅拌条件下加入45mg过硫酸钾引发剂，于80℃条件下反应24h，待反应结束后，自然冷却到室温，所得沉淀经磁分离、洗涤、干燥后为磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球，扫描电子显微镜检测结果见图1，X射线衍射表征检测结果见图2。
磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球固定脂肪酶的操作过程如下：
步骤1.将来源于猪胰腺的冻干脂肪酶粉采用pH＝7.4磷酸缓冲液配置为1mg/mL的脂肪酶溶液，至于4℃冰箱中保存备用；
步骤2.称取100mg上述方法制得的磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球，依次加入191.7mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、115.1mg N-羟基琥珀酰亚胺和20mL吗啉乙磺酸缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝6.0)，超声分散2min，并于35℃条件下反应3h，所得产品经磁分离、洗涤，即可得到活化的磁性聚苯乙烯纳米球。
步骤3.将上述活化的磁性聚苯乙烯纳米球，加入20mL上述脂肪酶溶液，于30℃条件下反应1.5h，所得产品经磁分离、洗涤，即可获得磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球固定的脂肪酶。
本发明提供的磁性固定化脂肪酶的制备方法中，所述的磁性固定化脂肪酶活性测试包含以下步骤：
磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球固定脂肪酶的催化活性的测定：
步骤1.称取50mg阿拉伯树胶，加入200mg Triton X-100(上海索莱宝生物科技有限公司)和45mL pH＝7.4的磷酸缓冲液，混合均匀形成混合缓冲液；
步骤2.称取15mg对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP)，加入5mL异丙醇，完全溶解后加入上述混合缓冲液，混合均匀配制p-NPP底物，至于4℃冰箱中保存备用；
步骤3.取4mL p-NPP底物溶液，预热5min后加入上述磁性固定化脂肪酶(或脂肪酶溶液)，测定磁性固定化脂肪酶(或脂肪酶)在45℃条件下水解反应速率；用差量法计算磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球的固载量；将磁性固定化脂肪酶(或游离脂肪酶)分别置于50℃保存相同时间，再用p-NPP法测定磁性固定化脂肪酶的催化活性，研究磁性固定化脂肪酶的热稳定性。
步骤4.在5mL正己烷中加入0.2mL有机酸和0.2mL醇，再加入30mg磁性固定化脂肪酶，在45℃条件下反应30min，磁分离出磁性固定化脂肪酶，用GC-MS检测脂的产率；有机酸为冰醋酸、丙酸、丁酸、苯甲酸或己二酸，醇为乙醇、正丁醇、丙醇、正己醇、乙二醇或丙三醇，有机酸和醇具体选择哪一种并不影响最终的结果。
检测所述脂肪酶在磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球上的固载量为176.7mg/g；所述的磁性固定化脂肪酶催化活性是游离脂肪酶催化活性的0.94倍；在50℃条件下放置10h后，所述的磁性固定化脂肪酶的活性仍能保持80.5％，是游离酶的2.45倍(见图3)；在正己烷中磁性固定化脂肪酶仍能保持较高的催化活性，催化合成乙酸丁酯的产率可达78％。
实施例2、
磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球的制备同实施例1。
磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球固定脂肪酶的操作过程如下：
步骤1.将来源于猪胰腺的冻干脂肪酶粉采用pH＝7.4磷酸缓冲液配置为1mg/mL的脂肪酶溶液，至于4℃冰箱中保存备用；
步骤2.称取100mg上述方法制得的磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球，依次加入191.7mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、57.6mg N-羟基琥珀酰亚胺和20mL吗啉乙磺酸缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝6.0)，超声分散2min，并于25℃条件下反应3h，所得产品经磁分离、洗涤，即可得到活化的磁性聚苯乙烯纳米球。
步骤3.将上述活化的磁性聚苯乙烯纳米球，加入40mL上述脂肪酶溶液，于30℃条件下反应1.5h，所得产品经磁分离、洗涤，即可获得磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球固定的脂肪酶。
磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球固定脂肪酶的催化活性的测定同实施例1：
检测所述产品中脂肪酶在磁性聚苯乙烯纳米球上的固载量为171mg/g；所述的磁性固定化脂肪酶催化活性是游离脂肪酶催化活性的0.93倍；在50℃条件下放置10h后，所述的磁性固定化脂肪酶的活性仍能保持81％；在正己烷中磁性固定化脂肪酶仍能保持较高的催化活性，催化合成丁酸丁酯的产率可达72％。
实施例3
本发明提供的磁性固定化脂肪酶的制备方法中，所述的磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球由下列方法所合成：
按照实施例1的步骤1和步骤2制备出磁性四氧化三铁乳状液；向24mL水中依次加入72mg十二烷基硫酸钠、5mL对氯甲基苯乙烯，搅拌混合均匀后，再超声条件下分散20min，制备出对氯甲基苯乙烯单体乳状液；将所获得的磁性四氧化三铁乳状液与对氯甲基苯乙烯单体乳状液混合均匀，在氮气气氛、搅拌条件下加入30mg过硫酸钾引发剂，于80℃条件下反应2h后，再加入30mg过硫酸钾引发剂，并于80℃条件下再反应20h，待反应结束后，自然冷却到室温，所得沉淀经磁分离、洗涤、干燥后为磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球，扫描电子显微镜检测结果见图4，X射线衍射表征检测结果见图5。
磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球固定脂肪酶的操作过程如下：
