CN107674112B - 一种以肝素为配体的亲和层析介质 - Google Patents
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Abstract
本案涉及一种以肝素为配体的亲和层析介质,以中空介孔二氧化硅微球为内核,在微球内核的表面以及孔道内附着或者填充复合物;附着或者填充复合物的内核被环氧活化,然后继续被多乙烯多胺胺化,多乙烯多胺用于偶联肝素配体;其中,复合物由壳聚糖、聚丙烯酰胺、氢氧化铝和氮化硼组成。本发明的肝素亲和层析介质的肝素配体含量以及对目标蛋白质的固载量大,亲和层析分离效率较高,同时制备工艺简单,能够实现大规模的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种层析介质,具体涉及一种以肝素为配体的肝素亲和层析介质。
背景技术
随着生物制药领域的迅猛发展,对生物药剂的安全性提出了越来越高的要求,而纯度是保证重组蛋白、抗体、酶等生物药剂安全性的关键。在对这些有机大分子生物药剂分离纯化时,不仅需要提纯浓缩,而且还要求保持一定的空间构型以维持其生物活性。亲和层析是利用生物大分子与介质表面的配体特异性结合而进行选择性分离的一种技术,分离提纯的选择性强,条件较温和,能维持目标蛋白的生物活性。
其中,以肝素(Heparin)为配体的亲和层析介质,能够特异性结合凝血因子、抗凝血酶Ⅲ等血浆蛋白,是使用较多的亲和配体之一。在化学组成上,肝素是由葡萄糖胺、L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成的黏多糖硫酸脂,平均分子量为12~15KDa。目前市场上的肝素亲和层析介质主要以高交联琼脂糖凝胶为基质,采用环氧活化工艺,将肝素偶联到琼脂糖凝胶上,其配基密度约3.5mg/mL,即每毫升琼脂糖凝胶基质键合肝素约3.5mg肝素,对抗凝血酶Ⅲ动态固载量约2mg/mL,现有肝素亲和层析介质的配体含量,以及对目标蛋白质的固载量都不高,使亲和层析分离效率较低,难以实现大规模的应用,同时制备工艺复杂,价格较贵,核心技术为国外公司所垄断。
发明内容
针对现有技术的不足之处,本发明的目的在于提供一种以肝素为配体的亲和层析介质。
本发明的技术方案概述如下:
以中空介孔二氧化硅微球为内核,所述中空介孔二氧化硅微球内核的表面以及孔道内附着或者填充复合物;所述附着或者填充复合物的内核被环氧活化;所述被环氧活化的内核被多乙烯多胺胺化;所述多乙烯多胺偶联肝素配体;
其中,所述复合物由下述组分按质量分数组成:
所述多乙烯多胺是乙二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺、四乙烯五胺的联产物。
优选的是,所述氮化硼的粒径小于10um。
优选的是,所述复合物在乙腈中以悬浮液形式存在。
优选的是,所述中空介孔二氧化硅微球与复合物的质量比为100∶80~85。
优选的是,所述偶联为肝素的末端醛基与多乙烯多胺中的胺基通过还原胺化法实现连接。
优选的是,环氧活化所选用活化剂为环氧氯丙烷或者烯丙基缩水甘油醚。
优选的是,所述中空介孔二氧化硅微球的粒径为30~100μm,所述孔道的平均孔径为40~50nm。
本发明的有益效果是:本发明对肝素亲和层析介质的内核基质进行改进优化,选用具有较大比表面积和耐酸碱骨架结构的中空介孔二氧化硅微球作为内核;微球附着和填充复合物有效改善了亲和层析介质基质的性能,其中壳聚糖增加了二氧化硅微球的生物亲和性,同时壳聚糖和聚丙烯酰胺均富含氨基,能够与肝素配体中醛基通过还原胺化法连接;填充介质中壳聚糖的羟基与环氧氯丙烷或者烯丙基缩水甘油醚反应,使内核被环氧活化,环氧基进一步与多乙烯多胺交联使内核胺化,多乙烯多胺继而与肝素配体中醛基通过还原胺化法偶联;复合物中的胺基与多乙烯多胺的胺基可以同时偶联于肝素配体,增大了肝素亲和层析介质中肝素配体的密度,能够提高分离效率。
本发明用多乙烯多胺代替现有肝素亲和层析介质中胺化环氧基时使用的浓氨水,多乙烯多胺中活性氨基位点远多于氨水,即能够用于肝素配体结合的位点更多,并且所需多乙烯多胺浓度较低,可减少对空气的污染;氢氧化铝和氮化硼的加入能够抑制壳聚糖和聚丙烯酰胺的溶胀,使中空介孔二氧化硅微球能够附着更多量的复合物,同时可以增加亲和层析介质的机械性能和稳定性;复合物在乙腈中能够形成均匀的悬浊液,同时乙腈有利于消除复合物与二氧化硅微球的相界面,有利于中空介孔二氧化硅微球对复合物的吸附。本发明所涉及的以肝素为配体的亲和层析介质中肝素配体含量高,对目标蛋白质的固载量多,使亲和层析分离效率较高,同时制备工艺简单,能够实现大规模应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。本案提供了一种以肝素为配体的亲和层析介质,通过下述实施例以及对比例具体阐述。
实施例1
制备过程如下:
1)将20g粒径在30~100μm的中空介孔二氧化硅微球浸泡在0.5mol/L的氢氧化钠溶液中,在50~55℃下搅拌1~1.5小时使二氧化硅微球活化,将中空介孔二氧化硅微球真空干燥12小时;二氧化硅微球从真空干燥炉中取出后迅速置于含有12g壳聚糖、6g聚丙烯酰胺、1g氢氧化铝、1g氮化硼、30ml乙腈、30ml 0.5mol/L氢氧化钠溶液的悬浊液中,在50~55℃下搅拌反应5小时,真空泵抽干后用去离子水冲洗并干燥,得到附着或者填充复合物的二氧化硅微球内核;
2)向步骤1)所得的微球中加入20mL环氧氯丙烷、10mL二甲基亚砜、20mL浓度为0.5mol/L氢氧化钠溶液,在35~40℃下搅拌反应2~3小时,过滤并用去离子水洗涤干燥后得到环氧化的微球内核;
3)向步骤2)所得的微球中加入5mL多乙烯多胺、45mL浓度为0.5mol/L氢氧化钠溶液,在35~40℃下搅拌反应2~3小时,过滤并用去离子水洗涤干燥后得到胺化的微球内核;
4)向步骤3)所得的微球中加入5g肝素钠、40mL甲醇,在氮气保护下于20~25℃的恒温振荡器中振摇58~60小时,使肝素初步以醛亚胺的形式偶联于微球上;向反应体系中加入2g硼氢化钠,反应3~4小时,将醛亚胺还原,得到最终的以肝素为配体的亲和层析介质。
实施例2
制备过程如下:
将步骤2)中20mL环氧氯丙烷用30mL烯丙基缩水甘油醚代替,两者的物质的量相同,其余制备过程与实施例1相同。
对比例1
将实施例1中所使用的中空介孔二氧化硅微球替换为相同尺寸的琼脂糖凝胶微球,其余制备过程与实施例1相同。
对比例2
在实施例1步骤1)中将中空介孔二氧化硅微球真空干燥后并不放入含有填充介质的悬浊液,直接进行步骤2)的操作,其余制备过程与实施例1相同。
对比例3
在实施例1步骤1)中配制的悬浊液中不加入聚丙烯酰胺,所加入壳聚糖的质量为18g,其余制备过程与实施例1相同。
对比例4
在实施例1步骤1)中配制的悬浊液中不加入氢氧化铝和氮化硼,其余制备过程与实施例1相同。
对比例5
将实施例1步骤3)中多乙烯多胺和氢氧化钠溶液替换为50mL体积分数为25%的浓氨水,其余制备过程与实施例1相同。
对比例6
市售的以肝素为配体的亲和层析介质,即肝素亲和层析介质。
为了进一步阐释实施例1~2和对比例1~5所制备的亲和层析介质性能,分别对所制备以肝素为配体的亲和层析介质的肝素结合量和该肝素亲和层析柱的柱容量进行测试。
测定肝素结合量:
采用电位滴定法进行测定。首先制作肝素的标准曲线,分别配制含有3.87、5.24、7.65、9.42、10.77、14.48、15.95、19.30、27.80、39.40mg肝素钠的0.1mol/L KCl溶液各10ml,用浓盐酸(36-38%)将它们的pH调到2.50±0.01,然后用0.5mol/L KOH进行滴定,记录到终点时消耗的KOH量,并制作标准曲线。将各以肝素为配体的亲和层析介质和步骤3)所得的没有偶联肝素的空白亲和层析介质在真空度约-30千帕时进行抽干,并用0.1mol/LKCl溶液预处理。