步骤1.将来源于猪胰腺的冻干脂肪酶粉采用pH＝7.4磷酸缓冲液配置为1.5mg/mL的脂肪酶溶液，至于4℃冰箱中保存备用；
步骤2.称取10mg上述方法制得的Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球，加入5mL丙酮和40μL三乙胺，1mL脂肪酶，于35℃条件下反应3h，所得产品经磁分离、洗涤，即可获得磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球固定的脂肪酶。
磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球固定脂肪酶的催化活性的测定同实施例1：
检测所述产品中脂肪酶在磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球上的固载量为132.1mg/g；所述的磁性固定化脂肪酶催化活性是游离脂肪酶催化活性的0.88倍；在50℃条件下放置10h后，所述的磁性固定化脂肪酶催化活性是游离脂肪酶催化活性的1.94倍；在正己烷中磁性固定化脂肪酶仍能保持较高的催化活性，其中丁酸丁酯的产率可达68％。
实施例4、
磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球的制备同实施例3。
磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球固定脂肪酶的操作过程如下：
步骤1.将来源于猪胰腺的冻干脂肪酶粉采用pH＝7.4磷酸缓冲液配置为0.5mg/mL的脂肪酶溶液，至于4℃冰箱中保存备用；
步骤2.称取10mg上述方法制得的Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球，加入1mL丙酮和10μL三乙胺，2mL脂肪酶，于25℃条件下反应1h，所得产品经磁分离、洗涤，即可获得磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球固定的脂肪酶。
磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球固定脂肪酶的催化活性的测定同实施例1：
检测所述产品中脂肪酶在磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球上的固载量为84mg/g；所述的磁性固定化脂肪酶催化活性是游离脂肪酶催化活性的0.92倍；在50℃条件下放置10h后，所述的磁性固定化脂肪酶催化活性是游离脂肪酶催化活性的2.1倍；在正己烷中磁性固定化脂肪酶仍能保持较高的催化活性，其中乙酸丁酯的产率可达73％。
实施例5、
磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球的制备同实施例3。
磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球固定脂肪酶的操作过程如下：
步骤1.将来源于猪胰腺的冻干脂肪酶粉采用pH＝7.4磷酸缓冲液配置为1mg/mL的脂肪酶溶液，至于4℃冰箱中保存备用；
步骤2.称取100mg上述方法制得的磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球，加入2mL 2M的氨水，超声分散均匀，并于25℃条件下反应4h，所得产品经磁分离、洗涤，即可得到氨基功能化的磁性聚苯乙烯纳米球；
步骤3.向上述氨基功能化的磁性聚苯乙烯纳米球中加入4ml 5％的戊二醛溶液，于25℃条件下反应12h，所得产品经磁分离、洗涤、真空干燥，即可得到活化的磁性聚苯乙烯纳米球；
步骤4.将上述活化的磁性聚苯乙烯纳米球，加入20mL上述脂肪酶溶液，于30℃条件下反应1.5h，所得产品经磁分离、洗涤，即可获得磁性聚苯乙烯纳米球固定的脂肪酶。
磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球固定脂肪酶的催化活性的测定同实施例1：
检测所述产品中脂肪酶在磁性聚苯乙烯纳米球上的固载量为187mg/g；所述的磁性固定化脂肪酶催化活性是游离脂肪酶催化活性的1.05倍；在50℃条件下放置10h后，所述的磁性固定化脂肪酶催化活性是游离脂肪酶催化活性的3.2倍；在正己烷中磁性固定化脂肪酶仍能保持较高的催化活性，其中丁酸丁酯的产率可达83％。
实施例6、
磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球的制备同实施例2。
磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球固定脂肪酶的操作过程如下：
步骤1.将来源于猪胰腺的冻干脂肪酶粉采用pH＝7.4磷酸缓冲液配置为1mg/mL的脂肪酶溶液，至于4℃冰箱中保存备用；
步骤2.称取100mg上述方法制得的磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球，加入2mL 1M的乙二胺溶液，超声分散均匀，并于40℃条件下反应8h，所得产品经磁分离、洗涤，即可得到氨基功能化的磁性聚苯乙烯纳米球；
步骤3.向上述氨基功能化的磁性聚苯乙烯纳米球中加入4ml 10％的戊二醛溶液，于40℃条件下反应4h，所得产品经磁分离、洗涤、真空干燥，即可得到活化的磁性聚苯乙烯纳米球；
步骤4.将上述活化的磁性聚苯乙烯纳米球，加入40mL上述脂肪酶溶液，于30℃条件下反应1.5h，所得产品经磁分离、洗涤，即可获得磁性聚苯乙烯纳米球固定的脂肪酶。
磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球固定脂肪酶的催化活性的测定同实施例1：
检测所述产品中脂肪酶在磁性聚苯乙烯纳米球上的固载量为193mg/g；所述的磁性固定化脂肪酶催化活性是游离脂肪酶催化活性的1.04倍；在50℃条件下放置10h后，所述的磁性固定化脂肪酶催化活性是游离脂肪酶催化活性的3.0倍；在正己烷中磁性固定化脂肪酶仍能保持较高的催化活性，其中乙酸丁酯的产率可达87％。

Claims (10)

1.一种可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于：以磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球或磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球作为载体，通过共价结合将脂肪酶固定在磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球表面或磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球表面。
2.如权利要求1所述的可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于：通过共价结合将脂肪酶固定在磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球表面的方法为：先用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合物活化磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球表面的羧基官能团，再利用酰胺化反应在磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球表面共价固定脂肪酶。
3.如权利要求2所述的可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶解在吗啉乙磺酸缓冲溶液中，加入磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球，超声分散2±1min，然后于25～35℃条件下反应2～4h，再将所得产品经磁分离、洗涤；
2)将步骤1)所得的产品加入到脂肪酶溶液中，于30±5℃条件下反应1.5±0.2h，然后将所得产品经磁分离、洗涤，即得可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶。
4.如权利要求3所述的可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，脂肪酶溶液的浓度为0.9-1.1mg/ml；磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的质量比为1：(1.8-2)；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:(0.3～0.6)；磁性Fe3O4/P(St-AA)纳米球与脂肪酶的质量比为1:(0.2～0.4)。
5.如权利要求1所述的可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，通过共价结合将脂肪酶固定在磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球表面的方法为：在三乙胺的作用下，利用亲核反应使脂肪酶共价固定在磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球表面。
6.如权利要求5所述的可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，通过共价结合将脂肪酶固定在磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球表面的方法为：将磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球分散到丙酮中，再加入三乙胺和脂肪酶溶液，于25～35℃条件下反应1～3h，然后将所得产品经磁分离、洗涤，即得在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶。
7.如权利要求6所述的可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，脂肪酶溶液浓度为0.5～1.5mg/mL；丙酮与脂肪酶溶液的体积比为1：(0.2～2)；三乙胺与脂肪酶溶液的体积比为1：(25～200)；磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球与脂肪酶的质量比为1:(0.1～0.15)。
8.如权利要求1所述的可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，通过共价结合将脂肪酶固定在磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球表面的方法为：先利用亲核反应使氨基官能团与磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球相结合，再将所得产品与戊二醛的一端醛基反应，使得戊二醛连接在磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球表面，最后利用连接在磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球表面的戊二醛另一端的醛基将脂肪酶共价固定在磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球表面。
9.如权利要求8所述的可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)将磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球加入到碱溶液中，超声分散均匀，于25～40℃条件下反应4～8h，再将所得产品经磁分离、洗涤；
2)将步骤1)所得的产品加入到戊二醛溶液中，于25～40℃条件下反应4～12h，再将所得产品经磁分离、洗涤、真空干燥；
3)将步骤2)所得的产品加入到脂肪酶溶液中，于30±5℃条件下反应1.5±2h，再将所得产品经磁分离、洗涤，即得可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶。
10.按照权利要求9所述的可在有机介质中使用的磁性固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，脂肪酶溶液的浓度为0.9-1.1mg/ml；碱溶液为氨水或乙二胺溶液；磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球与乙二胺或氨水中氨的质量比为1:(1.2～1.4)；磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球与戊二醛的质量比为1:(2～4)；戊二醛溶液的浓度为50～100g/L；磁性Fe3O4/PS-CH2Cl纳米球与脂肪酶的质量比为1:(0.2～0.4)。
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