同法滴定方法测定0.1mol/L KCl溶液中加入1.25、2.50、3.75、5.00、6.25、7.50、8.75、10.00g以肝素为配体的亲和层析介所消耗的KOH量;测定0.1mol/L KCl溶液中加入1.25、2.50、3.75、5.00、6.25、7.50、8.75、10.00g没有偶联肝素的空白亲和层析介质所消耗的KOH量,作为空白对照。根据测定原理:A=Aheparin+Asolution+ASepharose。(A为达到滴定终点时所要消耗的KOH量,Aheparin、Asolution、ASepharose分别为肝素、KCl溶液、没有偶联肝素的空白亲和层析介质达滴定终点时所要消耗的KOH量),利用标准曲线求各实施例及对比例产品所对应的肝素含量,平均值即为制备的肝素亲和柱的肝素结合量。
柱容量的测定:
将不同剂量的抗凝血酶Ⅲ溶液(1、1.5、2、2.5、3、3.5、4ml,浓度为1mg/mL)上0.2ml体积以肝素为配体的亲和柱亲和,经平衡、洗脱后分别收集平衡峰与洗脱峰。将平衡峰上样另一个相同肝素亲和柱亲和,检查亲和柱的饱和情况。记录在1mg/mL的抗凝血酶Ⅲ溶液浓度下,肝素亲和柱亲和柱的饱和点,超过此量,亲和就不完全。
表1记录了测试所得数据,本发明所制备的肝素亲和层析介质实施例1和实施例2的肝素结合量较高,同时对1mg/mL抗凝血酶Ⅲ溶液亲和的饱和点大于其余对比例,意味着本发明的亲和层析分离效率会高于其余产品;对比实施例1和对比例1的测试结果,选用中空介孔二氧化硅微球作为内核相较于现有技术中的琼脂糖凝胶微球而言,对复合物的吸附量更大,从而能够提供更多的肝素配体结合位点,有利于肝素配体的偶联与目标蛋白的亲和;由对比例2~4可以看出,复合物以及其中的组分都是必不可少的,一旦缺失或者被替代将难以达到本发明应有的亲和效果;对比例5中用浓氨水代替多乙烯多胺作为介质的胺化试剂,不仅所需氨水浓度较高,而且为亲和介质内核所提供的氨基位点少于多乙烯多胺,使肝素配体结合量少,进而对目标蛋白的亲和饱和点较低;对比实施例1和对比例6中市售肝素亲和介质的测试结果,发现本发明中肝素亲和介质对肝素配体的结合量提高了75%,对浓度为1mg/mL抗凝血酶Ⅲ溶液的饱和点增多了1倍以上,具有较好的亲和分离效果。
表1
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节。
Claims (3)
1.一种以肝素为配体的亲和层析介质,其特征在于,所述亲和层析介质通过如下方法制备:
1)将20g粒径在30~100μm的中空介孔二氧化硅微球浸泡在0.5mol/L的氢氧化钠溶液中,在50~55℃下搅拌1~1.5小时使二氧化硅微球活化,将中空介孔二氧化硅微球真空干燥12小时;二氧化硅微球从真空干燥炉中取出后迅速置于含有12g壳聚糖、6g聚丙烯酰胺、1g氢氧化铝、1g氮化硼、30ml乙腈、30ml 0.5mol/L氢氧化钠溶液的悬浊液中,在50~55℃下搅拌反应5小时,真空泵抽干后用去离子水冲洗并干燥,得到附着或者填充复合物的二氧化硅微球内核;
2)向步骤1)所得的微球中加入20mL环氧氯丙烷、10mL二甲基亚砜、20mL浓度为0.5mol/L氢氧化钠溶液,在35~40℃下搅拌反应2~3小时,过滤并用去离子水洗涤干燥后得到环氧化的微球内核;
3)向步骤2)所得的微球中加入5mL多乙烯多胺、45mL浓度为0.5mol/L氢氧化钠溶液,在35~40℃下搅拌反应2~3小时,过滤并用去离子水洗涤干燥后得到胺化的微球内核;
4)向步骤3)所得的微球中加入5g肝素钠、40mL甲醇,在氮气保护下于20~25℃的恒温振荡器中振摇58~60小时,使肝素初步以醛亚胺的形式偶联于微球上;向反应体系中加入2g硼氢化钠,反应3~4小时,将醛亚胺还原,得到最终的以肝素为配体的亲和层析介质。
2.根据权利要求1所述的亲和层析介质,其特征在于,所述氮化硼的粒径小于10μ m 。
3.根据权利要求1所述的亲和层析介质,其特征在于,环氧活化所选用活化剂为30mL烯丙基缩水甘油醚。
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